JPS5984161A - 免疫測定用固相担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な免疫測定用固相担体に関する。

従来よ）抗原抗体反応およびこれに類する反応を定員的
に行うための手段は数多く知られている。

このような方法は主として血液、栄などの体液中に微量
に存在する成分の′ｉ？、ｔ、定性などに応用されてい
る。微量の成分としては、生体成分としての種々のホル
モンなどの生理活性物質、生体内のアイソザイム、投与
された薬物や薬物に対する特異的抗体、微生物由来の抗
原成分や、微生物やその抗原成分に対する特異的抗体、
さらにこれらの代謝物など種々の生体内に存在する微Ｍ
゛成分があげられる。

そのような微量成分は主として免疫反応における抗原抗
体反応またはこれに類する反応、例えばホルモンとそれ
に対する抗体または受容体を応用して測定されている。

抗原抗体反応の結果、それらの結合物が不溶性になった
り、多数の抗原・抗体分子からなる大きな集合体が形成
されることを利用する方法は既に古曲的な方法として知
られてｈる。これらは試験管内に沈降する量を直管？１
ｌ１１定する方法や、ゲル内で沈降させる免疫拡散法、
あるいは抗原抗体結合物に結合する補体を用いる方法に
より測定されている。また、種々のノ・ブチン１抗原や
抗体を何らかの方法で標識しておき、その標識を測定す
ることによる方法もよく知られている。これらの内でも
高感度測定法として広く用いられている方法にラジオイ
ムノアッセイ但ＩＡ）があるが、ＲＩＡけ放射性同位元
素を利用するもので、またより安全な測定法として放射
性同位元素標識の代りに酵素で標識したものを用いる測
定法即ち酵素免疫測定法（Ｂ　Ｉ　Ａ）が近年広く利用
されている。

ＥＩＡは薬物や抗原（ｆｉｌｌ々の）・ブテンを含む：
以下単に抗原と記す、る）または抗体に酵素を結合させ
゛〔おき、その酵素活性を標識として抗原抗体反応の程
度を測定し、その結果より抗原または抗体の晴を測定し
ようとするものである。

このような測定法としては、測定しようとするものが抗
原である場合と抗体である場合、標識抗原゛または抗体
と標識しない（非ｌｌｉ識）抗原または抗体を競争的に
反応させる場合と競争させない場合、更に競争反応のと
きに抗原・抗体結合物と非結合物とを分離して測定する
場合と分離しな旨で測定する場合、などがあげられ、さ
らにサンドイツチ法もあげら」Ｌる。

本発明の免疫測定用同相担体を用いる測定法は、これら
の方法の内で競争反応法やサンドイツチ法に用りられる
測定法であり、その内でも特に不溶性担体である測定用
固相担体を抗体や抗原の１！′ｌ定化（不溶化）のため
に用かた方法である。更に詳しく云えば、本発明の免疫
測定用同相担体を用いる測定法は、スルホン酸基を導入
したポリスチレン固相担体にＩｇＧまたはその第１抗体
または第２抗体を固定化した同相担体を用い北方法であ
る。

不溶性担体を用いた従来の免疫測定法においては、抗体
固定担体としてナイロン、ポリスチレンやガラス製の球
状担体やペーパーディスク状担体等を用いたものであっ
た力、または反応管壁面を担体としで利用していたが、
これらの不溶性担体に固定される抗原や抗体の鍍は少な
く、満足のかくものではなかった。

本発明者らは、先にこれら種々の欠点を有する免疫測定
用固相担体を改良することを試み、特殊な形状例えば弾
丸状に成型した同相担体（特願昭５６−１０１３６５号
）を発明したが、固相担体として一般的に使用されるポ
リスチレンの場合、その物理的吸着力が弱く、結合抗体
が剥離し易く、またその吸着−針が少ない等の欠点を有
しているので、必らずｌ−も実用的とは云えなかった。

