CA2233248A1 - Nouvelles souches de bacillus thuringiensis et composition pesticide les contenant - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne notamment une souche de Bacillus thuringiensis caractérisée en ce qu'elle exprime le gène sigma E (.sigma.E) et ne sporule pas ou peu ou ne produit pas de spores viables. L'invention concerne également une composition pesticide contenant ladite souche de Bacillus thuringiensis.

Description

W O 97/15677 PCT~FR96/01684 NOUVELLES SOUCHES DE BACILLUS THURINGIENSIS ET COMPOSITION
PESTICIDE T F~ CONTENANT
La présente invention concerne de nouvelles souches de Bacillus thuringiensis, des compositions pesticides lcs mettant en oeuvre ainsi que l'utilisation de ces souches pour l'expression de protéines d'intérêt Bacillus thuringiensis (Bt) est une bactérie gram positive qui produit des protéines ayant des propriétés insecticides, notamment à
l'encontre des larves d'un grand nombre d'insectes Ces bactéries, éventuellement après une inactivation, sont utilisées dans des compositions pesticides destinées à lutter contre les insectes nuisibles aux cultures ou vecteurs de maladies, notamment les moustiques.
Actuellement, Bt sérotype 3a 3b notamment est utilisé contre les ravageurs des cultures, et le sérotype H1 1 est utilisé pour détruire les larves de moustiques.
Les protéines à activité pesticide produites par Bacillus thuringiensis sont appelées ~-endotoxines et sont produites abondamment durant la sporulation. Elles s'accumulent sous forme d'inclusions cristallines parasporales, et peuvent représenter jusqu'à ~5 % du poids sec dcs cellules sporulées.
De nombreux gènes de ~-endotoxines ont été clonés, séquencés et classifics en cinq groupes et en divers sous-groupes sur la base d'homologies de séquence et du spectre de toxicité. Les gènes correspondants sont dénommés gènes cry~
Les formulations à base de Bacillus thuringiensis sont utilisées a titre de biopesticides depuis près de 30 ans sous différentes appellations commerciales. L'utilisation de Bacillus thuringiensis comme agent de contrôle biologique présente de nombreux avantages par rapport au~:
pesticides chimiques; en effet, il a un spectre d'hôte étroit et très spécifiqueet il est sans effet sur les insectes qui ne constituent pas les cibles et il est sans effet défavorable sur les vertébrés ou sur l'environnement.
Toutefois, la faible persistance des ~-endotoxines dans l'environnement et la présence de spores dans les formulations représentent deux inconvénients pour la commercialisation des produits à
~ 35 base de B~cillus thuringiensis. Afin de résoudre ces deux problèmes, il a été
proposé, dans la dcmande de brevet EP-192 319, d'encapsuler les toxines dans les membranes cellulaires, en particulier en utilisant des cellules de type Pseudomonas fluorescens exprimant la toxine CryIAc, ou bien, dans la W O 97/lS677 PCT/FR96/01684 demande de brevet PCT WO94/25617, en exprimant la toxine CryIIlA dans un mutant non-sporulant affecté dans le gène spoOA. Cette dernière stratégie est possible car le mode d'expression du gène cryIIIA est différent du mode d'expression des autres gènes cry, en effet, ce gène cryIlIA est exprimé à
5 partir d'un promoteur dont l'activation est indépendante de tous les gènes impliqués dans l'initiation de la sporulation ou des facteurs impliqués dans la sporulation.
Chez Bacillus thuAngiensis, la sporulation est dépendante de l'expression de deux facteurs sigma dénommés respectivement sigma (a)35 10 et sigma (a)28; compte tenu de leur grande homologie avec les facteurs sigma (cJ)E et sigma (a)K chez Bacillus sllbtilis, c'est cette dernière terminologie qui sera utilisée ci-après, de même que les gènes correspondants seront dénommés sigE et sigK
La présente invention concerne une souche de Bacillus thuringiensis qui exprime aE mais ne sporule pas ou peu ou ne produit pas de spores viables.
La présente invention repose sur la mise en évidence du fait qu'un mutant de Bacillus thuAngiensis qui exprime sigE et qui n'e~prime pas sigK produit une quantité de toxines pratiquement identique à la souche ZO sauvage correspondante, mais, d'autre part, ne sporule pas ou ne produit pas de spores viables.
C'est en particulier le cas lorsque la souche est une souche sigK-La construction de telles souches présente deux intérêts : 1 ) ~5 éviter la dissémination de spores dans l'environnemcnt lors de traitementsavec des biopesticides; 7) augmenter la persistance des toxines dans l'environnement en raison de leur encapsulation.
Des essais ont montré qu'une souche de Bt n'exprimant pas le gène sigma K (sigK-) était capable d'accumuler une quantité de toxines 30 équivalente à la souche d'origine en ne produisant pas de spores. Elle était capable de produire la quasi totalité des toxines codées par les gènes cry ou les gènes apparentés dont l'expression est dépendante de la production de la protéine aE.
Afin d'obtenir des mutants sigK- de Bt il est particulièrement 35 avantageux d'utiliser une technique d'interruption, par insertion ou délétion ou changement de phase, du gène sigK en introduisant une W O 97/15677 PCT~FR96/01684 séquence d'ADN quelconque, cette séquence d'ADN pouvant, d'ailleurs, être choisie de façon à conférer au mutant un caractère de sélection; il pourra s'agir, par exemple, d'une résistance à un antibiotique, notamment à la kanamycine, ce qui permettra de sélectionner les souches ayant subi 5 l'interruption.
Les mutants sigK- peuvent également être obtenus par la délétion de tout ou partie de la séquence nucléotidique correspondant à celle du gène sigK avec ou sans régions régulatrices.
Les techniques d'interruption de gènes sont connues, elles 10 consistent essentiellement à introduire au sein d'une séquence d'ADN
portant le gène sigK une séquence d'ADN quelconque, l'ensemble étant introduit dans la souche, il se produit une recombinaison homologue, le gène sigK étant remplacé par le gène sigK interrompu. Le caractère de sélection permet à ce moment de sélectionner les mutants intéressants.
Bien entendu, il est particulièrement intéressant de choisir, à
titre dc souches destinées à etre transformées, des souches de Bacillus th uringiensis présentant une production de to~;ines très variées ou très importante. En effet, comme cela a été indiqué précédemment, le fait d'interrompre le gène sigK ne bloque que la sporulation mais ne bloque pas 20 la production des toxines.
Par Bt, on entend n'importe quelle souche de Bacillus th uringiensis Ainsi, parmi les souches destinées à subir l'interruption, on pourra utiliser les souches industrielles. Par e~;emple, Bt subsp. ~ursta~-i _5 E-ID-1 décrite par Dulmage H.T. (1970), ou Bt israelensis, ou une souche sauvage telle que Bt aiza~ai 7-29 (cette souche est accessible à IEBC sous le n~ T07029).
La présente invention concerne plus particulièrement la souche Bacillus thuringiensis 407 SigK- (pHT410) ainsi que la souche 30 recombinante Bacillus thuringiensis Kto SigK- (pHTF3-lC/A (b)-IRS-T-~) déposées à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'lnstitut Pasteur, respectivement le Z6 octobre 1995 sous le n~ I-1634 et le 27 octobre 1996 sous le n~ I-1776.
Il est également possible, afin d'augmenter la production de 35 toxines, d'introduire dans les souches sigK- selon l'invention des systèmes plasmidiques autoréplicatifs assurant l'expression desdites to~;ines selon des construc~ions qui sont également connues de l'homme du métier.

