【発明の詳細な説明】
Bacillus thuringiensisの新規菌株およびそれらを含む有害生物駆除組成物
本発明は、Bacillus thuringiensis（バチルス チューリンゲンシス）の新規
な菌株、それらを用いる有害生物駆除組成物、並びに目的のタンパク質を発現す
るためのこれらの菌株の使用に関する。
Bacillus thuringiensis（Ｂｔ）は、特に多数の昆虫の幼虫に対して殺虫特性
を有するタンパク質を産生するグラム陽性菌である。これらの細菌は、場合によ
っては不活性化の後に、穀物または疾患のベクターに有害な昆虫、特に蚊に作用
することを意図した有害生物駆除組成物に用いられる。
現在では、Ｂｔ血清型３ａ ３ｂが特に穀物の有害生物に対して用いられ、血
清型Ｈ１４は蚊の幼虫を殺すのに用いられている。
Bacillus thuringiensisによって産生される有害生物駆除活性を有するタンパ
ク質はδ−内毒素と呼ばれ、胞子形成の際に多量に産生される。それらはパラ胞
子結晶性封入体の形態で蓄積し、胞子形成細胞の乾燥重量の２５％まで存在する
ことができる。
δ−内毒素の多数の遺伝子はクローニングされ、配列決定され、配列相同性お
よび毒性スペクトルに基づいて５つの群に分類されている。相当する遺伝子は、
ｃｒｙ遺伝子と呼ばれる。
Bacillus thuringiensisに基づいた処方物は、様々な商品名で３０年近く生物
学的有害生物駆除剤(biopesticides)として用いられてきた。生物学的抑制剤と
してのBacillus thuringiensisの使用は、化学的有害生物駆除剤に関して多数の
利点を有し、実際に、これは宿主スペクトルが狭くかつ極めて特異的であり、標
的でない昆虫に対しては作用せず、またこれは脊椎動物または環境に望ましくな
い作用を持たない。
しかしながら、環境でのδ−内毒素の持続性が僅かであり、処方物中に胞子が
存在することは、Bacillus thuringiensisを基剤とする生成物を発売する上での
２つの不都合な点である。これらの２つの問題を解決するために、特許出願ＥＰ
−１９２，３１９号明細書では、特にＣｒｙ１Ａｃ毒素を発現するPseudomonas fluorescens
型細胞を用いてあるいは特許出願ＰＣＴ ＷＯ９４／２５６１２号
明細書には、ｓｐｏ０Ａ遺伝子における冒された胞子形成しない突然変異体でＣ
ｒｙ１IIＡ毒素を発現することによる細胞膜に毒素をカプセル封入することが提
案されてきた。この後者の方法は、ｃｒｙIII Ａ遺伝子の発現の様式が他のｃｒ
ｙ遺伝子の発現の様式とは異なっているために可能であり、実際にこのｃｒｙII
I Ａ遺伝子は、胞子形成の開始に関与しているすべての遺伝子または胞子形成に
関与している因子とは独立している。
Bacillus thuringiensisにおいて、胞子形成はそれぞれシグマ［σ］３５およ
びシグマ［σ］２８と呼ばれる２種類のシグマ因子の発現によって変化し、Baci llus subtilis
におけるシグマ（σ）Ｅおよびシグマ（σ）Ｋ因子との相同性が
大きいことを考慮して、以下において用いられるこの後者の名称は相当する遺伝
子と同様にｓｉｇＥおよびｓｉｇＫと呼ぶ。
本発明は、σＥを発現するが、胞子形成はしないか、または胞子形成をほとん
どしないか、または成育可能な胞子を生成しないBacillus thuringiensisの菌株
に関する。
本発明は、ｓｉｇＥを発現するが、ｓｉｇＫは発現しないBacillus thuringie nsis
の突然変異体が、相当する野生の菌株と実質的に同一の毒素を多量に産生す
るが、一方胞子形成はしないかまたは成育可能な胞子を生成しないという事実の
実証に基づいている。
これは、詳細には菌株がｓｉｇＫ-株である場合である。
このような菌株の構築は、1)生物学的有害生物駆除剤で処理する際の胞子の環
境への散布が回避され、2)それらをカプセル封入するため環境での毒素の持続性
が増加するという２つの利点を有する。
試験は、シグマＫ遺伝子ｓｉｇＫ-）を発現しないＢｔ株は、供給源菌株と同
等な毒素を多量に蓄積することができるが、胞子は生成しない。これは、ｃｒｙ
遺伝子、または発現がσＥタンパク質の産生によって変化する関連遺伝子によっ
てコードされる毒素をほぼ全量産生することができた。
ＢｔのｓｉｇＫ-突然変異体を得るには、任意のＤＮＡ配列を導入することに
よる挿入、または欠失、またはｓｉｇＫ遺伝子の相の変化による中断法を用いる
のが特に有利であり、更に、このＤＮＡ配列を突然変異体に選択特性を付与する
ように選択することができ、例えば、これは中断を施した菌株が選択される抗生
物質、特にカナマイシンに対する耐性であることができる。
ｓｉｇＫ-突然変異体も同様に、調節領域を有するまたは持たないｓｉｇＫ遺
伝子のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列の総てまたは一部を欠失す
ることによって得ることができる。
遺伝子の中断の技術は知られており、それらは本質的にはｓｉｇＫ遺伝子を運
ぶＤＮＡ配列の水準で任意のＤＮＡ配列を導入することにあり、菌株に導入され
る全体が相同組換えを生成し、ｓｉｇＫ遺伝子は中断されたｓｉｇＫ遺伝子によ
って置換されている。選択特性により、この時点で目的の突然変異体を選択する
ことができる。