本発明は上記のような神々の欠点を改善するために研究
開発されたもので烏って、その目的とするところは、不
溶性担体であるスチレン系ポリマーの測定用担体を発煙
硫酸ｔたは無水硫酸中にて低県下で処理することにより
得られたスルホン酸基を導入された同相担体が未処理の
ものに比べて７〜ｌ　（１倍以上抗原や抗体などの免疫
成分を結合し得る極めて良好なものであることを知り、
さらに好ましくはこの担体を特殊な構造に形成し、該測
定用同相体によって反応管内で接触面積を増大さぜ、さ
らに測定用固相担体に対する反応液の接触面を均一な層
とすることにより、攪拌、振とうなどの煩雑な操作を必
須とせず、また著しく少ない免疫反応媒体の使用にて、
その免疫反応を迅速かつ均一な条件下で行えるようにし
た免疫測定用固相担体紮提供するにある。

本発明は、ＥＩＡやＲＩＡにも応用できる。更に本発明
性、同相法などによる競争反応法やサンドイッチ法によ
る測定法に応用できる。

本発明で使用されるスチレン系ポリマーの不溶性担体と
しては、一般の１ｆｌｌＡ　−？　ＲＩＡに用いられる
スチレン系ポリマーの不溶性担体が使用さ）Ｌる。

マタ、このスチレン系ポリマーとしては、スチレンから
、するモノポリマーでもよく、マだスチレンとアミノス
チレン、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、エチレン
、′メクリル酸、メタアクリル酸、メチルメタアクリレ
ート、アクリニトリルビニルアルコール、酢酸ビニル、
ブタジェン、無水マレイン酸とのコポリマーであっても
よい。このスチレン系ポリマーの不溶性担体としての測
定用１１１」担体は、球状形として用いてもよく、！侍
に好ましく１よ弾丸状あるいは４ａ形状その他これに類
する形状のもので、他の固体成型物たとえば金Ｈ，プラ
スチックの表面に本発明の測定用同相担体の形状が保持
されるように付着形成させたものでもよ−。

次に本発明の測定用固相担体の好ましい構造例について
図面を参照しながら説明する。

第１図は測定用固相担体が符号１として総括的に示しで
ある。測定用固相担体ｌけ、例えばポリスチレン系の高
分子樹脂材料から成り、担体本体２と該本体２の上面部
２ａの中央部忙突出して設けらり、たＪｌｌ（（＝Ｊ’
　Ｉｔ’ｌｌ　３とから構成されている。取付脚３には
、曲の操作棒（図示せず）がはめ込んで取付りられるが
、取イτ１脚３自体を操作棒として使用するために延縄
させ、た形状であってもよい。担体本体２は弾丸状に成
型されてｂて、その外径は反応？！ｒ４の内径と僅かな
隙間を保つような径に形成しである。担体本体２の下周
面の頂部には、クサビ状の突起５が一体に設けてあって
、該突起５により、担体本体２の弧状外周面２ｂと反応
管４との弧状内周面４ａとの間に一定の間隙部６が保持
されるようＫなっている。また、クサビ状の突起５０代
わりに凸状の突起となしてもよ−。要は、突起５により
、担体本体２が反応管４の弧状内周面４ａと密着状態と
なることを防止し得る形状であればよい。ξの突起部の
高さとしては、担体本体２と反応管４の管内壁面との１
６（が同一となればよい。担体本体２の上面部２ａには
、第２図に示すように１取付脚３を中心部して四角形状
に切り込み溝８が付設しである。切勺込み溝８の終端は
、担体本体２の周縁部に開口させてあって、上面部２ａ
の殉長線上での反応液の表面張力を弱める様に考慮しで
ある６また、この切り込みｍ８の形状としては、断面形
状が半円状、楕円状、台形状、三角形状、四角形状など
のｈずれの形状であってもよい。

本発明のｎ＋＋ｊ定用両定損両相担体記の様な構造であ
るため、反応管４に入れた反応液中に担体本体２を浸漬
させれば、担体本体２の突起５が反応管４の内底部に接
触して担体本体２の外周面とそれ釦対応する反応管４の
内周面との間に僅かな隙間が形成される（第１図参照）
。したがって、反応液量が少敬であっても、担体本体２
の浸漬によりて、その液が隙間部に案内されるとともに
担体本体２の上面部にまで上昇され、さらにその反応液
は、切り込みＯ８内を流れて上面部での表面張力作用を
失う。それ故、反応液は、担体本体２の外周面全体にわ
たって均一な条件（一定厚の屑の形態）で接触すること
Ｋなる。

