JPS59196093A - インスリンの発現方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 （発明の分野） バイブリドＤＮＡ技法は、遺伝子の転写及び翻訳による
所望のポリペプチド生成物の製造を可能にする°。はと
んどの場合、注目するポリペプチド生成物は哺乳動物遺
伝子に関連するが、宿主細胞の選択はまず原核生物及び
下等真核生物、例えば菌類、特に酵母に向けられてきた
。これは増殖及び遺伝的操作が簡単なためである。所望
のポリペプチドの効果的な産生を供するＤＮＡ構成を形
成するするための方法の開発においては、要求される通
りにＤＮＡ断片を挿入しそして切り出すことが可能な方
法を開発しなければならない。−しばしば、種種の制御
シグナル、複製系、マーカー、及び注目する１又は複数
の構造遺伝子が異る分離源に由来する。従って、該当す
る配列中でエンドヌクレアーゼ切断、挿入及び切出しを
可能にし、複数のＤＮＡ断片を正しい方向に且つ適切な
空間的関係において配列せしめる方法を開発しなければ
ならない。さらに、目的とする構造遺伝子の効果的な転
写、翻訳又は壇加を妨害するか又は妨害する可能性があ
る配列の存在を回避しなければならず、又はこれらの配
列が不利益な効果を有しない場合にのみその存在が許さ
れる。

ＤＮＡ構成の調製に関する方法のほかに、制御シグナル
及び発現生成物についてコードする配列の選択、これら
の個々の相互作用、宿主に対するこれらの影響、宿主の
エネルギーが目的ポリペプチドの産生に用いられる効率
、及びポリペプチド生成物の分離の容易さも考慮に入れ
られる。従って、特定のポリペプチドの製造のための方
法の個々の開発は、実験計画、手順の組織化及び研究に
おける知的な実践となる。

（従来技術の記載） ヒト−インスリンのヒト−ＤＮＡ配列ｉｊ、Ｂｅ１１等
、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８２：　５２５−５２７
に見出される。ラットの「プレ」−プロインスリンポリ
ペプチド断片の細菌中での産生が米国特許第４．３３８
．３９７号に記載されている。Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒ
ｓｋｏｗｉｔｚにｅｌｌ　（１９８２）　３０：９３３
−９４３は、成熟α−ファクターの４個のタンデムコピ
ーを含有するα−ファクター前駆体を予想し、配列を記
載しそしてプロセシング機構を仮定している。

Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８１年に
おけるＣｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｍｅｅ
ｔｉｎｇ　ｏｎ　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ　ｏｆＹｅａｓｔのＩＡＰｕｔａｔｉｖｅ　
Ａｌｐｈａ−Ｆａｃｔｏｒ　　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　　
Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｆｏｕｒ　Ｔａｎ−ｄｅｍ　Ｒ
ｅｐｅａｔｓ　ｏｆ　Ｍａｔｕｒｅ　Ａｌｐｈａ−Ｆａ
ｃｔｏｒ　ｊと題する要約紙は、α−ファクターについ
てコードする配列、及びこれらの２個の配列の間のスペ
ーサーを記載している。米国特許第４，３３８．．３９
７号の第３及び第４欄は有用な定義を与えており、この
定義を引用によりこの明細書に組み入れる。

発明の要約 酵母宿主中で「プレ」−ゾロインスリンを産生せしめ、
そしてプロセシングされた「プレ」−ゾロインスリンを
培地中に分泌せしめるための方法及び構成が提供される
。このＤＮＡ構成は種々の分離源に由来するＤＮＡ配列
を連結することによって形成され、この構成は酵母宿主
中で安定に複製されそしてプロセシングされた「プレ」
−ゾロインスリンの栄養培地中への効率的な高レベル産
生をもたらす。他方、この生成物は高収率で分離され得
る。

特定の態様の記載 酵母宿主中で哺乳動物の「プレ」−プロインスリンを効
果的に産成し、そして「プレ」−プロインスリンをプロ
セシングする新規なりＮＡ構成が提供される。この構成
は、哺乳動物「ｆし」−ゾロインスリンの転写及び翻訳
、並びにこのポリペプチド生成物のプロセシング及び培
地への分泌をもたらす。従ってこの構成は、酵母宿主中
で安定な保持を可能にする複製系；効果的なプロモータ
ー；プロインスリンについてのコード領域に連結された
リーダー及びプロセシングシグナルを含有する構造遺伝
子（このゾロインスリンについてのコード領域は分泌リ
ーダー及びプロセシングコード配列とリーディングフレ
ームが一致している）；及びこの構造遺伝子から下流に
位置するターミネータ−配列を含む。場合によっては、
再転制御、遺伝子の増幅、転写の外的制御等のための他
の配列を有することができる。

