KR910008704B1

KR910008704B1 - 면역학적으로 검출 가능한 물질의 측정 방법 및 이것에 적당한 반응 용기

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Publication number: KR910008704B1
Application number: KR1019890006994A
Authority: KR
Inventors: 슈미트 우르반; 마우레트 에버하드; 뢰딘거 볼프강; 데그 롤프
Original assignee: 뵈링거 만하임 게엠베하; 데에르. 포우쿠에트, 데에르.베버
Priority date: 1988-05-25
Filing date: 1989-05-25
Publication date: 1991-10-19
Also published as: DE3901638A1; KR900018676A; DE3901638C2; DD283867A5; ZA893909B

Abstract

내용 없음.

Description

면역학적으로 검출 가능한 물질의 측정 방법 및 이것에 적당한 반응 용기

제1도는 상이한 양의 고정화 스트램타비딘과 비오티닐화 항-TSH-항체를 사용한 TSH 측정에 대한 검교정 고선(calibration curve)을 표시한다.

제2도는 프롤락틴 테스트에 대한 검교정 곡선을 표시한다.

제3도는 CEA-테스트에 대한 검교정 곡선을 표시한다.

제4도는 T4-테스트에 대한 검교정 곡선을 표시한다.

제5도는 상이한 양의 고정화 스트램타비딘을 사용한 항-HBs 측정에 대한 검교정 곡선을 표시한다.

본 발명은 면역학적으로 활성인 반응 성분의 하나가 결합되어 있는 고체상(sold phase)을 사용함에 의해서 이종(heterogeneous)명역분석의 원리에 따라 면역학적으로 검출가능한 물질을 측정하는 방법, 이것에 적당한 반응 용기 및 표준 반응 용기의 사용에 관한 것이다.

면역분석 방법은 종종 특이적으로 결합될 수 있는 물질을 측정하는데 이용된다. 이 방법에서 서로 특이적으로 결합할 수 있는 물질쌍의 성분중 하나는 공지된 방법으로 라렙링(labelling)된 그것의 특정 수용체(recetor)와 반응한다. 이러한 두 물질의 복합에는 복합체에 대해, 또는 복합체의 두부분중 하나에 대해 특이적인 수용체와 반응할 수 있다. 이러한 면역학적 방법에 대해 여러 변형방법이 있다. 이러한 방법에서, 수용체중 하나가 고체상에 결합되어 존재한다면 유리하다. 이것은 결합된 반응 성분 및 결합되지 않은 반응성분의 분리를 용이하게 한다. 특이적으로 결합할 수 있는 물질의 측정을 위해, 고체상엘 결합되어 있는 라벨링된 반응 성분의 양 또는 용액에 존재하는 라벨링된 성분의 양을 측정하여 공지된 방법에 따라 측정될 반은 성분의 양과 관련시킨다. 내부 표면에 반응 성분이 결합되어 있는 미량 적정 플래이트 또는 플라스틱튜브, 또는 외부 표면에 반응 성분이 결합되어있는 구 (sphere)를 일반적으로 면역학적 방법에 대해 고체상으로서 사용한다.

이 방법에서 각각의 표면에 대한 특이적 반응 성분의 결합은 이것이 특이적으로 결합할 수 있는 물질에 특이적으로 결합하는 그것의 능력을 잃지않도록 하는 방법으로 실행되어야한다. 이런이유 때문에 반응 성분은 보통 흡착력으로 고체상에 결합된다. 그러므로 결합을 중개하는 결합제(coupling agent)에 의해 반응성분을 고체상에 결합시키는 것이 이미 제안되었다. 이 방법에서 결합제에 대한 반응 성분의 결합이 특이적으로 반응하는 분자의 부위를 파괴하지 않거나 또는 반응 성분의 반응 부위가 고체상에서 떨어져 그것의 결합 성분쪽으로 면해있도록 하는 방법으로 결합됨에 주의해야 한다.

