JPS5888316A - 傷治癒用組成物、その製法及び利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、傷の治癒を促進するのに有用な組成物、４Ｉ
Ｋそのような組成物の、羊膜例えば人間の羊膜かもの製
造法に関する。

傷の治癒は、良好でない一般的門健秦及びいくつかの局
所的な因子例えば不適当な血液供給及び慢性感染によっ
て悪影響を受ける。傷の直接的な閉鎖が実際に行なわれ
離いならば、周辺Ｏ上皮形成酸いは自己谷部のいずれか
Ｋよ＃）閉鎖するであろう健康な内憂を生成する傷床が
望ましい、傷の治癒を促進するために使用されるクリー
ム、粉末、溶液及び包帯の多血症は、この主題に関する
知識の不完全な状態を示す。

少くとも１１１０年以来肉芽形成組織の生成を促進する
九めに、及び最近火傷及び足Ｏ慢性な潰瘍を含む開放性
の傷に対する生物学的包帯（ｄｒｅａｍｉｍｇ　）とし
て、人間の羊膜が時折り使用サレテきた０例えばＲ，Ｎ
、　Ｍａｔｔｋｅｗａら、Ｅｒ１ｔｉａｈ　　Ｊ、　　
Ｐｌａｓｔｉｃ　　Ｓｕｒｇｅｒｙ、　　３　４　　、
　　　７　　＠〜７１１（１９８１）は、深刻な頭の火
傷の処置に対する人間の羊膜の使用を開示している。

傷の治療を促進することに羊膜を用いることの問題は、
無菌の羊膜の供給が、普通セサリアン（Ｃａ５ｕａｌ−
αｎ）分娩から得られるが故に必要的に制限されるとい
うことにある。貯蔵し九及び乾燥した膜は通常の無菌包
帯よシかなシの抜食を提供することが見出されず、羊膜
は新しいか又は通常の食塩水中で保存した物を適用し九
ときに他の楕拳の包帯と比べて利点を提供するようであ
り九。

Ｈ，Ｂｔ＆デｇｏｍ　　及びＷ、　　Ｐａｇｅ　　Ｆａ
ｓＬｋ、　　Ｂｒ１ｔｉｓｈＪ、０ｂｓｔａｔｒｉｃａ
　　ａｎｄ　Ｇｙｓａａａｏｌｏｇｙ、　　１　ｇ　　
。

２９４〜３０Ｇ（１９８１）は、・治療に用いるために
羊膜銀行を設立することを考直して人間の羊膜を培養物
中に保持する方法を開示している。

モデル系において血管増殖（ｇち脈管形成）を刺激する
能力を有する細胞を含壕嫌い抽出物を得るための試みも
なされてきた０例えばＴｅｌ＆−ｒｔらは米国特許第４
２７＆８７１号において、脈管形成因子の生産に対して
多くの正常な人間細胞の系統を研究したが、多くのその
ような細胞系統が、例えばＡｍｇｒｂａｅｋら、Ｄｏｗ
ｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　４１　。

３９１−１９４（１９７４）及びＦｏｌｋｇＭｓｓ。

Ｃａ５ｅａｒ　Ｒａｍ、　８４　、　　ｆｌ　１０１１
〜１１及び３６゜１１０〜１１４（１１１７６）の絨毛
尿膜評価によって固定される如く貧情な脈管形成活性し
か有さないということを開示している。

しかしながら、人間の包皮線維芽輌胞のｍｍ系統は所望
の脈管形成の因子を適嶋な童で合成する仁とが発見され
た。Ｔ・（＆ｒｔらは、培養し友繕胞を収穫し、次いで
収穫した細胞を機械的に破壊することによってそのよう
な因子を含んでなる細胞を含む抽出物を得る方法を記述
してｈる。

今回、羊膜を＠％媒体中で培養して、生長促進因子を培
養媒体中に遊離させること、ま九これらの因子が傷の治
癒の補助に有用であることが発見され次。上述の、Ｂｕ
ｇｏｓ及びＦａ値ｋＫよる文献け、その方法において廃
吻として得られる用いた羊膜の生長媒体が傷の処置に使
用できるということを決して提案していない、同様に米
国特許第４１！？＆８７１号の実施例は、包皮線繕芽細
胞を培養するために使用される媒体が細胞外の脈管形成
因子の有用な起源でｓｂうるということを全熱暗示して
な−。確かに、培養媒体を捨てると明白に述べている。