形質転換をしようとする菌株として極めて変化したまたは極めて顕著な毒素産
生を有するBacillus thuringiensisの菌株を選択するのが特に有利であるのはも
ちろんである。実際に、上記したように、ｓｉｇＫ遺伝子の中断の事実は、胞子
形成を遮断するだけであり、毒素の産生は遮断しない。
Ｂｔは、Bacillus thuringiensisの任意の菌株を意味するものとして理解され
る。
従って、中断を施そうとする菌株では、工業用菌株を用いることができる。例
えば、Dulmage H.T.（1970）によって記載されたBt subsp ．kurstaki HD-1、ま
たはBt israelensis、またはBt aizawai 7-29（この菌株は、第Ｔ０７０２９号
でＩＥＢＣから入手可能である）のような野生菌株である。
本発明は、更に詳細には、それぞれ１９９５年１０月２６日に第Ｉ−１６３４
号でおよび１９９６年１０月２２日に第Ｉ−１７７６号でザ・ナショナル・コレ
クション・オブ・マイクロオーガニズム・カルチャーズ・オブ・ザ・インスティ
テュート・パスツール（the National Collection of Microorganism Cultures
of the Institut Pasteur ）に寄託された菌株 Bacillus thuringiensis 407 Si
gK-(pHT410)並びに組換え体菌株Bacillus thuringiensis Kto SigK-（pHTF3-IC/
A）(b)-IRS-T-Δ)に関する。
毒素の産生を増加させるために、本発明によるｓｉｇＫ-菌株に自己複製プラ
スミド系を導入して、同様に専門家に知られている構築物によって上記毒素を確
実に発現させることも可能である。
この菌株によって発現されるタンパク質は、求められる有害生物駆除活性の種
類に依存し、Ｃｒｙ１は類に対して毒性を有し、Ｃｒｙ１Ｉは鱗翅類及び双翅類
に対して毒性を有し、Ｃｒｙ１Ｖは双翅類に対して毒性を有する。
概していえば、ｃｒｙＩＣ、ｃｒｙＩＡ、ｃｒｙIVＡ、Ｂ、Ｄのような天然で
所定数の毒素を発現する野生菌株のｓｉｇＫ-を生成することが可能である。ま
た、本発明により記載された突然変異体菌株であって、ｓｉｇＫ-でありかつ染
色体またはプラスミドに組み込んだ後Ｂｔゲノムに関して同種または異種タンパ
ク質をコードする遺伝子を発現する菌株を用いることも可能である。
利用可能な技術の実例は、Biotechnology，1992，vol．10，p．418（Lereclus
et al）に記載されている。
遺伝子、例えばｃｙｒＩＣ遺伝子を、同種組換えによってＢｔ ｓｉｇＫ-に
導入することができる。組換え体は、ｃｒｙＩＣ遺伝子を得るが、任意の異種Ｄ
ＮＡを保持しない。
このようにして、数種類の毒素遺伝子を相同組換えによって細菌染色体に加え
ることができ、または常在性プラスミドに組み込むことができる。
例えば、Bt kurstaki の菌株であって、それ自身のプロモーターの制御下でｃ
ｒｙＩＡｃ遺伝子およびｃｒｙIII Ａ遺伝子のプロモーターの制御下でｃｒｙＩ
Ｃ遺伝子を同時に発現するものである。
これらの構造体で利用可能なｃｒｙ遺伝子の中には、ｃｒｙＩ、ｃｒｙII、ｃ
ｒｙIVおよびｃｙｔを挙げることができる。
発現される遺伝子の導入のもう一つの方法は、ｐＨＴ３０４およびｐＨＴ３１
５プラスミドに関する特許出願ＰＣＴ ＷＯ９３／０２１９９号明細書などに記
載のＢｔの機能的複製源を有するグラム陽性菌プラスミドを使用することからな
っている。
本発明の方法によって得られるｓｉｇＫ-菌株は、場合によっては不活性化し
た後に、有害生物駆除組成物、特に幼虫、詳細には昆虫の幼虫を殺す目的で用い
られる殺虫組成物に利用することができる。この有害生物駆除組成物は、自体知
られている手法によって調製され、すなわちこれが必要な場合には、関連のBaci
llus毒素の活性を最適にする不活性または非不活性担体との混合物として調製さ
れる。
ある国では、胞子形成菌株の利用に本質的な菌株の不活性化は、本発明に関し
て構築されるｓｉｇＫ-突然変異体の場合には任意である。この不活性化は、任
意の物理的または化学的方法によって、特に照射によって行うことができ、これ
によって菌株を成育不可能とする。本発明による菌株は成育可能な胞子を持たず
、それらの不活性化は、胞子形成した菌株の場合より容易である。
上記のように、毒素は細菌の内部に保持されているので、環境での毒素の有効
期間を増加することができる（毒素は幼虫が細菌を消化する際にだけ放出される
）。しかしながら、本発明によるある種の突然変異体は極めて例外的な耐性を有
し、この場合には、選択された特異的な菌株を用いて処理を行う昆虫で良好に消
化されるようにし、または例えば界面活性剤のような化学的処理、物理的処理、
超音波処理、または生物学的処理、特定の要素を（遺伝子組換え技術などにより
）微生物の壁に導入して、微生物が摂取されたときに毒素を一層良好に消化され
または一層容易に接近し得るようにする必要があることを示すことが可能となっ
た。
このＢｔの新規な菌株は、有害生物駆除組成物に要素の一つを供給することが
できるが、Ｂｔのゲノムに関して同種または異種遺伝子を発現するベクターとし
ても有用であり、上記遺伝子は、自己複製プラスミドによってまたは細菌のゲノ
ムに関する相同組換えによってＢｔのｓｉｇＫ-突然変異体でクローニングされ