이러한 공지된 모든 방법들의 단점은 각각의 특이적 반응을 위한 특별한 고체상이 제공되어야한다는 것이다. 이것은 각각의 개별 테스트에 대해 다른 고체상을 제조하고, 저장하여 측정을 위해 사용해야 함을 의미한다.

그러므로 여러가지 상이한 검출방법에 적당한 반응 용기와 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 통상적인 임상 진단을 위해 호르몬, 종양 마커(marker)뿐만아니라 감염, 알레르기 또는 수태에 대한 파라미터(parameter)같은 여러 상이한 파라미터가 단일 혈액 샘플로 부터 측정된다. 측정될 상기 파라미터들의 농도는 광범위하다. 예를들어 TSH 및 프롤락틴 같은 저농도의 파라미터는 10^-10-10^-12mol/1 범위이며 T₃및 T₄와 같은 고농도의 파라미터는 약 10^-7-10^-8mol/1 의 농도이다. 각각의 측정을 위해 매회 상이한 튜브를 사용하지 않고 모든 측정을 위해 표준 반응용기를 사용할 수 있다면 바람직할 것이다.

이러한 목적은 면역학적으로 활성인 반응 성분중 하나가 결합되어 있는 고체상을 사용함에 의해 이종 면역분석의 원리에 따라 면역학적으로 검출가능한 물질을 측정하는 방법으로 성취되는데, 내부면에 스트렙타비딘 또는 아비딘의 용량 1ml당 0.1-2.51μg 존재하는 양으로 결합되어 있는 반응 용기를 고체상으로 사용한다. 상기 예시된 양은 면역학적 반응의 과정동안에 비오티닐화된 단백질 또는 합텐의 형태로 결합 성분에 접근할 수 있는 스트렙타비딘 또는 아비딘에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 고체상에 고정화되어 있는 항체나 항원일 수 있는 수용체가 비오틴과 결합되는 모든 측정방법에 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 고체상에 결합된 스트렙타비딘 또는 아비딘 각각은 모든 튜브 물질에 잘 접착하며 이러한 결합은 세정제에 대해 안정하다. 여러가지 면역학적 방법을 평가하기 위해 필요한 검교정 곡선(calibration curve)를 만드는 과정에서, 고체상에 결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘은 정확하게 증가하는 작은 블랭크 좌표를 지닌 가파른 검교정 곡선을 나타낸다. 또 다른 이점은 피복된 스트렙타비딘의 양에 있어서의 변화가 측정 결과에 거의 영향을 주지 않는다는 것이다. 본 발명에 따른 방법의 특별한 이점은 결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘의 양을 고체상이 이종 면역분석의 원리에 따른 모든 지방법에 사용될 수 있도록 조절할 수 있다는 것이다. 또 다른 이점은 여러 물질, 특히 항체뿐 아니라 항원을 본 발명으로 동시에 측정할 수 있다는 것이다. 이것은 실시예7에서 더욱 상세하게 설명될 것이다.

특히 바람직한 구체예에서 고체상으로서 사용된 반응 용기는 라벨의 광도 측정을 위한 큐베트(cuvette)로서 동시에 사용된다. 단지 하나의 용기가 전체 반응을 실행하는데 필요하므로 이것은 특히 유리하다. 이런 경우에 반응 용기는 이것이 서로 마주보는 두개의 광투과성 월(wall)부분을 갖도록 구성되어 있다. 전체 월 부분을 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 피복시킬 수 있다.

본 발명에 따라 내부 표면에 스트렙타비딘이나 아비딘이 결합되어 있는 반응 용기를 고체상으로서 사용한다. 스트렙타비딘 또는 아비딘의 결합은 당업계에 공지된 방법(EP 12 22 09)으로 실행된다.

