JPS5915626B2 - β−ガラクトシダ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ペニシリウム・マルチカラー及びその類縁菌
を培地に培養し、培養物よりβ−ガラクトシダーゼを採
取することを特徴とするβ−ガラクトシダーゼの製造法
に関するものである。

β−ガラクトシダーゼは哺乳動物の乳汁中に含有される
乳糖を加水分解しグルコースとガラクトースにする酵素
であり、近年乳糖不耐症の治療や乳製品の加工上、注目
される酵素となりつつあり、一部には産業的開発も行な
われているが、問題点が多く、満足すべきものが得られ
ていない。

微生物の生産するβ−ガラクトシダーゼには乳酸菌等の
細菌によるもの、サツカロミセス・フラジリス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）等、の酵母
によるものが知られているが、これらは菌体内酵素であ
り、菌体より抽出分離が必要であるため、酵素の調製に
は多くの工程を必要とし、かつ高収率での回収が難かし
い。

また、菌体外分泌性のβ−ガラクトシダーゼとしては一
般に糸状菌を起源としたものが知られており、例えばア
スペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｇｅｒ） （特公昭４９−２１０７８号）、アスペル
ギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉ ｆｌｕｓ ｏｒｙ
ｚａｅ ） （特開昭５１−１５１３８５号）、アスペ
ルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａ
ｍｏｒｉ） （特公昭４９−２２７０９号）等のアスペ
ルギルス属菌株によるものの他、マクロフオミナ（Ｍａ
ｃｒｏｐｈｏｍｉｎｓ ）属（特開昭４９−１１７６７
７号）、スクレロチウム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）属（
特開昭４９−１１６２９湯）トリコブル？ （Ｔｒｉｃ
ｏｄｅｒｍａ ）属（特開昭４９−６２６８８号）等の
微生物の生産するものがある。

これらの中でアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス
・アワモリ、スクレロチウム属の微生物の生産するβ−
ガラクトシダーゼはｐＨ２〜３．５と極めて酸性側に至
適ｐＨを有する酸性β−ガラクトシダーゼであり使用用
途が限定される。

また、アスペルギルス・オリーゼ ＦＥＲＭ−Ｐ１６８
０株を除いて、これらの酵素生産菌のβ−ガラクトシダ
ーゼ生産力は微弱である。

アスペルギルス・オリーゼ ＦＥＲＭ−Ｐ １６８０株
は比較的高単位の生産力を有している菌株であると認め
られるが、その生産する酵素はｐＨ２，５〜３．０では
殆ど失活し、酸性サイドでの安定性にかける。

従って、医薬用に使用した場合、胃内のｐＨ２，５〜３
０で容易に失活しやすい。

更にβ−ガラクトシダーゼを生産する微生物としてペニ
シリウム・シトリナム等が知られている（特開昭５１−
１４２５９３号）。

また、一般にβ−ガラクトシダーゼはその酵素製剤とし
ての安定性に乏しく、その防止のために凍結乾燥（特公
昭４７−５０３９０号）やイノジットを添加するＣ特開
昭５１−９７８３号）様な酵素安定化方法が提案されて
いる。

本発明者らは、産業的に生産が容易でかつ、広範な目的
に合致するβ−ガラクトシダーゼの製造に関する研究を
行なった結果、ペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒＪびその類縁菌
株が、優れた酵素的性質を有する新規なβ−ガラクトシ
ダーゼを高単位に生産する新知見を見出し、本発明の完
成に至った。

即ち、本発明のβ−ガラクトシダーゼの製造法は、ペニ
シリウム・マルチカラー及びその類縁菌を培地に培養し
、培養物よりβ−ガラクトシダーゼを採取することより
なる。

ペニシリウム・マルチカラーはすてにザ・ジャパニーズ
・フエデレーション・オブ・カルチャア・コレクション
ズ・オブ・マイクロオルガニズムス（ＴＨＥ ＪＡＰＡ
ＮＥＳＥ ＦＥＤＥＲＡＴＩＯＮ ０ＦＣＵＬＴＵＲＥ
Ｃ０ＬＬＥＣＴＩＯＮＳ ＯＦ ＭＩＣＲＯ−ＯＲＧ
ＡＮＩＳＮＳ）のカタログ１９６８年版１０３頁に記載
されており、本発明で使用するβ−ガラクトシダーゼ生
産菌であるペニシリウム・マルチカラーＫＵ−０−１３
２も同種の菌株であるが、工業技術院微生物工業技術研
究所に受託番号第４３７５号として寄託されている。

