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JPS59173096A - ポリシストロン性発現ベクターおよびそれを用いた方法 - Google Patents

ポリシストロン性発現ベクターおよびそれを用いた方法

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JPS59173096A
JPS59173096A JP59007899A JP789984A JPS59173096A JP S59173096 A JPS59173096 A JP S59173096A JP 59007899 A JP59007899 A JP 59007899A JP 789984 A JP789984 A JP 789984A JP S59173096 A JPS59173096 A JP S59173096A
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protein
cells
sequence
host cell
vector
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Application number
JP59007899A
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アーサー・ディヴィッド・レヴインスン
クリスチャン・クリントン・サイモンゼン
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Genentech Inc
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Genentech Inc
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Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
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Publication of JPH0630609B2 publication Critical patent/JPH0630609B2/ja
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  • Separation, Sorting, Adjustment, Or Bending Of Sheets To Be Conveyed (AREA)
  • Sheets, Magazines, And Separation Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、を柚動物細胞培養におけるポリペプチド産生
への組換ＤＮＡ技術の適用に係る。更に詳しくは、本発
明は、を椎動物細胞培養における外来ポリペプチドの産
生を操る際の手段としての第２制御ポリペプチドのコー
ド配列の利用に係る。
巽秤タンパク質？Ｊなわち宿主細胞によって通常産生き
れないタンパク質を産生ずるために宿主細胞を利用する
一般的原理はよく知られている。然しながら、得られる
タンパク質の取り扱い易さという観点から望ましいを柑
動物宿主細胞の利用によりかなりの母の六種タンパク質
を得ることには多くの技術的囲動性を伴う。異種タンパ
ク質を］−ドする遺伝物質をバクテリアに組み込んでこ
れを発現させることに成功した例は沢山知られている。
たとえば、ヒトインターフェロン、デスアセチル−デモ
シンα−１，ソマトスタチン及びヒト成長ホルモンがこ
のようにして産生された。最近、宿１としで酵母細胞（
例えば本出願人の１９８１年２月２５日付ＵＳ特許出願
番号第２３７，９１３号：ＥＰＯ出願公開番号第００（
ｉ００５７号参照）及びを椎動物細胞培養物（１９８１
年８月３１日に出願されたＵＳ特許出願番号第２９８，
２３５号：ＥＰＯ出願公開番号第００７３６５６号参照
）のような非−バクチリア宿主を利用することが可能に
なった。哺乳動物のタンパク質の産生に宿主としてを椎
動物細胞培養物を利用することは有利である。なぜなら
ば、そのようなシステムは、修飾、グリコシレージョン
、輸送配列の付加及び細胞の中で産生されたペプチドの
その仙の後処理に対する付加的な可能性を有しているか
らである。例えば、バクテリアは成功裡にトランスフェ
クトされ且つ「αデモシン」を発現し得るが、産生され
るポリペプチドは哺乳動物に見られる「天然の」αデモ
シンのＮ−アセチル基を欠いている。
一般に、宿主細胞が異種タンパク質を産生じ得るように
工夫された遺伝子工学技術にあっては、（１）「プロモ
ーター」すなわちコード配列の発現を制御且つ可能にす
るヌクレオチド配列；■ｎ＋ＲＮＡにリポソーム結合部
位を付与する配９− 列； （３）　ｒ　：］−ド領領域すなわち所望ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列； （４）所望タンパク質に対する全コードが解読されたな
らその転写を終止させ得る「終止配列」；←）ベクター
が直接ゲノムに組み込まれない場合のルプリコン」すな
わちベクターが細胞内にあるなら該全ベクターの再生を
可能にする複製のオリジン； を含むＤ　ＮＡ配列すなわち「発現ベクター」を調製し
なければならない。
本発明のベクター構築に於いては、同一のプロモーター
が二つのコード配列即ち所望タンパク質の］−ド配列と
第２タンパク質の］−ド配列とを制御することになる。
転写終止もまたこれらの配列ににって行なわれる。黙し
ながら、タンパク質は分離した形態で産生される。なぜ
ならば、該ター１０＝ ンパク質は翻訳終止及び開始シグナルによって分離され
ているからである。