る。
例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、または任意の他の種類のタンパク質を発現
することができるベクター系の構築は、特許出願ＰＣＴ ＷＯ９４／２５６１２
号明細書に記載されているものと同様であることができる。
本発明は、ＳｉｇＥ遺伝子を含み、任意の活性なＳｉｇＫ遺伝子を含まず、目
的の遺伝子をコードする配列を含むヌクレオチド配列にも関する。
本発明の他の特徴および利点は、下記の実施例を読めば明らかになるであろう
。
第１図は、Bacillus thuringiensisのｓｉｇＥおよびｓｉｇＫ染色体遺伝子の
中断を表す。ｐＡＢ１およびｐＡＢ２プラスミドが相同組換えによってＢｔ染色
体に組み込まれ、相同組換えの第二の場合には、総てのｐＲＮ５１０１配列が失
われる。矢印はそれぞれアンピシリン、エリスロマイシンおよびカナマイシンに
対する耐性を付与する遺伝子に相当するＡｐR、ＥｍR、およびＫｍR遺伝子の転
写方向を示し、三角形はそれぞれｐＢＲ３２２（ｏｒｉＥｃ）の複製源およびｐ
Ｅ１９４ｔｓ（ｏｒｉｔｓ）の複製源を表す。
第２図は、Bacillus thuringiensis における転写の分析のためのプラスミド
の構築を表す。ｐＨＴ３０４−１８Ｚは以前に報告されている(Agaisse and Ler
eclus 1994b)。矢印はｅｒｍＣ、ｂｌａおよびｌａｃＺの転写方向、およびE．c
oli（ｏｒｉＥｃ）における機能的複製方向を示し、ｏｒｉ１０３０はＢｔ ｐ
ＨＴ１０３０プラスミドの複製源であり(Lereclus and Arantes 1992)、破線矢
印は上記のようにプロモーターｐｓｉｇＥ、ｐｓｉｇＫ、Ｂｔ ＩおよびＢｔ
IIから開始した転写方向を示す(Rong et al.，1986; Sandman et al.，1988; Wo
ng et al.，1983)。ｓｐｏIIＤ、ｃｏｔＡおよびｃｒｙＩＡａ遺伝子のプロモー
ター領域を有するＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片は、ｐＨＴ３０４−１８Ｚにお
いてクローニングされている。
第３図は、ｓｐｏIIＤおよびｃｏｔＡ遺伝子のプロモーターの制御下でのＢｔ
におけるβ−ガラクトシダーゼの発現を表す。細胞は３０℃でＳＰ培地で成育さ
せ、時間０は対数増殖期の終了を示し、ｔnは時間０の前または後の時間数であ
る。ＡはｐＨＴｓｐｏIIＤを有するＢｔ株のβ−ガラクトシダーゼ活性であり、
ＢはｐＨＴｃｏｔＡを有するＢｔ株のβ−ガラクトシダーゼ活性である。β−ガ
ラクトシダーゼの特異活性はＳｐｏ+４０７（■）、４０７ＳｉｇＥ（●）、お
よび４０７ｓｉｇＫ-（○）で示される時間に測定した。
第４図は、３０℃のＳＰ培地で成育したｐＨＴｃｒｙＩＡ２を有するＢｔの菌
株におけるｃｒｙＩＡａの制御下で指示されたβ−ガラクトシダーゼの発現を表
す。β−ガラクトシダーゼ活性は、Ｓｐｏ+４０７（■）、４０７ＳｉｇＥ（●
）、および４０７ｓｉｇＫ-（○）で示される時間に測定し、
第５図は、ｐＨＴＦ３−１Ｃ／Ａ（ｂ）−ＩＲＳ−Ｔプラスミドを表す。この
プラスミドはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐIIＫＳ-から誘導され（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐIIＫＳ-のＤＮＡは「ｂｌａ＋ｏｒｉＥｃ」ボックスによって表され）、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐIIＫＳ-、およびBacillus cereus 由来のテトラサイクリン耐
性を付与するｔｅｔ遺伝子の直ぐ両側に位置したＴｎ４４３０トランスポゾン(L
ereclus et al.，1986)の内部分割部位(internal resolution site)（ＩＲＳ）
を含む２個の配列を有し、これは、更にｃｒｙIII Ａのｐ３プロモーターの制御
下でｃｒｙＩＣ／Ａ（ｂ）キメラ遺伝子のコード部分(Agaisse and Lereclus，1
994)、およびB ．thuringiensisのｐＨＴ１０３０プラスミドの複製源(Lereclus
and Arantes，1992)を含んでいる。
第６図は、Ｋｔｏ ＳｉｇＫ-菌株に含まれるＴｎ４４３０トランスポゾンの
ＴｎｐＩインテグラーゼによって触媒される２個のＩＲＳ部位の間の組換え反応
を表す。部位特異的組換えから生じるプラスミドはｐＨＴＦ３−ＩＣ／Ａ（ｂ）
−ＩＲＳ−Ｔ−Δと呼ばれる。実施例１ 材料および方法 細菌株および培地
Ｂｔ４０７（血清型Ｈ１）およびそのアクリスタリフェラス誘導体(acrystall
iferous derivative)（Ｃｒｙ-）は、上記のようにO．Arantesによって単離され
た(Lereclus et al.，1989)。E．coli K-12株ＴＧ１（Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ
）ｓｕｐＥ ｔｈｉ ｈｕｄ Ｄ５（Ｆ′ｔｒａＤ３６ ｐｒｏ+ｐｒｏＢ+ｌａ
ｃｌｑ ｌａｃＺ ΔＭ１５））を、クローニング実験に用いる( Gibson，1984
)。Ｂｔ株を３０℃でルリア培地（ＬＢ）、およびＨＣＴ培地( Lecadet et al.
