DE2904225C2

DE2904225C2 - β-Galactosidase und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2904225C2
Application number: DE2904225A
Authority: DE
Inventors: Reisuke Shizuoka Kobayashi; Tan Miwa; Kiyoshi Shimizu Shizuoka Takita
Original assignee: Kumiai Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kumiai Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1978-02-06
Filing date: 1979-02-05
Publication date: 1985-11-14
Also published as: IT1165933B; DE2904225A1; NL7900762A; US4229539A; SU952111A3; JPS5915626B2; CH641837A5; AU4387879A; JPS54105290A; FR2422680B1; FR2422680A1; AU524893B2; GB2014154A; GB2014154B; IT7909337A0

Description

2. Verfahren zur Herstellung einer 0-Galactosidase gemäß Anspruch I durch Züchten eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium mit Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zur Bildung und Ansammlung der /J-Galactosldase in dem Medium und Isolieren der /J-Galactosidase aus dem Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Peniciilium multicolor ATCC 20 539 züchtet.

Die Erfindung bezieht sich auf eine /?-Galactosldase, die beim Abbau oder der Hydrolyse von Lactose zu Glucose und Galactose aktiv Ist und bei sauren pH-Werten, die in den Verdauungsorganen des Menschen vorherrschen, und bei Normal- und erhöhten Temperaturen bei der Lagerung stabil ist. Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur fermentatlven Gewinnung dieser /J-Galactosldase durch Kultivieren des Stammes Peniciilium multicolor ATCC 20 539 (vgl. die beiden Patentansprüche).

/!-Gaiactosldase ist ein Enzym, das die In der Müch von Säugetieren vorhandene Lactose zu Glucose und Galactose hydrolysiert. In den letzten Jahren hat dieses Enzym öffentliche Beachtung gefunden, da es zur Verbesserung oder therapeutischen Behandlung dyspeptlscher Erkrankungen von Kindern brauchbar Ist, die nicht In der Lage sind. Lactose abzubauen, und da es auch zur Bearbeitung verschiedener Milchprodukte brauchbar Ist.

Manche Arten /i-Galaciosidase wurden bereits nach kommerziellen Verfahren gewonnen, wozu das Kultivieren eines Bakterlums, von Hefe oder Pilzen (Fungi) und das Isolieren dieser /i-Galactosidasen aus der Kultur oder der Kulturbrühe des Mikroorganismus gehört. Doch sind nicht alle bekannten yS-Galactosldasen zufriedenstellend, da sie einen oder mehrere bestimmte Nachtelle hinsichtlich Ihrer Aktivität und Stabilität sowie der Ausbeute Ihrer Gewinnung aufweisen.

Durch Mikroorganismen gebildete bekannte /2-Galactosldasen umfassen solche, die durch Bakterien, wie Milchsäurebakterien, und solche, die durch Hefen, wie Saccharomyces fragllls, erzeugt werden. Da diese durch Bakterien und Hefen erzeugten bekannten /3-Galactosldasen das intrazelluläre Enzym darstellen, das im Zellkörper des Bakterlums oder der Hefe erzeugt wird und verbleibt, müssen die Enzyme aus dem Zellkörper dieser Mikroorganismen entfernt und extrahiert werden. Für die Gewinnung dieser Intrazellulären Enzymprodukte sind daher eine Reihe von Bearbeitungsstufen erforderlich, und gußerdem Ist es schwierig, diese intrazellulären Enzymprodukte in hoher Ausbeute zu gewinnen.

Andererseits Ist bekannt, daß einige /i-Galactosldasen als extrazelluläres Enzym durch Fungi der Gattung Asperglllus, wie Asperglllus nlger (vgl. die veröffentlichte JP-PA 21 078/74), Aspergillus oryzae (veröffentlichte JP-PA »Kokal« I 51 385/76), Asperglllus awamorl (veröffentlichte JP-PA 22 709/74), durch Fungi der Gattung Macrophomina (veröffentlichte JP-PA »Koka!« I 17 677/76), durch Fungi der Gattung Sclerotlum (veröffentlichte JP-PA »Kokai« I 16 291/74) und durch Fungi der Gattung Trlchoderma (veröffentlichte JP-PA »Kokal« 62 688/74) erzeugt werden.