W O 97/15677 PCT~FR96/01684 INDICATIONS RE~L,A'I I-'ES A UN I~IICRO-ORGANISI~IE DE:I'OSE
(r;~lc I 3~is du PCI~

A. Les intdicalions ont Irait au micro-organismc visc d3ns la dcscriplic-n p~e 3 .lignc 32 1~. IDENTIFICATION DU DEI'OT D aulrcs dcp~;t:i font l'objct d'unc feuille supplementaire [~
Nom de l instilulion de dépôt INSTITUT PASTEUR
Adressc de I ~in~titlltinn de dépot (~ compris D coLlcpcstal ct Icpa~s) 28 Rue du Docteur Roux FRANCE

Date du dcpot n~ d-ordrc 26 Octobre 1995 I-1634 C. INDICATIONS SUrrLE; lENTAlRES (IC cas LcJu.:ant ) pour la suite de ces r~n~igr~m~ nt~

1). ETATS DESIG#ES l'OUR LESQUELS LES INDICATIONS SON I DONNEES
~si IL'S indications nc sont pas donn~:Ls pour tous 113 Etats dLsi~n~s) E. INDICATIONS FOURNIES SErAREi-IENT (Ic cas cchcant) Les inrii~~~tinn~ U.~ ~ ci~après seront fournies ultc. ;cu-....~..t au E~urcau intcrnation3 i (spLci~L~r la naturcgLnLralc d~s ;n~icalions p. ~., "n' d ordrc du d~:pot~) Réservé à l'office recepteur Réservé au Bureau intemational Cette feuille a été reçue en même temps que la [~ Cette feuille est parvenue au Bureau int ~-.t jnn~l le:
demande internationale Fonrtinnn~ire autorisé Fnn~tinnn~i.e autorisé
J. LE PICAUD

Formulaire PCI/RO/13 1 (juillet 1992) W O 97/15677 PCT~R96/01684 lNDlCATlONS RELA~ 'ES A ~1N .'~I.lCI~O-ORG~#lS'.~l.E DEI~OSE
(r;~L~lc l;.~ du PCT) A. ._es indica~ions ont trait au micro-org.-.nismc visé dans la descnptlc n pa,~e 3 , ligne 33 Il. IDENTIFICATION DU DEI'OT .')'aulrcs dep~;ls font l'objcl d'unc fcuille supp1ementaire O
Nom dc l'institurion de depot INSTITUT PASTEUR
Adresse de l ' institulion de dépot (y compris k codc possul ct Ic pa)s) 28 Rue du Docteur Roux FRANCE

Date du d-lpot n~ d'ordrc 22 Octobre 1996 I-1776 C. INI)ICATIONS SUPrLE.' IENTAlRES tlccosccl~-:ant) pour l~ suite de ces renseignemer.ts O

[). ETATS DESIGN'ES l'OUR LESQUELS LES INDICA'I'IO#S SO~ .' DONNEES
(si Ics indications ni- sont pas donndcs pour tous Ic5 Etats dcsi~.-n- s) E. INDICATIONS FOURNlES SEPARE'~f EN'T (IC cas i:cl~.-ant) .'_es inrl jr~ti- n~ enu.. ~.~ s ci-apres seront .ournies ultcr;.. c.. ~.. l au Burcau intern.. tional (sp~:ciJi~rla naturcgcncralcdcsindica~ions p .~r, ~n~ d 'ordrc du dcpdt~) Reserve à l'o.'fice recepteur Réservé au Burcau international E~ Cette .'euille a eté reçue en mcme temps que la C~ Cette .'euille est parvenue au Bureau international le:
demande internationale Fcnrrionn7i-e autorise Fon~ionn~ire autorise J. LE P.CAUD