「プレ」−プロインスリン遺伝子とは、ヒト−プロイン
スリンについてコードし、酵母宿主により効率的に認識
されるリーダ配列及びプロセシングシグナルとリーディ
ングフレームが一致している遺伝子を意味する。すなわ
ち「プレ」とは、酵母宿主と関連する分泌及びプロセシ
ングシグナルを意味し、ゾロインスリン遺伝子と共に天
然に存在し天然のプレプロペプチドをプロインスリンに
プロセシングするためのヒトの配列と区別される。

この構成の調製においては、個々の配列をあらかじめ定
められた順序で一緒にすることにより、存在する複数の
配列が各段階において妨害されそれらの機能が不都合な
影響を受けることがないこと、及び導入される各配列が
他の配列との関係において適切に位置し、これらの個々
の機能が満たされ得ることを保証することが必要でおる
。さらに、構成を有利に調製するためにアダプター分子
を使用することができる。

使用されるゾロインスリン遺伝子は染色体ＤＮＡ　。

ｃ　ＤＮＡ　％合ｇＤＮＡ、又はこれらを組合わせたも
のであってよい。プロインスリン遺伝子は哺乳動物遺伝
子でアリ、そして制御シグナル、リーダー及びプロセシ
ングシグナル、並びに転写ターミネータ−シグナルは宿
主に由来しそして宿主によって認識される配列であるで
あろうから、幾つかの配列をコネクター配列又はアダプ
ター配列によｐ連結するのが有用であろう。すなわち、
制御部位を適切に選択することによｐ、コード鎖の内側
であり５′−末端の近くにおいて制限（ｒｅｓｔｒｉｃ
ｔ　）され幾つかの塩基対が欠失したプロインスリン遺
伝子を得ることができる。同様にして、リーダー及びプ
ロセシングシグナル配列を、コード鎖の内側であって３
′−末端の近くで制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔ　）　して多
数の塩基対を欠失せしめることができる。

（特にことわらないかぎゃ、５′−及び３′−の標示は
コード鎖について用いる。）アダプターが！ロインスリ
ン遺伝子の適切なリーディングフレームをもたらすよう
に制御部位が選択される。

アダプターは合成的に調製することができるので、アダ
ゲタ−のコドンは、天然に存在する哺乳動物のコドンで
はなく、酵母宿主により選択的に用いられるコドン、例
えば解糖系酵素の遺伝子中に存在するコドンであること
が好ましい。アダプターはコード配列中に約２０〜４０
、さらに一般的には約２５〜３５の塩基を有し、そして
接着末端又は平滑末端、好ましくは接着末端を有する。

好ましくは、アダプターの末端は異なる接着末端を有し
、該アダプターの正しい方向付けを保証する。従って、
連結されるべき２つの末端も文具なる末端を有するであ
ろう。

リーダー及びプロセシングシグナルのために、酵母由来
の天然のＤＮＡ配列を使用することができる。酵母によ
り分泌されるポリ４ゾチドにはα−ファクター、ａ−フ
ァクター等が含まれる。

この発明を、酵母α−ファクターの制御シグナル、リー
ダー及びプロセシングシグナル、並びに転写ターミネー
ターと共に、プロインスリンのｃＤＮＡを用いて説明す
る。

酵母α−ファクターは旦す型■及び旦す■によυ制限す
ることができる。Ｈｋ　ｎｄ　ＩＩＩは、α−ファクタ
ーのプロセシングシグナル中ｇｌｕコドンのコード鎖の
第２塩基において切断し、他方認識配列はｇｌｕコドン
を満たしそしてａｌｔをコードする。

Ｓａｌ　１部位はα−ファクター転写ターミネータ−に
先行する。

ヒト−プロインスリンｃ　ＤＮＡは、ＥｃｏＲＩにょシ
制限されて、プロインスリンの完全コート配列及びフラ
ンク配列を有する断片（拍：ｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）をも
たらす。足部ＲＩ−肋徂ＲＩ断片を拍」Ｒ■により部分
消化してコード配列の内部を切断することにより、５／
−末端においてコード配列の一部分が欠落した不完全断
片（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）が得られ
る。この塩基対はアダツタ−により与えられ、このアダ
プターは彫副ＲＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片とリーディングフ
レームが適切に一致するようにリーダー及びプロセシン
グシグナル断片（Ｈｉｎｄｌ１部位）に結合する。アダ
プターは単一断片として調製することができ、又は２以
上の単一鎖を連結することによって調製することができ
る。アダプターが、プロセシングシグナル及び発現され
るべき遺伝子の必要なコドンを再構成する。

