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CN104704118A - 凝血因子vii多肽 - Google Patents

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CN104704118A
CN104704118A CN201380053832.3A CN201380053832A CN104704118A CN 104704118 A CN104704118 A CN 104704118A CN 201380053832 A CN201380053832 A CN 201380053832A CN 104704118 A CN104704118 A CN 104704118A
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factor vii
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CN201380053832.3A
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H.R.斯坦尼克
O.H.奧森
H.奧斯特加亚尔德
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Novo Nordisk Health Care AG
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Novo Nordisk Health Care AG
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Abstract

本发明涉及具有凝结剂活性的经修饰的凝血因子VII(因子VII)多肽，以及编码表达此类多肽的多核苷酸构建体、包含且表达此类多核苷酸的载体和宿主细胞、药物组合物、用途和治疗方法。

Description

凝血因子VII多肽
技术领域
本发明涉及具有促凝活性的经修饰的凝血因子VII (因子VII)多肽。它还涉及编码此类多肽的多核苷酸构建体、包含且表达此类多核苷酸的载体和宿主细胞、包含此类多肽的药物组合物、以及此类多肽的用途和治疗方法。
通过引用并入本文的序列表
SEQ ID NO: 1：野生型人凝血因子VII。
发明背景
对血管的损伤活化止血系统，其涉及细胞和分子组分之间的复杂相互作用。最终引起出血停止的过程称为止血。止血的重要部分是在损伤部位处的血液凝固和凝块形成。凝血过程高度依赖几种蛋白质分子的功能。这些称为凝血因子。凝血因子中的一些是可以以失活酶原或酶促活性形式存在的蛋白酶。通过由另一种蛋白酶解活性凝血因子催化的多肽链的特异性切割，酶原形式可以转换为其酶促活性形式。因子VII是在肝中合成且作为单链糖蛋白分泌到血液内的维生素K依赖性血浆蛋白质。通过在单个位点处即在SEQ ID NO: 1的R152和I153之间的特异性蛋白酶解切割，因子VII酶原转换为活性形式(因子VIIa)，产生由单个二硫键连接的双链分子。因子VIIa中的两条多肽链被称为轻和重链，分别对应于SEQ ID NO: 1(野生型人凝血因子VII)的残基1-152和153-406。因子VII占优势地作为酶原循环，但较少部分采取活化形式(因子VIIa)。
血液凝固过程可以分成三个时期：初始、扩大和传播。初始和传播期促使凝血酶形成，所述凝血酶是在止血中具有许多重要功能的凝血因子。如果排列在血管内表面的内皮细胞的单层屏障发生受损，则凝血级联起始。这暴露出血液中的血小板将与之粘附的内皮下细胞和血管外基质蛋白质。如果这发生，则存在于内皮下细胞表面上的组织因子(TF)变得暴露于在血液中循环的因子VIIa。TF是膜结合蛋白质，并且充当因子VIIa的受体。因子VIIa是具有固有的低活性的酶，即丝氨酸蛋白酶。然而，当因子VIIa与TF结合时，它的活性极大增加。因子VIIa与TF相互作用也将因子VIIa定位于具有TF的细胞的磷脂表面上，并且将其最佳放置用于将因子X活化为Xa。当这发生时，因子Xa可以与因子Va组合，以在具有TF的细胞的表面上形成所谓的“凝血酶原酶”复合物。凝血酶原酶复合物随后通过切割凝血酶原而生成凝血酶。通过使TF暴露于循环因子VIIa而活化且导致凝血酶的初始生成的途径称为TF途径。TF:因子VIIa复合物也催化因子IX至因子IXa的活化。随后活化因子IXa可以扩散至血小板表面，所述血小板粘附至损伤部位且已活化。这允许因子IXa与FVIIIa组合，以在活化血小板的表面上形成“tenase”复合物。由于其在将因子X活化为Xa中的显著效率，该复合物在传播期中起关键作用。有效的tenase催化的因子Xa活性的产生，进而又导致由凝血酶原酶复合物催化的凝血酶原至凝血酶的有效切割。
如果在因子IX或因子VIII中存在任何缺陷，则它损害重要的tenase活性，并且降低凝血所需的凝血酶产生。最初由TF途径形成的凝血酶充当促凝信号，其鼓励血小板在损伤部位处的召募、活化和聚集。这导致松散的原始血小板塞的形成。然而，该原始血小板塞是不稳定的且需要强化以支持止血。塞的稳定涉及将血小板锚定且纠缠在纤维蛋白纤维网中。
坚固且稳定的凝块的形成依赖于产生局部凝血酶活性的强爆发。因此，在血管损伤后导致凝血酶生成的过程中的缺陷可以导致出血障碍，例如A和B型血友病。具有A和B型血友病的人分别缺乏功能因子VIIIa或因子IXa。在传播期中的凝血酶生成严重依赖tenase活性，即需要因子VIIIa和FIXa两者。因此，在具有A或B型血友病的人中，无法进行原始血小板塞的适当固结，且持续出血。
替补疗法是用于A和B型血友病的传统治疗，并且涉及因子VIII或因子IX的静脉内施用。然而，在许多情况下，患者产生针对输注蛋白质的抗体(也称为抑制剂)，这降低或取消治疗的功效。重组因子VIIa (Novoseven?)已被批准用于治疗具有抑制剂的A或B型血友病患者，并且还用于终止出血发作或预防与创伤和/或手术相关的出血。重组因子VIIa也已被批准用于治疗具有先天性因子VII缺陷的患者。已提出重组FVIIa通过不依赖TF的机制运转。根据该模型，重组FVIIa由于其Gla结构域导向活化血液血小板的表面，在此处，它随后将因子X蛋白酶解活化为Xa，因此绕过功能性tenase复合物的需要。在不存在TF的情况下，FVIIa的低酶促活性以及Gla结构域对于膜的低亲和力可以解释实现具有血友病的人中的止血所需的超生理学水平的循环FVIIa的需要。
重组因子VIIa具有2-3小时的体内功能半衰期，其可能需要频繁施用以解决患者中的出血。进一步地，患者通常仅在出血已开始后接受因子VIIa疗法，而不是作为预防措施，这通常影响其一般生活质量。具有更长的体内功能半衰期的重组因子VIIa变体将降低所需施用数目，支持更不频繁的给药且因此保留出于患者和护理持有者(care-holder)的利益显著改善因子VIIa疗法的希望。
WO2007031559 (7012)公开了对通过抗凝血酶的抑制敏感性降低的因子VII变体。
WO2009126307 (催化剂)公开了促凝活性改变的经修饰的因子VII多肽。
一般而言，在具有凝血病的人中存在许多未满足的医疗需要。重组因子VIIa促进凝块形成的用途突出了其作为治疗剂的增长的重要性。然而，重组因子VIIa疗法仍留下显著未满足的医疗需要，并且存在具有改善的药学特性，例如增加的体内功能半衰期和改善的活性的重组因子VIIa多肽的需要。
发明概述
本发明提供了经修饰的因子VII多肽，其经涉及而具有改善的药学特性。在广泛方面，本发明涉及与人野生型因子VIIa相比较，显示出增加的体内功能半衰期的因子VII多肽。在另一个广泛方面，本发明涉及因子VII多肽，其显示出对通过内源血浆抑制剂特别是抗凝血酶的失活的抗性增加。在进一步广泛方面，本发明涉及具有增强或基本上保持的活性的因子VII多肽。
本文提供的是具有增加的体内功能半衰期的因子VII多肽，其包含赋予增强的对抗凝血酶失活的抗性和很少或无蛋白酶解活性丧失的突变组合。在本发明的特别有利的方面，因子VII多肽与一种或多种“延长半衰期的基团”偶联，以增加体内功能半衰期。
在一个方面，本发明涉及相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，包含两个或更多个取代的因子VII (a)多肽，
其中所述取代中的至少一个是其中T293已替换为Lys(K)、Tyr(Y)、Arg(R)或Phe(F)；其中Q176已替换为Lys(K)、Arg(R)、Asn(N)；和/或Q286已替换为Asn(N)，并且其中所述取代中的至少一个是其中M298已替换为Gln(Q)、Lys(K)、Arg(R)、Asn(N)、Gly(G)、Pro(P)、Ala (A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)、Asp(D)、Glu(E)、His(H)、Cys(C)、Ser(S)或Thr(T)。
在有利实施方案中，本发明涉及与至少一种延长半衰期的部分偶联的因子VII (a)多肽。
在另一个方面，本发明涉及用于产生本发明的因子VII (a)多肽的方法。
在进一步方面，本发明涉及包含本发明的因子VII (a)多肽的药物组合物。
本发明的一般目的是改善目前在具有凝血病的人中可用的治疗选择，且获得具有改善的治疗效用的因子VII多肽。本发明具有的一个目的是获得因子VII多肽，其具有延长的体内功能半衰期，同时维持药学可接受的蛋白酶解活性。为了实现这点，本发明的因子VII多肽包含突变组合，所述突变赋予对通过血浆抑制剂抗凝血酶的失活的降低的敏感性，同时基本上保存蛋白酶解活性；在本发明特别有利的实施方案中，因子VII多肽还与一种或多种“延长半衰期的基团”偶联。
用本发明的经修饰的因子VII多肽的医学治疗提供了超过目前可用的治疗方案的许多优点，例如在注射间更长的持续时间、更低的剂量、更方便的施用和在注射间潜在改善的止血保护。
附图简述
图1显示了因子VIIa/抗凝血酶(AT)复合物的模型。通过经由CA原子的最小二乘法拟合程序重叠FVIIa (根据FVIIa和TF的复合物的x射线结构，pdb条目：1dan；Banner等人1996)和FXa (根据FXa和AT的复合物的x射线结构，pdb条目：2gd4；Johnson等人2006)的蛋白酶结构域，且仅保留FVIIa和抗凝血酶来生成该模型。在左取向中，将抗凝血酶(白色，以草图表示)置于FVIIa (以固体表面表示)之上，且在右取向中，显示了进入FVIIa的活性位点(以黑色表示)和底物结合裂缝内的视图。FVIIa表面的深灰色区域表示已就通过点诱变降低的抗凝血酶结合而探究的区域。特别地，氨基酸残基Q176、Q286和T293 (以黑色表示)已通过饱和诱变得到探究。
图2显示了来自多个物种的FVIIa重链的序列比对(Higgins等人1992)：人、黑猩猩、犬、猪、牛、小鼠、大鼠和兔。上部和下部的序列编号分别对应于胰凝乳蛋白酶和FVII序列编号系统。对带有下划线的残基实施突变。
图3显示了在静脉内施用于Sprague Dawley大鼠后，作为凝结活性(凝结)和FVIIa-抗凝血酶复合物EIA (AT)水平的半对数曲线的FVIIa变体的药物代谢动力学概况。对于几种化合物，FVIIa-抗凝血酶复合物的浓度在所有或几个时间点低于测定的检测极限，如通过曲线上的数据点缺失所示。数据显示为平均值± SD (n=3)，其中凝结活性和FVIIa-抗凝血酶水平转换为nM。图的标题描述了所施用化合物的特性。估计的药物代谢动力学参数在表3中给出。
图4显示了测量的FVIIa-抗凝血酶复合物的体外抗凝血酶反应性和体内峰水平之间的关系。如实施例12中详述的，对于许多未经修饰的FVIIa变体，测定了在静脉内施用于Sprague Dawley大鼠后的FVIIa-抗凝血酶复合物的峰水平(指示为Cmax FVIIa-AT)。线性关系证实体外FVIIa变体筛选操作的预测性。
图5显示了在FVIII缺陷小鼠(n = 6/剂量)的尾部尖端4 nm横切前5分钟静脉内给药的FVIIa Q176K和野生型FVIIa的急性剂量应答。结果作为平均值± SEM给出。分别计算了失血ED50，对于野生型FVIIa为1.8 mg/kg，并且对于FVIIa Q176K为2.6 mg/kg，p=0.50。
图6显示了从1) FVIIa突变体Q176K和2) 1DAN结构的催化结构域、重链的LSQKAB叠加计算获得的各个Cα-Cα距离(Banner, D'Arcy, Chène, Winkler, Guha, Konigsberg, Nemerson, & Kirchhofer，1996)。关于残基176的Cα-Cα距离由黑点指示。
图7显示了抗凝血酶和FVIIa Q176K之间的复合物的理论模型。在充填空间中的是两个残基：FVIIa突变体Q176K的Lys 176和抗凝血酶的Arg 399的相对位置。该模型由抗凝血酶/FXa复合物的结构构建(Johnson, Li, Adams, & Huntington, 2006)，其中FXa分子已被FVIIa突变体Q176K分子的重链重迭。FVIIa、FXa和抗凝血酶的主链以丝带表示法显示。FVIIa的残基Lys 176和Arg 399分别标记为FVIIa-176K和ATIII-399R。
发明详述
本发明涉及因子VII多肽的设计和用途，所述因子VII多肽显示出增加的体内功能半衰期、对通过血浆抑制剂抗凝血酶的失活的降低的敏感性和保持的蛋白酶解活性。本发明的发明人已发现人因子VII中的突变的特异性组合和与延长半衰期的部分的缀合的组合赋予上述特性。本发明的因子VII多肽具有在血液中延长的功能半衰期，这在需要更持久的促凝活性的情况下是治疗上有用的。
本发明涉及相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，包含两个或更多个取代的因子VII (a)多肽，
其中所述取代中的至少一个是其中T293已替换为Lys(K)、Tyr(Y)、Arg(R)或Phe(F)；其中Q176已替换为Lys(K)、Arg(R)、Asn(N)；和/或Q286已替换为Asn(N)，并且其中所述取代中的至少一个是其中M298已替换为Gln(Q)、Lys(K)、Arg(R)、Asn(N)、Gly(G)、Pro(P)、Ala (A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)、Asp(D)、Glu(E)、His(H)、Cys(C)、Ser(S)或Thr(T)。
因子VII
凝血因子VII (因子VII)是主要在肝中产生的糖蛋白。成熟蛋白质由通过SEQ ID NO: 1限定的406个氨基酸残基组成，并且由四个结构域组成。存在N末端富含γ-羧基谷氨酸(Gla)的结构域，随后为两个表皮生长因子(EGF)样结构域和C末端胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域。因子VII在血浆中主要作为单链分子循环。因子VII通过在残基Arg152和Ile153之间的切割活化为因子VIIa，产生由二硫键保持在一起的双链蛋白质。轻链含有Gla和EGF样结构域，而重链是蛋白酶结构域。根据SEQ ID NO: 1在因子VII中的特异性Glu(E)残基，即E6、E7、E14、E16、E19、E20、E25、E26、E29和E35，可以进行翻译后γ羧化。Gla结构域中的γ羧基谷氨酸残基是许多钙离子配位所需的，其使Gla结构域维持在介导与磷脂膜的相互作用的构象中。
术语“因子VII (a)”包含未切割的单链酶原，因子VII，以及切割的双链和因此活化的蛋白酶，因子VIIa。“因子VII (a)”包括因子VII (a)的天然等位基因变体，其可以存在于个体中且在每个个体中彼此不同。野生型人因子VII序列在SEQ ID NO: 1中提供。