스트렙타비딘 또는 아비딘은 고체상에 직접 결합되거나 또는 결합을 중재하는 물질이나 스페이서(spacer)에 의해 결합될수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 스트렙타비딘 또는 아비딘을 분자량이 약 500000이상인 가용성 단백질에 결합시킨 다음 이 결합체를 예를 들어 특허 출원 제 P3640412.8호에 기재된 바와같은 소수성 고체상에 흡착시킨다. 소수화된 단백질을 사용하는 것이 바람직하다.

이러한 소수화는 가열, 산, 변성화제 및/또는 캐오트로픽(chaotropic) 이온으로 처리함에 의해 및/또는 소수성 화합물에 화학적으로 결합시킴에 의해 행해질 수있다. 이들 시약으로 처리하므로써 분자량이 또한 증가된다. 분자량의 증가는 또한 이기능 또는 다기능 단백질 시약으로 가교결합시킴에 의해 이루어질 수 있다.

상기 산으로서 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 유산 또는 염산을 사용할 수 있다. 농도는 10분-16시간의 반응 시간에 따라 1-100mm mol/1이다.

적당한 케오트로픽 이온은 예를 들어 티오시아네이트, 요오드화물, 불화물, 브롬화물, 과염소산염 및 황산엽이다. 적당한 변성화제는 예를 들어 구아니딘 하이드로콜로라이드 또는 요소이다. 통상 10mmol/1-6mol/1의 농도를 사용한다.

소수성 화합물로 유도체화하기 저분자량 또는 고분자량 형태의 가용성 지방산, 리포이드 뿐아니라 폴리스티렌의 가용성 공중합체 또는 폴리 프로필렌 글리콜 같은 합성 중합체가 바람직하게 사용된다. 이러한 유도체화는 당 업계에 잘 알려진 방법으로 실행된다.

이기능 또는 다기능 화합물에 의한 가교결합은 공지된 단백질 결합 시약을 사용해 행해진다. 이들은 같거나 다를 수 있는 최소한 2개의 기능기를 같은 화합물이며 이들 기능기에 의해 단백질의 기능기와 반응할 수 있는 화합이다. 말단에 숙신이미드, 말레이미드, 및-또는 알데하이드 그룹이 있는 알킬 사슬로 구성된 화합물을 사용하는 것이 바람직하다. 단백질은 공지 방법으로 가용성 단백질과 이기능성 또는 다기능성 화합물을 반응시킴에 의해 이기능 또는 다기능 화합물과 가교결합된다.

소수성을 증가시키기 위해 및/또는 가교결합을 위해, 분자량이 10000-700000인 단백질을 사용하는 것이 바람직하다. 특히 소의 혈청 알부민, 리파제 또는 면역-Υ-글로불린이 바람직하다.

다음에 스트렙타비딘 또는 아비딘을 공지된 방법을 이용해 단백질에 결합시킨다. 적당한 결합 방법이 예를 들면 Ishikawa, J., Immunoassay4 (1983), 209-327에 기재되어있다.

스트렙타비딘이나 아비딘과 단백질로부터 얻은 복합체를 고체상으로서 제공된 플라스틱 표면상에 흡착시킨다. 단백질과 스트렙타비딘이나 아비딘의 복합체를 소수성 고체상에 흡착시키기 전에, 고체상을 화학적 또는 물리적으로 처리하는 것이 또한 가능하다. 그러므로 예를 들어 플라스틱 표면을 미리 팽윤시키거나 공지된 방법으로 활성화시킬 수 있다. 고체상에 대한 흡착 결합은 강하고 약한 상호작용, 소수력, 쌍극자간작용 또는 이온-쌍극자 작용으로 일어난다.

가용성인 소수성 단백질의 표면장력보다 작은 표면장력을 지닌, 즉 단백질보다 더 수소성인 담체 물질로 만들어진 반응 용기는 소수성 고체상으로서 특히 적당하다. 표면장력이 40erg/㎠인 담체 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 특히 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 테프론, 폴리아미드, 스티렌과 아크릴로니트릴의 공중합체, 유리 및 셀룰로스 제품이 적당하다.