Formulairc PCT/RO/134 (juillet 199'') W O 97/lS677 PCT~R96/01684 ' 6 Les protéines exprimées par la souche pourront dépendre du type d'activité pesticide recherché, ainsi, CryI est- toxique pour les lépidoptères, CryII contre les lépidoptères et les diptères et CryIV contre les diptères.
De fason générale, il est possible de rendre sigE~- des souches sauvages qui expriment de facon naturelle un certain nombre de toxines telles que cryIC, cryIA, cryIVA,B,D. On peut également utiliser les souches mutantes telles que décrites selon l'invention qui sont sigK- et qui expriment, après intégration chromosomique ou plasmidique, des gènes codant pour des protéines homologues ou hétérologues vis à vis du génome de Bt.
Une illustration de la technique utilisable est décrite dans Biotechnology, 1992, vol. 10, p. ~18 (Lereclus et al.).
On peut introduire dans la souche de Bt sigK-, par recombinaison homologue, un gène, par exemple le gène cryIC. Le recombinant acquiert le gène cryIC et ne retient pas d'ADN étranger.
Plusieurs gènes de toxines peuvent être ainsi ajoutés, soit dans le chromosome bactérien par recombinaison homologue, ou intégrés sur des plasmides résidents.
_0 A titre d'exemple, une souche de Bt kurstaki exprimant à la fois le gène cryIAc sous contrôle de son propre promoteur et le gène cryIC sous contrôle du promoteur du gène cryIIlA.
Parmi les gènes cry utilisables dans ces constructions, il faut citer: cryI, cry II, cry IV et cyt.
Un autre mode d'introduction d'un gène à exprimer consiste à
utiliser des plasmides de bactéries gram positive comportant une origine de réplication fonctionnelle chez Bt qui est décrit, par exemple, dans la demande de brevet PCT WO93/02199 concernant les plasmides pHT30-1 et pHT3 15.
Les souches sigK- obtenues selon le procédé selon l'invention sont utilisables, éventuellement après inactivation, dans des compositions pesticides, en particulier dans les compositions insecticides destinées à être utilisées afin de détruire les larves, en particulier les larves d'insectes. Lescompositions pesticides seront préparées selon des techniques elles-mêmes 3~ connues, c'est-à-dire, si cela est nécessaire, en mélange avec un support inerte ou non assurant une activité optimum des toxines de Bacillus en cause.

CA 02233248 l998-04-24 W O 97/15677 PCT~R96tO1684 L'inactivation des souches, qui est indispensable pour l'exploitation des souches sporulantes dans certains pays, est facultative dans le cas des mutants sigK- construits dans le cadre de la présente invention. Cette inactivation peut être réalisée par toute méthode physique ou chimique, notamment par une irradiation qui assure la non-viabilité des souches. Les souches selon l'invention ne comportent pas de spores viables, leur inactivation est plus aisée que dans le cas souches sporulées.
Comme cela été indiqué précédemment, les toxines étant maintenues à l'intérieur des bactéries, ceci permet d'augmenter la durée de vie des toxines dans l'environnement (la toxine n'étant libérée que lors de la digestion de la bactérie par la larve). Toutefois, on a pu mettre en évidence le fait que certains mutants selon l'invention présentaient une résistance tout à fait exceptionnelle, dans ce cas il est nécessaire de prévoir,soit l'utilisation de souches spécifiques sélectionnées pour leur bonne digestibili té chez les insectes à traiter, ou bien prévoir des traitements chimiques, agents tensio-actifs par exemple, physiques, traitements par les ultrasons, ou biologiques, introduction d'éléments particuliers dans les parois du microorganisme (par technique de recombinaison génétique ou autres) afin d'assurer une meilleure digestibilité ou une accessibilité plus aisée de la toxine lorsque le microorganisme a été ingéré.
Cette nouvelle souche de Bt est capable de fournir un des éléments ~i une composition pesticide, mais également utile comme vecteur pour exprimer des gènes homologues ou hétérologues vis à vis du génome de Bt, lesdits gènes étant clonés dans le mutant sigK- de Bt, soit à l'aide d'un plasmidc autoréplicatif, soit par recombinaison homologue vis à vis du génome de la bactérie.
La construction du système de vecteur pouvant exprimer, par exemple des protéases, des lipases, ou tout autre type de protéine, peut être .cimil~ire à celle décrite dans la demande de brevet PCT W09~/25612.
L'invention concerne également une séquence nucléotidique contenant le gène SigE, ne contenant pas de gène SigK actif et contenant une séquence codant pour un gène d'intérêt.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après et en se référant aux figures - 35 sur lesquelles:

- la figure 1 représente l'interruption des gènes chromosomiques sigE et sigK de Bacillus thuringiensis; les plasmides pABl et pAB2 sont intégrés dans le chromosome de Bt par recombinaison homologue, le second événement de recombinaison homologue conduit à la perte de toute la séquence de pRN5101; les nèches indiquent la direction de transcription des gènes ApR, EmR et Km R qui correspondent aux gènes conférant, respectivement, la résistance à l'ampicilline, l'érythromycine et la l;anamycine, les triangles représentent, respectivement, l'origine de réplication de pBR3Z2 (oriEc) et l'origine de réplication de pE194ts (orits);
- la figure 2 représente 1;3 construction des plasmides pour l'analyse de latranscription dans B~cillus thuringiensis; pHT30~-18Z est, comme cela a été préalablement décrit ( Agaisse et Lereclus 199 1b); les flèches indiquent la direction de transcription de ermC, bla et lacZ et la direction de réplication fonctionnelle dans E. coli (oriEc); orilO30 est l'origine de réplication du plasmide de Bt pHT1030 (Lereclus et Arantes 1992); les flèches brisées indiquen~ la direction de transcription initiée à partir du promoteur psigE, psigK, Bt I et Bt Il, comme cela a été indiqué
précédemment (Rong et al. 1986; Sandman et al. 1988; Wong et al. 1983);
les fragments HindlII-BamHI portant les régions promotrices des gènes spolID, cotA et crvlAa ont été clonés dans pl~T301-18Z;
- la figure 3 représente l'expression de la ~-galactosidase dans Bt sous contrôle des promoteurs des gènes spoIlD et cotA; les ccllules sont mises en croissance sur milieu SP à 30~C; le temps zéro indique la fin de la phase exponen~ielle, tn est le nombre d'heures avant ou après le temps zéro; A est l'activité ~-galactosidase de la souche Bt portant pHTspoIID;
B est l'activité ~-galactosidase de la souche Bt portant pHTcotA; l'activité
spécifique de ~-galactosidase est déterminée aux temps indiqués dans Spo+ 407 (~), 407 SigE (--) et 407 SigK- (O);
30 - la figure 4 représente l'expression de la ~-galactosidase dirigée sous contrôle de cr~lAa dans les souches de Bt portant pHTcrylA2, mise en croissance sur milieu SP à 30~C et l'activité ~-galactosidase étant déterminée aux temps indiqués Spo+ 407 (--), 407 SigE- (--) et 407 SigK-(O);
35 - la figure ~ représente le plasmide pHTF3-1C/A(b)-IRS-T; ce plasmide dérive du pBluescript Il KS- (l'ADN de pBluescript II KS- étant représenté
par la boîte "bla + oriEc"), il porte deux séquences comportant le site de WO 97/15677 PCT~R96/01684 résolution interne (IRS) du transposon Tn~30 (Lereclus et al., 1986) localisées en orientation directe de part et d'autre du pBluescript II KS- et d'un gène tet conférant la résistance à la tétracycline provenant de B~cillus cereus, il contient, de plus, la partie codante du gène chimère S cryl C/A (b) sous controle du promoteur p3 de cryIllA (Agaisse et Lereclus, 1991) et l'origine de réplication du plasmide pHT1030 de B. ~uringiensis (Lereclus et Arantes, 1992);
- la figure 6 représente la réaction de recombinaison entre les deux sites IRS, catalysée par l'intégrase TnpI du transposon Tn4~30présent dans la souche Kto SigK-, le plasmide issu de la recombinaison site-spécifique est désigné pHTF3- 1 C/A( b ) -IRS-T-~

