JPS5820194A - 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法Info
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- JPS5820194A JPS5820194A JP11893081A JP11893081A JPS5820194A JP S5820194 A JPS5820194 A JP S5820194A JP 11893081 A JP11893081 A JP 11893081A JP 11893081 A JP11893081 A JP 11893081A JP S5820194 A JPS5820194 A JP S5820194A
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- glutamic acid
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- galactose
- escherichia
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関
する。
する。
Ｌ−グルタミン酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属のフリネホルム細菌を用イテクルコース、
シュクロース、酢酸等の炭素源より製造されている。し
かしながらこれ゛らの従来用いられている≧リネホルム
細菌は、ガラクトース及びラクトースのいずれも資化す
ることができなく、従って、これらの糖類な含有する乳
ホエイ等の安価な原料を使用してＬ−グルタミン酸を製
造することはできなかった。
クテリウム属のフリネホルム細菌を用イテクルコース、
シュクロース、酢酸等の炭素源より製造されている。し
かしながらこれ゛らの従来用いられている≧リネホルム
細菌は、ガラクトース及びラクトースのいずれも資化す
ることができなく、従って、これらの糖類な含有する乳
ホエイ等の安価な原料を使用してＬ−グルタミン酸を製
造することはできなかった。
叙上のような従来のＬ−グルタミン酸の製造法ｔこ対し
、本発明者らは、エシェリヒア属の微生物よりガラクト
ース又はラクトースを炭素源として高い収率でＬ−グル
タミン酸を製造する能力を有する菌株を分離することに
成功し、本発明を完成するに至った。
、本発明者らは、エシェリヒア属の微生物よりガラクト
ース又はラクトースを炭素源として高い収率でＬ−グル
タミン酸を製造する能力を有する菌株を分離することに
成功し、本発明を完成するに至った。
本発明において使用されるエシェリヒア属のＬ−グルタ
ミン酸生産能を有する微生物としては、具体的ｔこは、 エシェリヒア・コリＡＪ１１４９９（ＦＥＲＭ−Ｐ５３
０１、ＮＲＲＬＢ−１２２８６）、エシェリヒア・コリ
Ａ Ｊ １１５４５ （ＦＥＲＭ−Ｐ５４０７、ＮＲＲ
ＬＢ−１２２（＋９）曹ＡＪ１１４９９及びＡＪ１１５
４５は以下のようにして育種分離されたものである。
ミン酸生産能を有する微生物としては、具体的ｔこは、 エシェリヒア・コリＡＪ１１４９９（ＦＥＲＭ−Ｐ５３
０１、ＮＲＲＬＢ−１２２８６）、エシェリヒア・コリ
Ａ Ｊ １１５４５ （ＦＥＲＭ−Ｐ５４０７、ＮＲＲ
ＬＢ−１２２（＋９）曹ＡＪ１１４９９及びＡＪ１１５
４５は以下のようにして育種分離されたものである。
（１） エシェリヒア・コリＥＧ −１９株（Ｋ −１
２（ＡＴＣＣ１０７９８）より誘導したＡＥＣ耐性株。
２（ＡＴＣＣ１０７９８）より誘導したＡＥＣ耐性株。
）を１ｅのし培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５
％、グル＊ −ス０．１ ％、ＮａＣｌ ０．５％
； ＰＴ（７，２１コ調整）中３７ｃで約３時間振盪培
養を行い、対数増殖期に菌体を集菌後、フェノール法ｔ
こよる通常のＤＮＡ抽出法によって染色体ＤＮＡを抽出
精製し、最終３．４ｍｇを得た。
％、グル＊ −ス０．１ ％、ＮａＣｌ ０．５％