一般に、遺伝発現ベクターは二本鎖ＤＮＡの染色体外ル
ープであるプラスミドの形態にある。これらはバクテリ
ア中に天然の形態で存在するものであり、しばしば細胞
毎に多数］ビーとして存在する。黙しながら、「制限酵
素」を用いて適当な配置で上掲した４つの必須要素を一
緒に切り継ぎ（スプライシング）することにより、人ニ
ブラスミドを構築覆ること゛ｂ可能である（もちろんこ
れらは最も有用である）。制限酵素とはその触媒活性が
特定の塩基配列での溶解に限定されるヌクレアーゼであ
り、各塩基配列は特定の制限酵素に対して特徴的である
。上掲要素（又はその断片）の末端部位をうまく構築す
ることにより、制限酵素はこれらの要素を一緒に切り継
ぎして最終遺伝発現ベクターを形成するものであること
が判る。
次に宿主細胞を誘発してベクターを取り込まゼ〈トラン
スフェクション）、通常の生育の附随的な結果として所
望のポリペプチドの合成が行なわれるように該宿主細胞
を増殖する。
上記した方法には２つの重要な問題が残っている。その
１つは、ベクター中に、上掲した４つの必須要素に加え
て、実際に遺伝発現ベクターを取り込んだ細胞を端的に
選択し得るようなマーカーを有することが望ましいこと
である。宿主としてバクテリアを利用覆る場合、しばし
ば用いられるマーカーはテトラザイクリン又はアンピシ
リンの如き抗生物質に対する耐性である。薬剤耐性の細
胞のみが抗生物質含有培地で成長する。それ故に、１〜
ランスフエクトさせようとする細胞培養物が抗生物質含
有培地で生育する場合には、現実にトランスフエフ１〜
された細胞のみがコロニーとして出現する。形質転換の
頻度は極めて低いので（理想的条件下でトランスフゴク
トした場合１０　　個の細胞当り約１個の細胞が形質転
換される）、これは実際問題として先ず第一に必要な要
件である。
宿主どしてを椎動物細胞を用いると、達成される形質転
換率はより高くなる（１０　　につき約１個の細胞）。
黙しながら、容易な選択は所望のトランスフェクトされ
た細胞を得る際の重要問題として残る。選択は重要であ
る。なぜならば、細胞分裂の速度がバクテリアの場合よ
りも約５０倍低いからである。すなわち、Ｅ、ｃｏｌｉ
は約２０〜３０分毎に１回４ｉＩＩＩ胞分裂するが、ヒ
ト組織培養細胞は１２〜２４時間毎に１回細胞分裂する
だけである。
本発明は、−面において、例えば、宿主細胞が欠損して
いる必須酵素の如き第２タンパク質のコード配列の発現
を利用することにより、所望タンパク質用遭伝発現ベク
ターを取り込んだを椎動物ＩＩＩ胞を選択するという問
題に指向している。例え１３− ば、ジヒドロフォ１ノー１〜リダクターゼ（Ｄ　Ｉ−Ｉ
　Ｆ　Ｒ）をＤ　ＨＦ　Ｒ欠損宿主を用いる際のマーカ
ーとして利用（）（ｑる。
外来宿主に於１−Ｊるポリペプチド産生の第２の問題は
、満”足的畠のタンパク質を回収するということである
。所望の異種ポリペプチド産生を調整し好ましくは該産
生量を高めるべく成るメカニズムを採用することは望ま
しいことである。本発明の別の一面に於いては、外部制
御パラメータによって影響され１ｑる第２の］−ド配列
を利用し、これらのパラメータを制御することにより発
現を制御覆る。更に、２つの配列をそれ自身ポリシスト
ロンとして配置することにより、第１配列の高い発現レ
ベルを有する形質転換体の選択が可能となる。
Ｄ　ｌ−１Ｆ　Ｒコード配列が、顛乳動物ｌｌ１ｌ胞中
に取り込まれ、発現され且つ増幅され得ることは既に示
されＣいる。メｌ−１−レキセード耐ｆ１ヂャイニーズ
′１４− ハムスター卵巣（ＣＩ−１０）細胞からのゲノムＤＮΔ
がマウス細胞に取り込まれ、これまたメトトレキセー１
〜耐（’Ｉである形質転換体が得られている（後記文献
１参照）。マウス細胞に於いてメトトレキセート（ＭＴ
Ｘ）耐性が得られるメカニズムは次の３つにｊこるもの
と思われる：　Ｄ　ＨＦ　Ｒコード配列遺伝子増幅（文
献２．３．４参照）；ＭＴＸ摂取の低下（文献５，６参
照）及び産生されたＤＨＦ　ＲのＭＴＸに対する親和力
の低下（文献７参照）。
ＭＴＸＩＩＷ露にＪ：るＤＨＦＲｍ伝子の増幅は同時に
１〜ランスフエク１−された遺伝子配列の増幅を同時に
１起−りるものど思われる。Ｂ型肝炎Ｄ　ＮＡ配列を含
むプラスミド及びＭＴＸ耐性ＤＨＦＲの突然変異逍伝子
を含むハムスター細胞系（１ルライン）からのゲノムＤ
ＮＡの両者でトランスフェクトされたマウス線層１芽細
胞は、Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ配列増幅を刺激すべくＭＴＸ
が使用された場合、培地中に増加された早のＢ型肝炎表
面抗原（ＨＢｓΔｇ）を分泌することが示されている（
後記文献８参照）。史に、Ｆ、ｃｏｌｉタンパク質ＸＧ
ＰＲＴをコードするｍＲＮＡは、ＭＴＸの存在下で、別
個のプロモーターによる制御下にあるＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　
Ｒ及びＸＧＰＲＴ３Ｗ伝子配列で同時にｊ〜ランスフェ
クトされたＣ　ＨＯ細胞中で増幅される（文献９参照）
。
また、ＭＴＸの存在下でＤＨＦＲ／ＳＶ／１０プラスミ
ド絹み合せ中のプロモーター固有の配列発現ちまた増加
されることが示されたく文献１０参照）。
本発明は、同一のプロモーターの制御下にある第２の遺
伝コード配列を含む所望ポリペプチドの渭伝発規ベイ７
ターで形質転換されたを椎動物Ｉ胞宿主に於いて、この
第２の配列が、一般的に形質転換体に対しての便利な選
択マーカーとなるのみならず、第１の配列に対し制御デ
バイスとして作用すると共に第１配列の高い発現レベル
を示す形質転換体に対しても簡便なスクリーニングマー
カーとなり、もって所望ポリペプチドの発現が調整され
ることになり大抵の場合該発現が高められることになる
という発見に基づいている。
このことは、本発明の方法によれば２つのタンパク質が
成熟形態で別々に産生されるので特に重要である。融合