Unter diesen bekannten /y-Galactosldasen, die als extrazelluläres Enzym gebildet werden, sind diejenigen, die von Asperglllus nlger und Asperglllus awamorl, sowie diejenigen die durch die Fungi der Gattung Sclerotlum gebildet werden, eine saure /i-Galactosidase, die optimalen pH bei stark saurem pH-Wert von 2 bis 3,5 zeigen und daher nur begrenzt verwendbar sind.

Weiler werden die bekannten, von Aspergillus oryzae und von Fungi der Gattung Macrophomina oder der Gattung Trlchodemia erzeugten /i-Galactosldasen von der neuen /i-Galactosldase unterschieden, die durch Penlclllluni multicolor ATCC 20 539 gemäß der Erfindung erzeugt wird, und zwar hinsichtlich Ihres otplmalcn Temperaturwerts, optimalen pH-Werts, des Temperaturbereichs und des pH-Bereichs, In denen diese Enzyme stabil-sind. Im übrigen haben die oben erwähnten bekannten Fungi, ausgenommen Asperglllus oryzae FERM-P 1680, eine nur mäßige Fähigkeit zur Bildung der /i-Galactosldase als extrazelluläres Enzym.

Asperglllus oryzae FERM-P 1680 besitzt eine günstig hohe Fähigkeit zur Erzeugung von /J-Galactosldase hoher Aktivität, aber die durch diesen speziellen Stamm erzeugte ^-Galactosldase kann bei saurem pH-Wert von 2,5 bis 3,0 inaktiviert werden und zeigt somit eine geringere Stabilität bei sauren pH-Werten im Vergleich zu der erfindungsgemäß neuen /J-Galactoöldase. Wenn die /J-Galactosidase von Aspergillus oryzae FERM-P 1680 als Verdauungsmitte! Menschen verabreicht wird, ist sie oft nutzlos, da sie bei einem pH-Wert von 2,5 bis 3,0 sehr leicht inaktiviert wird, also bei pH-Werten, die normalerweise Im Magenraum vorherrschen.

Im allgemeinen sind die eine bekannte ^-Galactosidase enthaltenden Enzympräparate bei ihrer Lagerung wenig stabil, und es wurde ein Verfahren zum Stabilisieren dieser Enzympräparate durch Gefriertrocknen (veri'fl'entlichie JP-PA 50 390/72 z. B.) sowie ein Verfahren zum Stabilisieren dieser Enzympräparate durch Einarbeiten von Inosit (veröffentlichte JP-PA »Kokai« 9 783/76) vorgeschlagen worden, um die Zerstörung der /J-Galactosidase zu verhindern.

Ferner ist auch bekannt, daß Penicilllum frequentans Westling FERM-P 3085 eine /J-Galactosidase erzeugt, die bei einem pH-Wert von 3 bis 5 bei 4° C stabil ist, wobei der optimale pH-Wert bei 3,5 bis 4,5 liegt; Penicillium luteum Sopp Ferm-P 3091 erzeugt eine /8-Galactosidas"., die bei einem pH-Wert von 3,5 bis 8 bsi 4° C stabil ist, wobei der optimale pH 4,0 bis 5,0 ist; Penicilllum citrinum ATCC 9849 (FERM-P 3086) produziert eine /J-Galactosidase, die bei einem pH-Wert von 3,5 bis 8 bei 4° C stabil ist, wobei der optimale pH 4,0 bis 5,0 ist; Penicillium glaueum Link FERM-P 3090 produziert eine 0-Galactosidase, die bei einem pH-Wert von 3,5 bis 8 bei 4° C stabil ist, wobei der optimale pH 4,0 bis 5,0 ist; Penicillium chrysogenum Thorn IFD 4626 (FERM-P 3088) erzeugt elcs yJ-GalactosIdase, die bei einem pH-Wert von 3 bis 8 bei 4° C stabil ist, wobei der optimale pH 4,0 bis 5,0 ist; und Pen!c!!Üum notatutn Westling FERM-P 3087 produziert eine /J-Galactosidase. die bei einem pH-Wert von 3,5 bis 8 bei 4° C stabil ist, wobei der optimale pH 4,0 bis 5,0 ist. Diese Penicillium-Arten können jedoch die vorerwähnten /J-GaI actosldasen in nur mäßiger Ausbeute erzeugen, die kommerziell unbefriedigend ist. Außerdem sind die durch diese PenicilHum-Arten erzeugten bekannten /J-Galactosldasen nicht völlig zufriedenstellend, weil sie bei pH-Werten von 2,5 bis 3,0, wie sie im Magen des Menschen vorherrschen, nicht stabil sind und well sie durch Erwärmen auf eine erhöhte Temperatur von etwa 65° C für 15 min. bei einem pH von 6 vollständig inaktiviert werden können.