본 발명에 따라 제조된 고체상 물질은 여러 가지 다른 파라미터의 측정에 사용된다. 이 방법에서 측정될 파라미터에 결합할 수 있는 물질을 비오틴과 결합시키고 이것을 고체상에 결합된 스트렙타비딘이나 아비딘과 결합시킨다. 이것에 의해 면역분석 방법의 결과로서 형성된 특이적 복합체를 고정화시킨 다음 측정할 수 있다. 그러므로 본 발명에 따라 특이적으로 결합할 수 있는 비오티닐화된 물질을 결합시키기 위해 반응 용량 1ml당 0.1-2.5㎍의 양으로 스트렙타비딘 또는 아비딘 각각을 고체상에 결합시킨다.

상기 반응 용량은 샘플 용량과 테스트 시약 용량의 총합을 표시한다.

특이적으로 결합할 수 있는 비오티닐화된 물질과 결합시키기 위해 1-2㎍의 스트렙타비딘 또는 아비딘일 존재하도록 고체상 물질을 피복시키는 것이 바람직하다. 특이적으로 결합할 수 있는 비오티닐화된 물질의 양은 반응 용량 1ml당 10^-6-10^-8mol 범위내이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 서로 마주보고 있는 광투과성 월 부분과 액체를 주입하기 위한 내부 월 부분내에 적어도 부분적으로 아비딘이나 스트렙타비딘으로 피복된 월을 갖고 있는 반응 용기인데, 여기서 액체를 주입하기 위한 상기 용기의 내부공간과 피복물의 스트렙타비딘이나 아비딘 함량은 반응 용량 1ml당 0.1-2.5㎍의 스트렙타비딘 또는 아비딘이 존재하도록 상호 관련하여 결정된다.

이런 반응 용기는 본 발명의 방법을 실행하는데 특히 적당하다. 이것이 서로 마주보고 있는 광투성 월 부분과 스트렙타비딘이나 아비딘의 피복물을 지니므로, 이것은 반응을 시행하고 광도를 측정하는데 동시에 사용될 수 있다. 반응 용량 1ml당 0.1-2.5㎍의 스트렙타비딘 또는 아비딘을 피복시키므로써 이 반응 용기를 이종 면역분석의 원리에 의거하여 다른 파마미터를 측정하는데 사용할 수 있다.

상기 반응 용기는 고체상을 구성한다. 이것은 플라스틱, 유리등과 같이 상기 목적에 일반적으로 사용되는 재료로 구성된다. 상기 광투과성 월 부분은 또한 공지의 재료로 구성된다. 이 경우에 폴리스티렌, 폴리스티렌의 공중합체, 폴리카보네이트, 콜리아크릴레이트 및 폴리메타크리레이트가 특히 바람직하다.

스트렙타비딘 또는 아비딘은 직접 피복되거나 또는 스페이서에 의해 피복될 수 있다.

예를 들어 스트렙타비딘이나 아비딘을 분자량이 500000이상인 가요성 단백질에 결합시킨 다음 반응 용기의 내부 표면에 흡착시키는 것이 적당하다.

본 발명의 구체예는 또한 명역분석의 원리에 따른 방법을 이용해 여러 가지 파라미터를 측정하기 위한 표준 반응 용기를 사용하는 것인데, 이것은 테스트 반응에 대해 반응 용량 1ml당 0.1-2.5㎍의 스트렙타비딘이나 아비딘이 사용되도록 하는 양으로 스트렙타비딘이나 아비딘을 내부 표면에 결합시킨 용기로 구성된다.

본 발명에 따라 스트렙타비딘이나 아비딘이 고체상으로써 제공된 반응 용기의 내부 표면에 대한 양호한 접착성으로 영구 결합되어 있는 반응 용기 및 방법이 제공된다. 접착성이 양호하여 세정제를 부가해도 물질이 분리되지 않는다. 본 발명에 따라 제공된 반응 용기는 일반적으로 사용될 수 있으며 여러 가지 파라미터의 측정방법을 실행하는데 적당하므로 통상적인 측정법의 실시를 용이하게 한다.

