JPH11510706A - 成長ホルモン分泌促進薬受容体ファミリー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト、ブタおよびラットの成長ホルモン分泌促進薬受容体を単離し、クローン化して、配列決定した。成長ホルモン分泌促進薬受容体は、Ｇ−タンパク質ファミリーの受容体の新規メンバーである。成長ホルモン分泌促進薬受容体は、成長ホルモン分泌促進薬受容体に結合する化合物をスクリーニングし、同定するために使用できる。そのような化合物は、成長ホルモン欠損症の子供、筋骨格障害のある年配の患者、股関節部骨折からの回復期にある年配の患者および骨粗鬆症に見られるような、成長ホルモンが不足した場合に生じる症状の治療において使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 成長ホルモン分泌促進薬受容体ファミリー 発明の分野 本発明は、成長ホルモン分泌促進薬受容体（ＧＨＳＲ）および成長ホルモン分 泌促進薬関連受容体（ＧＨＳＲＲ）などの新規受容体ファミリー、これらの受容 体（レセプター、receptor）をコードする核酸、ならびに成長ホルモン分泌促進 薬およびＧＨＳＲ機能を調節する化合物を同定するためのＧＨＳＲの使用に関す る。発明の背景 成長ホルモン（ＧＨ）は、身長の成長、体重増加および体全体の窒素保持を促 進することができる同化ホルモンである。古典的には、ＧＨは、主に、二つの視 床下部ホルモン、すなわち成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦまたはＧＲＦ）およ びソマトスタチンの調和的調節下で、下垂体前葉のソマトトロピン生成細胞（so matotroph）から放出されると考えられる。ＧＨ放出のＧＨＲＦ刺激およびソマ トスタチン阻害は共に、ソマトトロピン生成細胞膜上の受容体の特異的作用によ って生じる。 最近、ＧＨ放出が、短いペプチド群である成長ホルモン放出ペプチド（ＧＨＲ Ｐ；ＧＨＲＰ−６、ＧＨＲＰ−２〔ヘキサレリン〕）によっても刺激されること を示唆する証拠が増えており、例えば、米国特許第 4,411,890号、国際特許公 開 WO 89/07110、国際特許公開 WO 89/07111、国際特許公開 WO 93/04081お よび J．Endocrinol Invest.，15(Suppl 4)，45(1992)に記載されている。これ らのペプチドは、明確なソマトトロピン生成細胞膜受容体である成長ホルモン分 泌促進薬受容体（ＧＨＳＲ）に選択的に結合することによって機能する。薬物化 学的アプローチの結果、この受容体に特異的に結合してＧＨの拍動的放出を生じ る、経口的に活性で低分子量のいくつかの種類の非ペプチド化合物が設計された 。成長ホルモン分泌促進活性を有するそのような化合物は、例えば、次の文献に 開示されている。すなわち、米国特許第 3,239,345号、米国特許第 4,036,979 号、米国特許第 4,411,890号、米国特許第 5,206,235号、米国特許第 5,283, 241号、米国特許第 5,284,841号、米国特許第 5,310,737号、米国特許第 5,3 17,017号、米国特許第 5,374,721号、米国特許第 5,430,144号、米国特許第 5,434,261号、米国特許第 5,438,136号、米国特許第 5,494,919号、米国特許第 5,494,920号、米国特許第 5,492,916号、欧州特許 公開第 0,144,230号、欧州特許公開第 0,513,974号、国際特許公開 WO 94/07 486、国際特許公開 WO 94/08583、国際特許公開 WO 94/11012、国際特許公開 WO 94/13696、国際特許公開 WO 94/19367、国際特許公開 WO 95/03289、国 際特許公開 WO 95/03290、国際特許公開 WO 95/09633、国際特許公開 WO 95/ 11029、国際特許公開 WO 95/12598、国際特許公開 WO 95/13069、国際特許公 開 WO 95/14666、国際特許公開 WO 95/16675、国際特許公開 WO 95/16692、 国際特許公開 WO 95/17422、国際特許公開 WO 95/17423、国際特許公開 WO 9 5/34311、国際特許公開 WO 96/02530、Science，260，1640-1643（June 11，19 93）、Ann．Rep．Med．Chem.