Aufgabe der Erfindung war daher die Bereitstellung einer neuen /J-Galactosidase, die In hoher Ausbeute in kommerziellem Maßstab leicht eneugt werden kann und sich far zahlreiche Anwendungen eignet.

Gelöst wird diese Aufgabe dadurch, daß Penicillium multicolor ATCC 20 539 eine neue /5-Galactosidase in hoher Ausbeute erzeugt, die ausgezeichnete enzymatlsche Eigenschaften und insbesondere eine brauchbar hohe pH-Stabil'tät und eine brauchbar hohe Wärmestabilität zeigt. Diese neue /J-Galactosidase kann durch Kultivieren des genannten Stamme, von Penicillium multicolor In einem Kulturmedium, entweder flüssig oder fest, das Quellen für assimilierbaren kohlenstoff und Stickstoff enthält, zur Bildung und Ansammlung des Enzyms in dem Medium und anschließendes lsi, leren des gewünschten Enzyms aus dem Medium erhalten werden.

Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird also eine aus dem Kulturmedium von Penicilllum multicolor ATCC 20 539 isolierte pulverförmige /i-Galactosldase mit den folgenden Merkmalen zur Verfügung gestellt:

a) sie besitzt eine relative /J-Galactosldase-Aktlvltät von 224% für o-Nitrophenyl-/J-D-galacto/>yranosid und von 186% für p-Nltrophenyl-ZJ-D-galactopyranosid unter der Annahme einer relativen /f-Galactosldase-Aktivität von 100% für Lactose,

b) sie hat ein Molekulargewicht von etwa 120 000, bestimmt nach der Gelfiltrationsmethode,

c) sie ist bei einem pH-Wert von 2,5 bis 7 aktiv, wobei der optimale pH bei 4,5 liegt,

d) die /J-Galactosldase-Aktlvltät geht durch 15mlnütiges Erwärmen auf 75° C bei pH 6 verloren, wobei die Optimaltemperatur 55° C 1st,

e) die /(-Galactosldase-Aktlvltät ist in einem pH-Bereich von 2,5 bis 8,0 bei 24stündigem Stehen bei 4° C stabil,

f) die /i-Galactosidase-Aktivität wird bei 6O⁰C 100%ig stabil gehalten und bei 65⁰C auf 60%, bei 70° C auf 25% und bei 75° C auf 0% bei 15mlnütlgem Stehen bei pH 6 gesenkt,

g) die /I-Galactosldase-Aktivität wird durch die Anwesenheit von QuecksliberOD-Ionen (Hg⁺*) um etwa 20% gehemmt, jedoch durch die Anwesenheit von Eisen(II)-Ionen (Fe") und Kupfer(II)-Ionen (Cu⁺*) bei einer Metallionenkonzentration von 10"³ M nicht wesentlich gehemmt, und

h) sie hat einen Isoelektrischen Punkt von 5,37, gemessen nach einer Elektrophoresemethode.