I~/Iatériel et méthodes Souches bactériennes et milieux La souche Bt 407 (sérotype II 1 ) et son dérivé acristallifère (Cry-) ont été isolés par 0. Arantes comme cela a été décrit précédemment (Lereclus et al. 1989). E. coli K-12 souche TG1 (~ (lac-proAB) supE thi hsd D5 (F'traD36 pro+ proB+ lacIq lacZ ~I15)) est utilisé pour les expériences de clonage (Gibson 1984). Les souches de Bt sont cultivées à 30~C dans un milieu Luria (LB) et en milieu HCT (Lecadet et al. 1980) ou dans un milieu nutritif de sporulation (milieu SP) (Lereclus et al. 1995). Les souches de E. coli sont cultivées a 37~C dans un milieu LB. La concentration en antibiotique pour la sélection bactérienne est la suivante: ampicilline, 100 llg/ml (pour E. coli);
erythromycine, S llg/ml (pour Bt) ; I;anam) cine, 10 ~Lg/ml pour E. coli et 700 ~lg/ml pour Bt.
Plasmides et fra~ments d'AI)N
Le plasmide pRN5101 qui a été fourni par S. Gruss est un plasmide à origine de réplication thermosensible chez les gram positifs, il a été construit par insertion de pE194ts (Villafane et al. 1987) dans le site ClaIde pBR322. Le plasmide Bluescript (pBS KS-) provient de la société
Stratagène et les constructions des plasmides pI~T304-18Z et pHT410 ont déjà
été décrites (Agaisse et Lereclus 1 99~b ; Lereclus et al. 1989). Les oligonucléotides (CryIA-1 et CrylA-2) utilisés pour l'amplification PCR du fragment de 362 bp contenant la région promoteur du gène cryIAa (Wong et - 35 al. 1983) sont décrits dans le tableau 1. Le primer CryIA-l a une extension de 7 bp à l'extrémité 5' contenant le site de restriction HindIII et le primer CryIA-2 contient une extension de 8 bp avec le site de restriction Bam~I. Les deux sites de restriction sont introduits pour faciliter le clonage dans W O 97/15677 PCT~R96/01684 pHT30~-18Z. Pour interrompre les gènes Bt sigE et sigK, les régions 5' et 3' des gènes correspondants sont amplifiées par PCR en utilisant des oligonucléotides avec les sites de restriction appropriés à l'extrémité 5' (tableau 1) et sous-clonées séparément dans pBS KS-. Les régions 5' des gènes sigE et sigK sont des fragments de restriction de BamHI-Xbal de 857 et 611 bp respectivement. Les régions 3' sont des fragments de restriction EcoRI-BamHI de 807 et 606 bp respectivement. Les fragments d'ADN
contenant les régions 5' et 3' de chacun des gènes sont purifiés et ligaturés avec un fragment de 1,5 I;b Xbal-EcoRI portant le gène aphA3 10 d'Enterococcus faecalis (cassette KmR) (Trieu-Cuot et Courvalin 1983) dans le site de restriction BamHI du plasmidc pRN5101. Les plasmides thermosensibles résultants pAB1 et pAB2 portent une copie interrompue par un gène de résistance à la l;anamycine dans les gènes sigE et sigK
respectivement.
Les plasmides pDG675 et pDG676 portant respectivement la region promotrice des gènes spoIID et cotA de B. subtilis ont été fournis par le Dr. P. Stragier (Institut de Biologie Physico-Chimique, Paris, France).
plITspoIID a éte construit en sous-clonant le fragment de restriction de 300 bp HindIlI-BamHI de pDG675 entre les sites de restriction HindIII et 20 BamHI de pHT304-18Z. pHTcotA a été construit comme suit: les 400 bp du fragment EcoRI-BamHI de pDG676 sont d'abord sous-clonées dans pBS KS-, donnant pKScotA. Le fragment de restriction ~lindlll-Bam~II de pKScotA est alors sous-cloné entre les sites de restriction Hindlll et Baml-ll de pHT304-18Z, le plasmide résultant étant designé sous la dénomination p~lTcotA.
~5 Construction et transformation L'ADN plasmidique est extrait de E. coli par le procédé standard de Iyse alcaline. L'ADN chromosomique est extrait de Bt comme cela a été
décrit précédemment (Msadek et al. 1990). Les enzymes de restriction et la ligase T4 proviennent de New England Biolabs, beverly, ~fA. Les fragments 30 d'ADN sont purifiés sur gel d'agarose en utilisant le l;it Prep-A-Gene (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA.). Les primers d'oligonucléotides sont synthétisés par Genset (Paris, France) et l'amplification PCR est effectuée en utilisant le Système GeneAmp PCR 2400 (Per~in-Elmer, Foster City, CA).
La matrice d'ADN utilisée dans l'amplification PCR est soit le gène crylAa 35 déjà cloné à partir de la souche Bt 407 (Lereclus et al. 1989) soit l'ADN
chromosomique extrait de la souche 407 Cr~-. Les conditions de réaction sont les suivantes: une incubation de 5 min à 95~C, suivie par 30 cycles d'une min à 57~C pour l'hybridation, une min à 72~C pour l'extension et une min à

92~C pour la dénaturation; à la ~m, une nouvelle incubation à 7Z~C pendant 10 min est effectuée. La Taq polymérase provient des Laboratoires USB
(Cleveland, OH). La procédure standard est utilisée pour la transformation d'~ coli et les souches de Bt sont transformées par électroporation, comme cela a déjà été décrit (Lereclus et al. 1989).
L>analyse des protéines est effectuée après culture des souches de Bt et sonication, l'analyse étant effectuée sur 0,1% SDS - 12% PAGE.
Bio-essais d'activité insecticide La to,~;icité des préparations est estimée en utilisant la larve de Plutella xylostella au second stade et la technique d'ingestion libre telle qu'elle a été décrite précédemment (Sanchis et al. 1988).