본 발명은 도면과 다음 실시예로 설명된다.

실시예에서 사용한 TSH에 대한 단클론(monoclonal)항체는 영국, 포토 다운에 소재하는 유럽의 동물세표 배양물 기탁기관(European Collection of Animal Cell Cultures)에 기탁번호 ECACC 87 122 201 및 ECACC 87 122 202로 기탁된 하이브리도마 셀 라인으로 부터 유래한다.

[실시예 1]

본 발명에 따른 복합체의 고체상에 대한 결합 및 소수성 단백질과 스트렙타비딘의 고체상에 대한 결합을 조사하였다.

써모(thermo)-BSA로서 칭해지는 열에 의해 응집된 BSA를 다음과 같이 제조하였다:1g BSA를 pH7.0인 50mmol/1 인산칼륨 용액 100ml에 용해시키고 70℃까지 가열하며 이것을 이 온도에서 4시간 동안 유지시키면 서서히 교반하였다. 이 용액을 냉각시키고 여과하며 50mg/ml의 농도로 조절하였다. 그후 이것을 30배 용량의 2차 증류수에 대해 투석시켰다.

써모-BSA와 스트렙타비딘의 복합체 제조 : 스트렙토마이시스 아비디니 (streptomyces avidinii)로부터 스트렙타비딘을 분리하고 말레이미도-헥사노일-N-하이드록시-숙신이미드에 의해 말레이미도 그룹을 함유하는 스트렙타비딘으로 전화시켰다. 써모-BSA를 S-아세틸-머캅토-숙신산 무수물과 반응시키고 보호된 SH-그룹을 하이드록실아민의 부가로 이탈시켰다. 다음에 말레이미도 그룹을 함유하는 스트렙타비딘과 SH-그룹을 함유하는 써모-BSA를 혼합하여 원하는 복합체를 얻었다.

-폴리스티렌으로 만들어진 플라스틱 튜브를 스트렙타비딘-써모-BSA-복결합체로 피복시켰다. 1.5ml의 스트렙타비딘-써모-BSA-용액으로 18-24시간동안 튜브를 피복하였으며, 두 성분의 몰비는 20℃의 pH7.4인 40mmol/1 인산나트륨 완층액내의 1.8 : 1(10㎍/ml)이었다.

튜브를 흡인시킨 후에 이것을 2% 수크로스, 0.9%염화나트륨 및 0.3% BSA를 함유하는 1.8ml의 용액으로 20℃에서 30분간 재피복시켰다. 건조(20℃ 및 40% 상대습도에 24시간)후에 튜브는 사용할 수 있는 상태였고 안정하였다.

[실시예 2]

TSH에 대한 1단계 테스트

비오티닐화된 단클론 항-TSH-항체를 제조하였다. 이런 목적을 위해 ECACC 87 122 201인 항-TSH-항체를 일반적인 방법으로 비오틴과 반응시키므로써 아미노 그룹에 의해 상기 결합이 실행되었다. 항체와 비오틴을 1:16의 비율로 사용하였다. 이렇게 얻은 400ng의 비오티닐화된 항체를 1ml 완충액(40mmol/1 인산나트륨, 0.5% Pluronic F68, 0.2mol/1 주석산나트륨, 및 0.01% 페놀)에 용해시킨 다음 과산화효소와 결합된 75mU의 항-TSH-항체(ECACC 87 122 202) 및 공지량의 TSH를 함유하는 200μ1 샘플 용액 또는 표준 용액과 함께 실시예1에 기술된 피복튜브내에서 2시간동안 인큐베이트팅(incubating)시켰다. 그후 이것을 물로 3번 세턱하고 1ml의 TBTS-기질용액을 부가하였다. 1시간 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과를 제1도에 표시하였다. 이것으로써 0.1㎍/ml 보다 많은 테스트 용량을 사용할 때 고정화 스트렙타비딘을 이용해 만족한 결과를 얻음을 알았다.