Die erfindungsgemäße neue /J-Galactosldase ist bei einem pH-Wert von 2,5 bis 3,0 stabil, den der vom menschlichen Magen gebildete Verdauungssaft aufweist. Gewöhnlich schwankt der im Magen herrschende pH-Wert In Abhängigkeit von der Art und Menge der aufgenommenen Nahrung und der von der Nahrungsaufnahme an verstrichenen Zelt sowie auch aufgrund Individueller Unterschiede. Der pH in der Magenhöhle zeigt normalerweise einen Wert von 4 bis 5 nach der Aufnahme von Kuhmilch und Irgendwelchen Milchprodukten. Daher Ist es sehr vorteilhaft, daß die erfindungsgemäße /J-Galactosldase einen Optimal-pH von 4,5 hat. Zudem zeichnet sich die erfindungsgemäße neue /i-Gäläctösldäse In vorteilhafter Welse durch Ihre hohe Stabilität bei Raumtemperatur und bei erhöhter Temperatur bis zu 6O⁰C aus, so daß sie lange ohne Stablllslerungsmaßnahmen gelagert werden kann. Beispielsweise wird die erfindungsgemäße neue /J-Galactosldase selbst dann nicht wesentlich Inaktiviert, wenn sie In Form eines pulvrigen Enzympräparats In einem verschlossenen Behälter 1 Monat bei 45° C gelagert wird. Die /5-Galactosldase-Restaktlvität bleibt bei etwa 95% oder darüber, selbst wenn sie einen Monat in freier Luft einer relativen Feuchtigkeit von 50 bis 70% bei 45° C gelagert wird. Daher hat das crflndungsgemäße neue Enzym viele Vorteile im Vergleich zu den bekannten /?-Galactosldasen, die wenig stabil sind und normalerweise In der Kälte aufbewahrt werden müssen.

Genial! einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung einer /J-Galactosldase mit den

Merkmalen des Anspruches 2 geschaffen.

Der erfindungsgemäß venvendete Mikroorganismus, nämlich Penicilllum multicolor ATCC 20 539, Ist eine bekannte Art, die im »Japanese Federation of Culture Collections of Mlcroorganlsmsw-Katalog, Seite 103, 1968, der japanischen Hinterlegungsstelle »Institute for Fermentation (IFOK Osaka, Japan, beschrieben ist. Dieser Stamm wurde auch in der japanischen Hinterlegungsstelle »Fermentation Research Institute«, Agency of Industrial Science & Technology of Japan, Inage, Chiba City, Japan, am 25. Januar 1978 unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 4375 hinterlegt und von dort direkt an die ATCC transferiert, wo er die Hinterlegungsbezeichnung ATCC 20 539 erhielt.

Nachfolgend werden die dem oben erwähnten Stamm von Penlcillium multicolor eigenen morphologischen ίο Eigenschaften kurz beschrieben:

1. Makroskopische Feststellungen (nach lOtäglgem Inkubieren bei 25° C auf Czapek's Agar-Medium):
Kolonien von 30 bis 40 mm 0 bilden sich durch das Wachstum des Penicilllum multicolor. Die Wuchsoberfläche ist radial runzelig und mit einer dichten, samtigen Schicht aus Konldlen von tief bläulich grüner bis grau-grüner Farbe bedeckt. Die Peripherie der Wuchsstelle zeigt orange bis gelbe Farbe einer Breite von I bis 2 mm. Die Rückseite der Wuchsstelle zeigt gelbe bis braune Farbe.

2. Mikroskopische Beobachtungen (nach lOtäglgem Inkubieren bei 25° C auf Czapek's Agar-Medüum):

a) Penicillla: Monoverticillape

b) Konidophore: Gerade und senkrecht ohne Verzweigung, 2 bis 3 μπι breit und an den Spitzen verbreitert.

c) Sterigma: S bis 14 Sterigmen wachfen In der dichten Masse.

d) Konidium: Von kugeliger oder ovaler Form, 2 bis 3 μπι Durchmesser. Die Oberfläche Ist glatt.