情報（ｍＲＮＡ）が形成されるように２つのＤＮＡ７１
−ド配列は同一の転写プロモーターによって制御される
が、これらは第１の配列に対する翻訳終止シグナル及び
第２の配列に対する翻訳開始シグナルによって分離され
ており、それ故に２つの異なったタンパク質が得られる
のである。
を）１Ｆ動物宿主細胞培養システムは動物システムに適
当なグリコシレージョン、ホスホリレーション及び脂質
会合を生起し得るのでくバクテリア宿−１７＝ 主ではこれが起こらない）しばしば有利であり、このよ
うな状況に合うマーカーシステム及び調整システムが得
られるということは重要な意味をもつ。
したがって、本発明の一面は、第２のタンパク質及び所
望タンパク質をコードする配列を含み、所望配列及び第
２配列の両者が同一のプロモーターによって支配されて
いるポリシストロン性発川ベクターを利用して、を椎動
物細胞宿主から有用な異種タンパク質を得る方法にある
。コード配列゛は翻訳停止及び開始シグナル］トンによ
って分離されている。第２配列の発現は所望タンパク質
の配列の発現に対して制御作用を及ぼし、第２タンパク
質はトランスフェクトされた細胞の選択に対するマーカ
ーとして作用する。本発明はこれら作用のいずれか一方
又は両方を右する第２配列を利用するものである。
１８− 他の面に於いては本発明は、所望の異種ペプチドを産生
づ−るためにを椎動物細胞を１〜ランスフエクトするの
に適した）ｍ伝発現ベクター、このトランスフェクショ
ンにＪ：つて生じた細胞培養物及びこの細胞培養によっ
て産生されたポリペプチドに関する。
Ａ、定義 本明細ｍ中の１プラスミド」とは、バクテリア中に天然
に存在するプラスミド及び人工的に構築した環状ＤＮＡ
断片の両方を含む。
本明細書中の「発現ベクター」とは、宿主細胞培養に於
ける異種ペプチド発現のための上掲した４つの必須要素
を少なくとも含むプラスミドを意味する。
本明細書中の「異種タンパク質」とは、宿主有機体によ
っては通常産生されないものであるか又はイの生存のた
めには通常要求されないタンパク質又はペプチドを意味
する。
本明細書中の「所望タンパク質」とは、本発明方法で産
生じようとする異種タンパク質又はペプチドを意味する
。
本明細書中の「第２ペプチド」とは、宿主細胞に於（プ
る発現の第１産物として望ましい異種ペプチドではない
タンパク質又はペプチドを危味し、このタンパク質自身
の性質又はこれをコードし−Ｃいる配列の性質によって
、発現ベクターにＪ：るトランスフェクションのマーカ
ーとなり得及び／又は第１の所望の異種ペプチドの発現
を調整し得る別の異種ペプチドを意味する。
ペプチド配列は約５個のアミノ酸のように短いものから
約１０００のアミノ酸のように長いものまである。ペプ
チドという用語とタンパク質という用語の従来から観念
されている相違は本明細書に於いては従来のように識別
されていない。区別されな（プればならない場合には、
そのように特定する。
本明細書中の１第１配列」とは、所望ペプチドをコード
するヌクレオチド配列である。
本明細書中の「第２配列」とは、第２ペプチドをコード
するヌクレオチド配列である。
本明細書中の宿主細胞の「トランスフェクション」とは
、何らかのコード配列が実際に発現されるか否かに関わ
りなく、検知可能なように発現ベクターが宿主細胞に取
り込まれたことを意味する。
本発明に於いては、成功的トランスフェクションは該宿
主細胞中のこのベクターの作用の何らかの徴候が認めら
れたなら確認されたことになる。この意味に於いて成功
の種々のレベルが存在することが判る。第１に、ベクタ
ーのコード配列は発現されるかもしれないしされないか
もしれない。しかし、ベクターがプロモーター及びター
ミネータ−を含んで適切に構築されたなら、発現が生起
す２１− る確率は高い、１第２に、ベクターどなるプラスミドが
細胞中に取り込まれて発現されていても細胞の正常染色
体中に組み込まれていない場合には、このプラスミドを
発現覆る能力は数世代後喪失される。一方、ベクターが
染色体中に組み込まれれば、宿主細胞の繰り返し複製を
通じて発現は安定している。また中間の結果となる場合
もある。トランスフェクションがこのように生起し得る
方法の詳細は理解されていないが、宿主培養の数世代に
亘る発現の安定性という意味で一連の成果が実験的に認
められていることは明らかである。
Ｂ、所望ペプチドの好ましい廖体乳 好ましい特定の具体例に於いては、例えば、第１の遠伝
子配列はＢ型肝炎表面抗原（ｌ−ＩＢｓＡｇ）を］−卜
する。このタンパク質はＢ型肝炎ウィルスから誘導され
るものであり、ヒトのＢ型肝炎の感染源である。この病
気は衰弱、肝臓障害、初期＝２２− 癌及び時には死をもたらすものである。この病気は特に
多くのアフリカの国々及びアジアの国々でかなり流行し
ており、これらの国々では多数の人々が該病気を潜在的
に伝染する慢性的保菌者となっている。このウィルス（
トＩＢＶ）は核カプシド更にエンベロープで包囲されて
いるＤＮＡ分子からなる。該ウィルスに関連しているタ
ンパク質は表面抗原（ＨＢＳ　Ａ（１）、コア抗原及び
ＤＮＡポリメラーゼ等である。ｌ−Ｉ　Ｂ　ｓへ〇は感
染したヒトに抗体を生じさせることが知られている。感
染個体の血清中に見られる１−ＩＢＳＡ（Ｉは径の平均
値が約２２ｎｍであるタンパク貿粒子からなり、そのた
め「２２ｎｍ粒子」と呼称されている。したがって、Ｈ
ＢＳＡ！ＩＩ粒子がワクチン用の有効な基剤となると思
われる。
０、第２ペプチドの好ましい具体測 成る生育条件下で細胞によって産生される一定量の特定
酵素を制御するのに環境条件がしばしば有効であること
が認められている。本発明の好ましい具体例においては
、ジヒドロフオレートリダクターゼ（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）の
阻害剤であるメトトレキセート（−ＭＴＸ）に対するあ