因子VII (a)可以使用众所周知的生产和纯化方法，从血浆衍生或重组产生。糖基化、γ羧化及其他翻译后修饰的程度和位置可以取决于所选宿主细胞及其生长条件而改变。
因子VII多肽
术语“因子VII (a)多肽”在本文中指野生型因子VII (a)分子以及因子VII (a)变体和因子VII (a)缀合物。相对于野生型人因子VIIa，此类变体和缀合物可以显示出基本上相同或改善的活性。
如本文使用的，术语因子VII多肽的“活性”指由野生型人因子VII (a)显示出的任何活性，并且包括但不限于凝结或凝结剂活性、促凝活性、蛋白酶解或催化活性例如实现因子X活化或因子IX活化；结合TF、因子X或因子IX的能力；和/或与磷脂结合的能力。这些活性可以使用公认的测定在体外或体内进行评价，例如通过测量体外或体内凝血。此类测定的结果指示多肽显示出可以与多肽体内活性关联的活性，其中体内活性可以被称为生物活性。测定因子VII多肽的活性的测定是本领域技术人员已知的。评价FVII多肽活性的示例性测定包括体外蛋白酶解测定，例如在下文实施例中所述。
如本文使用的，术语“增加或保持的活性”指与野生型人因子VIIa相比较，显示出基本上相同或增加的活性的因子VIIa多肽，例如i)在TF的存在和/或不存在下，与重组野生型人因子VIIa相比较，基本上相同或增加的蛋白酶解活性；ii)与重组野生型人因子VIIa相比较，具有基本上相同或增加的TF亲和力的因子VII (a)多肽；iii)对于活化血小板具有基本上相同或增加的亲和力的因子VII (a)多肽；或iv)与重组野生型人因子VIIa相比较，具有基本上相同或增加的结合因子X或因子IX的亲和力/能力的因子VII (a)多肽。例如，保持的活性意指与野生型人因子VIIa相比较，保留的活性的量是或是约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多活性。
如本文使用的，术语“因子VII (a)变体”意指具有SEQ ID NO: 1的序列的因子VII，其中亲本蛋白质的一个或多个氨基酸已由另一种天然存在的氨基酸取代，和/或其中亲本蛋白质的一个或多个氨基酸已缺失，和/或其中一个或多个氨基酸已插入到蛋白质中，和/或其中一个或多个氨基酸已加入到亲本蛋白质中。此类添加可在亲本蛋白质的N-或C-末端或两者处发生。在一个实施方案中，变体与SEQ ID NO: 1的序列至少95%相同。在另一个实施方案中，变体与SEQ ID NO: 1的序列至少99%相同。如本文使用的，对特定位置的任何提及指SEQ ID NO: 1中的相应位置。
在本说明书中使用的氨基酸取代的术语如下。第一个字母表示在SEQ ID NO:1的位置处天然存在的氨基酸。随后数目表示在SEQ ID NO:1中的位置。第二个字母表示取代天然氨基酸的不同氨基酸。实例是K197A-因子VII，其中在SEQ ID NO:1的位置197处的赖氨酸替换为丙氨酸。
在本文背景下，如表1中所示，氨基酸的三字母或单字母缩写已以其常规含义使用。除非另有明确说明，本文提及的氨基酸是L-氨基酸。
表1：氨基酸缩写
如本文使用的，术语“因子VII (a)缀合物”意指相对于野生型因子VII (a)，显示出基本上相同或改善的生物活性的因子VII多肽，其中氨基酸中的一个或多个或所连接的聚糖链中的一条或多条已进行化学和/或酶促修饰，例如通过烷基化、糖基化、酰化、酯形成、二硫键形成或酰胺形成。
相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，本发明的因子VII多肽包含两个或更多个取代，
其中所述取代中的至少一个是其中T293已替换为Lys(K)、Tyr(Y)、Arg(R)或Phe(F)；其中Q176已替换为Lys(K)、Arg(R)、Asn(N)；和/或Q286已替换为Asn(N)，并且其中所述取代中的至少一个是其中M298已替换为Gln(Q)、Lys(K)、Arg(R)、Asn(N)、Gly(G)、Pro(P)、Ala (A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)、Asp(D)、Glu(E)、His(H)、Cys(C)、Ser(S)或Thr(T)。
在一系列有利实施方案中，本发明涉及因子VII多肽，其中所述多肽具有下述取代的组之一：T293K/M298Q、T293Y/M298Q、T293R/M298Q、T293F/M298Q、Q176K/M298Q、Q176R/M298Q、Q176N/M298Q、Q286N/M298Q、T293Y/V158D/E296V/M298Q、T293R/V158D/E296V/M298Q、T293K/V158D/E296V/M298Q、Q176K/V158D/E296V/M298Q和Q176R/V158D/E296V/M298Q。
半衰期 - 对通过血浆抑制剂的失活的抗性
除体内清除之外，体内功能半衰期也对化合物在体内是“治疗上可用的”的时间段具有重要性。重组人野生型因子VIIa的循环的半衰期是约2.3小时(“Summary Basis for Approval for NovoSeven?"，FDA参考号96 0597)。
术语“体内功能半衰期”以其通常含义使用，即，使体内/靶器官内剩余的因子VII多肽生物活性在末期中降低50%所需的时间，或因子VII多肽的活性是其初始值50%的时间。体内半衰期的替代术语包括终末半衰期、血浆半衰期、循环的半衰期、循环半衰期和清除半衰期。体内功能半衰期可以通过本领域已知的任何合适方法进行测定，如下文进一步讨论的(实施例12)。
如关于体内功能半衰期或血浆半衰期使用的，术语“增加的”用于指示如在可比较条件下测定的，多肽的有关半衰期相对于参考分子，例如野生型人因子VIIa的半衰期增加。
在一个方面，相对于野生型人因子VIIa，本发明的因子VIIa多肽显示出增加的体内功能半衰期。例如，有关半衰期可以增加至少约25%，例如至少约50%，例如至少约100%、150%、200%、250%或500%。
尽管对凝血级联的生物化学和病理生理学有详细的理解，但个别凝血因子从循环中清除的机制基础在很大程度上仍是未知的。与其他维生素K依赖性蛋白质的酶原和酶形式相比较，因子VII及其活化形式因子VIIa的循环半衰期中的显著差异提示存在因子VIIa的特异性和不同清除机制。两类途径看起来在因子VIIa的清除中是可操作的 - 一种导致完整蛋白质的消除，另一种由血浆抑制剂介导且导致蛋白酶解失活。
抗凝血酶III(抗凝血酶，AT)是丰富的血浆抑制剂，且靶向凝血系统的大多数蛋白酶，包括因子VIIa。它以微摩尔浓度存在于血浆中，并且属于丝氨酸蛋白酶抑制剂的serpin家族，其通过自杀底物机制不可逆地结合靶蛋白酶且使靶蛋白酶失活。通过抗凝血酶的抑制看起来促成在静脉内施用后的体内重组因子VIIa占优势清除途径。在血友病患者中的重组因子VIIa的药物代谢动力学的近期研究中，约60%的总清除率可以归因于该途径(Agerso等人，(2011) J Thromb Haemost, 9, 333-338)。
在一些实施方案中，相对于野生型人因子VIIa，本发明的因子VII (a)多肽显示出对通过内源血浆抑制剂特别是抗凝血酶的失活的增加的抗性。
在本发明的一个实施方案中，由于对通过抑制剂(例如内源血浆抑制剂，如抗凝血酶)的失活的抗性，因子VIIa多肽显示出增加的半衰期。由于与天然因子VIIa相比较，本发明的因子VII (a)多肽对抑制的更高抗性，较低剂量可能足以在作用部位处获得功能上足够的浓度，并且因此其可以以更低剂量和/或以更低频率施用于具有出血发作的受试者和/或需要增强正常止血系统的受试者。
本发明的发明人已发现具有下述突变T293Y、T293R、T293K、Q176K、Q176R、Q286N的因子VII多肽赋予增加的对抗凝血酶失活的抗性。不受理论束缚，这些因子VIIa多肽变体对抑制剂失活的该抗性可能是以不依赖TF的活性减小为代价而实现，这可以代表这些因子VIIa多肽变体就活性而言的缺点。
已知具有下述突变M298Q和V158D/E296V/M298Q的因子VIIa多肽赋予增加的蛋白酶解活性。然而，这些因子VIIa多肽变体还显示对抑制剂失活的敏感性增加，这可以代表这些因子VIIa多肽变体就体内功能半衰期而言的缺点。
本发明的发明人已发现通过组合上文提及的这两组突变，实现增加或保持的活性，同时维持对抑制剂失活的高抗性。也即，包含突变组合的本发明的因子VII多肽显示出对抗凝血酶失活的增加的抗性，以及基本上保持的蛋白酶解活性。当本发明的因子VII多肽与一种或多种延长半衰期的部分缀合时，实现惊人的对半衰期延长的改善作用。考虑到这些特性，本发明的此类缀合的因子VII多肽显示出改善的循环半衰期，同时维持药学可接受的蛋白酶解活性。
另外的修饰
本发明的因子VII多肽可以包含进一步修饰，特别是对因子VII多肽赋予另外的有利特性的进一步修饰。因此，除上文提及的至少两个取代之外，本发明的因子VII多肽可以例如包含进一步的氨基酸修饰，例如一个进一步的氨基酸取代。在一个此类实施方案中，本发明的因子VII多肽具有选自R396C、Q250C和407C的另外突变或添加，如例如WO2002077218中所述。
本发明的因子VII多肽可以包含另外的修饰，其在或不在因子VII多肽的一级序列中。另外的修饰包括但不限于碳水化合物部分的添加、延长半衰期的部分的添加例如PEG部分、Fc结构域的添加等。例如，可以进行此类另外的修饰，以增加因子VII多肽的稳定性或半衰期。
延长半衰期的部分或基团
术语“延长半衰期的部分”和“延长半衰期的基团”在本文中可互换使用，并且应理解为指连接至一种或多种氨基酸位点链官能的一种或多种化学基团，例如-SH、-OH、-COOH、-CONH2、-NH2，或者一种或多种N和/或O聚糖结构，并且当缀合至这些蛋白质/肽时，可以增加蛋白质/肽的体内循环半衰期。延长半衰期的部分的实例包括：生物相容性脂肪酸及其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)例如羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)n (HAP)、透明质酸(HA)、肝素前体聚合物(Heparosan polymers; HEP)、基于磷酰胆碱的聚合物(PC聚合物)、Fleximers、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样肽(ELP)、XTEN聚合物、PAS聚合物、PA聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽、FcRn结合肽，及其任何组合。
在特别有利的实施方案中，本发明的因子VII多肽与一种或多种持久基团/延长半衰期的部分偶联。
在一个实施方案中，本发明的半胱氨酸缀合的因子VII多肽具有缀合至引入因子VII多肽中的半胱氨酸的硫氢基的一种或多种疏水延长半衰期的部分。此外能够将持久的延长半衰期的部分连接至其他氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明的因子VII多肽与组织因子二硫键连接，如例如WO2007115953中所述。
在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是具有增加的血小板亲和力的因子VIIa变体。
PEG化衍生物
根据本发明的“PEG化因子VII多肽变体/衍生物”可以具有连接至FVII多肽的任何部分，包括因子VII多肽的任何氨基酸残基或碳水化合物部分的一种或多种聚乙二醇(PEG)分子。化学和/或酶促方法可以用于使PEG或其他持久基团缀合至因子VII多肽上的聚糖。酶促缀合过程的实例例如在WO03031464中描述。聚糖可以是天然存在的，或它可以使用本领域众所周知的方法，例如通过在因子VII的氨基酸序列中引入N糖基化基序(NXT/S，其中X是任何天然存在的氨基酸)中而改造。根据本发明的“半胱氨酸-PEG化因子VII多肽变体”具有缀合至存在于或引入到FVII多肽中的半胱氨酸残基的硫氢基的一种或多种PEG分子。
肝素前体缀合物
根据本发明的因子VII多肽肝素前体缀合物可以具有连接至FVII多肽的任何部分，包括因子VII多肽的任何氨基酸残基或碳水化合物部分的一种或多种肝素前体聚合物(HEP)分子。化学和/或酶促方法可以用于使HEP缀合至因子VII多肽上的聚糖。酶促缀合过程的实例例如在WO03031464中描述。聚糖可以是天然存在的，或它可以使用本领域众所周知的方法，例如通过在因子VII的氨基酸序列中引入N糖基化基序(NXT/S，其中X是任何天然存在的氨基酸)中而改造。
根据本发明的“半胱氨酸-HEP因子VII多肽缀合物”具有缀合至存在于或引入到FVII多肽中的半胱氨酸残基的硫氢基的一种或多种HEP分子。
在本发明的一个有利实施方案中，因子VII多肽偶联至HEP聚合物。
融合蛋白
融合蛋白是通过两种或更多种DNA序列的框内连接制备的蛋白质，所述DNA序列最初编码分开的蛋白质或肽或其片段。融合蛋白DNA序列的翻译将导致单一蛋白质序列，其可以具有衍生自原始蛋白质或肽的每一个的功能特性。编码融合蛋白的DNA序列可以通过标准分子生物学方法，例如重叠PCR或DNA连接人工制备，并且执行装配，排除在第一个5'末端DNA序列中的终止密码子，同时保留在3'末端DNA序列中的终止密码子。所得到的融合蛋白DNA序列可以插入适当的表达载体内，所述表达载体支持在标准宿主生物例如细菌、酵母、真菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞中的异源融合蛋白表达。
融合蛋白可以含有接头或间隔肽序列，其使限定融合蛋白的蛋白质或肽部分分开。接头或间隔肽序列可以促进单个的蛋白质或肽部分的正确折叠，并且可以使得单个的蛋白质或肽部分更可能保留其个体的功能特性。接头或间隔肽序列可以在完全融合蛋白DNA序列的单个DNA片段的框内装配期间，即在重叠PCR或DNA连接期间，插入融合蛋白DNA序列内。
Fc融合蛋白
术语“Fc融合蛋白”在本文中意欲包含融合至Fc结构域的本发明的因子VII多肽，所述Fc结构域可以衍生自任何抗体同种型。由于IgG抗体的相对长的循环半衰期，IgG Fc结构域通常是优选的。Fc结构域可以另外进行修饰，以便调节某些效应子功能例如补体结合和/或与某些Fc受体结合。与wt FVII多肽的半衰期相比较，FVII多肽与Fc结构域的融合一般导致融合蛋白的循环半衰期延长，所述Fc结构域具有与FcRn受体结合的能力。IgG Fc结构域中的位置234、235和237中的突变一般导致与FcγRI受体的结合降低，并且可能还导致与FcγRIIa和FcγRIII受体的结合降低。这些突变不改变与FcRn受体的结合，这通过胞吞再循环途径促进长循环半衰期。优选地，根据本发明的融合蛋白的经修饰的IgG Fc结构域包含下述突变中的一种或多种，其分别导致与某些Fc受体的亲和力减少(L234A、L235E和G237A)，且导致C1q介导的补体固定降低(A330S和P331S)。可替代地，Fc结构域可以是IgG4 Fc结构域，优选包含S241P/S228P突变。
因子VII多肽的产生
在一个方面，本发明涉及用于产生因子VII多肽的方法。本文描述的因子VII多肽可以借助于重组核酸技术产生。一般地，克隆的人野生型因子VII核酸序列进行修饰，以编码所需蛋白质。该修饰序列随后插入表达载体内，所述表达载体进而转化或转染到宿主细胞内。高等真核细胞特别是培养的哺乳动物细胞作为宿主细胞是优选的。
在进一步的方面，本发明涉及包含且表达所述多核苷酸构建体的转基因动物。
在进一步的方面，本发明涉及包含且表达所述多核苷酸构建体的转基因植物。
人野生型因子VII的完全核苷酸和氨基酸序列是已知的(参见U.S. 4,784,950，其中描述了重组人因子VII的克隆和表达)。