Bei der Durchführung der Erfindung kann der besagte Stamm von Penicilllum multicolor entweder In einem flüssigen Kulturmedium oder in einem festen Kulturmedium u; ter Anwendung bekannter Fermentationstechniken, vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, kultiviert werden. Das zum Fermentieren verwendete Kulturmedium kann einen oder mehrere natürliche Nährstoffe, wie Weizenkleie, Relsklele, entfettetes Sojabohnenmehl und Baumwollsamenmehl als Grundkomponenten enthalten. Das Kulturmedium kann auch Lactose, Stärke, Glucose, Arab I nose und Xylose als Kohlenstoffquelle und Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Pepton, Malzextrakt und Hefeextrakt als Stickstoffquelle, wenn nötig, enthalten. Anorganische Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalz und Calciumsalz, können In das Kulturmedium, wenn gewünscht, eingebracht werden. Im allgemeinen Ist zum Kultivieren von Penicilllum multicolor eine Inkubationstemperatur von 10 bis 35° C, vorzugsweise 25 bis 33° C, und eine Umgebung mit einem pH-Wert von 4 bis 9, vorzugsweise 5 bis 7,5, für I bis 8 Tage, geeignet, wenngleich die Kulturbedingungen in Abhängigkeit von der Art der angewandten Kultivierung schwanken können. Die Erzeugung der erfindungsgemäßen neuen /5-Galactosidase erreicht normalerweise in 2 bis 6 Tagen Inkubation ein Maximum.

In einer festen Kultur kann die neue /5-Galactosldase mit etwa 1000 Elnhelten/g des festen Kulturmediums erzeugt werden. In einer Flüssigkultur kann das neue Enzym mit etwa 150 Einheiten/ml des flüssigen Kulturmediums erzeugt werden. Diese hohe Produktivität des neuen Enzyms durch Penlcillium multicolor beträgt etwa das 10- bis 30fache der Produktivität der bekannten ^-Oalactosldasen durch die bekannten, /7-Galactosldase erzeugenden Stämme, die zuvor genannt wurden, ausgenommen Asperglllus oryzae FERM-P 1680.

Um die neue /NGalactosidase gemäß der Erfindung aus dem Kulturmedium des genannten PeniclHium multicolor zu gewinnen und zu isolieren, in dem sich das Enzym durch Kultivieren dieses Mikroorganismus gebildet und angesammelt hat, kann das flüssige oder feste Kulturmedium unter Anwendung bekannter Techniken zur Gewinnung vor. Enzymen bearbeitet werden, und das gewonnene Enzym kann in für die Reinigung von Enzymen bekannten Welse gereinigt werden. Das flüssige Kulturmedium kann von dem festen Material befreit werden, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugleren, und das so erhaltene Gärflltrat wird dann durch Destillieren unter vermindertem Druck oder mit Hilfe einer Dialysemembran konzentriert und anschließend einem Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder einem Fällungsprozeß mit Aceton und/oder Äthanol zur Fällung eines rohen Pulvers der neuen /7-Galactosldase unterzogen. Das feste Kulturmedium kirnn mit Wasser extrahiert werden, und der anfallende wäßrige Extrakt kann In gleicher Weise wie das oben genannte Gärflltrat bearbeitet werden. Zur weiteren Reinigung kann die rohe /i-GalactosIdase einer herkömmlichen Enzymreinigungstechnik unterworfen werden, wie dem Ionenaustausch, der Gelfiltration, der Dialyse, Adsorption und Proteinfällung. Wenn das konzentrierte Gärfiltrat oder der wäßrige Extrakt mit der darin gelösten neuen /5-Galactosldase ml! Aceton zu einer Acetonkonzentratlon von 30 bis 40 Gew.-% zusammengemischt wird, kann praktisch die gesamte /i-Galactosidase zu einem /J-Galactosldasepulver ausgefällt werden, das nach dem Trocknen eine hohe y?-Galactosldasestärke von z. B. etwa 34,8 E/mg zeigt. Das ergibt den Vorteil, daß die Anwendung der billigen und handelsüblichen Acetonfallungsmethode die Gewinnung einer pulverförmlgen /ί-Oalactosldase hoher Stärke möglich macht. Die pulvrige /J-Galactosldase einer Stärke von etwa 34,8 E/mg muß gewöhnlich nicht welter gereinigt werden, solange sie Lactose-unvertragilchen Patienten als Verdauungsmlttel oral verabreicht wird, das entweder zu einem oral verabreichbaren Pulver, zu Granula oder Tabletten im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie Stärke und Zucker, zusammengestellt oder In Milch oder Irgendwelchen von Patienten aufzunehmenden Getränken gelöst werden kann.