る秤の細胞の感受性を利用する。Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒは
１つの炭素単位の転位を含む合成反応に間接的に要求さ
れる酵素である。
ＤＨＦＲ活性を欠いていると、その合成に１つの炭素単
位の転位が必要とされる化合物が存在する場合を除いて
、細胞は成長することができない。
黙しながら、Ｄ　）−Ｉ　Ｆ　Ｒを欠く細胞はグリシン
、チミジン及びヒボキリーンチンが共に存在すると成育
する。
通常ＤＨＦＲを産生ずる細胞は、メトトレキセ−１〜に
よって阻害されることが知られている。殆んどの場合、
適当量のメトトレキセートを正常細胞に添加すると、細
胞の死につながる。しかしながら、成る種の細胞はＤＨ
ＦＲの量を多くすることによってメ１〜１〜レキセード
処理に対しても生き残るようであり、この酵素を阻害す
るメトトレキセートの能力を超えるものを有している（
後記文献２．３．４参照）。このＪｚうな細胞に於いて
はＤ）−Ｉ　Ｆ　Ｒ配列をコードするメツセンジャーＲ
ＮＡの凶が増加していることが既に示されている。この
ことはこのメツセンジャーＲＮＡをコードする遺伝子物
質中のＤＮＡＩＲが増加していることを仮想することに
より説明がつくものである。実際、メトトレキセートの
添加は明らかにＤＨＦＲ遺伝子の遺伝子増幅を生起する
。同一のプロモーターににっで調整されてはいないが、
ＤＨＦＲ配列に物理的に結合している遺伝子配列もまた
増幅される（文献１．８．９．１０参照）。結局、別種
のタンパク質（この場合は所望のタンパク質である）に
対する遺伝子を附随的に増幅するために、メトトレ＝２
５− キセート処理によって得られるＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ遺伝
子の増幅を利用でることが可能となる。
更に、Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒに対する第２の配列が取り込
まれる宿主細胞そのものがＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ欠損であ
ると、Ｄ　Ｉｔ　［Ｒ’はまた成功裡にトランスフェク
トされた細胞の選択に対する簡便なマーカーとして作用
する。ＤＨＦＲ配列が所望ペプチドに対する配列に有効
に結合していると、この能力は所望の配列を用いる成功
的トランスフェクションに対するマーカーとして同様に
作用する。
仄工皇」シたベクター構築技術（物質及び方法）下記Ｆ
に記載の実施例で構築されたベクターは単離プラスミド
又はＤＮＡ断片の開裂及び結合によって構築されたもの
である。
適当なバッファー中で１種又は複数の制限酵素で処理す
ると開裂が起こる。一般に、約２０７ｙのプラ゛スミド
又はＤＮＡ断片は２００成のバッファー溶２６− 液中の約１〜５単位の酵素を特徴とする特定の制限酵素
に対する適当なバッファーは製造業者により特定されて
いる）。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が
実行可能である。インキュベーション後、タンパク質を
フェノール及びクロロホルムで抽出除去し、核酸をエタ
ノールを用いる沈澱により水性画分から回収する。
平滑末端が要求される場合には、調製物を１０単位のポ
リメラーゼＩ　（Ｋ　Ｉｅｎｏｗ　）を用いて１５℃で
１５分間処理し、フェノール−クロロホルム抽出及びエ
タノール沈澱する。
開裂断片のサイズ分離をり、　Ｑｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　
ａｌ、。
Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、　８：４
０５７（１９８０）に記載されている６％ポリアクリル
アミドゲルを用いて行なう。この文献に記載の内容を本
発明書中に含めるものとする。
はぼ等モル量の所望成分を結゛合するために、正しい整
合性を提供づるべく適当に末端処理し、０．５Ｂ　Ｄ　
Ｎ　Ａにつき約１０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼで処理
する。
Ｆ、好ましいり体側の訂細な説明 一般に、本発明に好適な発現ベクターは遺伝子スプライ
シング技術の適用により構築される。出発物質は天然の
バクプリアブラスミドであり、必要に応じて予め修飾し
ておく。本発明の好ましい具体例に於いＣは、Ｍ、ｌ　
ｕｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｃ。
−λ、３９：　７９　（１９８１）に記載の方法により
調製された修飾ｒ）Ｂ　Ｒ３２２プラスミドであるｐＭ
ｌ−プラスミドを利用する。これは、ザルウィルスＳＶ
４０から誘導されるＩ「−のプロモーター並びにＤ　Ｉ
−Ｉ　Ｆ　Ｒ及びｌ−１１３３Ａ（＋に対するコード配
列を含有する。
構築に於いて、プロモーターを（リポソーム結合配列と
共に）、所望タンパク質をコードするコード配列及び第
２タンパク質をコードするコード配列の上流に位置ざＶ
る。単一の転写終止配列を両者の下流に位置さける。上
流コード配列の末端部に翻訳終止シグナルを位置させ、
その下流に下流配列の翻訳開始シグナルを位置する。こ
のＪ：うにして、２つのコード配列が単−ｍＲＮＡ鎖中
で発現するが、２つの別々の成熟タンパク質が発現され
る。
特に好ましい具体例に於いては、第２ペプチドを］−ド
する配列は所望ペプチドをコードする配列の下流にある
。これらの環境下にあっては、第２ペプチドによって形
質転換された細胞を選択しようどする方法が、所望ペプ
チドの特に高い産生をも選択する。
旦−丸−ｉ−色 下記実施例は本発明を説明するものであって、何ら本発
明を制限するものではない。
２９− １１例二Ｌ　社２＆り９−　　ｐＥ３４２゜第１図に、