，28，177-186(1993)、Bioorg．Med．Chem．Ltrs. ，4(22)，2709-2714（1994）および Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92,7001-700 5(July 1995)である。 ＧＨの拍動的放出を刺激する経口的に活性な物質を使用すると、子供および大 人の成長ホルモン欠損症の治療がかなり前進するとともに、ＧＨの同化作用が臨 床的に利用され得る環境下（例えば、股関節部骨折後のリハビリテーション、虚 弱年配者 および術後回復期の患者）においてかなり有益である。 また、この新規受容体ファミリーを分析し、ＧＨＲＦおよびソマトスタチンの 作用との共同によるその正常な生理学的役割を理解するためには、成長ホルモン 分泌促進薬受容体の分子構造を知ることが望ましい。この結果、リガンド−受容 体結合の際に生じるin vivoプロセスをより理解することができる。さらに、ク ローン化した成長ホルモン分泌促進薬受容体を、新規成長ホルモン分泌促進薬を 同定することができるアッセイ系の必須成分として使用するのが望ましい。発明の詳細な説明 本発明は、成長ホルモン分泌促進薬受容体（ＧＨＳＲ）および成長ホルモン分 泌促進薬関連受容体（ＧＨＳＲＲ）を含む新規受容体ファミリーに関する。 本発明の第一の側面は、受容体同伴タンパク質を含まない成長ホルモン分泌促 進薬受容体である。ＧＨＳＲは、どの種に由来していてもよく、さらに別の態様 では単離または精製することができる。本発明の一つの態様は、受容体同伴タン パク質を含まないヒト成長ホルモン分泌促進薬受容体（ｈＧＨＳＲ）である。本 発明のさらに別の側面は、単離し、または精製した ｈＧＨＳＲである。 本発明の別の側面は、受容体同伴タンパク質を含まないブタ成長ホルモン分泌 促進薬受容体（ｓＧＨＳＲ）である。本発明のさらに別の側面は、単離し、また は精製したｓＧＨＳＲである。 本発明の別の側面は、受容体同伴タンパク質を含まないラット成長ホルモン分 泌促進薬受容体（ｒＧＨＳＲ）である。本発明のさらに別の側面は、単離し、ま たは精製したｒＧＨＳＲである。 本発明の別の側面は、実質的に同じ核酸配列によってコードされるが、スプラ イシングの変化または他のＲＮＡプロセシングにより誘導される改変または突然 変異により誘導される変化を受けており、その結果、発現されるタンパク質は天 然のものと相同的であるが異なるアミノ酸配列を有するヒト、ブタおよびラット ＧＨＳＲである。これらの変異型は、細胞ベースのアッセイにおけるヒトおよび 動物の生理学またはin vitroにおいて異なるおよび／または付加的機能を有する 可能性がある。 本発明の別の側面は、受容体同伴タンパタ質を含まない成長ホルモン分泌促進 薬関連受容体である。さらに別の態様は、単 離し、または精製したＧＨＳＲＲである。これらは、ヒト、マウス、ラットおよ びブタを含むどの種に由来するものであってもよい。 成長ホルモン分泌促進薬受容体は、細胞膜において受容体を固定する１以上の ドメインを含む種々の機能性ドメインおよび少なくとも１つのリガンド結合ドメ インを含むタンパク質である。多くの受容体タンパク質と同様に、アミノ酸の多 く、特にリガンド結合ドメインには存在しないアミノ酸を改変し、元の受容体の 少なくとも一部分の生物学的活性をなおも保持することができる。本発明によれ ば、ＧＨＳＲのＮ−末端部分は、その成長ホルモン分泌促進薬（ＧＨＳ）による 活性化には必須でないことが分かった。すなわち、本発明は特に、欠失、切断ま たは突然変異したＮ−末端部分を有する機能的に等価な改変ＧＨＳＲを含む。本 発明はまた、特に、機能的活性の低下を伴わない他のドメインの改変および／ま たは欠失を含む、機能的に等価な改変ＧＨＳＲを含む。 さらに、結合特異性および／または選択性を変えることにより、第二のメッセ ンジャーエフェクター系と相互作用するような他の機能性ドメインを改変するこ とが可能である。そのよう な機能的に等価な突然変異体受容体も本発明の範囲内である。 本発明のさらに別の側面は、成長ホルモン分泌促進薬受容体またはブタ、ヒト 、ラットもしくは他の種に由来する機能的に等価のものをコードする核酸である 。これらの核酸は、同伴する核酸を含まず、あるいは単離または精製することが できる。ほとんどのクローニング目的に対しては、ｃＤＮＡが好ましい核酸であ るが、本発明は特に、他の形態のＤＮＡおよびＧＨＳＲまたは機能的に等価なも のをコードするＲＮＡを含む。 