上記の様な切）込み溝８の変形例としては、第３図（イ
）Ｋ示すように、担体本体２の上面部２ａの半径方向に
放射状に配設してもよい。また、他の変形例としては、
第３図（ロ）に示すように、担体本体２の上面部２ａの
直径方向に直線状に配設【〜てもよｈ０更に他の変形例
としては、第３図（ハ）に示すように、担体本体２の上
面部２ａの円周方向に左右対称の形に配設してもよい。

このように、切り込み／ｉ￥　８は、その終端が上面部
２ａの周縁部に開１１されている形状であればよく、ま
た如何なる形状にイ１設することもできる。

第４図は測定用固相担体ｌの他の変形例を示したもので
ある。この構造例における担体本体２は槍形状に形成し
である。したがって、反応管４も担体本体２に沿うテー
パー形状のものが使用される。従って、これから理解さ
れるように、種々の市販の反応管の形状に従って、その
担体本体を変形、加工すればよい。なお、第４図の実施
例における担体本体２のその他の構造については、前記
第１図で示した実施例のものと同じであるため、それと
構造を同じくする部分には同じ齢号を付し、説明は省略
する。

上記の如き、固相担体は種々の形状に形成されるが、例
えば弾丸状の固相担体の裏作のための実測例を第５図に
りｂて説明する。

例えば使用される小試験管が１５Ｘ１（１５ｙｎＷＬ（
内径１２．８ｍ、ｍ±ｎ、　１ｍｙ＋Ｌ）の場合、担体
本体２は第５図に符号人ないし工で示す各部寸法ＫＩＡ
作される。すなわち、Ａ：半径６ｍｍの半球部、Ｂ：円
柱部の高さ１０ｍｍ、　、Ｃ：円錐状突起部の高さく）
、４ｍ’ＷＬ　％　Ｄ　：円錐状突起部の円錐の半径０
．５ｔｎｔｎ　％　Ｅ　：半径０．７５ｍｍの半円状溝
、Ｆ：対向する溝間の中心部距離７．５ｍｍ　、　Ｇ　
：操作棒を挿着するための凸部の直径４　ｍ、ｍ％Ｈ：
操作棒挿着孔の直径２ｍｍｓＩ：挿操神挿着のための凸
部の高さ３　ｍｍの寸法に−〔示される円柱部、（高さ
ｌ　Ｏｍｍ　ｓ直径１２ｍｍ１と半径６ｍｍの半球部か
らなる担体本体で、免投結衝液の計け１（］　０　／ｉ
β程度、標識物質を結合させた成分を金山する液は１０
０／ｌ、ｅ稈度および被検液（血清、尿等）は１（）θ
μｍ程度を用いればよい。

また、この際反応液の液層の幅（厚み）は（１，４ｍＭ
Ｌと均一に形成されるものである。

」二記の１清造例のように形成された担体本体を、発煙
硫酸または無水硫酸液中に加え、通常冷却下、例えば５
℃程度にて２時間以上浸漬せしめて反応せしめスルフォ
ン酸基を導入する。

このようにして得られたスルフォン酸基ｔ　１８人した
測定用担体に１ｍ常公知の手段を適用して化学的または
物理的に抗体もしくは抗原、その他の薬物の受容体を結
合して不溶性抗体等（抗原、受容トド）となし、同相を
潤整する。