Construction des mutants Si~E- et Si~K: de Bt Les plasmides thermosensibles pAB 1 et pAB2 contenant la copie du gène interrompu par KmR de sigE et sigK respectivement sont introduits dans la souche Bt 407 Cr~ par électroporation. Le remplacement des gènes sigE et sigK par la copie interrompue sigE::Km et sigK::Km est obtenu par cultures successives des transformants en présence de l;anamycine à une température non permissive (~0~C) (voir figure 1).
Comme cela ressort de la figure 1, les souches de Bt transformées par les plasmides pAB1 ou pAB2 sont tout à la fois résistantes à l'érythromycine et à
la l;anamycine à 37~C.
Les transformants dans lesquels le gène sigE ou sigK a été
échangé pour sa copie interrompue sont cultivés ~ une température non permissive, c'est-~i-dire à laquelle la réplication des plasmides a été bloquée.Ils peuvent être sélectionnés pour leur résistance à la ~;anamycine. Les mutants Spo- (ci-après 407-SigE- et 407-SigK-) sont résistants à la ~;anamycine mais sensibles à l'érythromycine. Le remplacement des gènes Bt sigE et sigK par leur copie interrompue est contrôlé par analyse PCR, l'ADN chromosomique des mutants sélectionnés est utilisé comme matrice pour la PCR et les séquences ehternes complémentaires de chaque gène sont utilisées comme primer en association avec des oligonucléotides sigE-4 et sigK-4, respectivement. La taille des produits de PCR correspond à des gènes interrompus par KmR.
- 35 Les souches de mutants Bt SigE- et SigK- sont incapables desporuler. Aucune spore thermorésistante n'est produite après 72 heures de croissance à 30~C en milieu HCT ou SP. En utilisant des conditions similaires de croissance, au moins 90 % des cellules de la souche sauvage sporulent après 24 ou 48 heures. L'examen des cellules par microscopie en contraste de phase indique que la souche mutante sigE est bloquée à un stade de sporulation précoce (stade II), après la formation du septum asymétrique divisant la cellule mère et le compartiment des spores. La souche mutante S sigK- est bloquée dans un stade de sporulation plus tardif (stade IV). Une préspore grise placée à l'un des pôles de la cellule peut être observé à
l'intérieur des cellules.
Les plasmides pHTspolID et pHTcotA (voir figure 2) portant les régions promotrices des gènes spoIID et cotA de Bacillus subtilis fusionnées 10 avec le gène lacZ sont construits pour suivre l'apparition et la disparition des facteurs aE et ~K durant la sporulation de Bt. spoIID est transcrit par une ARN polymérase contenant le facteur ~E (Lopez-Diaz et al. 1986; Rong et al.
1986). Ce gène est impliqué dans le développement morphologique des spores au stade Il (Young et I~Iandelstam 1979). Le gène cotA code pour une 15 protéine d'enveloppe de spore (Donavan et al. 1987) et sa transcription dépend de ~K (Sandman et al. 1988). Les plasmides pHTspoIID et pHTcotA sont introduits dans Bt 407 Cry- Spo+, 407-SigE- et ~07-SigK- par électroporation et la synthèse de ~-galactosidase est suivie durant la croissance en milieu SP
(figures 3A et 3B). Dans la souche Spo+ la syllthèse de ~-galactosidase sous le ~0 controle du promoteur de spoIID démarre à t7 pour atteindre un maximum d'environ 10 000 U/mg de protéines à t5 et décrolt ensuite. Dans la souche dalls laquelle la synthèse de ~-galactosidase est sous lc contrôle du promotcur cotA, celle-ci est détectée seulement à t6 et atteint un maximum de 4 000 U/mg de protéines à tl l. ll n'y a aucune expression détectable de ~-_5 galactosidase (moins de 10 U/mg de protéines) dans le mutant 407-SigE- pour les fusions transcriptionnelles spoIID' ou cotA'-'lacZ. Comme la transcription de sigK dépend de ~E (Sandman et al. 1988) il n'y a pas de production du facteur K dans cette souche mutante. Il n'y a pas d'expression détectable de lacZ à partir du promoteur cotA dans le mutant 407-SigK- et 30 l'e~-pression à partir du promoteur spoIID a un maximum à tG comme dans la souche sauvage.
EX~MPI E 3 E~ ression de crvlAa'-'lacZ dans les mutants Si~E: et Si~K- de ~t Pour déterminer la régulation temporelle des promoteurs du 35 gène crylAa dans la souche sauvage de Bt et dans les mutants Spo-, un plasmide contenant la fusion transcriptionnelle crylAa'-lacZ a été
COnStruil. Une région contenant la région promotrice du gène cryIAa est amplifiée par PCR, comme cela a été décrit, puis clonée en amont du gène W O 97/15677 PCT~R961~1684 rapporteur lacZ dans pHT304-18Z. Le plasmide résultant, désigné sous la dénomination pHTcryIA2 (figure 2), est introduit dans les souches Bt 407 Cr~~ Spo+, 407 SigE et 407 SigK- par électroporation. La production de ,~-galactosidase dans la souche Spo+ 407 Cry- débute à t2 et présente deux pics, le premier à t7 et le second tl 1 (figure 4). Comme cela a été indiqué pour les fusions spoIID'-'lacZ et cotA'-'lacZ, t7 et tl 1 correspondent avec les périodesd'expression maximale de oE et aK. L'expression de la synthèse de ~-galactosidase dirigée par la région promotrice de cryIAa est sévèrement réduite dans les mutants 407-SigE- (figure 4). Toutcfois, une faible activité ,~galactosidase est détectée à t2 avec un maximum de 200 U/mg de protéines à
tlO. La synthèse ~-galactosidase dirigée par la région promotrice de cryIAa démarre à t2 et montre un maximum de 9 000 U/mg de protéines à T7 dans le mutant 407-sigK- (Qgure 4). Le second pic d'expression à un temps de sporulation plus tardif dans la souche Spo+ n'est pas apparent dans le mutant SigK-, ce qui indique une participation du facteur oK dans la transcription du gène cryIAa durant la phase tardive de sporulation.
EXEMPLI~ 4 Production de la to.~ine CrvlAa dans les mutallts SigE et Si~K de Bt Le plasmide pHT410 portant le gène crylAa de la souche sauvage de Bt 407 (Lereclus et al. 1989) est introduit dans les souches Bt 407 Crv- Spo+, 407-Sig~ et 407-SigK- par électroporation.
Les transformants sont cultivés sur milieu HCT et SP à 30~C et la production d'inclusions cristallines est examinée par microscopie en contraste de phase et microscopie électronique. Après 48 heures de