； ＰＴ（７，２１コ調整）中３７ｃで約３時間振盪培
養を行い、対数増殖期に菌体を集菌後、フェノール法ｔ
こよる通常のＤＮＡ抽出法によって染色体ＤＮＡを抽出
精製し、最終３．４ｍｇを得た。
（２） ベクターとしてプラスミドｐＢＲ３２２のＤ
ＮＡを次のようにして調製した。まず、ｐＢＲ３２２を
プラスミドとして保有するエシェリヒア拳コリに一１２
株の１種を１ｇのグルコース・カサミノ酸・無機塩培地
（グルコース２ ｔ１ＮＨ４Ｃ１１ｆ、 ＮａｇＨＰＯ
４６ｆ、ＫＨＩＰｏ。
ＮＡを次のようにして調製した。まず、ｐＢＲ３２２を
プラスミドとして保有するエシェリヒア拳コリに一１２
株の１種を１ｇのグルコース・カサミノ酸・無機塩培地
（グルコース２ ｔ１ＮＨ４Ｃ１１ｆ、 ＮａｇＨＰＯ
４６ｆ、ＫＨＩＰｏ。
３２、ＮａＣ１５９１ＭｇＳＯ４ｅ７ＨｑＯＯ，１ｆ。
ＣａＣＩｇ−２Ｔ（２０ｏ、ｏ １５ ｆ、 カザミノ
酸２゜ｔを１ｅの純水に溶解後ｐＨ７，２に調整し゛た
ものを基本培地として用い、これｔこサイアミン塩酸塩
１００μ２を添加）に接種し、３７ｃで対数後期まで培
養したのち１７０ ｐｆ ／ｙｘｌのクロラムフェニコ
ールを添加し、さらに−夜培養した。
酸２゜ｔを１ｅの純水に溶解後ｐＨ７，２に調整し゛た
ものを基本培地として用い、これｔこサイアミン塩酸塩
１００μ２を添加）に接種し、３７ｃで対数後期まで培
養したのち１７０ ｐｆ ／ｙｘｌのクロラムフェニコ
ールを添加し、さらに−夜培養した。
この操作により、細胞内ｔこプラスミドＤＮＡカ多ｚ
ｔこ生産される。クロラムフェニコール添加後１６時間
目に集菌し、リゾチーム・ＳＤＳ処理によって溶菌させ
、３ｏ、ｏｏｏｘｒ、１時間の超遠心により上清を得た
。これよりプラスミドＤＮＡを濃縮後、セシウムクロラ
イド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心法ｔこよ
って最終４８０μｍのｐＢＲ３２２° プラスミドＤＮ
Ａを分画採取した。
ｔこ生産される。クロラムフェニコール添加後１６時間
目に集菌し、リゾチーム・ＳＤＳ処理によって溶菌させ
、３ｏ、ｏｏｏｘｒ、１時間の超遠心により上清を得た
。これよりプラスミドＤＮＡを濃縮後、セシウムクロラ
イド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心法ｔこよ
って最終４８０μｍのｐＢＲ３２２° プラスミドＤＮ
Ａを分画採取した。
＋３１ （１１テ得た染色体ＤＮＡ １０ ｐｆをと
り、制限エンドヌクレアーゼ、Ｈｌｎｄ ［７を与え３
７ｃで５分、１０分、２０分、３０分又は６０分反応さ
せ、部分的に又は完全ｔこ切断せしめた。
り、制限エンドヌクレアーゼ、Ｈｌｎｄ ［７を与え３
７ｃで５分、１０分、２０分、３０分又は６０分反応さ
せ、部分的に又は完全ｔこ切断せしめた。
６５ｔＺ’、５分の熱処理後、Ｔ（ｉｎｄ［ｌで完全に
切断したｐＢＲ３２２と混合し、ＡＴＰ及びジチオスレ
イトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼに
よってＩＯＣ，２４時間ＤＮＡＭの連結反応を行った。
切断したｐＢＲ３２２と混合し、ＡＴＰ及びジチオスレ
イトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼに
よってＩＯＣ，２４時間ＤＮＡＭの連結反応を行った。
６５Ｃ，５分の熱処理後、反応液ケこ２倍容のエタノー
ルを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱採取した。
ルを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱採取した。
（４） エシェリヒア・コリに一１２株からニトロソ
グアニジン変異処理によって誘導したヒスチジン要求性
株Ｅｌ（Ｒ−１３及びｐ−フルオロフェニルアラニン耐
性株Ｊｆ６２８３−５を、それぞれれを氷冷下０．Ｉ
Ｍ ＭｇＣｌ、、Ｏ−Ｉ Ｍ Ｃ＊ ＣＩｔ各溶液ｔこ
順次懸濁させることによっていわゆるコンピテントな細