Die Stärke der neuen erfindungsgemäßen /J-Galactosldase kann nach herkömmlicher Testmethode wie folgt

fts ermittelt werden:

I ml einer Substratlösung mit 3,7 mg/ml o-Nltrophenyl-ZJ-D-galactopyranosId In Wasser, 2 ml 0,2m Macllvanic-gepufferter Lösung (pH 4,5) und 1 ml der Enzymlösung werden miteinander gemischt, und das Gemisch wird 15 min. auf 37° C erwärmt, um die enzymatlsche Reaktion zu bewirken. Danach wird dnc iipuirnr>nc:_

gemisch mit 4 ml einer wäßrigen, 1 m Natrlumcarbonatlösung zur Beendigung der Reaktion gemischt. Das Reaktionsgemisch wird einer kolorlmetrlschen Analyse bei einer Wellenlänge von 420 nm unterzogen, um den Gehalt an gebildetem o-Nltrophenol zu bestimmen unter Bezugnahme auf eine Standurdkurve von o-Nltrophenol für die kolorlmetrlsche Analyse. Vermag das Enzym ein μ-Mol o-Nltrophenol pro min. /u bilden, besitzt es eine Wirkungsstärke von 1.

Die erflndungsgemäfk neue /J-Galactosldase wird nun hinsichtlich Ihrer enzymatlschen Eigenschaften mit der bekannten /i-Galactosldase von Penlcilllum cltrlurn verglichen, die für die durch andere Penlcllllum-Arten erzeugten bekannten /i-Galactosldasen repräsentativ Ist, beschrieben In der erwähnten veröffentlichten JP-PA »Kokal« I 42 593/76. Die Ergebnisse dieses Vergleichs sind in der folgenden Tabelle kurz zusammengefaßt:

Tabelle I

erfindungsgemäßes
neues Enzym

Relative Aktivität (%)

/7-Galactosidase
von P.citrinum

(1) Substratspezifität

Substrat (Glycoside) Lactose o-Nitrophenyl-/?-D-galactopyranosid p-Nitrophenyl-yJ-D-galactopyranosid

(2) Molekulargewicht

(nach der Gelfiltrationsmethode abgeschätzt)

(3) optimaler pH

(4) aktiver pH (pH-Bereich, in dem das Enzym aktiv ist)

(5) Optimaltemperatur

(6) aktive Temperatur (Temperaturbereich, in dem das Enzym aktiv ist)

(7) pH-Siabiiiiät (pH-Bereich, in dem das Enzym beim Stehen bei 4° C 24 h stabil ist)

(8) Wärmestabilität, /7-Gaiactosidase-Restaktivität nach 15minütigem Stehen bei pH 6 und 60° C 65° C 70° C 75° C

(9) Einfluß von Metallionen

(bei l(H-molarer Konzentration) (Fe⁺-)

(Cu")

(Hg-)

(10) isoelektrischer Punkt (bestimmt durch Elektrophorese)

(11) Löslichkeit in wäßrig-organischen Lösungsmitteln Wasser mit 40 Gew.-% Methanol Wasser mit 50 Gew.-% Methanol

100	100
224	398
186	288
ca. 120 000	ca. 100 000
4,5	4-5
2,5-7	3,5-8
55° C	50° C
<75°C	<60°C

2,5 - 8,0

3,5 - 8,0

100%	50%
60%	0%
25%	0%
0%	0%
praktisch	praktisch
nicht	nicht
gehemmt	gehemmt
praktisch	wesentlich
nicht	gehemmt
gehemmt
etwa 20%	praktisch
gehemmt	nicht
	gehemmt ?