氨基酸序列改变可以通过多种技术来完成。核酸序列的修饰可以是通过位点特异性诱变。用于位点特异性诱变的技术是本领域众所周知的，并且在例如Zoller和Smith (DNA 3:479-488，1984)或"Splicing by extension overlap"，Horton等人，Gene 77，1989，第61-68页中描述。因此，使用因子VII的核苷酸和氨基酸序列，可以引入所选择的一种或多种改变。同样地，使用特异性引物，使用聚合酶链反应制备DNA构建体的操作是本领域技术人员众所周知的(参照PCR Protocols, 1990,Academic Press, San Diego, California, USA)。
编码本发明的因子VII多肽的核酸构建体可以适当地为基因组或DNA起源，例如通过制备基因组或cDNA文库，且依照标准技术，使用合成寡核苷酸探针，通过杂交筛选编码全部或部分的多肽的DNA序列而获得(参照Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York，1989)。
编码因子VII多肽的核酸构建体还可以通过确定的标准方法合成制备，所述方法例如由Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letters 22(1981)，1859 - 1869描述的亚磷酰胺方法，或由Matthes等人，EMBO Journal 3(1984)，801 - 805描述的方法。根据亚磷酰胺方法，例如在自动化DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化，退火，连接且克隆到合适载体中。编码人因子VII多肽的DNA序列还可以通过聚合酶链反应使用特异性引物进行制备，例如如US 4,683,202，Saiki等人，Science 239(1988)，487 - 491，或Sambrook等人，同上中所述。
此外，核酸构建体可以具有混合的合成和基因组、混合的合成和cDNA或混合的基因组和cDNA起源，依照标准技术，通过连接合成、基因组或cDNA起源(适当时)的片段制备，所述片段对应于整个核酸构建体的多个部分。
核酸构建体优选是DNA构建体。用于产生根据本发明的因子VII多肽的DNA序列通常编码在因子VII的氨基末端处的前原多肽，以获得适当的翻译后加工(例如谷氨酸残基的γ羧化)，且从宿主细胞中分泌。前原多肽可以是因子VII或另一种维生素K依赖性血浆蛋白质例如因子IX、因子X、凝血酶原、蛋白C或蛋白S的那种。如本领域技术人员应当理解的，可以在因子VII多肽的氨基酸序列中进行另外的修饰，其中这些修饰不显著损害该蛋白质充当凝结剂的能力。
编码人因子VII多肽的DNA序列通常插入重组载体内，所述重组载体可以是任何载体，其可以方便地进行重组DNA操作，并且载体的选择通常依赖于它待引入其内的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。可替代地，载体可以是这样的载体，当引入宿主细胞内时，其整合到宿主细胞基因组内且连同它已整合到其内的一条或多条染色体一起复制。
载体优选是其中编码人因子VII多肽的DNA序列可操作地连接至DNA转录所需的另外区段的表达载体。一般地，表达载体衍生自质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。术语“可操作地连接”指示区段如此排列，从而使得它们对于其预期目的协同地发挥作用，例如转录在启动子中起始且进行通过编码多肽的DNA序列。
用于表达因子VIIa多肽变体的表达载体可包含能够指导克隆的基因或cDNA转录的启动子。启动子可以是任何DNA序列，其显示在选择的宿主细胞中的转录活性，并且可以衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。
指导编码人因子VII多肽的DNA在哺乳动物细胞中转录的合适启动子的实例是SV40启动子(Subramani等人, Mol. Cell Biol. 1(1981)，854 -864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Pal-miter等人, Science 222(1983), 809 - 814)、CMV启动子(Boshart等人, Cell 41:521-530, 1985)或腺病毒2主要晚期启动子(Kaufman和Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982)。
用于在昆虫细胞中使用的合适启动子的实例是多角体蛋白启动子(US 4,745,051；Vasuvedan等人，FEBS Lett. 311,(1992)7 - 11)、P10启动子(J.M. Vlak等人，J. Gen. Virology 69，1988，第765-776页)、苜蓿丫纹夜蛾(Autographa　californica)多角体病毒碱性蛋白质启动子(EP 397 485)、杆状病毒立即早期基因1启动子(US 5,155,037；US 5,162,222)、或杆状病毒39K迟早期基因启动子(US 5,155,037；US 5,162,222)。
用于在酵母宿主细胞中使用的合适启动子的实例包括来自酵母糖酵解基因(Hitzeman等人，J. Biol. Chem. 255 (1980)，12073 - 12080；Alber和Kawasaki，J. Mol. Appl. Gen. 1(1982)，419 - 434)或醇脱氢酶基因(Young等人，in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaen-der等人，编辑)，Plenum Press，New York，1982)的启动子、或者TPI1 (US 4,599,311)或ADH2-4c (Russell等人，Nature 304(1983)，652 - 654)启动子。
用于在丝状真菌宿主细胞中使用的合适启动子的实例是例如ADH3启动子(McKnight等人，The EMBO J. 4(1985)，2093 - 2099)或tpiA启动子。其他有用的启动子的实例是衍生自编码米曲霉(A. oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizo-mucor　miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A. niger)中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A. awamori)葡糖淀粉酶(gluA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(A. nidulans)乙酰胺酶的基因的那些启动子。优选的是TAKA淀粉酶和gluA启动子。合适启动子在例如EP 238 023和EP 383 779中提及。
如果需要，编码因子VII多肽的DNA序列也可操作地连接至合适终止子，例如人生长激素终止子(Palmiter等人，Science 222，1983，第809-814页)、或者TPI1 (Alber和Kawasaki，J. Mol. Appl. Gen. 1，1982，第419-434页)或ADH3 (McKnight等人，The EMBO J. 4，1985，第2093-2099页)终止子。表达载体还可以含有位于启动子下游和因子VII序列自身的插入位点上游的一组RNA剪接位点。优选的RNA剪接位点可以得自腺病毒和/或免疫球蛋白基因。在表达载体中还包含的是位于插入位点下游的多腺苷酸化信号。特别优选的多腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期多腺苷酸化信号(Kaufman和Sharp，同前)、来自腺病毒5 Elb区的多腺苷酸化信号、人生长激素基因终止子(DeNoto等人Nucl. Acids Res. 9:3719-3730，1981)、或者来自人因子VII基因或牛因子VII基因的多腺苷酸化信号。表达载体还可以包括位于启动子和RNA剪接位点之间的非编码病毒前导序列，例如腺病毒2三联前导序列；和增强子序列例如SV40增强子。
为了将本发明的因子VII多肽导向宿主细胞的分泌途径内，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列或前序列)。分泌信号序列在正确读码框中连接至编码人因子VII多肽的DNA序列。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列5'。分泌信号序列可以是通常与蛋白质结合的那种，或可以来自编码另一种分泌蛋白质的基因。
对于从酵母细胞的分泌，分泌信号序列可以编码任何信号肽，其确保将表达的人因子VII多肽有效导向细胞的分泌途径内。信号肽可以是天然存在的信号肽或其功能部分，或它可以是合成肽。已发现的合适的信号肽是α因子信号肽(参照US 4,870,008)、小鼠唾液淀粉酶的信号肽(参照O. Hagenbuchle等人，Nature 289，1981，第643-646页)、经修饰的羧肽酶信号肽(参照L.A. Valls等人，Cell 48，1987，第887-897页)、酵母BAR1信号肽(参照WO 87/02670)、或酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参照M. Egel-Mitani等人，Yeast 6，1990，第127-137页)。
对于酵母中的有效分泌，编码前导肽的序列还可以插入信号序列下游和编码人因子VII多肽的DNA序列上游。前导肽的功能是允许将所表达的肽从内质网导向高尔基体，且进一步导向分泌囊泡用于分泌到培养基内(即人因子VII多肽跨越细胞壁或至少穿过细胞膜输出到酵母细胞的周质空间内)。前导肽可以是酵母α因子前导肽(其用途在例如US 4,546,082、US 4,870,008、EP 16 201、EP 123 294、EP 123 544和EP 163 529中描述)。可替代地，前导肽可以是合成前导肽，也就是在自然界中未发现的前导肽。合成前导肽可以例如如WO 89/02463或WO 92/11378中所述构建。
对于在丝状真菌中的使用，信号肽可以方便地衍生自编码曲霉菌属物种(Aspergillus sp.)淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，编码米赫根毛霉脂肪酶或蛋白酶或者柔毛腐质霉(Humicola　lanuginosa)脂肪酶的基因。信号肽优选衍生自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因。合适的信号肽公开于例如EP 238 023和EP 215 594中。
对于在昆虫细胞中的使用，信号肽可以方便地衍生自昆虫基因(参照WO 90/05783)，例如鳞翅类烟草天蛾(Manduca　sexta)脂肪动员激素前体信号肽(参照US 5,023,328)。
用于分别连接编码因子VII多肽的DNA序列、启动子和任选的终止子和/或分泌信号序列，且将其插入含有复制所必需的信息的合适载体内的操作，是本领域技术人员熟知的(参照例如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，1989)。
转染哺乳动物细胞且在细胞中表达所引入的DNA序列的方法在例如下述中描述：Kaufman和Sharp, J. Mol. Biol. 159(1982), 601 - 621；Southern和Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1(1982), 327 - 341；Loyter等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(1982), 422 - 426；Wigler等人, Cell 14(1978), 725；Corsaro和Pearson, Somatic Cell Genetics 7(1981), 603, Graham和van der Eb, Virology 52(1973), 456；和Neumann等人, EMBO J. 1(1982), 841 - 845。
通过例如磷酸钙介导的转染(Wigler等人, Cell 14:725-732, 1978；Corsaro和Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981；Graham和Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973)或电穿孔(Neumann等人, EMBO J. 1:841-845, 1982)，将克隆的DNA序列引入培养的哺乳动物细胞内。为了鉴定且选择表达外源DNA的细胞，一般将赋予可选表型(可选标记)的基因连同目的基因或cDNA一起引入细胞内。优选的可选标记包括赋予对药物例如新霉素、潮霉素和氨甲蝶呤的抗性的基因。可选标记可以是可扩增的可选标记。优选的可扩增的可选标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)序列。可选标记由Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, 引入本文作为参考)综述。本领域技术人员容易地能够选择合适的可选标记。
可选标记可以与目的基因同时在分开的质粒上引入细胞内，或它们可以在相同质粒上引入。如果在相同质粒上，则可选标记和目的基因可以处于不同启动子或相同启动子的控制下，后面一种安排产生双顺反子信息。这类构建体是本领域已知的(例如Levinson和Simonsen，U.S. 4,713,339)。将另外的DNA (称为“载体DNA”)加入引入细胞内的混合物中也可以是有利的。
在细胞已吸收DNA后，它们在适当生长培养基中生长，通常为1-2天，以开始表达目的基因。如本文使用的，术语“适当的生长培养基”意指含有细胞生长和目的因子VII多肽表达所需的营养素及其他组分的培养基。培养基一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖、维生素、盐、磷脂、蛋白质和生长因子。对于γ羧化蛋白质的产生，培养基将含有维生素K，优选以约0.1 μg/ml - 约5 μg/ml的浓度。随后应用药物选择，以选择以稳定方式表达可选标记的细胞的生长。对于已用可扩增的可选标记转染的细胞，药物浓度可以增加，以选择拷贝数增加的克隆序列，从而增加表达水平。随后在稳定转染的细胞的克隆中筛选目的人因子VII多肽的表达。
编码因子VII多肽的DNA序列引入其内的宿主细胞可以是任何细胞，其能够产生翻译后修饰的人因子VII多肽，并且包括酵母、真菌和高等真核细胞。
用于本发明中的哺乳动物细胞系的实例是COS-1(ATCC CRL 1650)、幼仓鼠肾(BHK)和293(ATCC CRL 1573；Graham等人, J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977)细胞系。优选BHK细胞系是tk- ts13 BHK细胞系(Waechter和Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982, 引入本文作为参考)，下文被称为BHK 570细胞。BHK 570细胞系已在ATCC登录号CRL 10314下，保藏于美国典型培养物中心，12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852。tk- ts13 BHK细胞系也可在登录号CRL 1632下得自ATCC。另外，许多其他细胞系可以在本发明内使用，包括大鼠Hep I (大鼠肝瘤；ATCC CRL 1600)、大鼠Hep II (大鼠肝瘤；ATCC CRL 1548)、TCMK (ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1)、CHO (ATCC CCL 61)和DUKX细胞(Urlaub和Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)。