2~ croissance dans le milieu HCT, les cristau.~; Iarges bipyramidau~; sont observés dans les transformants 407-Spo+ e~ 407-SigK-. Toutefois, les cristau~
dans la souche Spo+ sont libérés tandis que ceux des mutants SigK-demeurent encapsulés dans la paroi cellulaire. Même après 72 heures de croissance dans le milieu HCT, il n'y a pas de libération des inclusions cristallines à partir du mutant SigK-. Aucun cristal n'est observé dans la souche 407-SigE portant le plasmide pHT410.
Une analyse SDS-PAGE des protéines contenues dans les préparations cristal-cellule et spore-cristal à partir des cellules mises en croissance sur milieu HCT montre que la souche 407-SigE- portant pHT410 ne

- 3:, produit pas le polypeptide CryIAa de 130 };Da, au contraire de la souche 407-SigK- portant pHT410 qui produit une to~cine similaire à celle obtenue à
partir de la souche 407 Cry- Spo+ contenant le même plasmide.

WO 97/15677 PCT~FR96/01684 L'activité insecticide des préparations spore-cristal et cellule-cristal est analysée en utilisant les larves de lépidoptère Plutella xylostella au second stade (tableau 2). Compte tenu de la présence d'autres protéines que CryIAa dans le mutant -107-SigE~-, il n'est pas possible de déterminer la 5 concentration précise de toxine dans la préparation cristalline de cette souche. C'est pourquoi la DL50 est définie en terme de volume de culture pour estimer l'activité insecticide de ces produits. Les bio-essais indiquent que la toxine CryIAa produite dans 407-sigK- est très to~ique pour les larves de P. .~ylostella. Toutefois, I'activité insecticide de ces produits est augmentée 10 de facon significative par sonication.
La souche Bacill us th uringiensis, n'exprimant pas, ou très faiblement, la protéine sigma K, dans les conditions expérimentales ci-dessus, et déposée à la CNCM sous le n~ I-163~, est construite dans les conditions suivantes:
Souche bactérienne dont le gène sigK est interrompu par le gène aphA3 conférant la résistance à la ~;anamycine. La souche ainsi construite est transformée par le plasmide pllT~10 portant le gène cryIAa et le gène ermC, conférant la résistance à l'érythromycine. Cette souche non sporulante produit d'importantes quantités de toxine CryIAa pendant la~0 phase stationnaire.
MPL~
Construction d'une souche recombinante de B thurinyiensis dési~née Kto Sis~K- (pHTF3-lC/A(b)-lRS-T-~) ex~rimant un ~ène codant pour une ~-endotoxine chimère CrvlC/CrvlA(b) sous le controle du r~romoteur du ~5 s~ène crvlllA
La souche Kto est une souche naturelle sporulante de B. th uringiensis ; cette souche synthétise une ô-endotoxine de type CrylA(c). Cette ~-endotoxine possède une activité insecticide contre les larves de Ostrinia nubilalis (la pyrale du maïs) un ravageur majeur des 30 cultures de maïs aux Etats Unis et en Europe. Cette ~-endotoxine (et donc la souche Kto), est, en revanche, très peu active contre d'autres ravageurs importan~s appartenant ~i la famille des Noctuidae tels que Spodoptera littoralis, Spodoptera e~igua ou ~Iamestra brassicae (voir tableau 3).
Inversement, la ~-endotoxine CrylC ou la ~-endotoxine chimère 35 Cry1C/Cry1A(b), désignée ci-après CrylC/A(b), dont la construction (plasmide PHT81) est décrite ailleurs par Sanchis et al. (1989), sont actives contre S. littoralis mais très peu actives contre 0. nubilalis (tableau 3).