プロインスリンのｃＤＮＡ遺伝子を含有する断片の他゛
端にはＥｃｏ　Ｒ１認識部位が存在する。α−ファクタ
ー遺伝子はｆ−ｍｅｔコドンの第１塩基から５３３番目
の塩基にＳａｌ　ｌ制限部位を有する。小型の以遠Ｒ１
−Ｓａｌ　ｌアダプターがこの３′−非コード領域にお
いて２個の末端を連結するために機能し、そしてそれ由
に構成にα−ファクター転写ターミネータ−を復原する
ために機能する。

便利には、プロモーターとして、リーダー配列と関連す
るプロモーターを使用することができる。

この場合、プロモーター及びリーダー配列の両者を効果
的な転写のために適切である空間的関係において含有す
る５′−ポータプル要素を有ることができる。さらに、
転写ターミネータ−を含めることにより、プロモーター
／リーダー／外来性遺伝子／ターミネータ−から成る「
カセット」を形成することもできる。このことは、酵母
由来の無傷の遺伝子、並びにこの遺伝子の上流及び下流
の転写制御配列を含有するＤＮＡ断片（この遺伝子は酵
母宿主によって分泌されるポリペプチドを発現する）を
分離することによって達成される。このことは、α−フ
ァクターを用いてすでに例示した。

プロインスリンｃ　ＤＮＡはそれ自体の終結コドンを有
し、ポリペプチドのＣ−末端が天然のＣ−末端と同一で
あることを保証するであろう。

上記の方法に代えて、天然のプロモーターの代りに転写
制御を可能にする他のプロモーターを使用することがで
きる。このためには、異なるプロモーターを導入するた
めにリーダー配列から上流の領域の配列を決定しそして
／又は制限地図を作成することが必要であろう。ある場
合には、天然のプロモーターを残留せしめ、この天然の
プロモーターの上流又は下流のいずれかに第２のプロモ
ーターを与えることが望ましいであろう。

広範囲の種類のプロモーターを使用することができ、又
は酵母遺伝子から得ることができる。特に好ましいプロ
モーターには、解糖経路における酵累と関連するプロモ
ーター４例えばアルコールデヒドロダナーゼ、グリセル
アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロダナーゼ、ピル
ベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ
、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ
等ためのプロモーターが含まれる。これらのプロモータ
ーを制御配列、例えばオペレーター、レプレッサー及び
デレフレッサーと共に使用することにより、そして無傷
の制御系′ｆｔ有する宿主を使用することによジ、プロ
セシングされた「ブレ」−プロインスリンの発現を制御
することができる。

すなわち、目的ポリペプチドの産生の制御のために棟々
の小有機分子、例えはグルコ−スキ用いることができる
。

また、温度を変えることによって転写を調節することを
可能にする温度感受性変異株を使用することもできる。

すなわち、非許容的温度（ＱＱｎｅ−ｐｅｒｍｉｓｓｉ
ｖｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　）において細胞を増殖
せしめることにより細胞を高濃度に増殖せしめ、この後
温度を変えることによりプロセシングされた「２？し」
−プロインスリンを発現せしめる０その他の能力を構成
中に導入することもできる。

例えば、宿主に対するストレスの際に、増幅されたスト
レスに対して遺伝子のみならず７ランク領域も応答する
場合、遺伝子は増幅をもたらす。このような遺伝子を、
プロモーター及び「ブレ」−プロインスリンの転写制御
をもたらす他の制御遺伝子より上流に導入し、そして酵
母宿主をストレスすることにより、「ブレ」−プロイン
スリン遺伝子をその制御配列と共に含有する数の反復配
列を有するプラスミドが得られる。

代表的な遺伝子にはメタロチオネイン遺伝子及びジヒド
ロフオレートレダクターゼ遺伝子が含まれる。

構成はリーダー配列断片のほかに宿主染色体に相同の他
のＤＮＡ　’ｉｉ含有することができる。プロインスリ
ン遺伝子を染色体に組み込むことが望ましい場合には、
プロインスリン遺伝子構成の周縁に位置し宿主染色体Ｄ
ＮＡと相同の配列を用いて組込みを強化することができ
る。

酵母宿主によ！ｌｌ認識される複製系を用いる。従って
、複製系が酵母宿主にとって本来的なものであることが
好ましい。多数の酵母ベクターがＢｏｔａｔｅｉｎ等、
Ｇｅｎｅ（１９７９）旦：１７−２４により報告されて
いる。２μｍグラスミド複製系を含有するＹＥｐプラス
ミドが特に好ましい。これらのシラスミドは多コピー数
において容易に保持される。以上の方法′に代えて、又
はこれに加えて、ＡＲ８Ｉ及び９忍１の組合わせを用い
て安定な保持を得ることができる。