合适酵母细胞的实例包括酵母属物种(Saccharomyces　spp.)或裂殖酵母属物种(Schizosaccharomyces　spp.)的细胞，特别是酿酒酵母(Saccharomyces　cerevisiae)或克氏酵母(Saccharomyces　kluyveri)的菌株。用异源DNA转化酵母细胞且由其产生异源多肽的方法例如在US 4,599,311、US 4,931,373、US 4,870,008、5,037,743和US 4,845,075中描述，所述专利全部在此引入作为参考。经转化的细胞通过由可选标记决定的表型选择，所述表型通常为药物抗性或在不存在特定营养素例如亮氨酸的情况下生长的能力。用于酵母中的优选载体是公开于US 4,931,373中的POT1载体。编码人因子VII多肽的DNA序列之前可以是信号序列和任选的前导序列，例如如上所述。合适的酵母细胞的进一步实例是克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母(K.　lactis)，汉逊酵母属例如多形汉逊酵母(H.　polymorpha)，或毕赤酵母属(Pichia)例如巴斯德毕赤酵母(P.　pastoris)的菌株(参照Gleeson等人，J. Gen. Microbiol. 132，1986，第3459-3465页；US 4,882,279)。
其他真菌细胞的实例是丝状真菌的细胞，例如曲霉菌属物种、链孢霉属物种(Neurospora　spp.)、镰刀菌属物种(Fusarium　spp.)或木霉属物种(Trichoderma　spp.)，特别是米曲霉、构巢曲霉或黑曲霉的菌株。曲霉菌属物种用于表达蛋白质的用途在例如EP 272 277，EP 238 023，EP 184 438中描述。尖孢鐮刀菌(F.　oxysporum)的转化可以例如如由Malardier等人, 1989, Gene 78: 147-156描述的进行。木霉属物种的转化可以例如如EP 244 234中所述执行。
当丝状真菌用作宿主细胞时，它可以用本发明的DNA构建体转化，方便地通过将DNA构建体整合到宿主染色体内，以获得重组宿主细胞。该整合一般视为有利的，因为DNA序列更可能在细胞中稳定维持。DNA构建体整合到宿主染色体内可以根据常规方法，例如通过同源或异源重组执行。
昆虫细胞的转化和在其中异源多肽的产生可以如US 4,745,051；US 4,879,236；US 5,155,037；5,162,222；EP 397,485)中所述执行，所述专利全部引入本文作为参考。用作宿主的昆虫细胞系可以适当地是鳞翅目(Lepidoptera)细胞系，例如草地贪夜蛾(Spodoptera　frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia　ni)细胞(参照US 5,077,214)。培养条件可以适当地如例如WO 89/01029或WO 89/01028或上述参考文献中的任一个中所述。
上文描述的经转化的或经转染的宿主细胞随后在允许因子VII多肽表达的条件下，在合适的营养培养基中培养，这之后所得到的肽的全部或部分可以从培养物中回收。用于培养细胞的培养基可以是适合于生长宿主细胞的任何常规培养基，例如含有适当补充物的最小或复杂培养基。合适的培养基可得自商业供应商，或可以根据公开的配方(例如在美国典型培养物中心的目录中)制备。由细胞产生的因子VII多肽随后可以通过常规操作从培养基中回收，所述常规操作包括通过离心或过滤使宿主细胞与培养基分离，借助于盐例如硫酸铵沉淀上清液或滤液的蛋白质性质组分，通过多种层析操作例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等等纯化，取决于所讨论的多肽类型。
转基因动物技术可以用于产生本发明的因子VII多肽。优选在宿主雌性哺乳动物的乳腺内产生蛋白质。在乳腺内的表达和目的蛋白质随后分泌到乳内克服在从其他来源中分离蛋白质中遇到的许多困难。乳容易收集，可以大数量获得，且是生物化学充分表征的。此外，主要乳蛋白质以高浓度(通常为约1 - 15 g/l)存在于乳中。
从商业观点看来，明确优选使用具有大产乳量的物种作为宿主。虽然可以使用更小的动物例如小鼠和大鼠(且在原理阶段证明时是优选的)，但优选使用家畜哺乳动物，包括但不限于猪、山羊、绵羊和牛。由于诸如在该物种中的先前转基因历史、产乳量、成本和用于收集绵羊乳的设备的容易获得性(关于影响宿主物种选择的因素的比较，参见例如WO 88/00239)的此类因素，绵羊是特别优选的。一般希望选择宿主动物的品种，其已育种用于乳制品用途，例如East Friesland绵羊，或在以后通过转基因系的育种引入乳制品原种。在任何情况下，应使用已知的良好健康状态的动物。
为了获得在乳腺中的表达，使用来自乳蛋白质基因的转录启动子。乳蛋白质基因包括编码酪蛋白(参见U.S. 5,304,489)、β乳球蛋白、a-乳清蛋白和乳清酸性蛋白的那些基因。β乳球蛋白(BLG)启动子是优选的。在牛β乳球蛋白基因的情况下，一般使用基因的5'侧翼序列的至少近侧406 bp的区域，尽管高达约5 kbp的5'侧翼序列的更大部分是优选的，例如包含β乳球蛋白基因的5'侧翼启动子和非编码部分的~4.25 kbp DNA区段(参见Whitelaw等人，Biochem. J. 286: 31-39(1992))。来自其他物种的启动子DNA的相似片段也是合适的。
β乳球蛋白基因的其他区域也可以掺入构建体内，如可以表达基因的基因组区域一样。本领域一般公认例如与含有此类DNA序列的那些相比较，缺乏内含子的构建体弱表达(参见Brinster等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836-840(1988)；Palmiter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478-482(1991)；Whitelaw等人，Transgenic Res. 1: 3-13(1991)；WO 89/01343；和WO 91/02318，所述参考文献各自引入本文作为参考)。在这点上，可能时，一般优选使用含有编码目的蛋白质或多肽的基因的天然内含子的全部或一些的基因组序列，因此进一步包括来自例如β乳球蛋白基因的至少一些内含子是优选的。一个此类区域是提供来自牛β乳球蛋白基因的3'非编码区的内含子剪接和RNA多腺苷酸化的DNA区段。当取代基因的天然3'非编码序列时，该牛β乳球蛋白区段可以增强且稳定目的蛋白质或多肽的表达水平。在其他实施方案内，在变体因子VII序列的初始ATG周围的区域替换为来自乳特异性蛋白质基因的相应序列。此类替换提供了假定的组织特异性初始环境，以增强表达。将整个变体因子VII前原和5'非编码序列替换为例如BLG基因的那些是方便的，尽管可以替换更小的区域。
对于因子VII多肽在转基因动物中的表达，编码变体因子VII的DNA区段可操作地连接至其表达所需的另外DNA区段，以产生表达单元。此类另外的区段包括上述启动子，以及提供mRNA的转录终止和多腺苷酸化的序列。表达单元进一步包括编码与编码经修饰的因子VII的区段可操作地连接的分泌信号序列的DNA区段。分泌信号序列可以是天然因子VII分泌信号序列，或可以是另一种蛋白质例如乳蛋白质的那种(参见例如von Heijne, Nucl. Acids Res. 14: 4683-4690(1986)；和Meade等人, U.S. 4,873,316，其引入本文作为参考)。
通过将变体因子VII序列插入含有另外DNA区段的质粒或噬菌体载体内，方便地进行用于转基因动物中的表达单元的构建，尽管表达单元可以通过基本上任何序列的连接进行构建。特别方便的是提供含有编码乳蛋白质的DNA区段的载体，且将乳蛋白质的编码序列替换为因子VII变体的那种；从而制备包括乳蛋白质基因的表达控制序列的基因融合物。在任何情况下，表达单元在质粒或其他载体中的克隆促进变体因子VII序列的扩增。扩增方便地在细菌(例如大肠杆菌(E.　coli))宿主细胞中进行，因此载体通常包括在细菌宿主细胞中起作用的复制起点和可选标记。表达单元随后引入所选择的宿主物种的受精卵(包括早期胚胎)内。异源DNA的引入可以通过几种途径之一完成，包括显微注射(例如美国专利号4,873,191)、逆转录病毒感染(Jaenisch, Science 240: 1468-1474(1988))或使用胚胎干(ES)细胞的定点整合(由Bradley等人, Bio/Technology 10: 534-539(1992)综述)。随后将卵植入假孕雌性的输卵管或子宫内，并且允许发育足月。在其种系中携带所引入的DNA的子代以正常孟德尔方式将DNA传递给其后代，允许转基因兽群的发展。用于产生转基因动物的一般操作是本领域已知的(参见例如Hogan等人, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986；Simons等人, Bio/Technology 6: 179-183(1988)；Wall等人, Biol. Reprod. 32: 645-651(1985)；Buhler等人, Bio/Technology 8: 140-143(1990)；Ebert等人, Bio/Technology 9: 835-838(1991)；Krimpenfort等人, Bio/Technology 9: 844-847(1991)；Wall等人, J. Cell. Biochem. 49: 113-120(1992)；U.S. 4,873,191；U.S. 4,873,316；WO 88/00239，WO 90/05188，WO 92/11757；和GB 87/00458)。用于将外源DNA序列引入哺乳动物及其生殖细胞内的技术最初在小鼠中发展(参见例如Gordon等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384(1980)；Gordon和Ruddle, Science 214: 1244-1246(1981)；Palmiter和Brinster, Cell 41: 343-345(1985)；Brinster等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442(1985)；和Hogan等人(同前)。这些技术随后适用于大型动物，包括家畜物种(参见例如WO 88/00239，WO 90/05188和WO 92/11757；和Simons等人，Bio/Technology 6: 179-183(1988))。概括起来，在迄今为止用于生成转基因小鼠或家畜的最有效途径中，根据建立的技术，将目的DNA的几百个线性分子注射到受精卵的原核之一内。可以采用将DNA注射到接合子的细胞质内。
还可以采用在转基因植物中的产生。表达可以是一般化的或针对特定器官例如块茎(参见Hiatt，Nature 344:469-479(1990)；Edelbaum等人，J. Interferon Res. 12:449-453(1992)；Sijmons等人，Bio/Technology 8:217-221(1990)；和EP 0 255 378)。
纯化
本发明的因子VII多肽从细胞培养基中回收。本发明的因子VII多肽可以通过本领域已知的多种操作进行纯化，包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和尺寸排阻)、电泳操作(例如制备型等电聚焦(IEF)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、或提取(参见例如Protein Purification, J.-C. Janson和Lars Ryden, 编辑, VCH Publishers, New York, 1989)。优选地，它们可以通过在抗因子VII抗体柱上的亲和层析进行纯化。如由Wakabayashi等人，J. Biol. Chem. 261:11097-11108, (1986)和Thim等人，Biochemistry 27: 7785-7793,(1988)描述的，钙依赖性单克隆抗体的使用是特别优选的。另外的纯化可以通过常规化学纯化方法例如高效液相层析来实现。其他纯化方法包括柠檬酸钡沉淀是本领域已知的，并且可以应用于本文描述的新型因子VII多肽的纯化(参见例如Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982)。
对于治疗目的，优选本发明的因子VII多肽是基本上纯的。因此，在本发明的优选实施方案中，本发明的因子VII多肽纯化到至少约90 - 95%同质性，优选至少约98%同质性。纯度可以通过例如凝胶电泳和氨基末端氨基酸测序进行评价。
因子VII多肽在其活化位点处进行切割，以便将其转换为其二链形式。活化可以根据本领域已知的操作进行，例如由Osterud等人，Biochemistry 11:2853-2857(1972)；Thomas, 美国专利号4,456,591；Hedner和Kisiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841(1983)；或Kisiel和Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42(1983)描述的那些。可替代地，如由Bjoern等人(Research Disclosure, 269 September 1986, 第564-565页)描述的，因子VII可以通过使其经过离子交换层析柱例如Mono Q? (Pharmacia fine Chemicals)等等进行活化。所得到的活化因子VII变体随后可以如下所述配制且施用。
测定
本发明还提供了用于选择根据本发明的优选因子VII多肽的合适测定。这些测定随后可以作为简单的初步体外测试执行。
因子VIIa多肽的活性还可以使用生理学底物例如因子X (“体外蛋白酶解测定”)(参见实施例5)进行测量，适当地以5-1000 nM (例如30-40 nM) nM的浓度，其中在添加合适的生色底物(例如S-2765)后测量生成的因子Xa。另外，活性测定可以在生理温度下运行。
因子VIIa多肽生成凝血酶的能力还可以在包含以生理学浓度的所有相关凝血因子和抑制剂(当模拟A型血友病状况时，减去因子VIII)和活化血小板的测定中进行测量(如Monroe等人(1997)Brit. J. Haematol. 99，542-547中的第543页上所述，其在此引入作为参考)。参见实施例8。
药物组合物
在一个方面，本发明涉及包含本发明的因子VII多肽的组合物和制剂。例如，本发明提供了包含连同药学可接受的载体一起配制的本发明的因子VII多肽的药物组合物。
相应地，本发明的一个目的是提供包含因子VII多肽的药物制剂，所述因子VII多肽以0.25 mg/ml - 100 mg/ml的浓度存在，并且其中所述制剂具有2.0 - 10.0的pH。制剂可以进一步包含缓冲系统、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂、抗氧化剂或表面活性剂，以及其多种组合中的一种或多种。防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂、抗氧化剂和表面活性剂在药物组合物中的使用是技术人员众所周知的。可以参考Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在一个实施方案中，药物制剂是水性制剂。此类制剂通常是溶液或悬浮液、但还可以包括胶体、分散体、乳剂和多相材料。术语“水性制剂”定义为包含至少50% w/w水的制剂。同样地，术语“水溶液”定义为包含至少50% w/w水的溶液，并且术语“水性悬浮液”定义为包含至少50% w/w水的悬浮液。