従って本発明によれば、羊膜、好ましくは人間の羊膜を
培養した培養媒体を含んでなる又はそれに由来する傷の
処置に用いる丸めの実質的に羊膜を含まない組成物が提
供される。

今回、本発明による羊膜を含★な−組成吻は驚くことに
凍結乾燥に及び凍結乾燥状態での長期間の貯蔵に対して
安定であるととが発見された。この安定性は、そのよう
な組成物が簡便に及び会費となるまで非常に長期間貯蔵
できるという点で、完全な羊膜と比較して誼組成物を％
に有用ならしめる。更に、そのような組成物の製造法は
、米国籍ｅ第４２丁亀８７１号に記述されている如き細
胞破壊を含む方法よりも非常に簡単である。

好ましくは、羊膜は例えば竜すリアン（Ｃａａａａ−ｒ
ｉａ％）分娩から得られる無菌の羊膜の形をしている。

羊膜はｐ　Ｈ７，２〜７．４に緩衝され九適蟲な組織摘
養媒体中で１＠養する仁とができる。適＊ｔａｉ織培養
媒体の例はＨ，Ｊ、　Ｍｏｒｔｏｎ、　Ｉｓ　Ｖｉｔｒ
ａ、・。

１１１−１０８（１１？Ｏ）Ｋ記述されティる４０であ
る。そのような媒体は、公知の必須ア々ノ酸、鉱物塩、
炭素源、例えば炭水化物（例えばダルコース）、及びビ
タンンを種々の組合せで含有する。

羊膜は酸素を含有する、好ましくは更に比較的低濃度で
１．好ましくは６％以下、例えば２５％で二酸化炭素を
含有する雰囲気中で培養される。

膜は１種又はそれ以上の培養媒体中で培養することがで
きる０例えばそれは、最初に第１媒体例えば媒体Ａ（下
記の通り）中で４〜６日間、続いて第２媒体例えば媒体
Ｂ（下記の通υ）中で培養することができる。羊膜から
の汚染物が最初の数日の培養中に培養媒体によって洗い
出されうるから、続く培養媒体の変化を傷の処置に用い
ることが好適である。同様に８種の媒体を用−る場合、
本発明に従って用いるのが好適なものは落雪媒体である
。

完全な羊膜から分離した後、培養媒体を好ましくは遠心
分離に供して遊離の細胞を除去し、次すで好ましくは貯
蔵の簡便さのために凍結乾燥する。

凍結乾燥物は例えばセシウムＩ（ｉ［からのｒＩＩ哩射
Ｋ１って殺菌することができる。使用に必要な場合、乾
燥粉末又は実質的に乾燥粉末形の凍結乾燥物は無菌の蒸
留水の添加によって再組畔化できる。

上述の絨毛膜評価において４１に活性のあゐ調製′物は
、比較的大きい孔径の分子ふるい、例えばＳａｐｈａｇ
ｒｙｌ　３００上での、再組成化される凍結乾燥物のｒ
ル濾過り１２賃トダラフイーによって製造できることが
発見された。

本発明の落雪の観点によれば、羊膜０ｊｌＩ養に由来す
る実質的に羊膜を含まない生長促進因子を含んテする外
、科用包帯（ａｓｒｇｉｅ＠ｌ　ａｒｅａａ４ｍｇ　）
、例えば上述の実質的に羊膜を食まなりｋａｌ成物で鶏
通し良外科用包帯が提供される。そのような包帯には組
成物を液体媒体形で含浸させ、次すで乾燥することがで
きる。他に１例えば組成物は外科用包帯の傷に面する層
に吸収させてもよい、包帯は消毒剤を含んでいてもよい
。