各操作の後、適当でおれば構成をクローニングして、目
的とする構成を純粋な形でそしてさらに操作するのに十
分な量において得る。好ましくは、原核生物、特に互、
り中でクローニングができるように、シャトルベクター
（すなわち酵母及び細菌の複製開始点を含有するベクタ
ー）を用いる。

シラスミドは、酵母細胞又はスフェロプラストを用いそ
して形質転換のためのカルシウム沈澱ＤＮＡを用いる任
意の便利な手段により、又はその他の常用技法により、
酵母に導入することができる。変性された宿主は、発現
グラスミドを構成するためのベクターに通常備なえられ
ている遺伝的マーカーに従って選択することができる。

栄養要求宿主を用い、グラスミドはこの宿主を補完（ｃ
ｏｍ−ｐｌｅｍｅｎｔ）　Ｌそして原栄養性を付与する
遺伝子を有する。この方法に代えて、適当な殺生物剤、
例えば抗生物質、重金属、毒素又はこれらに類するもの
に対する耐性を、マーカーとしてプラスミドに導入する
ことができる。次に、親細胞をストレスしプラスミドを
含有する細胞を選択する栄養培地を用いることにより選
択を行う。次にプラスミド含有細胞を適当な栄養培地中
に増殖せしめ、そして分泌された目的ポリペプチドを常
法に従って分離する。このポリペプチドをクロマトグラ
フィー、抽出等により精製する。ポリペプチドは培地中
に成熟型として存在するであろうから、目的ポリペプチ
ドを連続的に取り出しながら栄養培地を循環することが
できる。

次に、この発明を具体的に説明するために例を記載する
がこれによりこの発明の範囲を限定するものではない。

ｊｌ（ １、ｐｈｉｎｓ　１−１９のＥｃｏＲＩ消化約７００ｐ
！Ｏｐｈｉｎｓ　１−１９　（ｐＢＲ３２８の旦輩−Ｒ
１部位においてクローニングされた、児全なヒト−ノロ
インスリン遺伝子を含有する５１７ｂｐのｅＤＮＡ　）
を、約１６００ユニツトの貯Ｒ１にューイングランドビ
オラブス）と共に、１ｍｔ中で１３７℃にて約４．５時
間（完了まで）製造者により指定された緩衝条件下でイ
ンキ−ベートした。

（ｐｈｉｎｓ　１−１９は、Ｂｅ１１等、前記、により
記載されたプラスミドがら、Ｐｓｔｌ開裂、Ｂａ１３１
切断、α」ＲＩリンカ−の付加、及びｐＢＲ３２８への
挿入により誘導される。） 凰並Ｒ１−澹四Ｒ１断片を５チ非変性条件下のポリアク
リルアミドダル電気泳動により分離した。

ダルを１μ９／ｍｔのエチジウムプロミド溶液中で約１
０分間染色し、そして長波長ＵＶ光のもとて可視化した
。５１７ｂｐ断片に対応するバンドを切り取り、そして
電気溶出［Ｓｍ１ｔｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
。

（１９８０）灸５：３７１−３８０）にょクグルから分
離した。ＤＮＡを濃縮し、そしてこれを指定された条件
下でエルチップ（Ｅｌｕｔｉｐ　）　−ｄカラムＣ５ｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ１１社）に通す
ことによ！ｌｌ精製した。

２、　　ＥｃｏＲＩ［を用いるＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
　　の　　　ヒα刹Ｒ１−用胆Ｒ１断片（約１７μ９）
を、約３ユニツトのＥｃｏＲｌｌ（ペセスダリザーチラ
ブス）と共に、１７０μ・ｔの容積において、３７℃に
て指定された緩衝条件下でインキュベートした。同量の
アリコートを１８．２１、及び２５分間目に採取した０ ＥｃｏＲＩ［−ＥｃｏＲＩ　（長断片）の　３９２ｂｐ
の且要ＲＩＩ−均徂Ｒ１断片を、前記のごトく、ポリア
クリルアミドダル電気泳動、電気溶出、及びエルチップ
−ｄクロマトグラフィーにより分離した。

３、　　ＥｃｏＲＩ［−ＥｃｏＲＩ断片と合成断片との
−□インスリンコード領域のほとんどを含有するＥｃｏ
Ｒｌ−ＥｃｏＲｉ部分消化断片を、シリコン加工しり１
．５　ｍｌノエッペンドルフ管中で水を蒸発せしめるこ
とにより乾燥した（８０μ９，０．３５ピコモル）。

この訣レッドに、１０ピコモルの５′−燐酸化合成断片
３及び４、並びに２５ピコモルの断片２及び５を加え、
容積を１４μｔとした。断片２〜５は次のＤＮＡ配列（
５′→３′で示す）を有する。