胞を調製した。このコンピテント細胞懸濁液に、（３）
で得たＤＮＡの溶解液を加えて水冷下３０分反応させ、
直ちｚ４２Ｃ，２分のヒートショックを与えた後、再び
水冷下に３０・分装置してＤＮＡを細胞内に取り込ませ
た。つぎｔここの細胞懸濁液の一定量を新たなＬ培地に
接種し、３７Ｃ，２時間振盪培養を行って形質転換反応
を完了させた後、集菌洗滌し、再懸濁液を最少培地プレ
ート（グルコース２９１（ＮＨ４）、ＳＯ４１ｆ、に、
Ｔ（ＰＯ４７ｆ、Ｉ Ｋ）Ｉ２ＰＯ４２２、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ，ＯＯ，１？、クエン酸ナトリウＡ０．５Ｆ、及
びＡＥＣ−Ｔ（ＣＩ Ｏ，５ｆを１ｅの純水に溶解し
ｐＨ７，２に調整したものに、寒天２０９を加えて殺菌
した固形培地に、アンピシリンを２０μｆ／ｍｅとなる
よう加えたプレー鮨抹し、３７Ｃで３日間培養した。
グアニジン変異処理によって誘導したヒスチジン要求性
株Ｅｌ（Ｒ−１３及びｐ−フルオロフェニルアラニン耐
性株Ｊｆ６２８３−５を、それぞれれを氷冷下０．Ｉ
Ｍ ＭｇＣｌ、、Ｏ−Ｉ Ｍ Ｃ＊ ＣＩｔ各溶液ｔこ
順次懸濁させることによっていわゆるコンピテントな細
胞を調製した。このコンピテント細胞懸濁液に、（３）
で得たＤＮＡの溶解液を加えて水冷下３０分反応させ、
直ちｚ４２Ｃ，２分のヒートショックを与えた後、再び
水冷下に３０・分装置してＤＮＡを細胞内に取り込ませ
た。つぎｔここの細胞懸濁液の一定量を新たなＬ培地に
接種し、３７Ｃ，２時間振盪培養を行って形質転換反応
を完了させた後、集菌洗滌し、再懸濁液を最少培地プレ
ート（グルコース２９１（ＮＨ４）、ＳＯ４１ｆ、に、
Ｔ（ＰＯ４７ｆ、Ｉ Ｋ）Ｉ２ＰＯ４２２、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ，ＯＯ，１？、クエン酸ナトリウＡ０．５Ｆ、及
びＡＥＣ−Ｔ（ＣＩ Ｏ，５ｆを１ｅの純水に溶解し
ｐＨ７，２に調整したものに、寒天２０９を加えて殺菌
した固形培地に、アンピシリンを２０μｆ／ｍｅとなる
よう加えたプレー鮨抹し、３７Ｃで３日間培養した。
生じたコロニーを釣菌し、その性質を調べたところ何れ
もＡＥＣ耐性、アンピシリン耐性を示した。そこで、こ
れらの菌株を形質転換株とした。
もＡＥＣ耐性、アンピシリン耐性を示した。そこで、こ
れらの菌株を形質転換株とした。
このようにして、ＥＲＲ−１３を受容菌としてＡＪ１１
４９９を、Ａ２８３−５を受容菌と ・してＡＪ１１
５４５をそれぞれ得た。
４９９を、Ａ２８３−５を受容菌と ・してＡＪ１１
５４５をそれぞれ得た。
このようなエシェリヒア属のし一グルタミン酸生産能を
有する微生物を培養する際に使用される培地は、ラクト
ース又はガラクトースを炭素源として含有する以外は、
特にかわったものではない。ラクトース及びガラクトー
スとして、これらを含有する乳ホエイ、大豆ホエイ等を
使用してもよい。これらの炭素源のほかに、副炭素源と
してグルコース、シュクロース等が培地に含まれている
こともある。炭素源のほかにはアンモニウムイオン、ア
ンモニアガス、アンモニア水等の通常の窒素源、リン酸
イオン、マグネシウムイオン、カリイオン等の無機イオ
ン、更１こ必要會こよりビタミン、アミノ酸等の有機微
量栄養素が培地中に含まれる。
有する微生物を培養する際に使用される培地は、ラクト
ース又はガラクトースを炭素源として含有する以外は、
特にかわったものではない。ラクトース及びガラクトー
スとして、これらを含有する乳ホエイ、大豆ホエイ等を
使用してもよい。これらの炭素源のほかに、副炭素源と
してグルコース、シュクロース等が培地に含まれている
こともある。炭素源のほかにはアンモニウムイオン、ア
ンモニアガス、アンモニア水等の通常の窒素源、リン酸
イオン、マグネシウムイオン、カリイオン等の無機イオ
ン、更１こ必要會こよりビタミン、アミノ酸等の有機微
量栄養素が培地中に含まれる。
培養は好気的条件下で行われる。培養の間、培養温度は
２７ないし３７ｒの範囲内の適当な温度會こ、培地のｐ
Ｈは、５．５から７．５の範囲の適当なｐｉ（に、それ