本発明の更なゐ観点によれば、羊膜の培養に由来する羊
膜を含まない生長促進因子を含んでなる軟こう、例えば
水を基剤とするクリームが提供される。軟ζうは、Ｂｒ
１ｔｉｓｈ　Ｐｈａｒｔｔｓｔｘａｏｐａａｉａ。

１１８０．８９１〜丁０２に記述されている如き公知の
組成に基づいていてもよく、例えば乳化軟こう、マクロ
がル軟こう、又はパラフィン軟こうであってよい、それ
は水＃Ｉ赦として、例えばポリ−２−ヒドロキシエチル
アクリレート、ゼラチン又は英国特許第Ｌ！＄　２４８
９９号に記述される重合体に基づく親水性ｒル中へ吸収
させることもできる。

軟こうけ他の活性成分、例えば消毒剤４含有しうる。消
毒剤を軟こうに含有させると、製造し良軟ζうの無菌性
を維持するために必要とされるｒ線照射の照射量を減す
ることができる。

軟ζうは、傷床に直接適用することがで勇、好ましくは
・臂ラフイン包帯のような非接着性の傷の包帯で植株す
べきである。選択した非接着性の包帯が吸収性でないな
らば、これを通常の吸着性物質、例えば・臂ルプ化七ル
ロースで被覆することが望ましい。これは順次通常の閉
鎖性のフィルムで被うことができる。この閉鎖性フィル
ムは接着テープによってしつかシ保持しうる。

軟こう、吸着性層及び閉鎖フィルムで禎侵された非接着
性層を含んでなる包帯は、無菌Ｏエンペｏ　ｆ　（ａｎ
ｖａｌｏｐａ　）　Ｋ予じめｉｉａ填することができる
。

更に本発明によれば、本発明により実質的に羊膜を含ま
ない組成物を傷に適用することを含んでなる、傷の治癒
に対する補助としての傷を処置する方法が提供される０
組成物は例えば単独で或りは適尚な担体中又は上に適用
することができる。

適当な担体の例は包帯及び上述の軟ζうである。

他に傷は、Ｗｅａｔａｂｙら、Ａｎｎａｌｓ　Ｒ，Ｃ，
Ｓ。

８％ｇ、ｓｓ、　　ａｓｓ〜８５８　（１・ａｔ）に記
述されて匹る方法におけるように、水溶形の組成物で連
続的に又は間断的に洗浄してもよい。

また本発明によれば、羊膜を培養媒体中で培養し、媒体
からいずれかの遊離の羊膜細胞を分離し及び／又は媒体
を凍結乾燥することを含んでいる傷を治癒するための組
成物の製造法が提供される。

本発明による組成物及びその製造法を実施例によって説
明する。

実施例 紙娠満期の正常の婦人の選択的表セすリアン部分から人
間の羊膜を無菌で集めた。この膜を、５％の胎生の血清
（ＦＣ８）又は新生牛の血清（ＮＢＣ８）を補充し九バ
ンク塩（Ｈｇｓｋ’ｍ　５ａｌｔ）を含み且っＩＩＥＰ
Ｅでｐ　Ｈ７，４Ｋ緩衝された水冷の最小必須媒体中に
移し、集めてから１−１１時間後に研究室で入手した。

これらを、ｐＨ１，ＢｓＯメルペツコ燐酸塩（Ｄ％ｌｂ
ｇｅｔｔｏ’ａ　ｐｈｏｓｐｈ＠ｔｇ　）で緩衝した食
塩水を４回変えて直ぐに洗浄し、血栓を洗い落し、ま九
絨毛膜ＩＩ１面に残っている脱落膜をガーゼ棒及び肺を
はさむ鉗子で洗い落し良。