，1980)、または胞子形成栄養培地（ＳＰ培地）(Lereclus et al.，1995)で培養
する。E．coli 株は、ＬＢ培地で３７℃で培養する。細菌選択のための抗生物質
濃度は下記の通りである：アンピシリン、１００μｇ／ｍｌ（E．coli に対する
）；エリスロマイシン、５μｇ／ｍｌ（Ｂｔに対する）；カナマイシン、E．col
i に対して１０μｇ／ｍｌおよびＢｔに対して２００μｇ／ｍｌ。プラスミドおよびＤＮＡ断片
S．Grussによって供給されたｐＲＮ５１０１プラスミドは、グラム陽性生物の
熱感受性複製源プラスミドであり、これはｐＢＲ３２２のＣｌａＩ部位にｐＥ１
９４ｔｓ(Villafane et al.，1987)の挿入によって構築された。Ｂｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔプラスミドはStratageneから入手し、ｐＨＴ３０４−１８ＺおよびｐＨＴ
４１０プラスミド構築物は既に報告されている(Agaisse and Lereclus 1994b; L
ereclus et al.，1989)。Ｃｒｙ１Ａａ遺伝子のプロモーター領域を含む３６２
ｂｐ断片の増幅に用いられるオリゴヌクレオチド（Ｃｒｙ１Ａ−１およびＣｒｙ
ＩＡ−２）を、第１表に示す。Ｃｒｙ１Ａ−１プライマーはＨｉｎｄIII 制限部
位を含む５′末端に７ｂｐの伸長部を有し、Ｃｒｙ１Ａ−２プライマーはＢａｍ
ＨＩ制限部位を有する８ｂｐの伸長部を有する。この２つの制限部位を導入して
、ｐＨＴ３０４−１８Ｚにおけるクローニングを促進する。Ｂｔ ｓｉｇＥおよ
びｓｉｇＫ遺伝子を中断するため、相当する遺伝子の５′および３′領域を５′
末端に適当な制限部位を有するオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって増幅
し、ｐＢＳ ＫＳ-において別個にサブクローニングする。ｓｉｇＥおよびｓｉ
ｇＫ
遺伝子の５′領域は、それぞれＢａｍＨＩ−ＸｂａＩの８５７および６１１ｂｐ
の制限断片である。３′領域は、それぞれ８０７および６０６ｂｐのＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ制限断片である。これらの遺伝子のそれぞれの５′および３′領域
を含むＤＮＡ断片を精製して、ｐＲＮ５１０１プラスミドのＢａｍＨＩ制限部位
におけるEnterococcus faecalis のａｐｈＡ３遺伝子（ＫｍRカセット）(Trieu-
Cuot and Courvalin，1983)を有する１．５ｋｂのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片に
結合する。生成する熱感受性プラスミドｐＡＢ１およびｐＡＢ２は、それぞれｓ
ｉｇＥおよびｓｉｇＫ遺伝子においてカナマイシン耐性遺伝子によって中断され
たコピーを有する。
B ．subtilis のｓｐｏIIＤおよびｃｏｔＡ遺伝子のプロモーター領域をそれぞ
れ有するプラスミドｐＤＧ６７５およびｐＤＧ６７６は、Dr．P．Stragier（Ins
titut de Biologie Physico-Chimique,パリ，フランス）から提供された。ｐＨ
ＴｓｐｏIIＤは、ｐＨＴ３０４−１８ＺのＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩ制限部
位の間のｐＤＧ６７５の３００ｂｐのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ制限断片をサブ
クローニングすることによって構築した。ｐＨＴｃｏｔＡは、下記のようにして
構築した。すなわち、ｐＤＧ６７６のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片の４００ｂｐ
を最初にｐＢＳ ＫＳ-においてサブクローニングして、ｐＫＳｃｏｔＡを得る
。次いで、ｐＫＳｃｏｔＡのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ制限断片を、ｐＨＴ３０
４−１８ＺのＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩ制限部位の間でサブクローニングし、生
成するプラスミドをｐＨＴｃｏｔＡという名称で呼ぶ。構築および形質転換
プラスミドＤＮＡを、標準的なアルカリリーシス法によってE．coli から抽出
する。染色体ＤＮＡを、以前に報告されている方法でＢｔから抽出する(Msadek
et al.，1990)。制限酵素およびＴ４リガーゼは、New England Biolabs 、ビバ
リー、マサチューセッツから入手する。ＤＮＡ断片を、Prep-A-Gene キット(Bio
Rad Laboratories，リッチモンド，カリフォルニア)を用いてアガロースゲル上
で精製する。オリゴヌクレオチドプライマーは、Genset（パリ、フランス）によ
って合成され、ＰＣＲ増幅はGeneAmp PCR 2400装置（Perkin-Elmer，フォスター
シティー，カリフォルニア）を用いて行う。ＰＣＲ増幅に用いたＤＮＡマトリッ
クスは、Ｂｔ４０７から既にクローニングしたｃｒｙＡａ遺伝子(Lereclus et a
l.，1989)、または４０７ Ｃｒｙ-株から抽出した染色体ＤＮＡである。反応条
件は下記の通りである。９５℃で５分間インキュベーションした後、ハイブリダ
イゼーションのため５７℃で１分間を３０サイクル、伸長のため７２℃で１分間
、および変性のため９２℃で１分間、最後に７２℃で１０分間新たなインキュベ
ーションを行う。Ｔａｑポリメラーゼは、USB Laboratories（クリーブランド、
オハイオ）から入手する。標準的手順を用いてE．coli の形質転換を行い、Ｂｔ
株は既に記載されているように電気穿孔によって形質転換した(Lereclus et al.