２、　　　ＡＣＡＡＡＡＧＣＴＴＣ ３、ＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣ
ＴＣＡＣＡ４、　　ＣＣＡＧＧＴＧＴＧＡＧＣＣＧＣＡ
ＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＴＴＣ５、ＡＡＴＴＴＧＡＴＡＡ
Ｇ これに、５μ９のポリ−Ａ（５μｔ）、　２５０ｒ＋４
（２）　ＥＤＴＡ　（１ｆｉｔ　）、２Ｍ酢酸ナトリウ
Ａ（２０μｔ）を加えた。この溶液を６０℃に５分間加
熱することにより残存キナーゼを失活せしめ、そして次
に２５ピコモルの５７−ヒドロキシン合成断片１及び６
を加えた。断片１及び６は次のＤＮＡ配列を有する。

１、　　ＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴ ６、　　ＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＡ この方法によりコンヵテマー（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ　
）の形成が回避される。これらの断片は、酵母α−ファ
クタープロセシングシグナルからゾロインスリン遺伝子
中のＥｃｏＲＩＩ制限部位までのコドンを、ｈｉｓ及び
ｌｅｕのコドンにおいて架橋し、そしてさらにプロイン
スリン遺伝子を含有する断片のＥｃ。

ＲＩ制限部位午酵母α−ファクターを含有する断片のと
り■制限部位（ＥｃｏＲｉ部位及び、ＫＬ１部位はいず
れもこれらそれぞれのコード領域より下流にある）とを
架橋するアダプターとなる。

この混合物を攪拌し、２００μｔの９５％エタノールを
加え、そしてチューブを一８０℃にて２０分間保持する
ことによ、Ｑ　ＤＮＡを沈澱せしめる。

１２．８００Ｇにて１０分間遠心分離した後、溶液をｒ
カントし、冷エタノールで洗浄し、そして蒸発乾燥した
。断片のアニーリングを、１８μＬの水を加え、渦流攪
拌し、９０℃に加熱しそして１時間かけて１４℃に冷却
することによシ達成したＯ全容積２７μｔに５ＱｍＭの
Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｔ（ｐＨ７，８）、ｌＱｍＭのＭｇ
Ｃｌ２、ｌｑ／ｍＡのスノソーミジン、１０ｍＭジチオ
スレイトール、１或のＡＴＰ　（リゼーション緩衝液）
を含有するように溶液を調整した。

６ワイス（Ｗｅｉａｓ）−＋−ニットのＴ　４　ＤＮＡ
リガーゼ（３μｔ）を加えることにより連結反応（ｌｉ
ｇａｔｔｏｎ）を開始した。１４℃にて２時装置いた後
、予想される４４３ｂｐのＨｉｎｄ　ｍ　−Ｓａｌ　Ｉ
断片を、非変性条件下の７％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分離した。エチジウムプロミド（０，５μ
ｇ／ｍｌ−”）で染色することによジノ々ンドを可視化
し、切υ取り、そして電気溶出した。バッグの内容物を
取り出し、５μｇのポリ−Ａを加え、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱し、そして乾燥した。断片’ｋＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（３ユニツト）ヲ用い、３７℃にて１時間
合計２０μｔのリゼーション緩衝液中で、５′−燐酸化
した。

ｐＡＢ　１１３は、ＨｉｎｄｌＩ［及びＳａｌ　１部位
が除去されているｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位におい
てクローニングされた酵母α−ファクター遺伝子を含有
する１、８　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片を含んで成るプラス
ミドである。ｐＡＢ　１１３はプラスミドｐＡＢ１０１
から誘導され、このものは、シラスミドＹＥ　ｐ　２４
のＢａｍＨ１部位においてクローニングされた部分５ａ
ｕ３Ａ断片としてα−ファクター遺伝子を含有する。

ｐＡＢ　１０１は、ＹＥｐ２４中にクローニングされた
酵母遺伝子ライブラリーを、公表されているα−７アク
ターコード領域（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｇｋｏｗｉｔ
ｚ。

Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　１９８１　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　、Ｍｅｅｔｉｎｇｏｎ　ｔｈｅ　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｌｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｙｅａｓｔ
ｓ、　２４２頁）と相同の合成オリゴヌクレオチドグロ
ーブを用いてスクリーニングすることにより得られる◇
ｐＡＢ　１１３をエンドヌクレアーゼＨ１ｎｄｎ［及び
坦■によシ完全消化した。

前記のようにして調製した連結生成物を含有するサンプ
ルを６０℃に加熱し、そして１００ｎＨの消化されたｐ
ＡＢ　１１３を加えた。この溶液を、１５分間かけて１
４℃に冷却し、２ワイスユニツトのＴ４　　リガーゼを
加え、そして１４℃にて２時間連結を行った。