やさしく取り扱って、羊膜の付着する絨毛膜からの剥離
を防いだ。羊膜の大きい膜片（ｔｉｏｘｌ　２０ｘ　−
２４０Ｘ　！　４０ｍ）を挟みて切シとり、２４．１Ｘ
２４３Ｘ１ｓ箇の４リステレン皿に絨毛膜を下にして広
け、絨毛１［Ｋ支持された羊膜を培養媒体ｌｉｏ−ｇｏ
ｏ−中に放置し丸、１０％のＦＣ８又はＮＢＣ８を補充
しｆＥ／ｓンタ塩を含み且９４ｍＡｆ炭酸水素ナトリウ
ム及び２０ｒｎＭＨＥＰＩＫｇでｐ　Ｈ７，２〜７．４
に＊衝した組織培養媒体１９９（媒体Ａ）を最初の４〜
６日間使用し、続いてこれを、ｌｏｗＪｌ／炭酸水素ナ
トリウム及び２０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳを含むアール塩（
１：ａｒｌａｉａａｌｔ）（媒体Ｂ）に変えた。抗生物
質（ベニシリアＧ　Ｉ　ＯＯ単位／ｗｔ及びストレプト
マイシン１０Ｇμｆ／−）を添加し、この＠９１１吻を
、へンク及びアール塩を含む媒体に対してそれぞれα５
％及び　　　　２５％のＣＯｌを含む空気中において、
湿度雰囲気（湿度９８％）下に３７ｔｌ’で保温した。

これらＯＣＯ＊　ｆｌｋｌｔｌｄ　媒体ｔ　ｊｌ　Ｈ７
，２〜７．４　Ｋｍ持−ｒるのに適当であった。２４時
間及び次いで１週間に２又ｉｊｓ回媒体を変え友。

除去した媒体Ｂを集め、次いで４Ｃ下に３へ０００ｔで
遠心分離し、遊離の羊膜細胞を除去した。次いて透明な
上澄液を凍結乾燥し、セシウム９０源からのｒｌ／ｇＮ
射で殺菌し次。

凍結乾燥物を、使用の必要となるまで一２０Ｃで貯蔵し
た。必要なとＩＩＫは、これを無菌の蒸留水を添加して
再組成化した。

本発明による湯の処置法及びそのような傷の処置に用い
るための外科用包帯を、添付する図面を参照して記述す
る。

第１図は包帯の平面図であ）、 第２図は第１図の線Ａ−ＡでＯ断面図であり、及び 第３図は別の包帯の断面図である。

図面を参照すると、７９２７４７層ｌが慢性潰瘍に悩む
多くの患者の各々の潰瘍床上に置いた。再組成化された
凍結乾燥物で飽和した外科ガーゼ層３をノ母うフインｌ
上に置き、次いでガーゼ３を、取り噛む組織の小領域と
一緒に、グラスチックのシート易で覆った。端部に多く
の孔１．１を備えた管７をパラフィン１及びガーゼ３間
に導入した。

管７の遊離端１３はグラスチックのシートの端から突き
出させておいた。次いでグラスチックのシートの端を、
プラスチック及び皮膚の間に液体流出防止シールを形成
させるために、接着チーブ１５によって患者の皮膚に固
定した。この方法で、潰瘍をエンペロア’　（ｅｎｖｅ
ｌｏｐｅ　）内に閉じ込め九。

このエンペログには、管７を通してだけ液体が導入でき
九、処置を開始する紡に、再組成化した凍結乾燥物５０
−を、管７に取り付けられる注射器１７によってエンペ
ロブの内部へ導入し、次いで管を挾んで封じ次、最初の
４８時間の関６時間毎に及び次いで３日間の間１２時間
毎に、エンペログの内容物を注射器で取り出し、新しく
再組成化した凍結乾燥物５０ｍを注入した。

対照群の患者は、再組成イヒした凍結乾燥物を、羊膜の
不存在下に培養し九媒体Ｂから製造する以外同一〇方法
で処置し念。

羊膜を用いた媒体で処置した患者の包帯を取シはずし良
とき、血管の新生（又は脈管形成）応答が観察された１
次いで各々のその上うな患者には、成功裏の自己移植が
行なわれた。