，1989)。
タンパク質分析は、Ｂｔ株の培養および超音波処理の後に行い、この分析は、
０．１％ＳＤＳ−１２％ＰＡＧＥ上で行う。殺虫活性のバイオアッセイ
製材の毒性を、第二段階でのPlutella xylostella の幼虫および以前に記載さ
れている自由摂取法(Sanchis et al.，1988)を用いて評価する。実施例２ ＢｔのＳｉｇＥ−およびｓｉｇＫ−突然変異体の構築
それぞれｓｉｇＥおよびｓｉｇＫのＫｍRによって中断された遺伝子のコピー
を含むｐＡＢ１およびｐＡＢ２の熱感受性プラスミドを、電気穿孔によってＢｔ
４０７ Ｃｒｙ-株に導入する。ｓｉｇＥおよびｓｉｇＫ遺伝子のｓｉｇＥ：
：ＫｍおよびｓｉｇＫ：：Ｋｍで中断したコピーによる置換は、非許容温度（４
０℃）でカナマイシンの存在下での形質転換体の連続培養によって得られる（第
１
図を参照されたい）。第１図から分かるように、ｐＡＢ１またはｐＡＢ２プラス
ミドによって形質転換されたＢｔ株は、いずれも３７℃でエリスロマイシンおよ
びカナマイシンに耐性である。
ｓｉｇＥまたはｓｉｇＫ遺伝子がその中断されたコピーに交換された形質転換
体を非許容温度、すなわちプラスミドの複製が遮断された温度で培養する。それ
らは、カナマイシンに対するそれらの耐性によって選択することができる。Ｓｐ
ｏ 突然変異体（下記の４０７−ＳｉｇＥ-および４０７−ＳｉｇＫ-）は、カナ
マイシンに耐性であるが、エリスロマイシンには感受性である。Ｂｔ ｓｉｇＥ
およびｓｉｇＫ遺伝子のそれらの中断されたコピーによる置換はＰＣＲ分析によ
ってチェックし、選択された突然変異体の染色体ＤＮＡをＰＣＲのマトリックス
として用い、それぞれの相補的外部配列をそれぞれｓｉｇＥ−４およびｓｉｇＫ
−４オリゴヌクレオチドと組合わせてプライマーとして用いる。ＰＣＲ生成物の
大きさは、ＫｍRによって中断される遺伝子に相当する。
Ｂｔ ＳｉｇＥ-およびＳｉｇＫ-突然変異株は、胞子形成を行うことができな
い。耐熱性胞子は、ＨＣＴまたはＳＰ培地で３０℃で７２時間成育した後に生成
しない。同様な成育条件では、野生株の細胞の少なくとも９０％が２４時間また
は４８時間後に胞子形成する。位相差顕微鏡による細胞の検討では、ｓｉｇＥ-
突然変異株が初期の胞子形成段階で遮断され（段階II）、非対称隔膜を形成した
後、母細胞と胞子区画とに分裂する。ｓｉｇＫ-突然変異株は後期胞子形成期（
段階IV）で遮断される。細胞の極の一方に位置する灰色の前胞子を、細胞の内部
に観察することができる。
ｌａｃＺ遺伝子と融合したBacillus subtilis のｓｐｏIIＤおよびｃｏｔＡ遺
伝子のプロモーター領域を有するｐＨＴｓｐｏIIＤおよびｐＨＴｃｏｔＡプラス
ミド（第２図を参照されたい）を構築して、Ｂｔの胞子形成の際のσＥおよびσ
Ｋ因子の出現および消失を観察する。ｓｐｏIIＤを、σＥ因子を含むＲＮＡポリ
メラーゼによって転写する(Lopez-Diaz et al.，1986; Rong et al.，1986)。こ
の遺伝子は、段階IIにおける胞子の形態学的発生に関与している(Young and Man
delstam，1979)。ｃｏｔＡ遺伝子は、胞子嚢タンパク質をコードし、その転写は
σＫ(Sandman et al.，1988)によって変化する。ｐＨＴｓｐｏIIＤおよびｐＨＴ
ｃｏｔＡプラスミドを電気穿孔によってＢｔ ４０７ Ｃｒｙ-Ｓｐｏ+、４０７
−ＳｉｇＥ-および４０７−ＳｉｇＫ-に導入し、β−ガラクトシダーゼの合成を
ＳＰ培地での成育中に観察する（第３Ａ図および３Ｂ図）。Ｓｐｏ+株では、ｓ
ｐｏIIＤプロモーターの制御下でのβ−ガラクトシダーゼの合成はｔ２で開始し
、ｔ５ではタンパク質が最大約１０，０００Ｕ／ｍｇに達した後、減少する。β
−ガラクトシダーゼの合成がｃｏｔＡプロモーターの制御下にある菌株では、こ
れはｔ６だけで検出され、ｔ１１にはタンパク質が最大４０００Ｕ／ｍｇに達す
る。ｓｐｏIIＤまたはｃｏｔＡ′−′ｌａｃＺ転写融合体に対する４０７−Ｓｉ
ｇＥ-突然変異体では、β−ガラクトシダーゼの発現は検出されない（タンパク
質１０Ｕ／ｍｇ未満）。ｓｉｇＫの転写はσＥによって変化するので(Sandman e
t al.，1988)、この突然変異株では因子Ｋは産生されない。４０７−ＳｉｇＫ-
突然変異株でｃｏｔＡプロモーターから開始するｌａｃＺの発現は検出されず、
ｓｐｏIIＤプロモーターから開始する発現は野生株と同様にｔ６で最大となる。実施例３ ＢｔのＳｉｇＥ-およびＳｉｇＫ-突然変異株におけるｃｒｙ１Ａａ′−′ｌａｃ Ｚの発現