본 테스트에 사용된 비오티닐화된 항체의 결합에 필요한 스트렙타비딘을 측정하였다. 이것을 위해 자유롭게 사용할 수 있는 비오틴의 양을 Bayer, Edward A., Meier-Wilchek, Analytical Biochemistry 154(1986), 367-370에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 1㎍의 항체가 1 : 15인 항체대 비오틴의 비로 비오티닐화된다면 (Guesdon, I,L., J. Histochem. Cytochem. 27 (1979) 1131-1139), 항체 1mol당 1-2mol의 비오틴을 결합에 사용할 수 있는데, 즉 항체 1㎍당 1.5-3ng 비오틴을 자유롭게 사용할 수 있다.

10㎍/ml 스트렙타비딘-써모-BSA-복합체 (실시예1)로 피복된 튜브는 방사성¹⁴C-비오틴으로 측정했을 때 테스트 용량 1ml 당 15-20ng의 비오틴에 대한 결합능력을 가졌다.

비오티닐화된 면역-γ-글로불린에 대한 스트렙타비딘 튜브의 결합 능력은 테스틀 용량 1ml당 1.7-2㎍이다. 이러한 측정을¹²⁵I-라벨링된 γ-글로불린 (MeConahey and Dixon 1966, Int. Arch. Allergy 29-185의 방법에 따라 라벨링됨)으로 실행하였다.

[실시예 3]

프롤락틴 테스트

프롤락틴을 1단계-샌드위치-면역분석으로 측정하였다. 다음 조성의 시약을 검출하기 위해 사용하였다.

프롤락틴에 특이적인 단클론 항체와 POD의 복합체 50mU/ml

인산염 완충액(pH7.0) 10mmol

Pluronic F65(폴리옥시에틸렌 폴리프로필렌) 0.5%

주석산나트륨 0.2mol/1

페놀 0.01%

소의 혈청 알부민 0.2%

프롤락틴에 대한 비오티닐화된 단클론 항체 400mg/ml

두 개의 단클론 항체는 단지 프롤락틴을 인식하여 프롤락틴의 여러 에피로프(epitoep)에 대해 대항하는데 필요하다. 1ml의 상기 시약과 50μ1의 샘플을 실시예1에 따라 얻은 스트렙타비딘-써모-BSA-복합체로피복된 풀리스티렌 튜브내 상온에서 30분간 인큐베이팅시켰다. 그후 이것을 물로 3번 세척하였다.

검출 반응을 위해 1ml ABTS^R-기질 용액을 부가하였다. 30분후에 405nm에서 흡광도를 측광법에 따라 측정하였다. 결과를 제2도에 표시하였다.

ABTS^R: 2,2′-아지노-디-[3-에틸벤즈티아졸린-6-서포네이트]-디-암모늄 염

[실시예 4]

CEA 테스트

1단계-샌드위치-면역분석에 의해 CEA를 샘플 용액내에서 측정하였다. 사용한 시약의 조성은 다음과 같다.

CEA에 대한 단클론 항체와 POD의 복합체 120mU/ml

인산염 완충액(pH7.0) 10mmol/1

Pluronic F68 0.5%

주석산나트륨 0.2mol/1

페놀 0.01%

소의 혈청 알부민 0.2%

CEA에 대한 비오티닐화 단클론 항체 500ng/l

CEA에 대한 두 개의 단클론 항체에 대해서는 단지 이것이 CEA를 인식하여 이것 각각이 CEA의 다른 에피토프에 대항하게 되는 것이 요구된다.