同相の調製法としＣは、前８Ｃ不Ｉ４注担体にあらかじ
め抗体等を結合せしめるための官能基を導入してＩｌ’
￥定の形状に加工してもよく、または加工した後に官能
基を導入してもよい。この同相を得るにあたっては、硫
酸処理されたスチレン系ポリマーと免疫成分とを水性媒
体中にて接触せしめることにより、その大部分がイオン
結合によって固定化されるものである。さらに、一般忙
化学的に固定化するＫあたりては、スチレン系ボリマー
ノ不溶性担体の分子内の官能基または導入された官能基
と、抗体等の分子内に有する官能基、例えばアミン基、
水酸基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基等
の官能基に基いで両者を結合し得る多官能性化合物が用
すられる。この公知のｇ々の多官能性化合物としＣは、
例えはへギザメチレンジイソシアナート、２．４−）ル
エンジイソンアナートなどのジイソシアナート化合物、
ヘキザメチレンジイソチオシ゛アナートなどのジイソヂ
オシアナート、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒ
ド、アジボアルデヒドなどのジアルデヒド、Ｎ１Ｎ−エ
チレンビスマレイミド、Ｎ、Ｎ’−０−フェニレンジマ
レイミド、ビビスジアゾベンジジン、Ｎ。

Ｎ１−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、ジエチル
マロンイミデー）・、ジメチルアジピンイミデート、３
−（２−ベンゾチアゾリル−ジチオ）−プロピオン酸、
３−（２−ピリジル−Ｎ−オキサイド−ジチオ）プロピ
オン酸、６−Ｎ［３−（２’−ベンゾチアゾリル−ジチ
オ）グロビオニル〕カプロン酸などのスルフィドカルボ
ン酸類またはそのスクシンイミドエステル、Ｐ−ニトロ
フェニルエステル、酸クロライド、イミデートなどの反
応＼伸性導体（特願昭５３−８５９００号参照）、マし
イミド安息香酸、マレイミドフェニル酢酸、マレイミド
フェニルプロピオン酸などのマレイミドカルボン酸類ま
たはその反応性誘導体などが挙らノＬる。

またこの多官能性化合物は、不溶性担体に官能Ｊぶを導
入するための官能基導入試薬としても使用、できるもの
である。

さらＫまた、免疫成分を固定化し念同相を得るＫあたっ
ては、例えばｐＨ６〜８の緩衝液やアセトン、メタノー
ル、エタノールナトのアルコール系媒体、ジエチルエー
テルなどのエーテル系媒体゛またはそれらの混合媒体な
どの不活性媒体中にて、冷却または室温にて、不溶性担
体と多官能性化合物を反応せしめる。その後必要に応じ
て洗浄し、さらに同様の不活性媒体中にこれを加え、さ
らに抗体等を加え反応せしめて不溶け４す体と抗体等を
反応せしめる。

以下、同相担体の調？！法と同相担体における抗体の吸
着の例とし°ＣＩｇＧの吸着例を詳しく説明する。

所定の形状に成型したポリスチレン製同相相体を５℃に
て１時間前処理した後、冷却した濃硫酸中に入れ５℃で
・１〜１６時間、ａＩましくｉｉ：ｆ’ｉ時間反応せし
める。反応後、同相担体を取り出し蒸留水にて充分に洗
滌し、更に１　ｔｌ　ＯｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ８，
ｎ）で充分に洗滌をくり返してスルフォン酸基を導入し
たポリスチン固、１０」１体を得る。

この同相担体を、その直径より僅かに大きな直径を有す
る試験管にあらかじめＩｇＧ溶液を少鮒入れたものに挿
入して、５℃にて適当時間例えば２−１６時間インキュ
ベートすることにより、同相担体にＩｇＧを吸着せしめ
ることができる。

いま、内径１２．８ｍｍ±０．Ｌｍｍの試験管に、直径
１２．０ｍｍの第５図に示される弾丸状に成型したスル
フォン酸基を導入した固相担体を使用し九場合のＩｇＧ
の吸着について述べること圧する。

上記試験管にウサギＩｇＧの１　（１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ８，０）溶液ｏ　、　４ｍ０　（Ｉ　ｇＧ　ｉ
ｔとして２５ｔｔｇ／ｍｅ　。

５０μｇ／ｍｅおよび１００μｇ／ｍｅを各々別々の試
験管に入れる）を加え、上記スルフォン酸基を導入した
ポリスチレン製固相担体を挿入し、適当時間（０，２，
４，６，８，１６時間）５℃にてインキュベートする。