Ｂｔの野生株およびＳｐｏ-突然変異株におけるｃｒｙ１Ａａ遺伝子のプロモ
ーターの一過性調節(temporal regulation)を測定するため、ｃｒｙ１Ａａ′−
ｌａｃＺ転写融合を含むプラスミドを構築した。ｃｒｙ１Ａａ遺伝子のプロモー
ター領域を含む領域を、記載されている方法でＰＣＲによって増幅した後、ｌａ
ｃＺリポーター遺伝子のｐＨＴ３０４−１８Ｚ上流でクローニングする。ｐＨＴ
ｃｒｙ１Ａ２という名称で呼ばれる生成したプラスミドを、電気穿孔によってＢ
ｔ ４０７ Ｃｒｙ-Ｓｐｏ+、４０７−ＳｉｇＥ-および４０７−ＳｉｇＫ-株に
導入する。Ｓｐｏ+４０７ Ｃｒｙ-株におけるβ−ガラクトシダーゼの産生はｔ
２に開始し、ｔ７に最初の、ｔ１１に第二の２個のピークを有する（第４図）。
ｓｐｏIIＤ′−′ｌａｃＺおよびｃｏｔＡ′−′ｌａｃＺ融合体について示され
ているように、ｔ７およびｔ１１はσＥおよびσＫの発現の最大期に相当する。
ｃｒｙ１Ａａのプロモーター領域によって指示されたβ−ガラクトシダーゼの合
成の発現は、４０７−ＳｉｇＥ-では顕著に減少する（第４図）。しかしながら
、若干のβ−ガラクトシダーゼ活性がｔ２で検出され、ｔ１０でタンパク質２０
０Ｕ／ｍｇの最大となる。ｃｒｙ１Ａａのプロモーター領域によって指示された
β−ガラクトシダーゼ合成はｔ２で開始し、突然変異株４０７−ＳｉｇＫ-では
ｔ７で最大値９０００Ｕ／ｍｇのタンパク質を示す（第４図）。Ｓｐｏ+株で後
期胞子形成時の第二の発現ピークはＳｉｇＫ-突然変異株では現れず、これは、
後期胞子形成期中のｃｒｙ１Ａａ遺伝子の転写におけるσＫ因子の関与を示して
いる。実施例４ ＢｔのＳｉｇＥおよびＳｉｇＫにおけるＣｒｙ１Ａａ毒素の産生
Ｂｔ ４０７の野生株のｃｒｙ１Ａａ遺伝子を有するｐＨＴ４１０プラスミド
(Lereclus et al.，1989)を、電気穿孔によってＢｔ ４０７ Ｃｒｙ-Ｓｐｏ+
、４０７−ＳｉｇＥ-および４０７−ＳｉｇＫ-株に導入する。
形質転換体を３０℃でＨＣＴおよびＳｐ培地で培養し、結晶性封入体(crystal
line inclusion)の産生を位相差顕微鏡法および電子顕微鏡法によって検討する
。ＨＣＴ培地で４８時間成育したところ、大きな二ピラミッド型結晶が４０７−
Ｓｐｏ+および４０７−ＳｉｇＫ-形質転換体で見られる。しかしながら、Ｓｐｏ+
株での結晶は、ＳｉｇＫ-突然変異株の結晶が細胞壁にカプセル封入されたまま
であるのに、遊離する。ＨＣＴ培地で７２時間成育した後でも、ＳｉｇＫ-突然
変異株からの結晶性封入体は遊離しない。ｐＨＴ４１０プラスミドを有する４０
７−ＳｉｇＥ-では、結晶は観察されない。
ＨＣＴ培地で成育した細胞からの結晶−細胞および胞子−結晶製剤に含まれる
タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、ｐＨＴ４１０を有する４０７−Ｓｉｇ
Ｅ-株は、ｐＨＴ４１０を含む４０７ Ｃｒｙ-Ｓｐｏ+株から得られるのと同様
な毒素を産生する同じプラスミドを有する４０７−ＳｉｇＫ-とは異なり、１３
０ｋＤａのＣｒｙ１Ａａポリペプチドを産生しないことを示している。
胞子−結晶および細胞−結晶製剤の殺虫活性を、第二段階でのPlutella xylos
tella 鱗翅類の幼虫を用いて分析する（第２表）。４０７−ＳｉｇＫ-突然変異
株におけるＣｒｙ１Ａａ以外のタンパク質の存在を考慮すれば、この菌株の結晶
性製剤での毒素の濃度を正確に測定することはできない。これは、ＬＤ５０を培
養容積によって定義して、これらの生成物の殺虫活性を評価するからである。こ
のバイオアッセイは、４０７−ＳｉｇＫ-で産生されるＣｒｙ１Ａａ毒素は、P．
xylostella の幼虫にとって極めて毒性が高いことを示している。しかしながら
、これらの生成物の殺虫活性は、音波処理によって著しく増加する。
上記の実験条件下ではシグマＫタンパク質を発現しないかまたは極めて弱くし
か発現せず、第Ｉ−１６３４号でＣＮＣＭに寄託されているBacillus thuringie nsis
株を、下記の条件下で構築する。
ｓｉｇＫ遺伝子を含む菌株をカナマイシンに対する耐性を付与するａｐｈＡ３
遺伝子によって中断する。このようにして構築した菌株を、Ｃｒｙ１Ａａ遺伝子
およびｅｒｍＣ遺伝子を有するｐＨＴ４１０プラスミドによって形質転換して、
エリスロマイシンに対する耐性を付与する。この非胞子形成株は、静止期１ａに
Ｃｒｙ１Ａａ毒素を多量に産生する。実施例５ ｃｒｙIII Ａ遺伝子のプロモーターの制御下でＣｒｙ１Ｃ／Ｃｒｙ１Ａ（ｂ）キ メラδ−内毒素をコードする遺伝子を発現するＫｔｏ ＳｉｇＫ-（ｐＨＴＦ３ −ＩＣ／Ａ（ｂ）−ＩＲＳ−Ｔ−Δ）と命名したB．thuringiensisの組換え菌株 の構築