エタノール沈澱の後、ベレットを７５ｍＭのＣａｃｔ２
に入れ、そしてこれを用いてコンピテントＥ、コリＨＢ
　１０１細胞を形質転換した。

８個の形質転換体を得、これらの各々からプラスミドＤ
ＮＡを抽出した（：　Ｂｉｒｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ　、
　Ｊ。

Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９７９）７　：１５
１３）。組換プラスミドをＰｓｔｌ及びＳａｌ　ｌによ
り消化し、そしてα−７アクターープロインスリン挿入
部に特異的な３１９．２０７．７９．４８．３１、及び
２７ｂｐの予想される断片の収得を電気泳動的に試験し
た。８個の形質転換体の内、ｐｙｉｎｓ　−Ｌ　　２、
−３、−４、−５と標示する５個の形質転換体がα−７
アクターーノロインスリン挿入部を含有していた。陽性
形質転換体の各々について１ｔの培養物からプラスミド
ＤＮＡを調製した。

５、　　ｐｙｉｎｓ−１、−２、−３、−４、−５のＥ
ｃｏＲｉ逍化 各形質転換体からのプラスミドＤＮＡ　（１００μｇ）
を、２４０ユニツトの均独Ｒ１（ＢＲＬ）と共に４時間
２００μｔの容積において指定された緩衝条件のもとて
インキ−ベートした。

ＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ断の　・ ２０５６　ｂｐ以ココＲ１均１Ｒ■断片を５チポリアク
リルアミド電気泳動により分離した（この方法に代えて
アガロースを使用することもできる）。

グルをエチジクムプロミドで染色し、そして予想される
ＵＶ−可視化バンドを切り出した。ＤＮＡを、前記のご
とく、電気溶出によ９分離し、そしてクロマトグラフィ
ーにより精製した。

各［ｐｙｉｎＪクローン（約４μｇ）を、次のＤＮＡ配
列を有する５′−燐酸化旦！Ｊ　ＲＩ　−ＪＬａｕＨＩ
アダプター１．０Ｂｇと共に、２０００ユニツトのＴ４
　ＤＮＡリガーゼにューイングランドビオラブス）の存
在下でインキュベートした。

５’−ＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＧＧ−３’　　；及び、５
′−ＡＡＴＴＣＣＴＡＧＡＧＧ−３’反応は、９００μ
ｔの指定された緩衝液中で１８℃にて２．５時間行った
。サンプルを６５℃に１０分間加熱し、フェノール抽出
し、そして２５０μｔの指定さｈた緩衝液中で３７℃に
て４時間、１００ユニ、トのＢａｍＨＩ　（ＢＲＬ　）
を用いて消化した。

ル狸ＨＩ−−四Ｈ１α−７アクタ一−プロインスリン断
片を、上記のようにして、１チアガロースグル電気泳動
、電気溶出及びこれに続くカラムクロマトグラフィーに
より精製した＠　　　−７、ｐｃ１／１のＢａｍＨ１部
位へのＢａｍＨｌ−ＢａｍＨ■断片の連結 ｐｙｉｍｓ　−１のＢａｍＨｌ　−ＢａｍＨｌ断片０．
７μｇ及び他のｐｙｉｎ＋ｓからの同様の断片０．４μ
ｇを、一定量の拠Ｈ■消化ｐｃ１／１と連結し、この場
合のモル比を断片１０：ベクター１とした。〔プラスミ
ドｐｃ１／１はｐＪＤＢ　２１９　（Ｂｅｇｇｇ、Ｎａ
ｔｕｒｅ、１９７８　。

翻’５：１０４）の誘導体であムｐＪＢＢ　２１９中の
細菌シラスミドｐＭＢ９に対応する領域はｐｃｌ／ｌ中
でｐＢＲ３２２により置換されている。ｐ　Ｃ１／Ｉ　
Ｕ完全な２μｍ複製因子、酵母以狙ユ遺伝子及び完全な
ｐＢＲ３２２を含有している。〕すべての連結反応は、
５　ｐｇ／ｍＡのＤＮＡ濃度及び８００ユニツトのＴ４
リガーゼにューイングランドビオラブス）を用いて２１
℃にて２．５時間行った。