6,41

87%
71%

Fortsetzung

erfindungsgemäßes ' /J-Galactosidase neues Enzym von P.citrinum

Relative Aktivität (%)

0%	82%
0%	64%
0%	91%
0%	72%

Wasser mit 40 Gew.-% Äthanol Wasser mit 50 Gew.-% Äthanol ίο Wasser mit 40 Gew.-% Aceton

Wasser mit 50 Gew.-% Aceton

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele welter veranschaulichl. Beispiel I

Ein festes Kulturmedium mit einem Gemisch aus 10 g Welzenkleie, 10 g entfettetem Sojabohnenmehl und ml Wasser wurde In einen konischen 500 ml-Kolben gebracht und durch 15mlnütlges Erhitzen auf 12O⁰C !" einem Autoklaven sterilisiert, das sterilisierte Kulturmedium wurde dann mit einer Schrägkultur von Penlcil-Hum multicolor ATCC 20 539 beimpft. Das beimpfte Medium wurde In einer sterilen Luft 4 Tage bei 28° C Inkubiert, das inkubierte Medium dann mit 200 ml Wasser vermischt, um /J-Galactosldase In die wäßrige Phase zu extrahieren. Das Gemisch wurde zum Entfernen festen Materials filtriert. Das Flltrat, d. h. der wäßrige Extrakt, zeigte eine /J-Galactosldasestärke von 228 E/ml.

Beispiel 2

Ein flüssiges Kulturmedium (100 ml) mit 3% Relsklele, 1% Baumwollsamenmehl, 0,25% Monokallumphosphat und 0,15% Dikallumphosphat (pH 6,2) wurde In einen 500 ml-Kolben gebracht und dann durch Erhitzen In einem Autoklaven sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium wurde mit einer Schrägkultur von Penlcllllum 3u multicolor ATCC 20 539 beimpft, und das beimpfte Medium wurde 3 Tage bei 28° C schüttelkultlvlert. Indem es auf einen hin- und herschüttelnden Tisch gebracht wurde. Die Inkubierte Kulturbrühe wurde filtriert, und das Brühenflltrat zeigte eine /J-Galactosldasestärke von 140 E/ml.

Beispiel 3

a) Ein festes Kulturmedium aus einem gleichförmigen Gemisch von 1,5 kg entfettetem Sojabohnenmehl, 1,5 kg DäüffiwüMsäiTicnniehi und 3 i Wasser wurde ais Schicht in einem großen Behälter gebracht und dann durch Erhitzen In einem Autoklaven sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium wurde dann mit 150 g einer Impfkultur von Penicllllum multicolor ATCC 20 539 beimpft, die durch Inkubieren der vorerwähnten

Schrägkultur dieses Mikroorganismus In einem Kleiemedium (einem Gemisch aus Welzenkleie und Wasser

bei einem Gewichtsverhältnis von 1 : 1) bei 28° C für 3 Tage hergestellt worden war. Das beimpfte Medium wurde dann ruhend 5 Tage bei 28° C Inkubiert, das Inkubierte Medium (5,4 kg) zerteilt und In eine zyllndrisehe Glassäule gebracht, durch die anschließend Wasser geführt wurde. Indem das Wasser am oberen Säulenende eingeführt wurde. Die Extraktlosung (18 I) mit dem gewünschten Enzym wurde als Ablauf am

Boden der Säule erhalten und zentrifugiert, um sie von einer geringen Menge festem Material zu befreien,

das in der Extraktlösung suspendiert war. Die anfallende überstehende Lösung zeigte /5-Galactosidasestärke von 347 E/ml.