Ｋｔｏ株はB ．thuringiensisの天然の胞子形成株であり、この菌株はＣｒｙ１
Ａ（ｃ）型のδ−内毒素を合成する。このδ−内毒素は、米国および欧州におけ
るトウモロコシ作物の主要な害虫であるOstrinia nubilalis（アワノメイガ）の
幼虫に対して殺虫活性を有する。一方、このδ−内毒素（従って、菌株Ｋｔｏ）
は、Spodoptera littoralis 、Spodoptera exigua またはMamestra brassicaeの
ようなヤガ科に属する他の重要な有害生物に対しては余り活性ではない（第３表
を参照されたい）。逆に、Ｃｒｙ１Ｃ δ−内毒素、または以下においてＣｒｙ
ＩＣ／Ｃｒｙ１Ａ（ｂ）と呼ばれるＣｒｙ１Ｃ／Ｃｒｙ１Ａ（ｂ）キメラδ−内
毒素であって、その構築（ＰＨＴ８１プラスミド）がSanchis et al.（1989）に
よって追加的に記載されているものは、S ．littoralis に対して活性を有するが
、O ．nubilalisに対しては余り活性でない（第３表）。
Ｋｔｏ株の活性のスペクトルを増加するには、Ｋｔｏ株にｃｒｙ１Ｃ遺伝子ま
たはキメラｃｒｙ１Ｃ／Ａ（ｂ）遺伝子を導入することが重要であった。しかし
ながら、既に１種類以上の他のδ−内毒素遺伝子を含み、その発現も同様にシグ
マＥおよびシグマＫ胞子形成因子によって変化するB ．thuringiensisの１菌株へ
のｃｒｙ１型遺伝子（胞子形成に依存性）の導入は、δ−内毒素の総生成量の増
加によっては説明されないことが示されている。従って、ｃｒｙ１型の様々な遺
伝子を含む組換え菌株は、一層広い活性スペクトルを有するが、δ−内毒素のそ
れぞれは余り産生せず、従って、標的とする昆虫のそれぞれに特異的な単独のδ
−内毒素を産生する菌株よりも標的昆虫のそれぞれに関する有効性は低くなる。
この現象は、この菌株に存在する様々なｃｒｙ１遺伝子のプロモーターによる胞
子形成のシグマ因子の滴定効果によって説明することができる。この問題を解決
するため、最近になり(Sanchis et al.，1996)、Ｃｒｙ１Ｃタンパク質をコード
する遺伝子を、発現がシグマ胞子形成因子(Agaisse and Lereclus，1994)とは独
立しているｃｒｙIII Ａ遺伝子のプロモーターの制御下に置くことができること
が示された。
ｃｒｙIII Ａプロモーターの制御下でｃｒｙ１Ｃ遺伝子をＫｔｏ株に導入して
、組換えＫｔｏ（ｐＨＴＦ３−１Ｃ−ＩＲＳ−Δ）株を得た(Sanchis et al.，1
996)。この組換え菌株は、同時にＣｒｙ１Ａ（ｃ）およびＣｒｙ１Ｃ毒素を産生
し、産生されるδ−内毒素の量は、親菌株と比較して１．５〜２倍だけ増加する
。菌株Ｋｔｏ（ｐＨＴＦ３−１Ｃ−ＩＲＳ−Δ）で得られる２種類のδ−内毒素
Ｃｒｙ１Ａ（ｃ）およびＣｒｙ１Ｃの総生成量の増加は、恐らくはこの菌株にお
けるｃｒｙ１Ｃ遺伝子の発現は胞子形成の特異的シグマ因子によって変化しない
ことによるものであり、胞子形成に依存するｃｒｙ１Ａ（ｃ）遺伝子の発現を妨
害しない。本明細書に記載のＫｔｏ ＳｉｇＫ-（ｐＨＴＦ３−１Ｃ／Ａ（ｂ）
−ＩＲＳ−Ｔ−Δ）株を構築するため、S ．littoralis に対する活性がＣｒｙ１
Ｃよりも若干勝っているキメラδ−内毒素Ｃｒｙ１Ｃ／Ａ（ｂ）をコードする遺
伝子を、ｃｒｙ１Ｃ遺伝子(Sanchis et al.，1996)について以前に記載した通り
にｃｒｙIII Ａ遺伝子のプロモーターの制御下に置いた。
同様に、Ｋｔｏ株のｓｉｇＫ-突然変異株（このｓｉｇＫ遺伝子がａｐｈＡ３
遺伝子によって中断されている）を、ｐＡＢ２プラスミド（第１図を参照された
い）を用いて実施例２に記載の方法で構築した。ＢｔのＳｐｏ-突然変異株であ
るＫｔｏ ＳｉｇＫ-をＨＣＴ培地で３０℃で４８時間培養すると、かなりの量
のＣｒｙ１Ａ（ｃ） δ−内毒素を産生し、これは結晶性封入体の形態で蓄積し
、細胞中にカプセル封入されたままになり、リーシスを受けない。O ．nubilalis
に
対するＫｔｏ ＳｉｇＫ-株の活性は、Ｋｔｏ ＳｉｇＫ-株が予め音波処理され
ていてもまたはされていなくとも、Ｋｔｏ親株の活性と同等である。
次いで、Ｋｔｏ ＳｉｇＫ-株を、ｐＨＴＦ３−１Ｃ／Ａ（ｂ）−ＩＲＳ−Ｔ
プラスミドで形質転換した（第５図を参照されたい）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
II ＫＳ-由来のこのプラスミドは、Ｔｎ４４３０＿トランスポゾンの内部分割