1ml 시약과 100μ1 샘플을 실시예1에서 얻은 스트렙타비딘-써모-BSA로 피복된 폴리스티렌 튜브내 상온에서 2시간 동안 인큐베이팅시켰다. 그후 이것을 물로 3번 세척하였다. 검출반응을 위해 1ml ABTS^R-기질용액을 부가하였다. 1시간 후에 흡광도를 405nm에서 측광법으로 측정하였다. 결과를 제3도에 표시하였다.

[실시예 5]

T4 테스트

T4를 비오티닐화된 항-T4-항체를 이용해 경쟁적인 면역분석으로 측정하였다. 이런 목적을 위해 다음과 같이 조성된 500μ1 시약과

티록신-POD-복합체(EP 209 155에 따라 제조) 100mU/ml

바비튜레이트 120mmol/1

인산염 완충액(pH8.6) 18.2mmol/1

ANS(8-아닐리노-1-나프탈린설폰산) 0.04중량%

소의 혈청 알부민 0.2중량%

20μ1의 샘플을 실시예 1에 따라 얻은 스트렙타비딘-써모-BSA-복합체로 피복된 폴리스틸렌튜브내 상온에서 10분간 인큐베이팅시켰다. 그후 다음과 같이 조성된 제2시약 500μ1를 부가하고 상온에서 30분간 더 인큐베이팅시켰다.

T4에 대한 비오티닐화된 다클론 항체 1㎍/ml

인산염 완충액(pH8.6) 120mmol/1

ANS(8-아닐리노-1-나프탈린설폰산) 0.04중량%

소의 혈청 알부민 0.2중량%

이것을 물로 3번 세척한 후에 1ml의 ABTS^R-기질 용액을 부가하고 상온에서 30분간 인큐베이팅시켰다.

그후에 흡광도를 405nm측광법으로 측정하였다. 결과를 제4도에 표시하였다.

[실시예 6]

항-HBs테스트

HBs-항체를 1단계-샌드위치-면역분석으로 측정하였다. 다음과 같은 조성을 갖는 시약을 검출하는데 사용하였다.

POD와 HBs-항원의 복합체 60mU/ml

인산염 완충액(pH7.0) 40mmol/1

주석산나트륨 200mmol/1

Pluronic F68 0.5중량%

페놀 0.01중량%

소의 혈청 알부민 0.2%

소의 IgG 0.1중량%

비오티닐화된 HB_SAg(Immunol. Letters8(1984), 273에 따라 제조) 150ng/ml

1ml의 상기 시약과 200μ1의 샘플을 스트렙타비딘-써모-BSA의 복합체로 피복된 폴리스티렌 튜브내 상온에서 4시간 동안 이큐베이팅시켰다. 이것을 물로 3번 세척한 후에 검출 반응을 위해 1ml의 ABTS-기질용액을 부가하였다. 60분후에 흡광도를 422nm에서 측정하였다.

항-HB_S-테스트를 상이한 양의 고정화 스트렙타비딘을 사용해 튜브에서 실행하였다. 결과를 제5도에 표시하였다. 본 발명에서 사용한 양보다 많은 양으로 스트렙타비딘을 사용할 때 상기 테스트의 감도가 상당히 감소하게됨을 알 수 있다.

[실시예 7]

항-HIV테스트

HIV-항체를 2단계-샌드위치-면역분석으로 측정하였다. 검출하기 위해 다음과 같은 조성을 갖는 시약을 사용하였다.

[시약 1]

하나 이상의 비오티닐화된 HIV-항원 각각 10^-7mmol/1

인산염 완충액(pH7.0) 40mmol/1

염화나트륨 0.9중량%

소의 혈청 10부피%

항원으로서 다음 것들을 사용하였다 : HIV1-(gp41-rek., Centocor^tm-p121) 및 HIV1-p24(p24-rek., Contocor^tm-pg2)에 상응하는 유전공학에 의해 제조된 HIV-항원, HIV-gp41(gp41-pep, Wang 등 , PNS, 83, 6159, 1986) ALC HIV2-gp32(gp32-pep, Gnann, J.W. 등, Science, 237, 1346, 1987)로부터 화학적으로 합성된 펩타이드, 이들 항원을 Leary 등의 PNAS, 80, 4045(1983)에 기재된 바와 같이 비오틴으로 라벨링하였다.