ＨＢＳ　Ａｇプラスミドの構築を示す。
表面抗原遺伝子を含む１９８６　ｔａｐ　Ｅ　ｃｏＲＩ
　−１３Ｏｆ■断片をζｌ　ｉｕ　ｅｔ　ａｌ、、Ｄ　
ＮＡ、ユニ　　２１３　（１９８２）（本明細書中に包
含する）に記載の如く、Ｉ）ＢＲ３２２でクローン化し
たＨ　Ｂ　Ｖウィルスゲノムから甲部した。この配列を
ｎＭＩ−のｌ”：ｃｏＲ■及び３ａｍ）−１１部位間に
結合した。ＩＩＭＬはＬ−ｕｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、。
Ｎａｔｕｒｅ、　２９３：　７９（１９８１）　　（本
明細書中に包含する）に記載のように、ザル細胞中での
複製を阻害する配列を欠如しているｒｌＢ　Ｒ３２２誘
導体である。
得られたプラスミドの唯一のＥＣｏＲＩ部位に、ウィル
スゲノムの生国ｄ■及びＰｖｕＩ［消化によって得、予
め修飾して両端をＦＣＯＲＩ制限部位にしたＳＶ４０の
３４２　ｂｐルオリジン片を挿入してρ３４２Ｅを得た
。ｐ３４２Ｆ　（ｐＨＢ　５３４８−　Ｆとも相称され
る）３０− は、１−ｅｖｉｎｓｏｎ　０１　ａｌ、にＪこる１９８
１年１２月　３日付出願の米国時Ｗ［出願第３２６，９
８０号明細書に記載されている。該出願を引用して本明
細書中に包含する（欧州特許出願公開第００７３６５６
号）。要約すれば、ザルウィルスＳＶ４０のオリジンを
単離するために、５Ｖ４０ＤＮＡを±則ｄＴＩ［で消化
し、コンバーター（ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣ＞を添加して
生国ｄｌ［［末端をＦ　Ｃｏ−ＲＩ末端に変換した。Ｄ
ＮＡをＰｖｕｌＩで切断しＲＩリンカ−を添加した。Ｅ
Ｃ０ＲＩで消化後、オリジンを含む３４８　ｂｐ断片を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び電気溶出で単離し
、ｐＢＲ３２２中でクローン化した。ｌ−Ｉ　Ｂ　Ｖ　
（Ａ　ｎｉｍａｌＶｉｒｕｓ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　
（Ｃｈ、５　）　Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓ、Ｎ。
Ｙ、　　（１９８０）　）のＬ蚊ＲＩ及び影蛙■による
消化で得られた１９８Ｇ　ｂｐ断片（これはＨＢＳ　Ａ
（ｌをコードする遺伝子を含んでいる）を、ＥＣｏＲＩ
部位及び胆ト」■部位でプラスミドＩＢＭ　１．　（Ｌ
　１ｌｓｋＶｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、　２９３：
　７９　（１９８１）　）にクローン化して発現プラス
ミドｐＨＢ　５３４８−　Ｅを構築した（Ｉ）ＭＬは、
サル細胞中でのプラスミド複製を■害する配列が除去さ
れた欠失を有するｌ）Ｂ　Ｒ３２２誘導体である）。１
りられたプラスミド（ｐＲＩ−シ±）を次にＥＣ０ＲＴ
で直線化し、ＳＶ４０のオリジン領域を示す３４８　ｂ
ｐ断片をＩ）ＲＪ〜刊のＥＣｏＲＩ部位に導入した。オ
リジン断片はいずれの配向でも挿入され得る。この断片
は複製のオリジン以外に初期及び後期のＳＶ４０プロモ
ーターをコードしているので、オリジンの配向次第でど
ちらかのプロモーターが作用し該プロモーターの制御下
でｌ−Ｉ　Ｂ　Ｖ遺伝子が発現し得た（　＋）ＨＢｓ　
３４８−Ｅば初期プロモーターの制御下で発現したｌ−
Ｉ　Ｂ　ｓを示寸）。ｐＥ３４２を修飾するために、ｐ
［３４２を旦蚊ＲＩで部分消化し、Ｋ　ｌｅｎｏｗ　Ｄ
　Ｎ　Ａポリメラーゼ■を用いて開裂部位を充填し、プ
ラスミドを再結合し、これにより　１）Ｅ３４２中のＳ
Ｖ４０オリジンに先行するＦＣＯＲＩ部位を除去する。
得られたプラスミド即ち、ρＦ３４２ΔＲ１をＥＣ０Ｒ
Ｉで消化し、Ｋ　ｌｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ
■を用いて充填し、ＢａｍＨＩで再度切断する。アクリ
ルアミドゲル電気泳動後、約３５００　ｂｐ断片を電気
溶出し、フェノール−クロロホルム抽出し、前記の如く
エタノール沈澱させる。ＥｃｏＲＩ及びと咳で消化して
ＨＢＳＡＧの５′非翻訳リーダー領域を除去し、肝炎発
現プラスミドｐＨ８９４（ｌ　ｉｕ　ｅｔ　ａｌ、、上
掲）の類似する１５０　ｂｐ旦剪ＲＩ−泣吠断片を代わ
りに挿入してｒｌＥ　３４２．１−Ｉ　８９４．１」Ｂ
　Ｖを形成した。
（１−ｉｕ　ｅｔ　ａｌ、によって記載されているよう
に１１Ｈ８９１１は真の１−ＩＢｓＡＯ３ｔｌ仏子の翻
訳開始コドンを含むが、５非翻訳情報記列は全部欠如し
ている。前記のごときＳＶ４０初期プロモーターの制御
下で真のＦ　ｃｏＲＩ−Ｂ（］ｌＩｒ断片と１）Ｈ８９
４由来等３３− 刷物の双方の発現レベルは同等であり、プラスミドの性
能に影響することなく交換可能である。）実−〇−２−
ユ十ＦＲ配列含有ベクターｐＦ３４２．Ｄ彰 唯−の発現可能な配列としてＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒを担持
するプラスミドｐＥ　３４８．ｒ）　２２の構築を第２
図に示す。
ＤＨＦＲｃＤＮΔプラスミド１１Ｄ　Ｉ−１「Ｒ−１１
（Ｎ　ＬＩｎｂｅｒＱ　ｅｉ　ａｌ、、Ｃｅｌｆ、１９
　：　　３５５　（１９８０）参照）の１６００　ｈｐ
　Ｐｓｔ■インサー１へをエキソヌクレアーゼ３ａ１３
１で処理してＰｓｔＩ部位に隣接するポリＧ：Ｃ領域を
除去し、ＢＯｌｍで浦化し、得られた約ｅｅｏ　ｂｐ断
片をゲルから単離した。β」リー３ｌ−ＢｏｌＴｒ消化
ＣＤ　Ｎ　ＡをＢ（ＪＩＴＩ部位を含有するｌ）Ｂ　Ｒ
３２２プラスミド誘導体に結合した（　　ｒｌＢＲ３２
２ヲＨｉｎｄＩＩ［で消化した後、プラスミド断片をＫ
　ｌｅｎｏｗ　［）ＮＡポリメラーゼを用いて４種のデ
オキシヌクレオヂド三リン酸の存在下で充填し、影吐■