本発明のさらに別の側面は、ＧＨＳＲまたは機能的に等価なものをコードする 核酸を含むベクターに関する。これらのベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡで構成 することができ、ほとんどのクローニングの目的に対しては、ＤＮＡベクターが 好ましい。典型的なベクターとしては、プラスミド、改変ウイルス、バクテリオ ファージおよびコスミド、酵母人工染色体ならびにＧＨＳＲをコードすることが できる他の形態のエピソームまたは組込みＤＮＡが挙げられる。特定の遺伝子伝 達または他の使用に対して適切なベクターを決定することは十分当業者の技術の 範囲内である。 本発明のさらに別の側面は、成長ホルモン分泌促進薬受容体 または機能的に同等のものをコードする遺伝子で形質転換した宿主細胞である。 宿主細胞は、細胞膜上でＧＨＳＲを天然に発現するものであってもなくてもよい 。好ましくは、宿主細胞は、いったん形質転換すると、成長ホルモン分泌促進薬 受容体または機能的に同等のものを細胞膜上で発現することができる。宿主細胞 によっては、特定のコドンを使用して発現が最適化されるようにＤＮＡを適応さ せることが望ましいと考えられる。そのような適応は、当技術分野で公知であり 、これらの核酸も本発明の範囲内である。一般には、ＣＯＳ、ＨＥＫ−２９３、 ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＳ／０、ＣＶ−１、ＧＣ、ＧＨ３またはＶＥＲＯ細胞など の哺乳類セルラインが好ましい宿主細胞であるが、Xenopus卵母細胞または昆虫 細胞などの他の細胞およびセルラインも使用できる。 成長ホルモン分泌促進薬関連受容体は、ＧＨＳＲに関係しているが、異なる遺 伝子によってコードされる。ＧＨＲＲ遺伝子は、ＧＨＲ ＤＮＡのｃＤＮＡのゲ ノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーション（緩和または中程度のストリンジェ ンシーでの後ハイブリダイゼーション洗浄条件を使用）によって同定できる。こ れらの配列は、ＧＨＲとの類似性が高い。 本発明の別の側面は、成長ホルモン分泌促進薬関連受容体をコードする核酸の 同定法であり、成長ホルモン分泌促進薬受容体をコードする第一の核酸を成長ホ ルモン分泌促進薬をコードする核酸を含むと推測される第二の核酸とハイブリダ イズし（ハイブリダイゼーションは緩和または中程度のストリンジェンシーでの 後ハイブリダイゼーション洗浄条件下で行う）、第二の核酸のハイブリダイゼー ションが生じた領域を同定することを含む。図面の簡単な説明 図１は、クローン７−３に含まれるブタＧＨＳＲ（Ｉ型）のＤＮＡである。 図２は、図１のＤＮＡによってコードされるブタＧＨＳＲのアミノ酸配列であ る。 図３は、図１のＩ型クローンの全オープンリーディングフレームである。 図４は、クローン１３７５に含まれるブタＧＨＳＲ（II型）のＤＮＡである。 図５は、図４のＤＮＡによってコードされるブタＧＨＳＲ(II型)のアミノ酸配 列である。 図６は、クローン１１４６に含まれるヒトＧＨＳＲ（Ｉ型）のＤＮＡである。 図７は、図６のＤＮＡによってコードされるヒトＧＨＳＲ(Ｉ型)のアミノ酸配 列である。 図８は、図６のＤＮＡ配列によってコードされるＩ型ＧＨＳＲの全オープンリ ーディングフレームである。 図９は、クローン１１４１に含まれるヒトＧＨＳＲ（II型）のＤＮＡである。 図１０は、クローン１１４１によってコードされるヒトＧＨＳＲ（II型）のア ミノ酸配列である。 図１１は、クローン１１４３に含まれるヒトＧＨＳＲ(Ｉ型)のＤＮＡである。 図１２は、クローン１１４３によってコードされるヒトＧＨＳＲ（Ｉ型）のア ミノ酸配列である。 図１３は、ブタＩ型のＯＲＦ（全長ＧＨＳＲのＭＥＴイニシエーターに欠け、 １２個の追加アミノ酸に欠ける）をブタII型受容体の相同的ドメインと比較した ものである。 図１４は、ヒトＩ型およびII型受容体の相同的ドメイン（アミノ末端配列は、 ＭＥＴイニシエーターおよび４個の追加アミ ノ酸に欠ける）を比較したものである。 図１５は、ブタＩ型およびヒトＩ型受容体のＯＲＦ（アミノ末端配列は、ＭＥ Ｔイニシエーターおよび１２個の追加アミノ酸に欠ける）を比較したものである 。 図１６は、ブタII型およびヒトII型受容体の全長を比較したものである。 図１７は、ブタおよびヒト成長ホルモン分泌促進薬受容体ｃＤＮＡクローンの 物理的マップを表す模式図である。 