W O 97/15677 PCT~FR96/01684 Afin d'augmenter le spectre d'activité de la souche Kto, il était intéressant d'introduire le gène cryl C ou le gène chimère cryl C/A(b) dans la souche Kto. Il a cependant été montré que l'introduction d'un gène de type cryl (dépendant de la sporulation) dans une souche de B. thuringiensis contenant déjà un ou plusieurs autres gènes de ~-endotoxines, dont l'expression dépend également des facteurs sigma E et sigma K de sporulation, ne se traduit pas par une augmentation de la production totale de ~-endotoxines. Par conséquent, une souche recombinante contenant différents gènes de type cr~ l possèdera un spectre d'activité plus large mais 10 produira moins de chacune des ~-endoto?;ines; elle possèdera donc une efficacité moindre vis-à-vis de chacun des insectes cibles que des souches produisant une seule ô-endotoxine spécifique de chacun des insectes visés.
Ce phénomène peut être expliqué par un effet de titratior des facteurs sigma de sporulation par les promoteurs des différents gènes cryl présents 1~ dans la souche. Afin de résoudre ce problème, on a récemment montré
(Sanchis et al., 1996) qu'il est possible de placer le gène codant pour la protéine Cryl C sous le contrôle du promoteur du gène cryIIIA, dont l'expression est indépendante des facteurs sigma de sporulation (Agaisse et Lereclus, 1 994).
Le gène cryl C, sous contrôle du promoteur c~yIIIA, a été
introduit dans la souche Kto pour donner la souche recombinante Kto(pHTF3-lC-lRS-~) (Sanchis et al., 1996). Cette souche recombinante produit à la fois les to~ines CrylA(c) et CrylC et la quantité de ~-endoto.~;ines produite est augmentée d'un facteur 1,5 à 2 par rapport à la souche parentale.
2~ L'augmentation de la production totale des deu~; ~-endotoxines CrylA(c) et CrylC obtenue dans la souche Kto(pHTF3-lC-lRS-~) résulte probablement du fait que l'expression du gène crylC dans cette souche ne dépend pas des facteurs sigma spécifiques de la sporulation; elle n'interfère donc pas avec celle du gène crylA(c) dépendant de la sporulation. Afin de construire la 30 souche Kto SigK-(pHTF3-lC/A(b)-IRS-T-~) décrite ici, le gène codant pour la ~endotoxine chimère CrylC/A(b) dont l'activité vis-à-vis de S littoralis est légèrement supérieure à celle de CrylC, a été placé sous le contrôle du promoteur du gène cryIIIA, comme décrit précédemment pour le gène cryl C (Sanchis et al., 1996).
3~ De même, un mutant sigK- (dont le gène sigK est interrompu par le gène aphA3), de la souche Kto a été construit comme décrit dans l'exemple 7 à l'aide du plasmide pAB~ (voir figure 1). Lorsque la souche Kto SigK-, qui est un mutant Spo- de Bt, est cultivée a 30~C en milieu HCT pendant W O 97/15677 PCT~R96/01684 48 heures, elle produit des quantités importantes de la a-endoto~;ine CrylA(c) qui s'accumule sous la forme d'une inclusion cristalline qui reste encapsulée dans la cellule qui ne Iyse pas. L'activité de la souche Kto SigK-vis-à-vis de O. nubibalis est équivalente à celle de la souche parentale Kto, 5 que la souche Kto SigK- ait été préalablement soniquée ou non.
La souche Kto SigK- a ensuite été transformée avec le plasmide pHTF3-lC/A(b)-IRS-T (voir figure 5). Ce plasmide dérivé du pBluescript lI
KS- porte deux séquences comportant le site de résolution interne (IRS) du transposon Tn~30 (Lereclus et al., 1986). Ces deux IRS sont localisées en 10 orientation directe de part et d'autre du pBluescript II KS- et d'un gène tetconférant la résistance à la tétracycline provenant de Bacillus cereus. En outre, le pHTF3-lC/A(b)-IRS-T contient la partie codante du gène chimère crylC/A(b) sous le contrôle du promoteur p3 de cry~IlA et l'origine de réplication du plasmide pHT1030 de B. thuringiensis (Lereclus et Arantes, 1992).
Après transformation, I'intégrase Tnpl du transposon Tn4~30 présent dans la souche Kto SigK- catalyse une réaction de recombinaison entre les deux sites IRS et l'ADN contenu entre ces deux sites est excisé. Des deux molécules circulaires résultant de la recombinaison, seule celle qui 20 porte l'origine de réplication du plasmide pHT1030 et le gène chimère crylC/A(b) peut se répliquer et le plasmide ainsi obtenu, désigné pHTF3-lC/A(b)-lRS-T-~, a perdu l'ADN correspondant au pBluescript Il KS- et au gène tet (voir figure 6)~ La souche recombinallte Kto SigK- (pHTF3-lC/A(b)-IRS-T-~) produit à la fois les a-endoto~;ines CrylA(c) et CrylC/A(b) en quantité importante et présente donc l'avantage de posséder un spectre d'activité plus large que la souche parentale Kto ou Kto SigK- (tableau 4).
De plus, une telle souche présente deux autres intérêts:
1~) Les a-endotoxines CrylA(c) et CrylC/A(b) restent encapsulées dans la cellule. Ceci pourrait se traduire par une augmentation 30 de la persistance des toxines dans la zone des cultures traitées, en raison de la protection physique que cela pourrait leur conférer contre la dégradation et le rayonnement UV après épandage.
2~) Le mutant sigK- est un mutant Spo- bloqué au stade IV du processus de sporulation et ne produit donc pas une spore viable;
35 l'utilisation d'un tel mutant permet d'éviter la dissémination de spores dans l'environnement lors des traitements insecticides.

W O 97/15677 PCT~R96/01684 Tableau 1 Séauences d'oli~onucléotides utilisés comme amorce de PCR