部位(internal resolution site)（ＩＲＳ）を含む２個の配列を有する(Lereclu
s et al.，1986)。これらの２個のＩＲＳは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ-
、およびテトラサイクリンに対する耐性を付与しかつBacillus cereus 由来のｔ
ｅｔ遺伝子の直ぐ両側に配置されている。更に、ｐＨＴＦ３−１Ｃ／Ａ（ｂ）−
ＩＲＳ−Ｔは、ｃｒｙIII Ａのｐ３プロモーターの制御下にあるキメラｃｒｙ１
Ｃ／Ａ（ｂ）のコード部およびB ．thuringiensisのｐＨＴ１０３０プラスミドの
複製源を含んでいる(Lereclus and Arantes，1992)。
形質転換の後、Ｋｔｏ ＳｉｇＫ-株に含まれているＴｎ４４３０トランスポ
ゾンのＴｎｐＩインテグラーゼは、２個のＩＲＳ部位の間の組換え反応を触媒し
て、これらの２個の部位の間に含まれるＤＮＡを切除する。組換えにより生じる
２個の環状分子のうち、ｐＨＴ１０３０プラスミドの複製源とキメラｃｒｙ１Ｃ
／Ａ（ｂ）遺伝子とを有するものだけが複製することができ、このようにして得
られたｐＨＴＦ３−１Ｃ／Ａ（ｂ）−ＩＲＳ−Ｔ−Δと呼ばれるプラスミドは、
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ-およびｔｅｔ遺伝子に相当するＤＮＡを失っ
ている（第６図を参照されたい）。Ｋｔｏ ＳｉｇＫ-（ｐＨＴＦ３−１Ｃ／Ａ
（ｂ）−ＩＲＳ−Ｔ−Δ）組換え体菌株は、Ｃｒｙ１Ａ（ｃ）およびＣｒｙ１Ｃ
／Ａ（ｂ） δ−内毒素をかなりの量で産生し、従って親ＫｔｏまたはＫｔｏ
ＳｉｇＫ-株よりも広い活性スペクトルを有するという利点を有する（第４表）
。
更に、このような菌株は２つの他の利点を有する。
1.）Ｃｒｙ１Ａ（ｃ）およびＣｒｙ１Ｃ／Ａ（ｂ） δ−内毒素は、細胞中に
カプセル封入されたままである。これは、散布した後に分解および紫外線に対し
て付与される物理的保護により、処理を施した作物帯での毒素の持続性が増加す
ることによると考えられる。
2.）ｓｉｇＫ-突然変異株は、胞子形成過程の段階IVで遮断されたＳｐｏ-突然
変異株であり、従って成育可能な胞子を産生せず、このような突然変異株の使用
により、殺虫処理中に胞子の環境中への伝播を回避することができる。
a オリゴヌクレオチドの位置は、下記の文献から決定される：*
Wong et al.，1983、および **Adams et al.，1991。
a ＬＤ50は、昆虫の幼虫５０％を殺すのに必要な製剤の溶液である。b
葉の上に散布した溶液のｍｌ当たりの使用した胞子−結晶または細胞−結晶
溶液のμｌ数。c
細胞を１分間の音波処理によって部分的に破壊し、結晶性封入体の大部分は
細胞の内部に残る。d
細胞を５分間の音波処理によって完全に破壊すると、結晶の９５％が遊離す
る。
(1) ＬＣ50、または致死濃度５０は、処理した個体数の５０％を５日後に殺す
のに要するδ−内毒素の濃度であり、生物学的試験はSanchis et al.，1996によ
って記載された方法で行った。
(1) ＬＣ50は、処理した個体数の５０％を５日間で殺すのに要する濃度であ
り、括弧内の値は９５％信頼区間であり、生物学的試験はSanchis et al.，1996
によって記載された方法で行った。
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ensis.Mosqutio larvicidal crystal protein gene cryIVA.J.Bacterial.175:27
50-2753.
Demande de brevet PCT WO94/25612.
Demande de brevet PCT WO93/02199.
Demande de brevet PCT WO82/03872.
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:07）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:07）
(72)発明者 ルレキュルス，ディディエ
フランス国パリ、リュ、セザール−フラン
ク、12
(72)発明者 アゲス，エルベ
フランス国パリ、ブールバール、パストゥ
ール、54
(72)発明者 サラミトゥー，シルビ
フランス国モル、リュ、ドルレアン、55
(72)発明者 サンシ，バンサン
フランス国パリ、リュ、ドミエ、14