在另一个实施方案中，药物制剂是冷冻干燥制剂，医生或患者在使用前向其中加入溶剂和/或稀释剂。
在进一步方面，药物制剂包含因子VII多肽的水溶液和缓冲剂，其中所述多肽以1 mg/ml或以上的浓度存在，并且其中所述制剂具有约2.0 - 约10.0的pH。
本发明的因子VII多肽可以肠胃外，例如静脉内、例如肌内、例如皮下施用。可替代地，本发明的FVII多肽可以经由非肠胃外途径例如口服或局部施用。本发明的多肽可以预防施用。本发明的多肽可以治疗施用(根据需要)。
治疗用途
在广泛方面，本发明的因子VII多肽或包含所述多肽的药物制剂可以用作药剂。
在一个方面，本发明的因子VII多肽或包含所述多肽的药物制剂可以用于治疗具有凝血病的受试者。
在另一个方面，本发明的因子VII多肽或包含所述多肽的药物制剂可以用于制备药剂用于治疗出血障碍或出血发作或者用于增强正常止血系统。
在进一步方面，本发明的因子VII多肽或包含所述多肽的药物制剂可以用于治疗A型血友病、B型血友病或者具有获得性抑制剂的A或B型血友病。
在另一个方面，本发明的因子VII多肽或包含所述多肽的药物制剂可以用于治疗受试者中的出血障碍或出血发作或者用于增强正常止血系统的方法中，该方法包括给有此需要的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的因子VII多肽。
如本文使用的，术语“受试者”包括任何人患者或非人脊椎动物。
如本文使用的，术语“治疗”指有此需要的任何人或其他脊椎动物受试者的医学治疗。所述受试者预期已经历通过医学从业者或兽医学从业者的体格检查，所述从业者给出指示所述特异性治疗的使用对所述人或其他脊椎动物的健康有益的初步或明确诊断。根据受试者健康的现状，所述治疗的时机和目的可以从一个个体到另一个不同。因此，所述治疗可以是预防、姑息、针对症状和/或治愈的。就本发明而言，预防、姑息、针对症状和/或治愈治疗可以代表本发明的分开方面。
如本文使用的，术语“凝血病”指增加的出血趋势，其可以通过正常凝血级联的任何凝固组分的任何性质或数量缺陷，或者纤维蛋白溶解的任何上调引起。此类凝血病可以是先天性和/或获得性和/或医源性的，并且由本领域技术人员鉴定。先天性低凝血病(hypocoagulopathies)的非限制性实例是A型血友病、B型血友病、因子VII缺乏、因子X缺乏、因子XI缺乏、血管性血友病和血小板减少症，例如血小板无力症和巨大血小板综合征。A或B型血友病的临床严重性通过血液中的FIX/因子VIII的功能单位浓度确定，并且分类为轻度、中度或重度。重度血友病通过对应于<1%正常水平的<0.01 U/ml的凝血因子水平限定，而具有中度和轻度血友病的人分别具有1-5%和>5%的水平。具有“抑制剂”(即，针对因子VIII的同种抗体)的A型血友病和具有“抑制剂”(即，针对因子IX的同种抗体)的B型血友病是部分先天性和部分获得性的凝血病的非限制性实例。
获得性凝血病的非限制性实例是由维生素K缺乏引起的丝氨酸蛋白酶缺乏；此类维生素K-缺乏可以通过施用维生素K拮抗剂例如华法林引起。获得性凝血病也可以在广泛创伤后发生。在另外称为“血液的恶性循环”的这种情况下，它的特征在于血稀释(稀释性血小板减少症和凝固因子的稀释)、体温过低、凝固因子的消耗和代谢紊乱(酸中毒)。输液疗法和增加的纤维蛋白溶解可能恶化该情形。所述出血可以来自身体的任何部分。
医源性凝血病的非限制性实例是可能开处方用于治疗血栓栓塞性疾病的抗凝血药(例如肝素、阿司匹林、华法林及其他血小板聚集抑制剂)的超剂量。医源性凝血病的第二个非限制性实例是由过度和/或不适当的输液疗法诱发的凝血病，例如可以由输血诱发的凝血病。
在本发明的一个实施方案中，出血与A或B型血友病相关。在另一个实施方案中，出血与具有获得性抑制剂的A或B型血友病相关。在另一个实施方案中，出血与血小板减少症相关。在另一个实施方案中，出血与血管性血友病相关。在另一个实施方案中，出血与严重组织损伤相关。在另一个实施方案中，出血与严重创伤相关。在另一个实施方案中， 出血与手术相关。在另一个实施方案中，出血与出血性胃炎和/或肠炎相关。在另一个实施方案中，出血是例如在胎盘早剥中的血崩。在另一个实施方案中，出血在机械性止血可能性有限的器官中，例如颅内、耳内或眼内发生。在另一个实施方案中，出血与抗凝治疗相关。
本发明进一步通过下述实施例举例说明，然而，所述实施例不应解释为限制保护范围。前述说明书和下述实施例中公开的特点可以分开地或以其任何组合是用于以其不同形式实现本发明的材料。
实施例
蛋白质
人血浆衍生的因子X (FX)和因子Xa (FXa)得自Enzyme Research Laboratories Inc.(South Bend，IN)。可溶性组织因子1-219 (sTF)或1-209根据公开的操作(Freskgard等人，1996)进行制备。重组野生型FVIIa的表达和纯化如前所述(Thim等人，1988；Persson和Nielsen，1996)执行。根据公开的操作(Olson等人，1993)，通过肝素琼脂糖凝胶(GE Healthcare)再纯化人血浆衍生的抗凝血酶(Baxter)。
实施例1
为了对FVIIa-抗凝血酶相互作用作图，基于FVIIa-抗凝血酶复合物的复合物结构模型，在计算机芯片上设计FVIIa变体文库。使用公开的FXa-抗凝血酶Michaelis复合物的X射线结构(Johnson等人2006)作为模板，构建图1中所示的模型。对模型中与抗凝血酶紧密接近的FVIIa残基(在FVIIa和抗凝血酶侧链之间的最大距离是12 ?)实施诱变。第一个文库设计为探究保守变化对人FVIIa结合抗凝血酶的影响。来自多个物种(黑猩猩、犬、猪、牛、小鼠、大鼠和兔)的FVII序列比对显示于图2中。将在其他物种中具有不同侧链，与抗凝血酶紧密接近的人FVIIa中的侧链突变为相应物种的那种。一个实例是在位置286中的残基在人FVII中是Gln，并且在猪FVII中是Arg。在筛选第一个文库后，随后设计第二个聚焦文库，在其中测试所选位置中的可能氨基酸取代的全部或一些(除Cys和Pro之外)。实例包括根据SEQ ID NO: 1的位置176、286和293。
实施例2
使用来自Novagen的KOD Xtreme? Hot Start DNA聚合酶或来自Stratagene的QuickChange?定点诱变试剂盒，使用基于定点诱变PCR的方法，将突变引入编码FVII cDNA的哺乳动物表达载体内。使用下述表达载体：pTT5 (Durocher等人(2002) Nucleic Acid Res. 30(2):e9)用于转染HEK293F和HKB11细胞；来自Icosagen (Estonia)的pQMCF用于转染CHOEBNALT85；pZEM219b (Busby等人(1991)J.Biol.Chem.，266:15286-15292)和pMPSVHE (Artelt等人 (1988) Gene 62:213-219)用于转染CHO-K1；pLN174 (Persson等人 (1996) FEBS Lett.,385:241-243)用于转染BHK细胞。根据制造商的建议设计引物。所需突变的引入通过DNA测序(MWG Biotech，德国)加以验证。
实施例3
FVII变体在幼仓鼠肾(BHK)细胞、FreestyleTM 293-F人胚肾细胞(HEK293F；Gibco by Life Technologies, Naerum, DK)、HKB11(HEK293和人B细胞系的杂交细胞系)细胞(ATCC, LGC Standards AB, Boras, 瑞典)、中国仓鼠卵巢(CHOK1)细胞或来自Icosagen Cell Factory, Estonia的CHO-EBNALT85细胞中表达。
根据用于产生稳定细胞系的制造商的说明书，使用来自Merck Millipore (Hellerup，丹麦)的GeneJuice?，用FVII变体构建体转染BHK贴壁细胞。使用氨甲蝶呤(Sigma-Aldrich)作为选择试剂。将稳定细胞系在培养基中培养至大规模，给出总共5 - 10升细胞上清液。细胞在温箱中在37℃、5或8% CO2下在DMEM (Gibco by Life Technologies，Naerum，DK)中进行培养，所述DMEM补充有2%(V/V)胎牛血清(Gibco by Life Technologies，Naerum，DK)、1%(v/v)青霉素/链霉素(Gibco by Life Technologies，Naerum，DK)和5 mg/l维生素K1(Sigma-Aldrich)。
根据制造商的说明书，使用293FectinTM (Invitrogen by Life Technologies, Naerum, DK)瞬时转染HEK293F和HKB11悬浮细胞。细胞在振荡温箱中在37℃、5或8% CO2和85 - 125 rpm下进行培养。经转染的细胞在培养基中扩增至大量表达，给出总共250 ml – 1升细胞上清液。上清液通过离心收获，随后通过0.22μM PES滤器(Corning；Fischer Scientific Biotech, Slangerup, DK)进行过滤。HEK293F和HKB11细胞在补充有1%(v/v)青霉素/链霉素(Gibco by LifeTechnologies, Naerum, DK)和维生素K1(Sigma-Aldrich)的Freestyle 293 Expression Medium (Gibco by Life Technologies, Naerum, DK)中进行培养。
通过电穿孔(Gene Pulse Xcell, Biorad, Copenhagen, DK)，瞬时转染CHOEBNALT85悬浮细胞。经转染的细胞用700 μg/l Geneticin? (Gibco by Life Technologies)选择，并且扩增至中等/大量，给出总共500 ml - 10升上清液。根据制造商的说明书，将细胞在补充有5 mg/l维生素K1(Sigma-Aldrich)的培养基中进行培养。细胞在振荡温箱中在37℃、5或8% CO2和85或125 rpm下进行培养。上清液通过离心收获，随后通过0.22μM PES滤器(Corning；Fischer Scientific Biotech, Slangerup, DK)进行过滤。
根据制造商的建议，通过电穿孔(Gene Pulse Xcell, Biorad, Copenhagen, DK)，转染适应于悬浮细胞的CHOK1细胞。使用700 μg/l Geneticin? (Gibco by Life Technologies)作为选择试剂。稳定细胞系用于大规模表达。细胞在温箱中在37℃、5或8% CO2和85或125 rpm下进行培养。补充有1%(v/v)青霉素/链霉素(Gibco by Life Technologies, Naerum, DK)和5 mg/l维生素K1 (Sigma-Aldrich)的Thermo Scientific Hyclone CDM4CHOTM培养基用于表达。将上清液通过0.22 μM PES滤器(Corning, Fischer Scientific, Slangerup, DK)过滤。
大规模表达(BHK)- 贴壁BKH细胞系在DMEM/F12培养基(Invitrogen by Life Technologies, Naerum, DK)中进行培养，所述DMEM/F12培养基补充有5 mg/l维生素K1和2%胎牛血清(Invitrogen by Life Technologies，Naerum，DK)。在用于生物反应器的种子培养繁殖物的期间，使用10%胎牛血清且培养基补充有1 μM氨甲蝶呤(Sigma-Aldrich, Copenhagen, DK)。简言之，细胞在通风T-175烧瓶、2层和10层细胞工厂中繁殖，在37℃和5% CO2下温育。在汇合时，使用TrypLE? Express (Gibco by Life Technologies,Naerum，DK)解离细胞，之后传递至下一步骤。生产期作为在具有微载体(5 g/L，Cytodex 3，GE Life Sciences，Uppsala，SE)的生物反应器中的重复分批培养执行。通过添加CO2和Na2CO3，将pH控制在7附近。通过用氧吹扫，将溶解氧浓度保持高于50%的空气中的饱和。温度维持在36.5℃。在纯化前，抽取的收获物通过过滤(3 μm Clarigard, Opticap XL10；0.22 μm Durapore, Opticap XL10, Merck Millipore, Hellerup, DK)澄清。
大规模表达(CHOK1)- 悬浮适应的CHOK1细胞系在补充有5 mg/L维生素K1的化学成分确定的培养基(CDM4CHO, Thermo Scientific HyClone, Fisher Scientific, Slangerup, DK)中进行培养。在用于生物反应器的种子培养物的繁殖期间，培养基补充有600 μg/ml Geneticin? (Invitrogen by Life Technologies, Naerum, DK)，简言之，细胞在通风的摇瓶中扩增，在定轨振荡器中在37℃和5% CO2下温育。生产期作为在生物反应器中的重复分批培养执行。通过添加CO2和Na2CO3，将pH控制于在7附近。通过用氧吹扫，溶解氧浓度保持高于50%的在空气中的饱和。温度维持在36.5℃。在纯化前，抽取的收获物通过过滤(3 μm Clarigard, Opticap XL10；0.22 μm Durapore, Opticap XL10, Merck Millipore, Hellerup, DK)澄清。
实施例4
基本上如其他地方(Thim等人1988)描述的，FVII变体通过针对Gla结构域的抗体亲和层析进行纯化。简言之，方案包括1 - 3个步骤。在步骤1中，将5 mM CaCl2加入条件培养基中，并且将样品装载到亲和柱上。在用20 mM HEPES、2 M NaCl、10 mM CaCl2、0.005% Tween 80，pH 8.0充分洗涤后，在(步骤2)阴离子交换柱(Source 15Q，GE Healthcare)上，用20 mM HEPES、20 mM NaCl、20 mM EDTA、0.005% Tween80，pH 8.0洗脱结合的蛋白质。在用20 mM HEPES、20 mM NaCl、0.005% Tween80，pH 8.0洗涤后，在(步骤3)CNBr-Sepharose Fast Flow柱(GE Healthcare)上，用20 mM HEPES、135 mM NaCl、10 mM CaCl2、0.005% Tween80，pH 8.0洗脱结合的蛋白质，根据制造商的说明书，人血浆衍生的FXa已以1 mg/ml的密度与所述柱偶联。将流速优化以确保纯化的酶原变体基本上完全活化为活性形式。对于能够在条件培养基中或在阴离子交换柱上自活化的活性增强的FVIIa变体，省略步骤2和/或步骤3，以阻止蛋白酶解降解。将纯化的蛋白质贮存于-80℃下。蛋白质质量通过SDS-PAGE分析进行评价，并且功能分子的浓度如下所述通过活性位点滴定或经由rpHPLC的轻链含量定量进行测量。