Position Site de Amorce Séquence en bparestriction à
l'extrémité 5' crylA- 1 S'CCCAA~I~CAGGTAAATGGTrCTAAC3' 156-177* HindIlI
cryIA-2 5'CGCGGATCCAl~-l~-l l l lATTAAGATACC3' 495-518* BamHI
sigE- 1 5 'CGGGATCCCGTTGAAAGCGTAGAGGTCAGAA3' 1 6-3 8** BamHI
sigE-2 5'GCTCTAGAGCCAACGCGATGCATATGTTGCTA3' 831-855** Xbal sigE-3 5'GGAATTCCAl l~-l~lGACGTGTTAGGTACA3' 961-982** EcoRI
sigE- I 5'CGGGATCCCGATACGCAATATCTCGCAATGA3' 1730-1751** BamHI
sigK- 1 5'CGGGATCCCGTCCAGTTATAATTTGAGCTCCAA3' 31-53** BamHI
sigK-2 5'GCTCTAGAGCCCCGATTGTACCAATrGAAAT3' 603-623** Xbal sigK-3 5'GGAATTCCATTAAAGCGATCGAGAGCTATT3' 627-648** EcoRI
sigK-4 S'CGGGATCCCGGCACCTTCTAATATrACAGATAGAA3' 119 1-1217** BamHI
sigE-Ch 5~ 1 AAAAAGCGTATTGAA3' 1-22** aucun sigK-Ch 5'GGAGAAACCATAGTTATGAA3' 1-20** aucun a la position des oligonucléotides est déterminéc à partir de:
* Wong et al. 1983 et ** Adams et al. 1991 Tableau 2 Activité insecticide des souches Bt Souche DL50a ~Ll/ml de nourriture pulvériséeb 407 Spo~ (pHT410) 1 ~,7 (7,9 - 21,8) 407-SigK- (pHT410) 121,6 (68,6 -1358,7) 407-SigK- (pHT410) soniqué 1 minC 35,6 (15,2 - 71,2) 407-SigK- (pHT410) soniqué 5 mind 9,5 (6,2-12,6) a la DL50 est le volume de preparation nécessaire pour tuer 50% des larves d'insectes b ~Ll de solution de spore-cristal ou cellule-cristal utilisée par ml de solution rcpandue sur lcs feuilles c les cellules sont partiellement cassées par sonication de 1 min, la majorité des inclusions cristallines demeure à l'intérieur des cellules d les cellules sont totalement cassées par sonication de 5 min, 95~ des cristaux sont libérés W O 97/15677 PCT~R96/01684 ~9 Tableau 3 Activité com~arée des ~-endotoxines CrvlA(c). CrvlC et CrvlC/A(b) vis-à-vis de S. Iittoralis et O. nubilal;s CL50(1) vis-à-vis de larves de second stade en ng de protéine/cm2 10 ~endotoxines S. Iittoralis 0. nubilalis Cr~lA(c) 1000 2 CrylC 70 , 250 CrylC/A(b) 20 87 (1) La CL50, ou concentration létale 50, est la concentration de ~-endotoxines qui est nécessaire pour tuer 50% de la population traitée après 5 jours; les tests biologiques ont été réalisés comme décrit par Sanchis et al. 1996.

W O 97/15677 20 PCT~R96/01684 Tableau l Activité insecticide des souches de Bacillus thurinFiensis CL50( l) vis-a-vis de larves de second stade Caractéristiquesen ng de prc)tine/cm2 Souches de la souche S. Iittoralis 0. nu~i1alis Kto Souche naturelle Spo+ 981 1,7 produisant CrylA(c) (758-1270) (0,9-3) Kto(pHTF3-lC-IRS-a) Souche Kto Spo+ 25 < 1,2 produisant CrylA(c) (13-50) et CrylC
Kto SigK-(pHTF3- Souche Kto- Spo- produi- 11 2,6 lC/A(b)-IRS-T-~) sant CrylA(c) et Cr~ lC/A(b) (3-36) (0,06-110) sous forme encapsulée (l) La CL50 est la concentration qui es~ nécessaire pour tuer 50% de la population -traitée en 5 jours; les valeurs entre parenthèses représentent les intervalles de confiance à 95%; les tests biologiques ont été réalisés comme décrit par 30 Sanchis et al. (1996).

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Dem~nde de brevet PCT WO91/25612.
20 Dem~ulde de brevet PCT WO93/02199.
Demande de brevet PCT W082/03872.
Demande de brevet Européen 0 178 151.
Demande de brevet Européen 0 224 331.
Demande de brevet Européen 0 192 319.
25 Demande de brevet Européen 0 228 838.
Demande de brevet Européen 0 295 156.
Demande de brevet Européen 0 349 353.

Claims

REVENDICATIONS

1) Bacillus thuringiensis caractérisé en ce qu'il exprime le gène sigma E (.sigma.E) et ne sporule pas ou peu ou ne produit pas de spores viables.2) Bacillus thuringiensis selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche ne sporule pas, 3) Bacillus thuringiensis selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une souche n'exprimant pas le gène sigma K.
4) Bacillus thuringiensis selon la revendication 3, caractérisé en ce que le gène SigK a été interrompu par introduction d'une séquence d'ADN ou a été au moins partiellement délété.
5) Bacillus thuringiensis selon la revendication 4, caractérisé en ce que le gène sigK a été interrompu par introduction d'une séquence d'ADN
conférant à la souche un caractère de sélection positif.
6) Bacillus thuringiensis selon la revendication 5, caractérisé en ce que le caractère de sélection positif est la résistance à un antibiotique.
7) Bacillus thuringiensis selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la souche de Bt exprime un ou plusieurs gènes Cry.
8) Bacillus thuringiensis selon la revendication 7, caractérisé en ce que le ou les gènes Cry sont portés par un vecteur, par exemple un plasmide.
9) Bacillus thuringiensis selon la revendication 7, caractérisé en ce que les gènes Cry sont intégrés dans le chromosome.
10) Bacillus thuringiensis selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il exprime une protéine d'intérêt porté par un plasmide autoréplicatif ou par une séquence d'ADN intégrée dans le chromosome.
11) Bacillus thuringiensis selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'ADN dans le gène SigK exprimant une protéine d'intérêt.
12) Bacillus thuringiensis selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comporte en remplacement de tout ou partie du gène SigK, une séquence d'ADN exprimant une protéine d'intérêt.
13) Bacillus thuringiensis 407 SigK- (pHT410) déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 26 octobre 1995 sous le numéro I-1634.
14) Bacillus thuringiensis Kto SigK- (pHTF3-1C/A(b)-IRS-T-.DELTA.
déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 22 octobre 1996 sous le n° I-1776.

15) Composition pesticide, caractérisée en ce qu'elle contient une souche de Bt selon l'une des revendications 1 à 14.
16) Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce que la souche de Bt a été inactivée.
17) Composition selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisée en ce qu'elle a été inactivée par des moyens physiques.
18) Composition selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisée en ce qu'elle a été inactivée par irradiation.
19) Composition selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisée en ce qu'elle a été inactivée par des moyens chimiques.
20) Composition selon l'une des revendications 15 à 19, caractérisée en ce que la souche de Bt a été traitée pour améliorer la digestibilité de la souche ou bien améliorer l'accessibilité de la protéine 21) Composition selon la revendication 20, caractérisée en ce que la souche de Bt a été traitée par sonication.
22) Séquence nucléotidique contenant le gène SigE, ne contenant pas de gène SigK actif et contenant une séquence codant pour un gène d'intérêt.