エタノール沈澱の後、ＤＮＡを７５ｍＭのＣａＣｔ２１
００μｔに再懸濁し、そしてこれを用いて且、ヨＨＢ　
１０１細胞を形質転換した。

各「ｐｙｉｎＪのクローンについて数百側ずつの形質転
換体を得た。５種類の「ｐｙｉｎｓＪクローンのそれぞ
れに由来する４個ずつの形質転換体を、プラスミドＤＮ
Ａ　ｅ抽出し、これをＰ８ｔＩにューイングランドビオ
ラブス）により消化することによｐ試験した。このＰｓ
ｔＩは、挿、入部の存在下で・２０７．４８、及び２７
ｂｐの特異的な断片を生じさせるものと予想される。試
験した２０個の形質転換体の内の１４個がα−ファクタ
ー−プロインスリン挿入部を含有していることが見出さ
れたＯこれらの形質転換体にもとの［ｐｙｉｎｓ　ｊク
ローンの各々を代表している。もとのｒｐｙｉｎａＪｐ
ローンの各々に由来する形質転換体からプラスミド標品
を調製した。

このテラスミドを用いて酵母ΔＢ１０３細胞（α。

県４−３．ｌｅｕ　２−３．ｌｅｕ　２−１１２．ｕｒ
ａ　３−５２．ｈｉｓ４−４卸）を形質転換し、そして
Ｌｅｕ形質転換体を選択した。

細　　地のインスリンのラジオ　ムノア、七を酵母形質
転換体ＡＢ１０３（ｐＹｉｎｓｌ又はｐＹｉｎｓ５）を
、ロイシンを含有しない最少プレート上に「斑点」とし
て増殖せしめた。殺菌したプラスチック製植菌耳を用い
て各床の幾らかを、ロイシンを含有しない最少培地２ｍ
Ｌに植付けた。この培養物及びＡＢ　１０３　（ｐｃ１
／１）の対照培養物を飽和状態まで増殖せしめた。ペッ
クマンＪ６Ｂ遠心分離機中で２．５０Ｏｒｐｍで１０分
間遠心分離することにより細胞をペレットにした。上清
清を取り出し、アマージャム製のキットを用いてＲＩＡ
７ツセイした。１．１０、及び１００μｔの上清液を測
定した。

ｐＹｉｎｓ５−２Ｂ　　　　　　１６ ｐＹｉｎｓ５−３Ａ　　　　　　１３ ｐＹｉｎｓ５−３Ｂ　　　　　　　　３３２　　　　　
ｐＣ１／１　　　　　　　　　０ｐＹｉｎｇｌ−４Ａ　
　　　　　　　６０ｐＹｉｎｓ５−２Ｂ　　　　　　　
　３２ｐＹ１ｎｓ５−３Ｂ　　　　　　　　２２ｐＹｉ
ｎｓ７−ＩＡ　　　　　　　　１５ｐＹｉｎｓ７−２Ａ
　　　　　　　４６ｐＹｉｎｓ８−４　　　　　　　４
８ 脂肪形成バイオアツセイ（ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ　　
ｂｉｏａ−ｓｓａｙ）〔Ｍｏｏｄｙ等、Ｈｏｒｍ、Ｍｅ
ｔａｂ、Ｒｅａ、（１９７４）旦：１２−１６）におい
て、１μｇのサンプルは２７−のインスリン活性を示し
た。サンプルはプラスミドｐＹｉｎｓｌ−４Ａから次の
ようにして得た。この特徴付けのために酵母培養物を遠
心分離して細胞を除去し、そして上清液を酢酸によりｐ
Ｈ３に酸性化した。この材料を、ビオレックス（Ｂｉｏ
ｒｅｘ）−７０に吸着し、カラムを０．ＩＮ酢酸及び５
０チエタノールで洗浄し、そして８０チ工タノール中１
０ｍＭＨＣ７で溶出することにより精製した。溶出物を
ロータリーエバポレーターにより乾燥し、そして少ｔ。

水に入れた。上記の結果はインスリン活性ベゾチドの存
在を示す。

この発明に従えば、新規な構成が提供され、この構成は
ベクターに挿入され、「プレ」−ゾロインスリンの発現
、プロセシング及び分泌がもたらされる。こうして、天
然のヒト−インスリンと同一の配列を有するポリペプチ
ドが得られる。分泌により細胞数に対する収量が非常に
増加し、その後の調製操作及び精製が非常に単純化され
る。

以上、この発明を説明及び例によｐいく分詳細に記載し
たが、これは理解を明確にするためのものであυ、この
発明の範囲内において幾つかの変更及び変法を行うこと
ができることに言うまでもない。

なお、細胞系ｐＹｉｎａｌは、１９８３年４月６日、Ａ
ｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ａ　２０６７０としてＡ、Ｔ、Ｃ，
Ｃ，に寄託された。