で再切３４− 断した）。得られたプラスミドＩ）ＤＨＦＲ−Ｄ２２は
、Ｉ’ｌＢ　Ｒ３２２とＤＩ−ＩＦＲｃＤＮＡの５末端
との融合部位の２９　ｈｐ　Ｊ−流に位置するＦＣＯＲ
Ｉ部位を有り−る。次いで、ｃＤ　Ｎ　Ａインサートの
コード配列を含むＬ刈ＲＩ−良蛙■断片をｐＤｌ−ＩＦ
Ｒ−Ｄ２２から切り出し、Ｅ　ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで
消化した１’ｌＥ　３４２．ＨＢ　Ｖ　（実施例１）に
結合してＤＨＦＲ発現プラスミドｌ）Ｅ　３４２．Ｄ　
２２を形成した。
２種のベクター、即ちＤＨＦＲ遺伝子がＨＢ　ＳΔ０遁
伝子の下流にあるポリシストロン含有ベクターｔ）Ｅ　
３４２．１」Ｂ　Ｖ　、　Ｄ　２２、並びにＤＨＦＲ及
びｌ−（Ｆ３　ｓΔｇ渭伝子がポリシストロンになって
いないベクター、Ｉ’ｌＥ　３４２．ＨＢ　Ｖ　、　Ｅ
　４００．Ｄ　２２を構築した（第３図）。
Ａ、　クローン化ＨＢＶ　　ＤＮＡ　（Ｌｉｕ　ｅｔ　
ａｌ、。
上掲）の旦組ＲＩ　−、−Ｔ炊■断片を、ＥＣ０ＲＩ−
ｐ　ｌａ工で消化したＩＣＥ　３４２．Ｄ　２２に結合
してｐＥ３４２．ＨＢＶ、Ｄ２２を構築した。
旦−、ｌ’１Ｆ３４２．１−ＩＢＶ、　Ｄ２２のＷ旺■
部位とＤ　Ｉ−１［Ｒインサー１〜のＣｌａＩ部位間に
ＳＶ４０初期プロモーターを融合して更に修飾した。
１−Ｉ　Ｂ　ＭウィルスＤＮＡは、ＢｑｌｌＩ部位を超
えて２０　ｂｐの位置に１１１１−のＴａｑＩ部位を含
有している。
この部位を用いて、表面抗原遺伝子を含むＥＣ０ＲＩ−
Ｂ（］ｌＴ［断片を生成した。即ち、クローン化トＩＢ
Ｖウィルスｌ’）ＮＡを＝ＥＣＯＲＩ及びＴａａ■消化
すると、表面抗原遺伝子を含み目っＥＣｏＲｌ部位から
１９８５　ｈｐ　離れている（　１−　ｉｕ　ｅｔ　ａ
ｔ、、上掲）ＩｌｌＬ−のＢｏｌＴｒ部位を含有づる〜
２０００　ｂｐの断片が得られる。（消化によって生成
するＤＮＡ断ハの末端Ｔａｇ−Ｉ及び片組■は粘着性で
あり共に結合する。）史胆工部位が再生される。即ち、
ｐＦ　３４２．１−Ｉ　ＢＶ、Ｄ２２は１蛙ＩＩ及びｌ
ｉＩ部位の双方を含み、これらはＤ　ＨＦ　Ｒコード配
列の直前に位置している。
ＳＶ／ｌ０ＤＮＡを±［■で消化し、前記のように充填
し、比圧ｄｌｌＩで再切断して、ｐＥ　３４２．１−Ｉ
　Ｂ　Ｖ　。
Ｄ２２のＢｏｌＩＩ及び注１部位に対して粘着性の制限
部位を両端に右するＳＶ４０オリジンを構築した。
Ａリジンを含む４４０　ｂｐ断片を単離した。これを土
ｉｎｄ　ＩＩＩ及び３ａｍト１■消化によって生成する
４０００ｂｐｌ）Ｂ　Ｒ３２２断片並びに、クローン化
したＨ　Ｂ　ＶウィルスＤＮＡをＥＯＯＲＩ消化しＫ　
ｌｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＴで充填し、ｍ旺
■で再消化し、アクリルアミドゲルで単離して生成した
表面抗原遺伝子を含む１り８６　ｂｐ断片と共に三者間
結合した。
これら３秤の断片の結合は、充填したＨｐａＩＩを［：
ｃｏＲＩと、２個の±ｉｎｄ　ｌ１部位を互いに、口つ
ＢｏｌＴＩをＢａｍ１−ＩＩと結合することによっての
み達３７− 成し得る。次いで、得られたプラスミドをＱｌａ’［及
びＢａｍＨＩで制限消化すると、５ＶＩＩＯオリジンを
含む４７０　ｂｐ断片が得られる。この断片をＩＣＥ３
４２．１−（Ｂ　Ｖ　、　Ｄ　２２の史坦Ｔ及び比几■
部位に挿入シテ、ＩＩＥ　３４２．１−Ｉ　Ｆ３　Ｖ　
、　Ｅ　４００．Ｄ　２２を形成する（第３図参照）。
実施例４　宿主細胞のトランスフェクション本実施例の
宿主細胞は組織培養で増殖させたを椎動物細胞である。
当業界で公知のように、これらの細胞は単離した正常細
胞から連続トランスファー処理により得られ、永久セル
ラインとし−Ｃ組持し得る。これらのセルラインは、液
体媒質中の固体支持体上に維持されるか、又は支持栄養
物を含有する懸濁物中で増殖させることにより維持され
る。
好ましい実施例では、Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ活性を欠損し
ているＣ　ＨＯ細胞を使用した。これらの細胞は、３８
− ＬＪ　ｒｌａｕｂ　　ａｎｄ　　Ｃｈａｓｉｎ、Ｐ　ｒ
ｏｃ、Ｎ　ａｔｌ、Ａ　ｃａｄ、Ｓ　ｃｉ。
（Ｕ　Ｓ　Ａ　）　、　７７：　４２１６　（１９８０
）　　（本明細書中に包含する）に記載のように製造し
増殖させる。
これらの細胞を上記のにうに調製された所望のベクター
５ｍｇで、ＧｒａｈａｍａｎｄＶａｎ　　ｆ）ｅｒ　　
Ｆｂ。
Ｖ　ｉｒｏｌｏｇｙ、５５　：　　４５Ｇ　（ＩＱ７８
）　　（水明）ｉｌｌｌｆｆｉ中に包含する）の方法で
トランスフェクトする。
一連のプラスミドが特定宿主細胞と確実に相互作用する
にうにし得る方法があり、その結果１個のプラスミドが
細胞に吸収されると仙のプラスミドも同様に吸収される
確立が増大する。従って、１次配列及び２次配列を人々
含む別々のベクターを使用してこれらの配列を導入して
もよいし、両配列を含む単一ベクターを使用して導入し
てもよい。
ｌＬｉ！’１５　−１−ランスフエクトされた　胞の増
１に前記のトランスフェクション操作にかけたＣＨＯ細
胞を、最初非選択培地中で２０間増殖させ、次いでグリ
シン、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く培地中に細胞
を移し、プラスミドＤＨＦＲを発現し得る細胞を選択し
た。約１〜２週間後個々の］ロニーをり［ｉ−ニングリ
ングで単１１１．た。
６０又は１００ｍｍの組織培養凹に約０，５ｘ　１０　
　細胞／■で細胞をプレートした。２日間増殖させた接
、増殖培地を交換した。２４時間ＩＵＲＩＡ（△ｕ　ｓ
　ｒ　ｉ　ａ■、　Ａ　ｈｂｏｔｔ’　）で１−ｌＢｓ
Ａｇをアツｂイした。細胞をカラン１〜し、ＨＢＳ　Ａ
！１産生を細胞１個当りの基準で標定した。このように
して、使用した各ベクターについて１０〜２０個のラン