ぞれ保つのが望ましい。かくして、１ないし４日間も培
養を続ければ培地中に著量のＬ−グルタミン酸が生成蓄
積される。
２７ないし３７ｒの範囲内の適当な温度會こ、培地のｐ
Ｈは、５．５から７．５の範囲の適当なｐｉ（に、それ
ぞれ保つのが望ましい。かくして、１ないし４日間も培
養を続ければ培地中に著量のＬ−グルタミン酸が生成蓄
積される。
培地中ｔこ蓄積されたＬ−グルタミン酸を採取する會こ
は、通常の方法で行うことができる。
は、通常の方法で行うことができる。
実施例１
ガラクトース３．６ｔｔ／ｄｌ、（ＮＨ，）、Ｓｏ、
２．５１／１１７！、ＫＨ，ＰＯ４０，２ｙ ／ｄｔ
、ＭｇＳＯ４・７Ｈ，ＯＯ，１ｔ／ｄｉ、酵母エキスｏ
、ｏ ｓ ｔ ／ｄｌ、 Ｌ−チロシン１０．０ ｍｇ
／ ｄ１１チアミン塩酸塩１００μｔ ／ ｄｔ ５
ＦｅＳＯ，−７１（，０１ｖｒ９／ｄｉ及びＭｎ８０４
畳４Ｈ２０１１ｔｇ／ｄｌを含み、ｐＨ７，ｏｒ−調節
した培地を５００耐フラスコに２Ｏｙｇｌずつ入れ殺菌
した。これに第１表に示す菌株を１白金耳植えつけ、３
１Ｃで４８時間培養した。なお、培養途中、４５９７ｄ
ｉの尿素水を０．３ｄずつ添加し、ｐＨの低下を防止し
た。培養終了時ｔこおけるし一グルタミン酸の蓄積量は
第１表に示すとおりであった。
２．５１／１１７！、ＫＨ，ＰＯ４０，２ｙ ／ｄｔ
、ＭｇＳＯ４・７Ｈ，ＯＯ，１ｔ／ｄｉ、酵母エキスｏ
、ｏ ｓ ｔ ／ｄｌ、 Ｌ−チロシン１０．０ ｍｇ
／ ｄ１１チアミン塩酸塩１００μｔ ／ ｄｔ ５
ＦｅＳＯ，−７１（，０１ｖｒ９／ｄｉ及びＭｎ８０４
畳４Ｈ２０１１ｔｇ／ｄｌを含み、ｐＨ７，ｏｒ−調節
した培地を５００耐フラスコに２Ｏｙｇｌずつ入れ殺菌
した。これに第１表に示す菌株を１白金耳植えつけ、３
１Ｃで４８時間培養した。なお、培養途中、４５９７ｄ
ｉの尿素水を０．３ｄずつ添加し、ｐＨの低下を防止し
た。培養終了時ｔこおけるし一グルタミン酸の蓄積量は
第１表に示すとおりであった。
第 １ 表
ｌ６２８３−５ ８２８
ＡＪ１１５４５ １１０９
ＥＧ−１９７２０ ＡＪ１１４９９ １０５０
実施例２ 乳糖５９７ｄｌ、（ＮＨ４）ｓ ５ｏ４２．５ ｔ ／
ｃｔｔ、Ｋ）Ｌ、 ＰＯ４０，２ｆ ／ｄｉ、ＭｇＳ
Ｏ４−７）１，０ ０．１ｔ／ｄｉ。
ＥＧ−１９７２０ ＡＪ１１４９９ １０５０
実施例２ 乳糖５９７ｄｌ、（ＮＨ４）ｓ ５ｏ４２．５ ｔ ／
ｃｔｔ、Ｋ）Ｌ、 ＰＯ４０，２ｆ ／ｄｉ、ＭｇＳ
Ｏ４−７）１，０ ０．１ｔ／ｄｉ。
酵母エキスｏ、ｏ ｓ ｙ ／ｄｌ、 Ｌ−チロシン１
０．０８９ ／ ｄｌ 、チアミン塩酸塩１００μｆ／
ｄｔ。
０．０８９ ／ ｄｌ 、チアミン塩酸塩１００μｆ／
ｄｔ。
ＦｅＳＯ４−７Ｈ，Ｏｌｖｒｇ／ｄｌ、Ｍｎ ＳＯ４・
４Ｈ１０１１ｇ／ ｄｉ、及び炭酸カルシウム２．５
ｔ ／ｌｒｉ （別殺菌添加）を含み、ｐ）（７，０に
調節した培地を５００１１／フラスコ１こ２０耐ずつ入
れ殺菌した。これに第２表に示す菌株を１白金耳植えつ
け、３１Ｃで７２時間培養した。培養終了時におけるし
一グルタミン酸の蓄積量は、第２表Ｖこ示す通りであっ
た。
４Ｈ１０１１ｇ／ ｄｉ、及び炭酸カルシウム２．５
ｔ ／ｌｒｉ （別殺菌添加）を含み、ｐ）（７，０に
調節した培地を５００１１／フラスコ１こ２０耐ずつ入
れ殺菌した。これに第２表に示す菌株を１白金耳植えつ
け、３１Ｃで７２時間培養した。培養終了時におけるし
一グルタミン酸の蓄積量は、第２表Ｖこ示す通りであっ
た。
第 ２ 表
扁２８３−５ １０５０
ＡＪ１１５４５ １３２５
ＥＣ−１９９７６
実施例３
下記の酸沈・乳ホエイな乳糖として５？／ｄｅｓ（Ｎｌ
（４）、Ｓｏ、 ２．５ ｆ／ｄｌ、 ＫＨ，ＰＯ４
０，２ｆ／ｄｌ。
（４）、Ｓｏ、 ２．５ ｆ／ｄｌ、 ＫＨ，ＰＯ４
０，２ｆ／ｄｌ。
Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ，ＯＯ，１ｆ／ｄｌ、酵母エキス０．
０５ｔ ／ｄｅ、、 Ｌ−チｑ シｖ １ｏ、ｏ ｍｇ
／（Ｈ１チア ＝ ７塩酸塩１ｏ ｏ ’ｐ ｔ ／ｄ
ｅ、 Ｆｅ１ｏｎ −７Ｔ（、ｏ １１１１７／ｄ／