以下余白 第１頁の続き ０発　明　者　パブ口・ディー・ティー・バレンズエラ アメリカ合衆国カリフォルニア ・サンフランシスコ・アバーテ ラス４５５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、「プレ」−プロインスリンを酵母において発現せし
   め、この「プレ」−ゾロインスリンのプロセシング及び
   分節を供する改良された方法（ここで、「プレ」とは酵
   母分泌及びプロセシングシグナルの存在を意図する）で
   ｈ−ｚて；プロインスリンについてコードする第１のＤ
   ＮＡ配列を含有し、そしてこのＤＮＡ配列の第１塩基に
   又はその下流にコード鎖の５′−末端を有する第１のＤ
   ＮＡ断片を調製し； 酵母−認識分泌及びプロセシングシグナルについてコー
   ドする第２のＤＮＡ配列を含有し、そしてこのプロセシ
   ングシグナルの末端塩基又はその上流にコード鎖の３′
   −末端を有する第２のＤＮＡ断片を調製しくここで、前
   記の第１の断片及び第２の断片の少なくとも一方はその
   末端をコード配列の内部に有する）； 前゛記第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片を、この
   第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片の欠損した・塩
   基対についてコードするアダプタ下により連結□しくこ
   こで、前記第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片は同
   一のリーディングフレーム中にあって「フレ」−プロイ
   ンスリン遺伝子を供する）；そして、 前記「プレ」−プロインスリン遺伝子を酵母中の発現ベ
   クター中でクローニングする（これにより、前記「プレ
   」−ゾロインスリンが分泌され、そしてプロセシングさ
   れル）； ことを含んで成る方法。 ２、前記分泌及びプロセシングシグナルが酵母α−ファ
   クターシグナル又はその部分である特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ３、　　プロセシングされた「フレ」−ゾロインスリン
   の改良された製造方法であって； ヒトインスリンｃ　ＤＮＡ断片を、発現プラスミド中分
   泌及びプロセシングシグナルから下流に、この分泌及び
   プロセシングシグナルとリーディングフレームが一致す
   るように、ｃＤＮＡのコード領域の５７−塩基対の少な
   くとも１部分を含有しそしてこのｃＤＮＡ断片に相補的
   な末端を有するアダプターを用いて挿入しくここで、前
   記ｃ　ＤＮＡ断片は、前記アダプターに相補的な末端を
   供するように前記ｃＤＮＡのコード鎖の５′−末端の近
   くで制限されており、こうして前記発現プラスミド中で
   前記分泌配列及びプロセシングシグナルのＤＮＡ配列と
   リーディングフレームが一致する完全なプロインスリン
   遺伝子が得られる）； 前記発現プラスミドを酵母宿主に導入し、モしてこの酵
   母宿主を増殖せしめ、こうして「プレ」−プロインスリ
   ンを産生及びプロセシングせしめ；そして、 前記プロセシングされた「プレ」−プロインスリンを栄
   養培地から分離する； ごとを含んで成る方法。 ４、アダプタ、−が、Ｎ−末端のｐｈｅコドンの少なく
   とも一部分と関連する塩基対を含有しそして第１のｈｉ
   ａコドンの少なくとも一部分にまで延びている特許請求
   の範囲第３項記載の方法。 ５、前記分泌及びプロセシングシグナルがα−ファクタ
   ー分泌及びプロセシングシグナルでおる特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 ６、前記アダプターが前記α−ファクターのプロセシン
   グシグナル中のＨｉｎｄｎ［制限部位から前記ｈｉｓコ
   ドンの前記部分まで延びている特許請求の範囲第５項記
   載の方法。 ７、前記ベクターが酵母によって認識される複製系を含
   有する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、前記発現ベクターが旦・ヨにより認識される複製系
   を含有する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９、前記酵母複製系が２μｍシラスミド又はその部分を
   含んで成る特許請求の範囲第７項記載の方法０ １０、酵母−認識ＤＮＡ分泌及びプロセシングシグナル
   と、プロインスリンについてコードするコード配列であ
   って前記の分泌及びグロセミングシグナルとリーディン
   グフレームが一致しているものと金含んで成るＤＮＡ構
   成。 １１、酵母により認識される複製系を含有する特許請求
   の範囲第１０項記載のＤＮＡ構成。 １２、前記コード配列の少なくとも一部分が、酵母によ
   って優先的に利用されそしてヒトのコドンとは異るコド
   ンを有する特許請求の範囲第１１項記載の構成。 １３、前記分泌及びプロセシングシグナルがα−ファク
   ター分泌及びプロセシングシグナル又はその部分である
   特許請求の範囲第１１項記載の構成。 １４、前記構成が旦、牡により認識される複製系を含有
   する特許請求の範囲第１３項記載の構成。 １５、前記酵母複製系が２μｍシラスミド又はその部分
   を含んで成る特許請求の範囲第１１項記載のＤＮＡ構成
   。