本発明のβ−ガラクトシダーゼの製造の実施に当っては
、菌株を固体又は液体培地に好気的暑こ培養する。

培養に用いる培地組成は、核、米糖、脱脂大豆、綿実粉
等の天然物を基礎に必要に応じては、澱粉、グルコース
、アラビノース、キシロース等の炭素源、硫酸アンモニ
ウム、硝酸ナトＩＪウム、ペプトン、麦芽エキス、酵母
エキス等の窒素源、無機リン酸塩、マグネシウム塩、カ
ルシウム塩等の無機塩類を添加することができる。

培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃で、
ｐ）１２．５〜９、好ましくはｐｉ（：３．！５〜７．
５の環境下で１〜８日間好気的に培養を行うことが望ま
しい。

一般的にβ−ガラクトシダーゼの生産は培養２〜６日で
最高に達する。

培養物は、液体培養ならばその培養液から、固体培養な
らば培養抽出液から通常の酵素精製法により精製するこ
とができる。

即ち、培養物を必要によっては、低温減圧濃縮、メンプ
ラン濃縮等により濃縮し、硫安等で塩析し又はアセトン
、アルコール等で沈澱化して分別採取する。

勿論、培養物をそのまま、酵素として利用することもで
きる。

更に精製を進めるにはイオン交換法、ゲル沢適法、透析
、担体吸着法、 白沈澱化剤法等の通常の酵素精製の方
法で純化することが可能である。

本発明の方法によって得られるβ−ガラクトシダーゼは
、公知の酵素とは全（異なるものである。

次に本発明酵素の酵素的諸性質を挙げるが、ペニシリウ
ム・シトリナム等の生産するβ−ガラクトシダーゼとの
差異を示すため比較して挙げる。

（アンフオラインの電気泳動） 以上の様に明らかな相異が見られる。

特に、基質特異性、温度安定性、金属イオンの影響等で
その差は埜然としている。

また、ペニシリウム・シトリナムの生産するβ−ガラク
トシダーゼは、固体培養抽出液からアセトンを用いて沈
澱分離する際、アセトン濃度４５〜７０係区分に集中し
て回収されるか、本発明のβ−ガラクトシダーゼは、ア
セトン濃度４５係以下の区分、正確には３０〜４０係区
分でその殆どのβ−ガラクトシダーゼを沈澱させ分離回
収することができる。

この事実は物質的差異の証明の他に産業的に有機溶媒使
用量が１／３以下で済むという利点がある。

次に酵素溶解率を挙げて比較する。

更に、精製法についてもペニシリウ・シトリナムの生産
するβニガラクトシダーゼはｐＨ３，８にてＤＥＡＥ−
セファデックスカラムを通過後、ＳＰ−セファデックス
に吸着させるが、本発明によるβ−ガラクトシダーゼは
ｐＨ３，０〜３２でないとＳＰ−セファデツクスカラム
には吸着しない。

また、産業的利用上置も主要な点である酵素生産力価に
おいても、本発明のペニシリウム・マルチカラーは前述
のペニシリウム・シトリナム等に比べ３０培強の酵素生
産力を有する。

即ち、皺１ｇ当りのβ−ガラクトシダーゼがペニシリウ
ム・シトリナムでは２０〜３０Ｕに対し、本発明では１
．０ＯＯＵである。

このβ−ガラクトシダーゼ生生産方力、現在知られてい
るアスペルギルス属、トリコデルマ属、スクレロチウム
属等の菌株の酵素生産力に比較しても強力なる生産力価
を示している。

即ち、本発明のペニシリウム・マルチカラーは実施例に
見られる如く、固体培養の場合、皺１ｇ当り約１，０Ｏ
ＯＵ、液体培養の場合、培養液１ｍｌ当り約１５０Ｕの
生産力を示し、上述の既知の生産菌の１０〜３０倍の生
産力を有している。

また本発明の酵素は、アスペルギルス・オリーゼ、マク
ロフオミナ属、トリコデルマ属等の微生物の生産するβ
−ガラクトシダーゼとは至適温度、至適ｐＨ，安定温度
、安定ｐＨ等で、差異が認められる。