！ｘＭｎ ８０４−４Ｈｔ Ｏ１ｇ１７ ／ ｄｌ及び
炭酸カルシウム２．５ｔ／ｄｌ（別殺、添加）を含み、
ＫＯ）ＩでｐＨ７，２Ｔ１ｍ調節した培地を調製し５０
０ｙｄフラスコ１こ２０ｗ５ｅずつ入れ、殺菌した。こ
れＶこ第３表に示す菌株を１白金耳植えつけ、３１Ｃで
７２時間培養した。
０５ｔ ／ｄｅ、、 Ｌ−チｑ シｖ １ｏ、ｏ ｍｇ
／（Ｈ１チア ＝ ７塩酸塩１ｏ ｏ ’ｐ ｔ ／ｄ
ｅ、 Ｆｅ１ｏｎ −７Ｔ（、ｏ １１１１７／ｄ／
！ｘＭｎ ８０４−４Ｈｔ Ｏ１ｇ１７ ／ ｄｌ及び
炭酸カルシウム２．５ｔ／ｄｌ（別殺、添加）を含み、
ＫＯ）ＩでｐＨ７，２Ｔ１ｍ調節した培地を調製し５０
０ｙｄフラスコ１こ２０ｗ５ｅずつ入れ、殺菌した。こ
れＶこ第３表に示す菌株を１白金耳植えつけ、３１Ｃで
７２時間培養した。
培養終了時におけるＬ−グルタミン酸の蓄ｍｔは、第３
表ｔこ示す通りであった。
表ｔこ示す通りであった。
酸沈・乳ホエイの成分は、水分９３．９％、乳糖４．５
チ、全固形分６．１係、窒素化合物０．８０チ、 −
灰分０．７０チ、脂肪０．１チであった。
チ、全固形分６．１係、窒素化合物０．８０チ、 −
灰分０．７０チ、脂肪０．１チであった。
第 ３ 表
Ａ２８３−５ ８７５ＡＪ
１１５４５ １０５５ＥＣ，−
１９８３０ ＡＪ１１４９９ １１ ９０
特許出願人 味の素株式会社
１１５４５ １０５５ＥＣ，−
１９８３０ ＡＪ１１４９９ １１ ９０
特許出願人 味の素株式会社
Claims (1)
- エシェリヒア属のし一グルタミン酸生産能を有する微生
物を、ラクトース又はガラクトースを炭素源として含有
する液体培地中に培養し、培地中に生成蓄積されたし一
グルタミン酸を採取することを特徴とする発酵法による
Ｌ−グルタミン酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11893081A JPS5820194A (ja) | 1981-07-29 | 1981-07-29 | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11893081A JPS5820194A (ja) | 1981-07-29 | 1981-07-29 | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5820194A true JPS5820194A (ja) | 1983-02-05 |
Family
ID=14748724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11893081A Pending JPS5820194A (ja) | 1981-07-29 | 1981-07-29 | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5820194A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5573945A (en) * | 1994-01-10 | 1996-11-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Mutant and method for producing L-glutamic acid by fermentation |
-
1981
- 1981-07-29 JP JP11893081A patent/JPS5820194A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5573945A (en) * | 1994-01-10 | 1996-11-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Mutant and method for producing L-glutamic acid by fermentation |
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