反応後、固相担体を引出し、１００ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ８，０）にて洗滌し、残った試験管内のＩｇＧ溶液
の蛋白Ｊ（をＣｕ−Ｆｏｌｉｎ法にて測定し、吸＊　Ｉ
ｇＧ景をしらべる。結果は第６図に示すごとく、無処理
のポリスチレン固相担体を用い九場合に比べ１０μｇＡ
ｌｌｒ相担体の場合で約７．５倍、２０μｇおよび４０
ｔｉｇ／固相担体の場合で約１０倍ＩｇＧの固定化ｉｆ
ｔが上昇した。この事実から、本発明の固相担体が抗体
の結合液が無処理に比べきわめて大であり、少量の担体
で充分反応性に當む抗体結合抗体であることが判る。

また、工ｇＧと同相Ｊｕ体の結合の安定性についてしら
べた結果を以下に述べる。

ＩｇＧを固定化した同相担体を下記の２通りの処理をす
ることにより、結合安定性をしらべた。イオン結合によ
る固定化物の解離法として、ＩＮ塩酸室温３時間処理、
物理的吸着による固定化物のｊＱＴｆｌｌ法として１０
％ＳＤＳ室温３０分間処理を行ない、遊離してくるＩｇ
Ｇを測定することによ、Ｄ、ＩｇＧの結合線式をしらべ
た。

上記の表に示した通り、硫酸処理したポリスチレン製周
相担体においては、固定化されたＩｇＧの約８５−のも
のが、イオン的にきわめて安定した形で同相と結合する
ことが明らかであシ、本発明の固相担体はきわめて結合
安定性のよい担体であることが判る。

次に、本発明の同相担体における抗体の活性保持率を仙
の担体と比較した例を述べる。

３鍾の固相担体に抗モルモットＩｇに　（ウツギ）のＩ
ｇＧ画分２０μｇの１００フルＭリン酸緩衝液（ｐｉｆ
　８．０）溶液（抗体含有１１約２チ）を室温で３時間
、５℃で１晩反応させた後、残存のＩｇＧ−Ｉｆを測定
することにより、吸着ＩｇＧ　ｌｅｔを求めた。次に、
モルモットＩｇＵ　Ｉｐｑを抗体１ｉ’１１定化固相担
体に５℃で１晩作用さす、免疫反応により同相に結合し
たモルモットＩｇＧ　ｈＪを求めた。そこで、抗体の活
性保持率上記の表に示した通り、ポリスチレン製固相担
体は、無処理同相担体とほぼ同４″Ａ度の活性保持率を
示し、ナイロン郷固相担体に比べ、はるかに良好な保持
率であった。

なお、上記のナイロン製同相用体についてはイミクロ法
によりアミノ基を導入した後、グルタルアルデヒド法で
活性化したものを用いた。

以上述べた如く、本発明のスルフォン酸基導入ポリスチ
レン製固相担体は、担体当りの抗体の固定化箪がきわめ
て大であり、従って抗体を匝小４（使用することによ巾
、充分免疫測定が可能であるばかりでなく、結合した抗
体もきわめて安定な形で存在するので、長時間、頻回の
１史用に耐える上、抗体の活性保持率も良好である等、
きわめてすぐり、た免投測足用担体である。

本発明の同相担体において、ｉｔ（２抗体を用いて第１
抗体を結合せしめてなる担体表面−第２抗体−第１抗体
結合物を得るにあたっては、向えば１旧の形状に加工し
た測定用担体ｔ・ｍ−で、上述の如くの同相を肖る手段
に基いて、まずｇ３２抗体を結合せしめる。次いでこれ
に、第１抗体を加えて免疫反応に糸いて結合せしめれば
よく、このようにして得られた第１抗体の免疫活性ｔよ
ケ１とんど劣化されないために管に好ましい同相である
。

さらに、測定にあ之って用いられる酵素を結合させた成
分、例えば抗体、抗原、２１ブテンなどや敏剖性同ｆＳ
″Ｌ元素を結合させた成分は、公知のＥＩＡｔ−ＲＩＡ
に用いられる標＃メ丸めの手段が用いられる。また、標
識物質としての酵素としては、公知のｌｉｉ々の酵素、
例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、転１ｊ″Ｌ酵素、
リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼに墾４する酵素力！
利用できる。