b) Diese überstehende Lösung wurde auf ein Volumen von 41 durch Ultrafiltration konzentriert, und dann wurden der konzentrierten Lösung 2,7 I Aceton bei tiefer Temperatur zugetropft. Die gebildete Fällung wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck zu 165 g eines erfindungsgemäßen /f-GalactosIdasepulvers getrocknet, das eine hohe /i-Galactosldasestärke von 34 COO E/g zeigte. Ausbeute 92%.

c) Das wie oben erhaltene /5-GalactosldasepuIver (mit einer Stärke von 34 800 E/g) wurde folgendermaßen weiter gereinigt: Dieses /9-Galactosidasepulver wurde In 0,01 m gepufferter Acetatlösung bei pH 4,5 gelöst, und die erhaltene Lösung wurde durch eine Säule mit CM-Cellulose geführt, um das Enzym an das Säulen material zu adsorbieren. Die CM-Cellulosesäule wurde dann mit wäßrigen Natriumchloridlösungen stufen weise eiulert. Die aktiven Eluatfraktionen wurden miteinander vereinigt und mit 0,01 m gepufferter Phosphatlösung bei pH 7,0 dlalysiert, und die so dlalysierte Enzymlösung dann durch eine DEAE-Cellulosesäule geführt, um das Enzym zu adsorbieren. Diese DEAE-Cellulosesäule wurde anschließend stufenweise mit wäßrigen Natriumchloridlösungen eiulert. Die aktiven Fraktionen des Eluats wurden miteinander vereinigt M) und dann durch eine Säule mit einem Gelfiltrationsmittel (»Sephadex« G 150) geführt. Der aus dieser

Sephadex-Säule austretende Ablauf wurde fraktionsweise aufgefangen und solche aktiven Fraktionen, die die /i-Galactosidasestärke mit einem konstanten Wert zeigten, wurden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert.

Der so erhaltenen konzentrierten Lösung wurde Äthanol bei tiefer Temperatur zugetropft, um das gewünschte ιό Enzym auszufällen. Das Enzym wurde abfiitriert und unter vermindertem Druck zu einem farblosen und elektrophoretisch reinen Pulver der erfindungsgemäßen /!-Galactosidase getrocknet, die eine /J-Galactosidasestärke von 170 000 E/g zeigte. Ausbeute 50%.

Claims

Patentansprüche:

1. Pulverförmige /Ϊ-Galactosidase, isoliert aus dem Kulturmedium von Peniciilium multicolor ATCC 20 539, mit folgenden Eigenschaften:

a) sie besitzt eine relative /I-Galactosidase-Aktivltät von 224* für o-Nltrophenyl-/!-D-gaIactopyranosid und von 186% für p-Nitrophenyl-jS-D-galactopyranosid unter der Annahme einer relativen 0-Gaiactosidase-Aktivität von 100% für Lactose,

b) sie hat ein Molekulargewicht von etwa 120 000, bestimmt nach der Gelfiltrationsmethode, ίο c) sie ist bei einem pH-Wert von 2,5 bis 7 aktiv, wobei der optimale pH bei 4,5 liegt,

d) die /J-Galaetosldase-Aktivität geht durch ISminütiges Erwärmen auf 75° C bei pH 6 verloren, wobei die Optimaltemperatur 55° C ist,

e) die ß-Galactosldase-Aktlvität ist In einem pH-Bereich von 2,5 bis 8,0 bei 24stündlgem Stehen bei 4° C stabil,

0 die /3-GaIactosidase-Aktivität wird bei 60° C 100%lg stabil gehalten und bei 65° C auf 60%, bei 70° C auf

25% und bei 75° C auf 0% bei 15minütigem Stehen bei pH 6 gesenkt, g) die yS-Galactosidase-Aktivität wird durch die Anwesenheit von QuecksilberUD-Ionen (Hg**) um etwa 20% gehemmt, jedoch durch die Anwesenheit von Eisen(II)-Ionen (Fe⁺+) und KupferUD-Ionen (Cu⁺*) bei

einer Metallionenkonzentration von 1(H Μ nicht wesentlich gehemmt, und h) sie hat einen isoelektrischen Punkt von 5,37, gemessen nach einer Elektrophoresemethode.