[시약 2]

사람의 면역글로블린에 대한 양의 하체와 POD의 복합체 20mU/ml

인산염 완충액(pH7.0) 40mmol/1

Tween 20 0.05중량%

소의 혈청 알부민 0.2중량%

소의 IgG 0.2중량%

1ml의 시약1과 10μ1 사람의 혈청이나 혈장을 스트렙타비딘-써모-BSA의 복합체로 피복된 폴리스티렌튜브내 상온에서 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 그후에 튜브를 물로 3번 세척하고 1ml의 시약 2와 함께 상온에서 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 튜브를 다시 물로 3번 세척하고 검출 반응을 위해 1ml의 ABTS 기질 용액을 부가하였다.

60부후에 흡광도를 422nm에서 측광법으로 측정하였다.

항-HIV-테스트를 각각의 HIV-항원 및 항원의 조합체를 사용해 실행하였다. 결과로서, 스트렙타비딘-써모-BSA의 복합체로 피복된 폴리스티렌 튜브내에서의 테스트 실시는 항체들이 동일한 비루스에 대한 것이건, 또는 여러 가지 비루스에 대한 것이건, 또는 문제의 항원에 대한 것이건에 관계없이 각각의 항원-특이 항체의 측정뿐아니라 여러 가지 항체 또는 항체 혼합물의 동시측정에 적당하다고 입증되었다.(스크리닝 테스트 : 표 1)

[표 1]

Claims

내부표면에 스트렙타비딘이나 아비딘이 반응 용량1ml당 0.1-2.5㎍존재하는 양으로 결합되어 있는 반응용기를 고체상으로 사용하는 것을 특징으로하는, 면역학적으로 활성인 반응성분중 하나가 결합되어 있는 고체상을 사용함에 의해 이종 명역분석의 원리에 따라 면역학적으로 검출가능한 물질을 측정하는 방법.
제1항에 있어서, 월(wall)의 내부 표면이 스트렙타비딘이나 아비딘으로 피복된 큐베트(cuvette)가 반응 용기로서 사용되는 방법.
전기한 항중 어느 한 항에 있어서, 스트렙타비딘 또는 아비딘을 분자량이 약500000이상인 가용성 단백질에 결합시킨 다음 스트렙타비딘이나 아비딘과 단백질과의 복합체를 소수성 고체상에 흡착시키는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 여러 가지 물질 특히 여러 항체가 동시에 측정되는 방법.
서로 마주보고 있는 광투과성 월 부분을 갖고 있으며 액체를 주입하기 위한 내부 월 부분내에 적어도 부분적으로 아비딘이나 스트렙타비딘으로 피복시킨 월을 갖고 있는 반응 용기에 있어서, 액체를 주입하기 위한 용기의 내부 공간과 피복물의 스트렙타비딘이나 아비딘 함량은 반응 용량 1ml당 0.1-2.5㎍의 아비딘이 존재하도록 상호 관련하여 결정되는 것을 특징으로 하는 반응 용기.
제5항에 있어서, 분자량이 약 500000이상인 가용성 단백질에 의해 스트렙타비딘 또는 아비딘이 고체상에 결합되는 반응 용기.
제5항 또는 제6항에 있어서, 반응 용기가 큐베트인 반응 용기.
테스트 반응에 대해 반응 용량 1ml당 0.1-2.5㎍의 스트렙타비딘이나 아비딘이 사용되도록 하는 양으로 스트렙타비딘이나 아비딘이 내부 표면에 결합되어 있는 용기로 구성된 표준 반응 용기를 면역분석 원리에 따른 방법을 이용해 여러 가지 파라미터를 측정하는데 사용하는 방법.