本発明の酵素は、安定でありこの点でも大きな特徴を有
しており、酵素製剤は何らの安定化の処理をすることな
く、長期間の保存に耐える特長を有する。

次に、実施例を挙げて具体的に説明するが、β−ガラク
トシダーゼの力価は通常行なわれる次の方法で測定した
。

即ち、０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド３７１ｎ９／１ｒＬｌを含有する基質液１ｍｌにｐＨ
４，５，０，２ＭのＭａｃ １ｌｖａｉｎｅ緩漬液２ｍ
ｌ、酵素液１ｒ／′Ｌｌを混合し、５５°Ｃにて１５分
間反応後、ＩＭ濃変の炭酸ナトリウム液４ｒ／Ｌｌを加
え反応を停止し、４２０ｍμの波長で比色定量し、０−
二トロフェノールの検量線より生成した０−ニトロフェ
ノールの量を求める。

同条件で１分間に１μモルのＯ−ニトロフェノールの生
成力をもって１単位（Ｕ）と定める。

実施例 １ 皺１０．９．脱脂大豆ｉｏｙ、水２０ｍ１を混合し、５
００ｍ１三角フラスコに入れ、オートクレーブで殺菌後
、ペニシリウム・マルチカラーＫＵ−０−１３２を斜面
培地から接種した。

２８℃の環境条件下で４日間培養後２００ｍ１の水でβ
−ガラクトシダーゼを抽出し、炉別して固型物を除外し
た。

この抽出液のβ−ガラクトシダーゼ゛力価は２２８Ｕ／
ｍｌｌであった。

実施例 ２ 米糠３係、棉実紛１係、リン酸−カリウム０、２５ ％
、’Ｊン酸二ナトリウムｏ、１５％の組成液体培地（ｐ
Ｈ６，２） １００ｍｌを５００ｍ１容の振盪フラスコ
に入れ、オートクレーブで殺菌後、ペニシリウム・マル
チカラーＫＵ−０−１３２を斜面培地より接種し、２８
°Ｃにて３日間往復振盪培養した。

培養液を炉別して得た清澄液のβ−ガラクトシダーゼ゛
力価は１４０ Ｕ／ＴＬｌであった。

実施例 ３ 脱脂大豆１．５ｋｇ、棉実紛１．５ｋｇ、水３１を均一
に混合し、大型バットに入れ、オートクレーブで殺菌後
、皺培地（皺：水工１＝１）に３日間培養したペニシリ
ウム・マルチカラーＫＵ−０−１３２の種核１５０ｇを
接種し、２８℃の環境条件下で、５日間固体静置培養を
行った。

培養後の出麹５．４ｋｇを解砕後カラムに詰め、上部よ
り水を流して得た抽出液１８１を遠心分離して少量の固
型物を除去した。

この清澄液のβ−ガラクトシダーゼカ価は３４７ Ｕ
／ｍｌであった。

次いでこの清澄液を限外濾過を用いて４１まで濃縮後、
低温下でアセトン２．７１を滴下し、生ずる沈澱を分離
後、減圧乾燥しβ−ガラクトシダーゼ粉末１６５ｇを得
た。

この粉末のβ−ガラクトシダーゼ活性は３４．８００Ｕ
／ｇの高力価のものであった（回収率約９２＠。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ペニシリウム・マルチカラーを培地に培養し、培養
   物より下記の理化学的性質を有するβ−ガラクトシダー
   ゼを採取することを特徴とするβ−ガラクトシダーゼの
   製造法。 理化学的性質 （１）基質特異性 ラクトース、０−ニトロフェニル−β−Ｄ −ガラクト
   ピラノシド、Ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピ
   ラノシドを基質として活性比は、ラクトースを１００と
   した場合、各々２２４．１８６である。 （２）分子量 ゲルろ適法による分子量は約１２０，０００である。 （３）至適ｐ）１ ４．５ （４）作用ｐＨ ２，５〜７ （５）至適温度 ５５°Ｃ （６）作用温度 ７５℃未満 （７） ｐＨ安定性 ｐＨ２，ｓ〜８．０で２４時間（４℃）安定である。 （８）温度安定性 ｐＨ６で１５分処理後の残存活性は次の通りである。 ６０°Ｃ９５〜１００係 ６５°０ ６０係 ７０°Ｃ２５係 ７５°ＣＯ係 （９）金属イオンの影響 １０−３モル濃度で鉄にやや不安定、銅に安定である。 （１０）等電点 アンフオラインを用いて測定した結果はｐＨ５，３７で
   ある。