通过活性位点滴定测量FVIIa变体浓度- 在用亚化学计量水平的d-Phe-Phe-Arg-氯甲基酮(FFR-cmk；Bachem)滴定后，通过来自不可逆的酰胺裂解活性丧失的活性位点滴定来测定在纯化制剂中的功能分子浓度，基本上如其他地方(Bock，1992)描述的。简言之，所有蛋白质均在测定缓冲液(50 mM HEPES(pH 7.4)、100 mM NaCl、10 mM CaCl2、1 mg/mL BSA和0.1%(w/v)PEG8000)中稀释。使最终浓度150 nM的FVIIa变体与500 nM可溶性组织因子(sTF)预温育10分钟，随后在96孔板中的100 μL总反应体积中添加以0-300 nM(n=2)最终浓度的FFR-cmk。反应在室温下温育过夜。在另一块96孔板中，20 μL每种反应在含有1 mM S-2288 (Chromogenix，Milano，意大利)的测定缓冲液中稀释10倍。在配备SOFTmax PRO软件的Spectramax 190微板分光光度计中，在405 nM处连续测量吸光度增加10分钟。酰胺裂解活性报告为在空白扣除后线性进展曲线的斜率。活性位点浓度通过外推测定，作为完全取消酰胺裂解活性所需的FFR-cmk的最小浓度。
使用反相HPLC由轻链含量测量FVIIa变体浓度– 在可替代方法中，纯化制剂中的功能FVIIa分子浓度通过经由反相HPLC (rpHPLC)定量FVIIa轻链(LC)含量进行测定。使用范围为0 - 3 μM的FVIIa浓度制备使用野生型FVIIa的校准曲线，而浓度未知的样品以1.5 μM(n=2)的估计浓度进行制备。所有样品均使用以20%(v/v)浓度加入样品中的0.5 M三(2-羧乙基)膦(TCEP；Calbiochem/Merck KGaA，Darmstadt，德国)和甲酸的1:1混合物进行还原，随后将样品在70℃下加热10分钟。将还原的FVIIa变体装载到维持在30℃下的C4柱(Vydac，300 ?，粒子大小5 μM，4.6 mm，250 mm)上。移动相由在水中的0.09% TFA (溶剂A)和在乙腈中的0.085% TFA (溶剂B)组成。在注射80 μL样品后，系统在25%溶剂B下等度运行4分钟，随后为经过10分钟来自25-46% B的线性梯度。使用分别为280和348 nm的激发和发射波长，通过荧光检测峰。通过峰整合执行轻链定量，并且基于野生型FVIIa标准曲线计算FVIIa变体的相对量。
实施例5
为了鉴定具有基本上保持的活性但与血浆抑制剂抗凝血酶降低的反应性的FVIIa变体，对生成的变体文库实施下文详述的筛选测定，其以手动和自动化形式两者建立。简言之，活性测量为在磷脂囊泡的存在下，每种变体蛋白酶解活化大分子底物因子X的能力(体外蛋白酶解测定)。每种反应在辅因子组织因子(sTF)的存在或不存在下执行，以模拟可能的TF依赖性和不依赖性重组FVIIa作用机制。每种变体对通过抗凝血酶抑制的敏感性在假一阶条件下，在低分子量肝素的存在下进行定量，以模拟内源肝素样葡糖氨基聚糖(GAG)在体内加速反应的能力。如图4中所示，发现测量的体外抗凝血酶反应性与FVIIa-抗凝血酶复合物的体内累积关联，因此验证体外筛选操作的预测性。
来自变体筛选的结果在表2中给出。在变体中，用Lys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)或Phe(F)替换T293使抗凝血酶反应性降低至或低于10%的野生型FVIIa的水平，而在不存在sTF的情况下的蛋白酶解活性维持轻微高于野生型水平。对于T293Y变体，观察到>200%的野生型FVIIa的活性水平。类似地，在Q176处的Lys(K)、Arg(R)和Asn(N)取代极大降低抗凝血酶反应性，同时使蛋白酶解活性基本上保存在野生型水平。值得注意的是，对于Q176R变体观察到小于1%的抗凝血酶反应性。
表2：相对于野生型FVIIa (以%表示)，FVIIa变体的蛋白酶解活性和抗凝血酶反应性。如所示的，在磷脂囊泡的存在下以及在可溶性组织因子(sTF)的存在和不存在下，用人血浆衍生的FX作为底物测量蛋白酶解活性。在低分子量肝素的存在下，测量通过人血浆衍生的抗凝血酶的抑制。指示了用于产生每种变体的表达系统。
使用因子X作为底物测量蛋白酶解活性(手动体外蛋白酶解测定)– FVIIa变体的蛋白酶解活性使用血浆衍生的因子X(FX)作为底物进行估计。所有蛋白质均在测定缓冲液(50 mM HEPES (pH 7.4)、100 mM NaCl、10 mM CaCl2、1 mg/mL BSA和0.1%(w/v) PEG8000)中稀释。通过在25 μM 75:25磷脂酰胆碱:磷脂酰丝氨酸磷脂囊泡(PS:PC；Haematologic Technologies，Vermont，USA)的存在下，在96孔板中的100 μl总反应体积中(n = 2)，使10 nM每种FVIIa缀合物与40 nM FX一起在室温下温育30分钟，测定FX活化的动力学参数。通过在25 μM PC:PS磷脂的存在下，在100 μl总反应体积中(n = 2)，使5 pM每种FVIIa缀合物与30 nM FX一起在室温下温育20分钟，测定在sTF的存在下的FX活化。在温育后，通过添加50 μl停止缓冲液[50 mM HEPES(pH 7.4)、100 mM NaCl、80 mM EDTA]，随后添加50 μl 2 mM S-2765生色底物(Chromogenix，Milano，意大利)，来猝灭反应。最后，在Spectramax 190微板阅读器中，在405 nM处连续测量吸光度增加。通过使用线性回归，将数据拟合至Michaelis Menten方程的简化形式(v = kcat * [S] * [E] / Km)，估计表观催化速率值(kcat/Km)，因为FX底物浓度([S])低于活化反应的Km。由在相同条件下用人血浆衍生的FXa制备的标准曲线估计生成的FXa量。估计的kcat/km值相对于野生型FVIIa的那种进行报告。结果在表2和表3中给出。
表3：FVIIa变体和PEG化缀合物的体外功能(上面部分)和药物代谢动力学(下面部分)特性
DVQ：FVIIa V158D/E296V/M298Q
AT：抗凝血酶
+ 40k PEG：使用40-kDa PEG糖基PEG化。
FVIIa凝块效力：以野生型FVIIa比活性百分比表示的，FVII缺乏血浆中的sTF依赖性凝块比活性。
蛋白酶解活性: 以野生型FVIIa百分比表示的，在PS:PC囊泡存在下的FXa活性
TEG R-时间：高岭土诱导的血友病样人全血的血栓弹力图凝血时间。
TGA效力：以野生型rFVIIa百分比表示的，富含血小板的血友病样血浆中的凝血酶生成速率
AT抑制：以野生型rFVIIa百分比表示的，在低分子量凝血酶的存在下通过AT的抑制。
T?：在IV施用后的活性分子的终末半衰期
MRT：在IV施用后的活性分子的平均停留时间。
AT复合物Cmax/剂量：化合物-抗凝血酶复合物的最大测量水平除以剂量。
使用因子X作为底物测量蛋白酶解活性(自动化体外蛋白酶解测定)– FVIIa变体的蛋白酶解活性使用血浆衍生的因子X(FX)作为底物进行估计。所有蛋白质均在50 mM HEPES(pH 7.4)、100 mM NaCl、10 mM CaCl2、1 mg/mL BSA和0.1%(w/v)PEG8000中稀释。通过在25 μM 75:25磷脂酰胆碱:磷脂酰丝氨酸(PS:PC)磷脂(Haematologic technologies，Vermont，USA)的存在下，在96孔板中的100 μL总反应体积中(n = 2)，使10 nM每种FVIIa缀合物与40 nM FX一起在室温下温育30分钟，测定相对蛋白酶解活性。通过在25 μM PC:PS磷脂的存在下，在100 μL总反应体积中(n = 2)，使5 pM每种FVIIa缀合物与30 nM FX一起在室温下温育20分钟，测定在sTF的存在下的FX活化。在温育后，通过添加在停止缓冲液[50 mM HEPES(pH 7.4)、100 mM NaCl、80 mM EDTA]中的100 μL 1 mM S-2765，来猝灭反应。紧在猝灭后，在Envision微板阅读器(PerkinElmer，Waltham，MA)中，在405 nM处连续测量吸光度增加。所有添加、温育和板移动均通过与Envision微板阅读器联机偶联的Hamilton Microlab Star自动机(Hamilton，Bonaduz，瑞士)执行。蛋白酶解活性相对于野生型FVIIa进行计算。结果在表2和表3中给出。
通过抗凝血酶的FVIIa抑制的测量(手动测定)- 不连续方法用于测量在假一阶条件下，在低分子量(LMW)肝素(Calbiochem/Merck KGaA，Darmstadt，德国)的存在下，通过人血浆衍生的抗凝血酶(AT)的体外抑制速率。测定在96孔板中在200 μl总反应体积中执行，使用含有50 mM HEPES(pH 7.4)、100 mM NaCl、10 mM CaCl2、1 mg/mL BSA和0.1%(w/v)PEG8000的测定缓冲液。向200 nM FVIIa和12 μM LMW肝素的混合物中，加入在100 μl最终反应体积中的5 μM抗凝血酶。在不同时间，通过将20 μl反应混合物转移至另一块含有180 μL sTF(200 nM)、猝灭反应的聚凝胺(0.5 mg/ml；海美溴铵，Sigma-Aldrich)和S-2288(1 mM)的微量滴定板，来猝灭反应。紧在转移后的不同时间，在Spectramax 190微板阅读器中，在405 nm处监控底物切割10分钟。通过数据与指数衰变函数的非线性最小二乘法拟合获得假一阶速率常数(kob)，并且由下述关系k = kobs/[AT]获得二阶速率常数(k)。抑制速率相对于野生型FVIIa的那种进行报告。结果在表2和表3中给出。
通过抗凝血酶的FVIIa抑制的测量(自动化测定)- 不连续方法用于测量在假一阶条件下，在低分子量(LMW)肝素(Calbiochem/Merck KGaA，Darmstadt，德国)的存在下，通过人血浆衍生的抗凝血酶(AT)的体外抑制速率。测定在96孔板中在200 μL总反应体积中执行，使用含有50 mM HEPES(pH 7.4)、100 mM NaCl、10 mM CaCl2、1 mg/mL BSA和0.1%(w/v)PEG8000的缓冲液。向200 nM FVIIa和12 μM LMW肝素的混合物中，加入在100 μL最终反应体积中的5 μM抗凝血酶。在不同时间，通过将20 μL反应混合物转移至另一块含有180 μL sTF(200 nM)、聚凝胺(0.5 mg/mL；海美溴铵，Sigma-Aldrich)和S-2288(1 mM)的微量滴定板，来猝灭反应。紧在转移后的不同时间，在Envision微板阅读器中，在405 nm处监控底物切割10分钟。通过数据与指数衰变函数的非线性最小二乘法拟合获得假一阶速率常数(kob)，并且由下述关系k = kobs/[AT]获得二阶速率常数(k)。所有添加、温育和板移动均通过与Envision微板阅读器(PerkinElmer，Waltham，MA)联机偶联的Hamilton Microlab Star自动机(Hamilton，Bonaduz，瑞士)执行。抑制速率相对于野生型FVIIa的那种进行报告。结果在表2和表3中给出。
实施例6
鉴定的抗凝血酶抗性FVIIa变体的选择进一步与活性增强取代M298Q、V158D/E296V/M298Q或L305V/S314E/K337A/F374Y组合进行评估。
使用实施例5中所述的蛋白酶解测定表征纯化的蛋白质制剂证实变体保留超活性。这使用实施例7中所述的基于STACLOT?VIIa-rTF血浆的测定通过效力评估加以证实，并且对于一些变体，还通过如实施例8中所述的在FVIII缺乏血浆中的凝血酶生成和血栓弹力图加以证实(参见表2。另外，T293K和Q176K突变使M298Q的抗凝血酶反应性有效降低至低于野生型FVIIa的10%，而较不显著的降低与更活性(和抗凝血酶反应性)变体V158D/E296V/M298Q或L305V/S314E/K337A/F374Y组合观察到(参见表4)。在V158D/E296V/M298Q背景下，T293K突变使抗凝血酶反应性降低至野生型水平的约20%。相反，在M298Q背景下，T293A和T293L均不能使抗凝血酶反应性维持低于100%。这些数据显示Q176K和T293K突变就维持活性同时基本上降低抗凝血酶反应性而言是优良的。
表4：与活性增强取代M298Q、V158D/E296V/M298Q或L305V/S314E/K337A/F374Y组合的FVIIa变体的蛋白酶解活性和抗凝血酶反应性(以野生型的%表示)。如所示的，在磷脂囊泡的存在下以及在可溶性组织因子(sTF)的存在和不存在下，用人血浆衍生的FX作为底物测量蛋白酶解活性。在低分子量肝素的存在下，测量通过人血浆衍生的抗凝血酶的抑制。指示了用于产生每种变体的表达系统。
实施例7
使用商业FVIIa特异性凝血测定；来自Diagnostica Stago的STACLOT?VIIa-rTF估计效力。测定基于由J. H. Morrissey等人，Blood. 81:734-744(1993)公开的方法。它测量在磷脂的存在下，在FVII缺乏血浆中sTF起始的FVIIa活性依赖性纤维蛋白凝块形成时间。凝血时间在ACL9000(ILS)凝固仪器上进行测量，并且基于FVIIa校准曲线使用在双对数尺度(bilogarithmic scale)上的线性回归计算结果。相同测定用于测量在来自动物PK研究中的血浆样品中的FVIIa凝结活性。血浆中的定量下限(LLOQ)估计为0.25 U/ml。使用比活性将血浆活性水平转换为nM。结果在表2和图3中给出。
实施例8
如下所述，未经修饰的和40k-糖基PEG化形式中的抗凝血酶抗性变体的选择就其对FVIII缺乏血浆中的凝血酶生成和凝块形成的作用进行测试。结果在表2中给出。
人供体血液的凝血酶生成测定(TGA) - 在来自健康供体的富含血小板的血浆(PRP)(最终血小板浓度为150×109/l)中测量凝血酶生成。PRP用抑制性抗人因子VIII IgG进行处理，以诱导A型血友病样状况。在起始测定前大约5分钟，通过添加100 μM最终浓度的PAR-1激动剂SFFLRN(Bachem，Bubendorf，瑞士)和100 ng/ml最终浓度的胶原受体(GPVI)激动剂惊厥蛋白(convulxin)(Pentapharm，Basel，瑞士)活化血小板。将FVIIa和FVIIa变体以20 μl的体积连同80 μl含血小板激动剂的PRP一起加入微量滴定板中。通过添加以16.7 mM最终浓度的20 μl含CaCl2生荧光凝血酶底物(FluCa Kit，Thrombinoscope bv，Maastricht，荷兰)起始反应。使用Fluoroscan Ascent? 荧光计(Thermo Fisher Scientific，Helsinki，芬兰)，连续测量凝血酶生成120分钟。如所述的(Hemker等人2003)，荧光信号在390 nm(激发)和460 nm(发射)的波长下进行检测，就α-2-巨球蛋白结合凝血酶校准，且借助于校准器(Thrombinoscope)和Thrombinoscope软件(Synapse BV， Maastricht，荷兰)转换为生成的凝血酶摩尔(nM)。凝血酶生成速率计算为凝血酶峰/(至峰的时间 - 滞后时间)。因为无法获得顶部平台水平，所以无法生成EC50值。相反，通过比较获得在曲线图的最陡部分上表示的某一速率所需的化合物浓度，估计相对于野生型FVIIa的变体活性。
人全血的血栓弹力图(TEG)– TEG分析在来自健康供体的全血中执行(基本上如Viuff等人Thrombosis Research，2010；126-144-149中所述)。血液用抑制性抗人因子VIII IgG进行处理，以诱导A型血友病样状况。将FVIIa、FVIIa变体或缓冲液(HEPES 20 mM、NaCl 150 mM、BSA 2%)加入含有高岭土(Haemoscope，Niles，IL，USA)的管中，并且通过管倒置小心地与全血混合。将样品转移至TEG杯，并且再钙化以起始凝血。止血过程通过TEG凝固分析仪(5000系列TEG分析仪，Haemoscope Corporation，Chicago，USA)记录。TEG凝血时间(R，指示从将血液置于样品杯直到凝块开始形成(2 mm幅度)的等待时间，并且凝块形成的速度(MTG，最大血栓生成)用于分析。样品作为单一样品进行分析，并且实验执行两次(每次不同供体)。数据分析用Haemoscope Software版本4执行。对于每种参数，EC50值基于4参数逻辑浓度应答曲线拟合进行计算。