ダムなコロニーを解析した。
本発明の一実施例で次表の結果が得られた。
最高の発現を示すセルラインの数個で２０回以十の移行
の間表面抗原の産生をモニターしだどころ安定であった
。表面抗原を発現する細胞は基層に無限に６１着したま
まであり、培地を補充している限りは大Ｍの表面抗原を
分泌し続（）る。
ポリシストロンｔ’Ｌ　’＞Ｗ伝子構築にＪ：って高レ
ベルのＨＢＳ　Ａ（＋を産生ずる細胞が単離されること
は明らかである。ＩＩＥ　３４２．１−Ｉ　Ｂ　Ｖ　、
　Ｄ　２２で形質転換されたコロニーは１００％が５０
０ｎ＋Ｊ／　１０Ｇ細胞／日以上を産生したが、非ポリ
シス１〜ロン性プラスミドＩ）Ｅ　３４２．　ｌ−Ｉ　
Ｂ　Ｖ　、　Ｅ　４００．　Ｄ　２２テ形質転換された
コロニーは９２％が前記吊より少早を産生じた。
１５００ｎ（１／　１０　　細胞７日以上のレベルで産
生したのはポリシストロン性トランスフ■クションを行
なった細胞のみであった。
割」１灸　　メトトレキセー１〜処理 表面抗原を産生ザるレルラインは、１００Ｍより高濃度
のメトトＬｚキｔ−１−（ＭＴＸ、ＤＩ−ＩＦＲの特異
的阻害剤）によって阻害される。ＭＴＸの組織培養細胞
に対する影響に関する従来の研究結果ぎ と一致して、約１０　　の頻度で高濃度（！’ｉ（ｌｎ
Ｍ）のＭＴＸに耐性のクローンが出現する。然しながら
、これらのクローンは、ＭＴＸ耐性クローン中で１１Ｂ
Ｖ配列が増幅するにもかかわらず、最早表面抗原を産生
じない。即ちこの場合、ｌ−Ｉ　Ｂ　Ｍ　遺伝子は増幅
されるが発現は低下する。これは、表面抗原を更に産生
すると細胞に致死性になることを示す。
実施例７　所望ペプチドの回収 産生された表面抗原は、ウィルスに感染した患者の血清
で観察される２２ｎｍ粒子に類似の粒子状である。この
抗原形態は高い免疫原性を有することが示されている。
仔ウシ血清又は他の補足物を欠く培地で細胞を増殖さけ
ると、培地に含有されるタンパク質の約１０％が表面抗
原であり、このタンパク質は当業界に公知のｙＪ　Ｐｉ
で１１４蘭され１ｑる。表面抗原は、ＳＤＳ〜ポリアク
リルアミトゲ／Ｌ、−ｌ二を２２ｎｍ粒子山来タンパク
と共に移動する。
文　　　献 １、　Ｗｉｏｌｃｒ；Ｍ、　ｃｔ　ａｌ、、　　Ｐ＋’
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
ＳＣｉ、　７７：　３５６７＜　１９８０）２、３ＣＩ
Ｔ１ｍｋｅ、　Ｒｏｂｅｒｔ　Ｔ、　ｅ［ａｌ、、　３
ｃｉｅｎｃｅ匝：　１０５１　（１９７８） ３、　Ｒ１ｅｄｌｅｒ、　Ｊ　、　　Ｌ　、　ｅｔ　ａ
ｔ、、　ｃａｎｃｅｒ　Ｒ（！Ｓ。
琵：　１５３　（１９７２） ４、　　ＣｈａｎＬ　　Ｓ、　　Ｅ、ｅｔ　ａｌ、、　
　Ｃｅ１ｌ　　７：　　３９１（１９７６） ５、　　Ｆ　１ｓｃｈｅｒ、　Ｇ　、　Ａ　、、　Ｂ　
ｉｏｃｈｅｍ　　ｐ　ｈａｒｍａｃｏｌ。
υ−：　１２３３　（１９６２） ６、　Ｓ　１ｒｏｔｎａｋ、　Ｆ　、　Ｍ　、　ｅｔ　
ａｔ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。
孤：　７５　（１９６８） ７、　　Ｆ　１ｉｎｔｏｆｆ、Ｗ、　　Ｆ、　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｓｏｍａｔ、Ｃｅ１ｌ。
Ｇ　ｅｎｅｔ、２　：　　２４５　（１９７６）８、　
Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｐｒｏ
ｃ、Ｎａ口。
Ａ　ｃａｄ、Ｓ　ｃｉ、　　７９　：　１８１５　（１
９８２）９、　　Ｒｉｎｇｏｌｃｌ、　　Ｇｏｒｄｏｎ
　ｅｔ　　ａｔ、、　　Ｊ　、　　ｊｖｌｏｌｅｃ　ａ
ｎｄΔｐｐ１．Ｇｅｎ、　　１：　　１６５（１９８１
）１０、ｌ（ａｕｆｍａｎ、　　Ｒ、Ｆ　、　　ｅｔ　
　ａｌ、、　　Ｊ　、　　Ｍｏ１ｅｃ。
Ｂｉｏｌ、　　１５９：　　６０１（１９８２）１１、
ＰｅｒｕｃｈｏｏＭａｎｕａｌ　　ｅｔ　　ａｌ、、　
　Ｃｅ１ｌ　　２２：　　３０９（１９８０）
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＨＢＳ　Ａ（＋発現ベクターｐＥ３４２．Ｈ
３９４、ＨＢＶ（７）構築ヲ示ス図、第２図は、ＤＨＦ
Ｒ発現ベクターρＥ　３４２．　Ｄ　２２の構築を示す
図、第３図は、Ｄ　ＨＦ　Ｒ及びトＩＢｓΔｑ発現ベク
ターｐＥ　３４２．１−Ｉ　Ｂ　Ｖ　、　　Ｄ　２２及
び　ｐＥ　３４２．ＨＢ　Ｖ　、　　Ｅ　４００゜Ｄ２
２ノａｔｉヲ示ｔ　ｒＥＪ　テｔ５ル・出願人ジ：；ｌ
ｙ７．イ＞’ｌ−４’−’ｙ＜９．、小’第１頁の続き ｏＩｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番号／／
ＣＣ１２Ｐ　２１１００ Ｃ１２Ｒ１／９１　） （Ｃ１２Ｎ　　５１００ Ｃ１２Ｒ１／９１　） ０発　明　者　クリスチャン・クリントン・サイモンゼ
ン アメリカ合衆国カリフォルニア ９５３１０サン・ジョゼ・パークヴ イユー・アヴエニュ１５０９ ５７２−

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）　を椎動物宿主細胞に於いて所望の成熟タンパク
    質を産生する方法であって、 （ａ）ｉ）所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列と 肖）その合成が環境制御の支配下にある第２タンパク質
    をコードするＤＮＡ 配列とからなり、 ｉ）及びｉｉ）の各配列が、同一のプロモーターの制御
    下にあるように位置し且つ翻訳終止シグナルと翻訳開始
    シグナルとによって分離されている発現ベクターを用意
    し、 （ｂ）を椎動物宿主細胞を（ａ）に記載のベクターでト
    ランスフェクトし、 　１− （Ｃ）第２タンパク質の産生に好都合な条イ！ｒ下で該