逆に、対照群の患者の潰瘍け、成功裏の自己移植を支持
する十分な脈管形成組織に欠けていることがわかった。

傷を治癒する組成物を軟こう形で与えるのに用いるため
の包帯を第３図に示す。上述の再麺成化し九凍結乾燥物
を徐放性マトリックス中に含んでなる軟こう２３で傷床
２１が被覆される。この軟こう２３上には非接着性の包
帯２５が存在し、この非接着性の包帯が順次吸収性のセ
ルロースフクル１２丁の層で覆れている。仁の全包帯は
、接着チーブ３１を用いて患者Ｏ皮膚に接着される被覆
グラスチックフィルム！Ｉ９によって感染物の侵入から
保護されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は包帯の平面図であり、 第２図は第１図の＠Ａ−Ａに沿う断面図であり、及び 第３図は別の包帯の断面図である。 第２図 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｌ　羊膜を培養した培養媒体を含んでなる或いはそれに
   由来する、ＩＩＯ処置に使用するための実質的に羊膜を
   含まない調製剤。 ２　羊膜が人間の羊膜である特許請求の範囲第１項記載
   の調製剤。 亀　咳篭養媒体を、遊離の細胞の除去のために遠心弁−
   に供する特許請求の範囲第１又は２項記載の調製剤。 表　該培養媒体を、凍結乾燥状態で含んでなる特許請求
   の範囲第１〜３項のいずれかに記載の調製剤。 ＆　　ｒａｉ１照射により殺菌した特許請求の範囲第４
   項記載０ｖＩ４製剤。 ＆　活性画分をｒル濾過クロマトグラフィーによる精製
   に供し次特許請求の範囲＠１−１１項のいずれかに６己
   載の調製剤。 ７、ｔ＠養媒体を、該羊膜の培養中、ｐＨｒ、２〜７．
   ４に緩衝させる特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに
   記載の調製剤。 ＆　＠％媒体が該羊膜のＩ＠養中、５重量％以下の濃度
   で二酸化炭素を含有した特許請求の範囲第１〜７項のい
   ずれかに記載の調製剤。 ９、該培養媒体が実質的に２５重量％の濃度で二酸化炭
   素を含有した特許請求の範囲第８項記載の調製剤。 ｌα　羊膜を予じめ予備培養媒体中で４〜６日間培養し
   、該調製剤が続く培養媒体からなる或いはそれに由来す
   る特許請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の調製剤
   。 ＩＬ　　該予備的培養媒体が後述する如き媒体Ａであり
   、該続く培養媒体が後述する如自媒体Ｂである特許請求
   の範囲第１１項記載の調製剤。 １２　％許Ｗｆ４求の範囲第１−１１項記載のいずれか
   の１１１ｍ１！剤を含む外科用包帯。 ｌａ　　液体形の調製剤を含浸させ、次いで乾燥した特
   許請求の範囲第１！項記載の包帯。 １４、包帯の傷に面する層に該調製剤を吸収させ次特許
   請求の範囲第１２項記載の包帯。 ｌａ　殺菌剤も含む特許請求の範囲第１宏〜１４項記載
   のいずれかの包帯。 ｌａ　　％許請求の範囲第１−１１項のいずれかに記載
   の調製剤を含んでなる軟こう。 １７、　　軟こうが乳化軟こう、マクログル軟こう又は
   パラフィン軟こうであり、或いは水溶液として親水性ｒ
   ル中へ吸収された特許請求の範囲第１６項記載の軟こう
   。 １＆　　１種又はそれ以上の他の活性成分も含有する特
   許請求の範囲第１６又は１７項記載の軟こう。 ＩＱ、　　該ｌａＩ又はそれ以上の他の活性成分が殺菌
   剤からなる又はそれを含む特許請求の範囲第１８項記載
   の軟こう。 ３α　羊膜を＠養護体中でｔ＠養し、媒体な羊膜から分
   離し、次いで媒体から遊離の羊１に細胞のいずれをも分
   魅し及び／又は媒体を凍結乾燥する、ことを含んでなる
   傷を治療するための調製剤の製造法。 ２１、実質的に実施例を参照して後述する如き傷を治療
   するための特許請求の範囲第２０項記載の藺製剤の製造
   法。 ２２　実質的に実施例を参照して後述する如き傷の処置
   に用いるための実質的に羊膜を含まない％１ｆｖＩｉｌ
   Ｉ求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載の調製剤。 ！＆　実質的に添付する図面を参照して後述する如き特
   許請求の範囲第１１項記載の外科用包帯。