实施例9
为了探究鉴定的取代通过其影响抗凝血酶识别的机制，测定代表性变体(FVIIa Q176K)的晶体结构。
使用依照(Bjelke等人2008)的悬滴法，使与可溶性组织因子(片段1-209)复合的纯化的H-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮(FFR-cmk；Bachem，瑞士)活性位点抑制的FVIIa Q176K结晶。蛋白质缓冲溶液是10 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、15 mM CaCl2，pH 7.5的混合物，并且蛋白质浓度为5.8 mg/ml。沉淀、孔、溶液为：100 mM柠檬酸钠，pH 5.6、16.6% PEG 3350和12% 1-丙醇。悬滴在24孔VDX板中设置，使用1 ml孔溶液，并且使用1.5 μl蛋白质溶液和0.5 μl孔溶液的混合物。晶体随着薄板生长，其中尺度最高达0.3 x 0.15 x 0.05 mm。
将晶体转移至含有80体积%结晶孔溶液和20%甘油(99%纯度)的溶液。使晶体浸泡约30秒，这之后将晶体转移至液氮且在液氮中速冻。X射线衍射数据在束线911-3、MAX-实验室同步加速器，Lund，瑞典(Mammen等人，2002)处收集。一份晶体是单晶，而其他份显示孪晶。获得来自晶体的非孪生部分的完全数据集。数据通过XDS数据简化软件(Kabsch，2010)进行加工，导致1.95 ?的最终分辨率截断。晶体学数据、精化和模型统计学显示于表5中。
来自蛋白质数据库(Berman等人，2000)的3ELA条目(Bjelke等人2008)的晶体学坐标，用作CCP4软件包(Collaborative Computational Project，1994)的REFMAC5 (Murshudov等人，2011)中的刚体精化的起始模型。精化随后为计算机图形学软件COOT (Emsley等人，2010)中的相互作用模型校准。坐标精化和模型构建随后转移至PHENIX软件包(Adams等人，2010)和PHENIX.REFINE软件(Afonine等人，2012)。获得的最终R和R游离分别为0.183和0.216。晶体学数据、精化和模型统计学显示于表5中。
表5：关于FVIIa Q176K结构的晶体学数据、精化和模型统计学
aRsym =Σ h Σ i | I(h,i)- ?I(h)? | / ΣI h Σ i (h,i，其中I(h,i)是h的第i次测量的强度，并且?I(h)?是所有i次测量的相应平均值。
bRcryst=Σ h | |F(h) o |–|F(h) c | | / |F(h) o |，其中F(h)c是计算的反射h的结构因子，R游离等价于R晶体，但对于随机选择的5%反射进行计算，所述反射从精化过程中省略。
cR-游离基于所有反射的5%。
d基于的最大似然性。
结构分析– 重链FVIIa Lys 176残基位于β链B1的最开始中的β链A1和B1/之间的环中。当在似然性加权的2mFo-DFc图中使用1.0 截断时，重链Lys 176残基的电子密度对于主链明确显示，并且直至C -原子的侧链。Lys 176侧链的取向在重链293 Thr残基的方向中，远离3.5 ?。FVIIIa Q176K结构与蛋白质数据库(Berman，Westbrook，Feng，Gilliland，Bhat，Weissig，Shindyalov，& Bourne，2000)1DAN结构(Banner等人，1996)的比较显示结构间的高相似性。FVIIa FFR-cmk抑制且含Gla结构域的Gla结构在另一个空间群P41212中结晶，并且在结构域间取向中存在小差异。Cα-原子之间的均方根差(RMSD)通过GESAMT(Krissinel，2012)和CCP4软件程序包(Collaborative Computational Project，1994)的LSQKAB进行计算。关于两种复合物的三条共同链，FVIIa重(H)、FVIIa轻(L)和组织因子(T)的总体RMSD为0.796 ?(对于529 Cα-原子对)，而关于仅FVIIa重链、催化结构域的RMSD为0.347 ?。图6显示了在FVIIa突变体Q176K的催化结构域和1DAN结构的那种之间的LSQKAB叠加运行的个别Cα-Cα距离。
为了研究抗凝血酶和FVIIa突变体Q176K之间的可能相互作用，对具有PDB代码2GD4(Johnson等人，2006)的坐标的因子Xa分子作出在FVIIa突变体的叠加。FXa和FVIIa分子之间的同一性位置为34.1%，而共有位置为49.4%。使用GESAMT软件的叠加给出1.05 ?的RMSD，Q=0.783和229个残基的比对长度。根据残留(riding)抗凝血酶分子，随后明确的是如果抗凝血酶与FVIIa (Q176K)相互作用，则两个带正电的氨基酸：抗凝血酶的Arg 399和FVIIa重链的K176将变得非常接近(参见表6)和图7)，但是，因为两个残基均是带正电的，则后果是两个残基之间的静电排斥。此外，抗凝血酶Arg 399是抗凝血酶分子的反应中心环(RCL)的部分(Johnson等人2006)，并且所述排斥最可能负面影响抗凝血酶将其RCL置于FVIIa的活性位点内的可能性。由此，Q176K突变的FVIIa分子对通过抗凝血酶的抑制更不敏感。这与表2、表3和图3中观察到的一致，并且给出其解释，显示对通过抗凝血酶的失活的抗性增加、延长的半衰期和随后为活性中的轻微减少。
表6：两个残基FVIIa的Q176K和复合物的Arg 399之间的距离(Johnson等人2006)已叠加且替换为FVIIa突变体Q176K分子。
实施例10
为了评价抗凝血酶抗性与活性增强取代和化学修饰组合的效应，如下述部分中所述，通过酶促糖缀合使选择的FVIIa变体(参见表2)缀合至40-kDa PEG。
基本上如其他地方公开的(Stennicke等人2008)进行N聚糖指导的PEG化。简言之，将4-氨基苯甲脒(Sigma)加入在10 mM组氨酸、50 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 5.8中的溶液中的蛋白质(约1.55 mg/ml)至10 mM的最终浓度。随后加入产脲节杆菌(A. Urifaciens)唾液酸酶至4 μg/ml的最终浓度，以去除N聚糖上的末端唾液酸。去唾液酸反应在室温下进行1小时。去唾液酸蛋白质随后通过针对Gla结构域的单克隆抗体亲和层析进行纯化，如其他地方描述的(Thim等人1988)，使用50 mM Hepes、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.4，以洗掉过量苯甲脒和50 mM Hepes、100 mM NaCl、10 mM EDTA pH 7.4作为洗脱缓冲液。立即将氯化钙和苯甲脒加入收集的级分至10 mM的最终浓度。
根据制造商的说明书，使用4-12% Bis-Tris Gels (Invitrogen)，通过还原和非还原SDS-PAGE分析获得的产物。蛋白质浓度通过轻链rpHPLC分析进行测定。所获得的去唾液酸蛋白质基于SDS-PAGE和RP-HPLC分析是同质的。向去唾液酸蛋白质(最终浓度约26 μM)中，加入40kDa-PEG-GSC (N-((2,3-二(20 kDa mPEGyl)丙氧羰基氨基)乙酰基)-O 2-[5']胞苷酰-ζ-神经氨酸；10当量)和ST3Gal-III (最终浓度0.22U/ml)。反应在32℃下进行3小时。在糖基PEG化(glycoPEGylated)产物在32℃下由NAN-CMP(胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸；3 mM)加帽1小时后，如上所述通过抗体亲和层析分离产物。使用Superdex 200 pg 26/600柱(GE Healthcare)，通过尺寸排阻层析进一步纯化糖基PEG化产物。合并对应于单-糖基PEG化产物的级分，且如上所述通过SDS-PAGE分析。随后，使用Amicon 10 kDa截断超速离心装置(Millipore)，使产物浓缩至约1 mg/ml。
通过分析型SEC HPLC使用TSK-Gel G300SWXL柱评价二糖基PEG化FVIIa的含量，并且通过荧光(激发280 nm，发射在354 nm处)和吸光度(280 nm)检测。柱温为30℃，并且流速在200 mM Na-磷酸盐、300 mM NaCl、10%异丙醇，pH 6.9中维持在1 ml/分钟。
测试的所有变体(参见表4中的列表)顺应糖基PEG化，并且获得占优势的单PEG化(>85%)产物。体外表征显示FVIIa野生型、M298Q和V158D/E296V/M298Q背景下的Q286N、Q176K和T293K变体显示出在糖基PEG化后的抗凝血酶抗性中的轻微增加。另外，观察到蛋白酶解活性的下降。然而，基于Q176K和T293K的变体与M298Q和V158D/E296V/M298Q组合仍保留>100% TF不依赖性蛋白酶解活性，证实这些突变的优越性。
实施例11
定量方法：
Hepylated FVIIa缀合物通过HPLC分析纯度。基于FVIIa参考分子，HPLC也用于定量分离的缀合物量。样品以非还原或还原形式进行分析。使用Zorbax 300SB-C3柱(4.6x50 mm；3.5 um Agilent，目录号: 865973-909)。柱在30℃下操作。注入5 ug样品，并且用含有0.1%三氟乙酸的水(A)- 乙腈(B)溶剂系统洗脱柱。梯度程序如下：0分钟(25% B)；4分钟(25% B)；14分钟(46% B)；35分钟(52% B)；40分钟(90% B)；40.1分钟(25% B)。通过将10 ul TCEP/甲酸溶液(在水中的70 mM三(2-羧乙基)膦和10%甲酸)加入25 ul/30 ug FVIIa (或缀合物)制备还原样品。在HPLC(5 ul注入)上分析前，反应在70℃下静置10分钟。
HEP-马来酰亚胺聚合物的制备
使用两种糖核苷酸UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA，通过酶促(PmHS1)聚合反应制备限定大小的马来酰亚胺官能化肝素前体聚合物。引发三糖(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2用于起始反应，并且聚合运行直至糖核苷酸构件块耗尽。末端胺(源于引物)随后用合适的反应基团官能化，在这种情况下，设计用于缀合至游离半胱氨酸的马来酰亚胺功能性。试剂例如N-(g-马来酰亚胺丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS，Pierce)可以用于胺至马来酰亚胺转换。肝素前体聚合物的大小可以通过在糖核苷酸:引物化学计量学中的变化预测定。该技术在US 2010/0036001中详细描述。
FVIIa Q286N 407C的选择性还原：
使用基于谷胱甘肽的氧化还原缓冲系统，FVIIa Q286N 407C如US 20090041744中所述进行还原。非还原的FVIIa Q286N 407C (20 mg)在5℃下在含有0.5 mM GSH、15 uM GSSG、25 mM对氨基苯甲脒和2 μM Grx2的18.2 ml 10 mM Hepes、10 mM CaCl2、50 mM NaCl、0,01% Tween80，pH 6,0的总体积中温育18小时。溶液用20 ml 50 mM Hepes、100 mM NaCl，pH 7.0稀释且在冰上冷却。随后加入4.0 ml 100 mM EDTA溶液，同时保持pH中性。将整个内容物装载到两个连接的5 ml HiTrap Q FF柱 (Amersham Biosciences、GE Healthcare)上，所述柱在缓冲液A (50 mM HEPES、100 mM NaCl、1 mM EDTA，pH 7.0)中平衡，以捕获FVIIa Q286N 407C。在用缓冲液A洗涤以去除未结合的谷胱甘肽缓冲液和Grx2p后，FVIIa Q286N 407C在一步中用缓冲液B(50 mM HEPES、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.0)洗脱。在洗脱物中的FVIIa Q286N 407C浓度通过HPLC进行测定。17 mg FVIIa Q286N 407C在12.2 ml 50 mM Hepes、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.0中分离。当反应重复第二次时，50 mM Hepes、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.0的定量得率(20 mg)在8 ml 50 mM Hepes、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.0中分离。
60k HEP-[C]-FVIIa Q286N 407C的合成：
单个半胱氨酸还原的FVIIa Q286N 407C (20 mg)与60K HEP-马来酰亚胺(32 mg)在50 mM Hepes、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.0缓冲液(8.0 ml)中在室温下反应14小时。随后将反应混合物装载到用Gla结构域特异性抗体修饰的FVIIa特异性亲和柱(CV = 25 ml)上，并且进行步骤洗脱，首先使用2柱体积的缓冲液A (50 mM Hepes、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.4)，随后为两柱体积的缓冲液B (50 mM Hepes、100 mM NaCl、10 mM EDTA，pH 7.4)。该方法基本上遵循由Thim，L等人Biochemistry (1988) 27，7785-779描述的原理。收集具有展开的Gla结构域的产物，并且直接应用于两个连接的5 ml HiTrap Q FF离子交换柱(Amersham Biosciences，GE Healthcare，CV=10 ml)，所述柱用10 mM His、100 mM NaCl，pH 7.5平衡。柱用4柱体积的10 mM His、100 mM NaCl，pH 7.5和5柱体积的10 mM His、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH = 7.5洗涤，以洗脱未经修饰的FVIIa Q286N 407C。pH随后用10 mM His、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH = 6.0(12柱体积)降低至6.0。用10柱体积的40%缓冲液A (10 mM His、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH = 6.0)和60%缓冲液B (10 mM His、1 M NaCl、10 mM CaCl2，pH = 6.0)溶剂混合物洗脱60k-HEP-[C]-FVIIa Q286N 407C。合并含有缀合物的级分，并且使用10kD截断的Slide-A-Lyzer盒(Thermo Scientific)，针对10 mM His、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH = 6.0透析。在使用反相HPLC的三(2-羧乙基)膦还原后，通过针对FVIIa标准定量FVIIa轻链含量来测定得率(2.61 mg，13%)。还分离12.6 mg未经修饰的FVIIa Q286N 407C。