この様にして測定用担体に固定した不溶化抗体り「「を
用いて、この抗体等に対して特異的結合性を［）′Ｊ−
るａｌｌｌ定ずべき成分、例えば抗原、抗体を測定Ｉ−
るためには、公知のｇｌＡまたけＲＩＡによる測定法が
適用される。

以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明するが、本
ｓｂ明はこれにのみ限定されるものではない。

固相担体の調製法： 第５図に示す如く弾丸状に成型されたポリスチレン製担
体（直径１２　、　ＯｔｒＬｍ）を５℃にて１時間冷却
前処理を行った。次いで冷却した濃硫酸中に上記の相体
を加え、５℃にて６時間反応させた。反応後、担体を取
り出し、蒸留水にて充分に洗滌した後、１００ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨＬＯ）にて充分に洗滌し、スルフォン酸
基を導入したポリスチレン製固相担体をイひた。

実施例２ 抗体吸着同相担体の調製法： 試験管（内径１２．８ｍｍ±０．１ｍｍ）にウサギＩｇ
Ｇの１（）０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，１））溶液（
ＩｇＧ　Ｊｔは夫＊　２５．５０．１００μｇ／ａｇ）
を０．４ｍ、ｅずつ入れ、これに実施例１で得たスルフ
ォン「硬基を導入したポリスチレン製固相担体を挿入し
、５℃にて、０．２．４．６．８ならびに１６時間反応
させた。夫々の時間において、固相担体を取り出し、試
験管内の残存ＩｇＧ溶液の蛋白類、を銅−フォーリン法
（Ｃｕ−Ｆｏ　ｌ　ｉ　ｎ法）にて測定して非吸着Ｉｇ
ＧＪＪＮを算出し、固相担体に吸着したＩｇＧ量を求め
た。

結果は、第６図に示すとおりで、ボリスチｔ／ンそのも
の（無処理ポリスチレン）に比べて、ＩｇＧ固定化喰は
約７．５−１０倍上昇していることが判った。また、反
応時間は２時間で最大吸着績゛に達し、後は平衝状態に
なる仁とも判った。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の好適な実施例を示ｊ−ものであって、第
１図は第１夾施例による免疫測定用固相担体を試験管に
挿入した状態の部分断面図、第２図は免疫測定用固相、
担体の平面図、第３図ビ）（ロ）（ハ）は、担体釦形成
さ・れる切込み溝の夫り異なる実施例を示す平面図、第
４図は第２実施例の免疫測定用固相担体の縦断面図、第
５図は免疫測定用同相担体ｊｌｔ″！作のための１例の
実測図、第６図は１＾１相担体に吸着するＩｇＧＪｌの
グラフ図である。 符号の説明 ■は免役測定用担体、２は担体本体、４は試験管である
。 ９ 、ρ 第３図 （イ） （ロ） （ハ） 反先・端間　　０１５°Ｃ 処工ｔ　ＩｇＧ −Ｏ−０−１０μ９／匿口旧４旦イ木 −０−０−２０ｐｇ／固木ｎキ旦休 （５０，Ｌｔｇ　ＩｇＧ　７ｍ）’？０．４ｍ１）−ム
ーー６−４０．Ｌｌ（１／固ホＢオ旦体（１００ＰｃＪ
　　ＩｇＧ　／ｍ〕６）０．４ｍ１７）３８２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）スルフォン酸基を導入したスチレン系ポリマーよ
   ）なる免疫測定用固相担体。 （２；　　スチレン系ポリマーがポリスチレンまたはス
   チレンからなるモノポリマー、スチレンとアミノスチレ
   ン、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、エチレン、ア
   クリル酸、メタアクリル酸、メチルメタアクリレート、
   アクリニトリルビニルアルコール、酢酸ビニル、フタジ
   エン、無水マレイン酸との、コポリマーである特許請求
   の範囲第１項記載の免疫測定用固相担体。 （３）反応管と一定の隙間部を保っ担体がほぼ弾丸状あ
   るいは槍形状その他これに類する形状に成形され、しか
   もスルフォン酸基を導入したスチレン系ポリマーからな
   る特許請求の範囲第１項に記載の免疫測定用固相担体。