    宿主細胞を増殖する ことからなる前記タンパク質産生方法。 （２）　第２タンパク質がＤ　）−Ｉ　Ｆ　Ｒであるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （３）　所望のタンパク質がＨＢｓ△０であることを特
    徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （／Ｉ）　所望のタンパク質が）−ＩＢｓ　Ａｏである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の方法。 （５）　宿主細胞がＣＩ−１０細胞であることを特徴と
    する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （６）　宿主細胞がＤＨＦＲを欠損していることを特徴
    とする特許請求の範囲第２項に記載の方法。 （７）　宿主細胞がＣＨＯ細胞であることを特徴とする
    特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ２− （８）　トランスフェクトされた宿主細胞培養物がＤ　
    Ｉ−Ｉ　Ｆ　ＲＩ！ｆｌ害剤の存在下で生育することを
    特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の方法。 （９）　阻害剤がメ１〜ｉ〜レキセードであることを特
    徴とする特許請求の範囲第８項に記載の方法。 （１０）　　宿主細胞に於いて所望タンパク質の産生を
    制御する方法であって、 （ａ）所望タンパク質及びその発現が環境制御に支配さ
    れている第２タンパク質をコードしている配列を含み、
    双方の配列が同一のプロモーター配列に有効に結合して
    おり且つ翻訳終止シグナル及び翻訳開始シグナルによっ
    て分離されている発現ベクターで該宿主細胞をトランス
    フエフ１〜し、 （ｂ）第２タンパク質を］−ドしている配列の増幅を生
    起し得る１つ又はそれ以上の環境因子の存在下で細胞を
    培養すること からなる前記方法。 （１１）　　所望タンパク質、及び選択的培養条件下で
    の宿主細胞の生育のためにその存在が要求される第２タ
    ンパク質の双方のコード配列を含むベクターで細胞を処
    即し、選択的培養条件下で細胞を増殖することから成り
    、双方のコード配列が同一のプロモーター配列に有効に
    結合しており且つ翻訳終止及び開始コドンによって分離
    されていることを特徴とする、所望タンパク質を発現し
    得る発現ベクターでトランスフェクトされたを椎動物細
    胞を選択する方法。 （１２）　　第２タンパク質がＤＨＦＲであることを特
    徴とする特許請求の範囲第１１項に記載の方法。 （１３）　　選択的生育条件がグリシン、ヒボキサンチ
    ン及びデミジンを欠く培地であることを特徴とする特許
    請求の範囲第１２項に記載の方法。 （１４）　　その存在がトランスフエフ１〜された細胞
    に対する選択マーカーとして作用し所望タンパク質の］
    −ド配列の下流にある第２タンパク質のコード配列を含
    むベクターで細胞を処理し、選択的培養条件下で細胞を
    増殖させることからなり、両］−ド配列が同一のプロモ
    ーター配列に有効に結合しており且つ翻訳終止及び開始
    シグナルによって分離されていることを特徴とする、所
    望の異種タンパク質を高レベルで産生ずるを椎動物細胞
    を選択する方法。 （１５）　　第２タンパク質がＤ　ＨＦ　Ｒであること
    を特徴とする特許請求の範囲第１４項に記載の方法。 （１６）　　選択的生育条件がグリシン、ヒポキサンチ
    ン及びデミジンを欠く培地であることを特徴とする特許
    請求の範囲第１５項に記載の方法。 （１７）　　特許請求の範囲第１項に記載の方法によっ
    てを椎動物細胞培養で産生された所望タンパク質。 （１８）　　所望タンパク質をコードするＤＮＡ配列と
    第２タンパク質をコードするＤＮＡ配列どを含み、両Ｄ
    ＮＡ配列が同一のプロモーター配列に有効に結合し口つ
    翻訳終止及び開始コドンによって分離されており、を椎
    動物宿主細胞培養で所望タンパク質及び第２タンパク質
    を発現し得る発現ベクター。 （１９）　　第２タンパク質の］−ド配列がＤ　Ｉ−Ｉ
    　Ｆ　Ｒをコードしていることを特徴とする特許請求の
    範囲第１８項に記載の発現ベクター。 （２０）　　プロモーター配列がＳＶ４０に由来する初
    期プロモータであることを特徴とする特許請求の範囲第
    １８項に記載の発現ベクター。 （２１）　　　１）Ｆ３４８．ＨＢＶ、　Ｄ２２である
    ことを特徴とする特許請求の範囲第２０項に記載の発現
    ベクター　〇 （２２）　　特許請求の範囲第１８項に記載のベクター
    で形質転換されたを椎動物細胞。 （２３）　　所望の異種タンパク質の］−ド配列と第２
    タンパク貿の］−ド配列とを含み、両コード配列が同一
    のプロモーターに有効に結合し且つ翻訳終止及び開始］
    トンによって分離されており、第２タンパク質をコード
    する配列が所望タンパク質を］−ドする配列の下流にあ
    る、ポリシストロン性発環ベクター。 （２４）　　第２タンパク質のコード配列がＤＨＦＲを
    コードしていることを特徴とする特許請求の範囲第２３
    項に記載の発現ベクター。
JP59007899A 1983-01-19 1984-01-19 ポリシストロン性発現ベクターおよびそれを用いた方法 Expired - Lifetime JPH0630609B2 (ja)

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