FVIIa T293K 407C的选择性还原：
使用基于谷胱甘肽的氧化还原缓冲系统，FVIIa T293K 407C如上文对于FVIIa Q286N 407C描述的进行还原。总共22.8 mg FVIIa T293K 407C在12 ml 50 mM Hepes、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.0中分离。
40k HEP-[C]-FVIIa T293K 407C的合成：
单个半胱氨酸还原的FVIIa T293K 407C (22 mg)和40K HEP-马来酰亚胺(24 mg)在含有0.5 mM对氨基苯甲脒的8 ml 50 mM Hepes、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.0缓冲液中在室温下温育18小时。随后将反应混合物用20 ml 50 mM Hepes、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.4稀释，并且装载到用Gla结构域特异性抗体修饰的FVIIa特异性亲和柱(CV = 64 ml)上。将柱逐步洗脱，首先使用两柱体积的缓冲液A (50 mM Hepes、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.4)，随后为两柱体积的缓冲液B (50 mM Hepes、100 mM NaCl、10 mM EDTA，pH 7.4)。收集具有展开的Gla结构域的产物，并且直接应用于三个连接的5 ml HiTrap Q FF离子交换柱(Amersham Biosciences，GE Healthcare，CV=15 ml)，所述柱用10 mM His、100 mM NaCl，pH 7.5平衡。柱用4柱体积的10 mM His、100 mM NaCl，pH 7.5和5柱体积的10 mM His、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH = 7.5洗涤，以洗脱未经修饰的FVIIa T293K 407C。pH随后用10 mM His、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH = 6.0(12柱体积)降低至6.0。用15柱体积的40%缓冲液A (10 mM His、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH = 6.0)和60%缓冲液B (10 mM His、1 M NaCl、10 mM CaCl2，pH = 6.0)溶剂混合物洗脱40k-HEP-[C]-FVIIa T293K 407C。合并含有缀合物的级分，并且使用10kD截断的Slide-A-Lyzer盒(Thermo Scientific)，针对10 mM His、100 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH = 6.0透析。在使用反相HPLC的三(2-羧乙基)膦还原后，通过针对FVIIa标准定量FVIIa轻链含量来测定得率(15.3 mg，69%)。
实施例12
在大鼠和犬中执行单独或与M298Q和V158D/E296V/M298Q和40k-糖基PEG化组合的所鉴定的抗凝血酶抗性突变的药物代谢动力学分析，以评价其对FVIIa的体内存活的作用。Sprague Dawley大鼠(三只/组)或小猎犬(两只/组)静脉内给药。Stabylite? (TriniLize Stabylite Tubes；Tcoag Ireland Ltd，爱尔兰)稳定的血浆样品在适当时间点作为完全概况收集，并且冷冻直至进一步分析时。血浆样品就凝结活性(如实施例7中所述)并且通过定量FVIIa-抗凝血酶复合物的ELISA进行分析。使用WinNonlin (Pharsight Corporation)，通过非区室方法进行药物代谢动力学分析。估计下述参数：FVIIa-抗凝血酶复合物的Cmax (最大浓度)，以及凝结活性的T? (功能终末半衰期)和MRT (功能评价停留时间)。
简言之，通过使用酶免疫测定(EIA)测量FVIIa-抗凝血酶复合物。与EGF结构域的N末端结合且不阻断抗凝血酶结合的单克隆抗FVIIa抗体用于捕获复合物(Dako 丹麦 A/S，Glostrup；产品代码O9572)。多克隆抗人AT抗体过氧化物酶缀合物用于检测(Siemens Healthcare Diagnostics ApS，Ballerup / 丹麦；产品代码OWMG15)。形成的纯化的人野生型或变体FVIIa和血浆衍生的人抗凝血酶复合物用作标准，以构建EIA校准曲线。将血浆样品稀释且分析，并且计算一式两份测量的平均浓度。EIA的测定间精确度为1-8%。
药物代谢动力学概况显示于图3中，并且估计的参数在表3中列出。对于FVIIa野生型和40k-糖基PEG化背景下的抗凝血酶抗性变体，FVIIa-抗凝血酶复合物的累积降低至低于检测水平。此外，这反映为，与糖基PEG化FVIIa (在大鼠中7.4小时和在犬中8小时)相比较，糖基PEG化FVIIa Q286N (大鼠中16小时和在犬中20小时)的显著延长的功能半衰期。类似地，当变体进一步与M298Q和V158D/E296V/M298Q组合时，通过抗凝血酶的体内失活极大缩小。值得注意的是，与FVIIa 40k-PEG的7.4小时相比较，FVIIa M298Q T293K 40k-PEG的半衰期在大鼠中为13小时，同时保留222%的不依赖TF的蛋白酶解活性(参见表3)。
实施例13
以0.5、2、5和10 mg/kg剂量，在FVIII敲除(Bi等人1996)小鼠中的尾部出血模型中，检查与野生型FVIIa相比较Q176K FVIIa的体内功效。在FVIIa或赋形剂(vehicle)在尾静脉中静脉内给药后5分钟，通过尾部尖端4 mm的横切，在异氟烷麻醉的大鼠中发起尾部出血。如其他地方描述的(Elm等人2012)，出血时间和失血在37℃盐水中测量30分钟时期。结果在图5中给出。分别计算失血ED50，对于野生型FVIIa为1.8 mg/kg，并且对于Q176K FVIIa为2.6 mg/kg，p=0.50。出血时间相对于剂量和失血以及出血时间相对于野生型FVIIa和FVIIa Q176K的暴露也显示非常相似的剂量应答曲线。总之，在FVIII缺失小鼠中的急性尾部出血中，在抗凝血酶抗性FVIIa Q176K变体和野生型FVIIa之间的剂量应答中不存在显著差异。
本发明进一步通过下述非限定性实施方案进行描述：
实施方案1：相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，包含两个或更多个取代的因子VII (a)多肽，其中所述取代中的至少一个是其中T293已替换为Lys(K)、Tyr(Y)、Arg(R)或Phe(F)；其中Q176已替换为Lys(K)、Arg(R)、Asn(N)；和/或Q286已替换为Asn(N)，并且其中所述取代中的至少一个是其中M298已替换为Gln(Q)、Lys(K)、Arg(R)、Asn(N)、Gly(G)、Pro(P)、Ala (A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)、Asp(D)、Glu(E)、His(H)、Cys(C)、Ser(S)或Thr(T)。
实施方案2：根据实施方案1的因子VII (a)多肽，其中T293已替换为Lys(K)、Tyr(Y)、Arg(R)或Phe(F)。
实施方案3：根据实施方案1的因子VII (a)多肽，其中Q176已替换为Lys(K)、Arg(R)或Asn(N)。
实施方案4：根据实施方案1的因子VII (a)多肽，其中Q286已替换为Asn(N)。
实施方案5：根据实施方案1-4的因子VII (a)多肽，其中M298已替换为Q。
实施方案6：根据实施方案5的因子VII (a)多肽，其中作为另外的取代，V158已替换为Asp(D)，并且E296已替换为Val(V)。
实施方案7：根据实施方案6的因子VII (a)多肽，其中作为进一步的另外取代，K337已替换为Ala (A)。
实施方案8：根据实施方案1的因子VII (a)多肽，其中所述多肽具有下述取代的组之一：T293K/M298Q 、T293Y/M298Q、T293R/M298Q、T293F/M298Q、Q176K/M298Q、Q176R/M298Q、Q176N/M298Q、Q286N/M298Q、T293Y/V158D/E296V/M298Q、T293R/V158D/E296V/M298Q、T293K/V158D/E296V/M298Q、Q176K/V158D/E296V/M298Q或Q176R/V158D/E296V/M298Q。
实施方案9：根据实施方案1-8的因子VII (a)多肽，其中所述因子VII (a)多肽与至少一种延长半衰期的部分偶联。
实施方案10：根据实施方案9的因子VII (a)多肽，其中所述“延长半衰期的部分”选自生物相容性脂肪酸及其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)例如羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)n (HAP)、透明质酸(HA)、肝素前体聚合物(HEP)、基于磷酰胆碱的聚合物(PC聚合物)、Fleximers、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样(ELP)肽、XTEN聚合物、PAS聚合物、PA聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽和FcRn结合肽。
实施方案11：根据实施方案10的因子VII (a)多肽，其中所述延长半衰期的部分是HEP。
实施方案12：根据实施方案9-11中任一项的因子VII (a)多肽，其中所述因子VII (a)多肽具有另外的突变R396C、Q250C或+407C。
实施方案13：根据前述实施方案中任一项的因子VII (a)多肽，其中所述因子VII (a)多肽与组织因子二硫键连接。
实施方案14：根据前述实施方案中任一项的因子VII (a)多肽，其中所述因子VII (a)多肽是具有增加的血小板亲和力的因子VIIa变体。
实施方案15：多核苷酸构建体，其编码根据实施方案1-14中任一项的因子VII (a)多肽。
实施方案16：宿主细胞，其包含根据实施方案15的多核苷酸构建体。
实施方案17：用于产生实施方案1-14中任一项中限定的因子VII (a)多肽的方法。
实施方案18：药物组合物，其包含如实施方案1-14中任一项中限定的因子VII (a)多肽。
实施方案19：根据实施方案18的药物组合物，其在A或B型血友病治疗中作为药物使用。
实施方案20：如实施方案1-14中任一项中限定的因子VII (a)多肽用于制备药物的用途，所述药物用于治疗出血障碍或出血发作或者用于增强正常止血系统。
实施方案21：根据实施方案20的用途，其用于治疗A或B型血友病。
实施方案22：用于治疗受试者中的出血障碍或出血发作或者用于增强正常止血系统的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗或预防有效量的如实施方案1-14中任一项中限定的因子VII (a)多肽。
实施方案23：如实施方案1-14中任一项中限定的因子VII (a)多肽，其作为药物使用。
实施方案24：根据实施方案23的因子VII (a)多肽，其在A或B型血友病治疗中作为药物使用。

Claims (15)

1.相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，包含两个或更多个取代的因子VII (a)多肽，
其中所述取代中的至少一个是其中T293已替换为Lys(K)、Tyr(Y)、Arg(R)或Phe(F)；其中Q176已替换为Lys(K)、Arg(R)、Asn(N)；和/或Q286已替换为Asn(N)，和
其中所述取代中的至少一个是其中M298已替换为Gln(Q)、Lys(K)、Arg(R)、Asn(N)、Gly(G)、Pro(P)、Ala (A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)、Asp(D)、Glu(E)、His(H)、Cys(C)、Ser(S)或Thr(T)。
2.根据权利要求1的因子VII (a)多肽，其中T293已替换为Lys(K)、Tyr(Y)、Arg(R)或Phe(F)。
3.根据权利要求1的因子VII (a)多肽，其中Q176已替换为Lys(K)、Arg(R)或Asn(N)。
4.根据权利要求1的因子VII (a)多肽，其中Q286已替换为Asn(N)。
5.根据前述权利要求中任一项的因子VII (a)多肽，其中M298已替换为Q。
6.根据权利要求1的因子VII (a)多肽，其中所述多肽具有下述取代的组之一：T293K/M298Q、T293Y/M298Q、T293R/M298Q、T293F/M298Q、Q176K/M298Q、Q176R/M298Q、Q176N/M298Q、Q286N/M298Q、T293Y/V158D/E296V/M298Q、T293R/V158D/E296V/M298Q、T293K/V158D/E296V/M298Q、Q176K/V158D/E296V/M298Q或Q176R/V158D/E296V/M298Q。
7.根据前述权利要求中任一项的因子VII (a)多肽，其中所述因子VII (a)多肽与至少一种延长半衰期的部分偶联。
8.根据权利要求7的因子VII (a)多肽，其中所述延长半衰期的部分选自生物相容性脂肪酸及其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)，例如羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)n (HAP)、透明质酸(HA)、肝素前体聚合物(HEP)、基于磷酰胆碱的聚合物(PC聚合物)、Fleximers、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样肽(ELP)、XTEN聚合物、PAS聚合物、PA聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽和FcRn结合肽。
9.根据权利要求8的因子VII (a)多肽，其中所述延长半衰期的部分是肝素前体聚合物。
10.根据权利要求7-8中任一项的因子VII (a)多肽，其中所述因子VII (a)多肽具有另外的突变R396C、Q250C或407C。
11.用于产生权利要求1-10中任一项中限定的因子VII (a)多肽的方法。
12.药物组合物，其包含如权利要求1-10中任一项中限定的因子VII (a)多肽。
13.用于治疗受试者中的出血障碍或出血发作或者用于增强正常止血系统的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗或预防有效量的如权利要求1-10中任一项中限定的因子VII (a)多肽。
14.如权利要求1-10中任一项中限定的因子VII (a)多肽，其作为药物使用。
15.根据权利要求14的因子VII (a)多肽，其在A或B型血友病治疗中作为药物使用。
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