図１８は、エクオリン生物発光アッセイの使用によるXenopus卵母細胞におい て発現したブタおよびヒト成長ホルモン分泌促進薬受容体の薬理学を示すグラフ である。 図１９は、エクオリン生物発光アッセイおよび各種分泌促進薬の使用によるXe nopus卵母細胞において発現したブタおよびヒト成長ホルモン分泌促進薬受容体 の薬理学を示す表である。 図２０は、³⁵Ｓ−標識化合物Ａ結合アッセイの使用によるＣＯＳ−７細胞にお いて発現した純粋なブタ成長ホルモン分泌促進薬受容体の薬理学を表すグラフで ある。 図２１は、³⁵Ｓ−標識化合物Ａ結合アッセイおよび各種分泌促進薬および競合 アッセイにおける他のＧ−タンパク質共役受 容体（ＧＰＣ−受容体）リガンドの使用によるＣＯＳ−７細胞において発現した 純粋なブタ成長ホルモン分泌促進薬受容体との競合分析を表す表である。 図２２は、クローン１１３０４によってコードされる全長ヒトＧＨＳＴ（Ｉ型 ）のアミノ酸配列である。 図２３は、ＭＥＴ開始コドンから終結コドンまでのラットＧＨＳＲ ＤＮＡ配 列である。この配列は、イントロンを含む。 図２４は、図２３のラットＧＨＳＲのオープンリーディングフレームのみであ る。 図２５は、図２４のＯＲＦの推測されるアミノ酸配列である。 図２６は、トランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞における機能的ラッ トＧＨＳＲの発現を示す。 明細書および請求の範囲全体にわたって使用するとき、下記定義を適用する。 成長ホルモン分泌促進薬−動物において成長ホルモンの放出を直接または間接 的に刺激し、または増加させる化合物または物質。 リガンド−本発明のＧＨＳＲに結合する分子。これらのリガンドは、アゴニス ト、部分的アゴニスト、部分的アンタゴニス トまたはアンタゴニスト活性を有する。 受容体同伴タンパク質を含まない−受容体タンパク質が、他の膜受容体タンパ ク質との混合物でも溶液でもない。 同伴核酸を含まない−核酸が、天然には生物の染色体に共有結合するＤＮＡに 共有的に結合していない。 単離した受容体−タンパク質が他のどのタンパク質との混合物でも溶液でもな い。 単離した核酸−核酸が他のどの核酸との混合物でも溶液でもない。 機能的に等価−代替的スプライシング、欠失、突然変異または付加により、天 然に存在する成長ホルモン分泌促進薬受容体のアミノ酸配列と正確に同じではな いが、天然の受容体の生物活性の少なくとも１％、好ましくは１０％、より好ま しくは２５％を保持する受容体。そのような誘導体は、天然のＧＨＳＲとかなり の相同性を有し、ＧＨＳＲから得られるＤＮＡ配列との低められたストリンジェ ンシーでのハイブリダイゼーションにより検出できる。機能的に等価なものをコ ードする核酸は、天然の受容体核酸に対してヌクレオチドレベルで少なくとも約 ５０％の相同性を有する。 精製した受容体−受容体の純度が少なくとも約９５％である。 精製した核酸−核酸の純度が少なくとも約９５％である。 化合物Ａ−Patchett，1995 Proc．Natl．Acad．Sci．92:7001-7005に記載の、 （Ｎ−〔１（Ｒ）−〔（１，２−ジヒドロ−１−メタン−スルホニルスピロ〔３ Ｈ−インドール−３，４’−ピペリジン〕−１’−イル）カルボニル〕−２−（ フェニルメチルオキシ）エチル〕−２−アミノ−２−メチルプロパンアミド。 化合物Ｂ−Patchett，1995 Proc．Natl．Acad．Sci．92:7001-7005に記載の、 ３−アミノ−３−メチル−Ｎ−（２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ− １−｛〔２’−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）（１，１’−ビフェニル）−４− イル〕メチル｝−１Ｈ−ベンズアゼピン−３（Ｒ）イル−ブタンアミド。 化合物Ｃ−米国特許第 5,206,235号に記載の３−アミノ−３−メチル−Ｎ− （２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１−｛〔２’−１Ｈ−テトラゾ ル−５−イル）（１，１’−ビフェニル）−４−イル〕メチル｝−１Ｈ−ベンズ アゼピン−３（Ｓ）イル−ブタンアミド。 標準または高いストリンジェンシーでの後ハイブリダイゼー ション洗浄条件−６ｘＳＳＣ、５５℃。 中位のストリンジェンシーでの後ハイブリダイゼーション洗浄条件−６ｘＳＳ Ｃ、４５℃。 緩和した後ハイブリダイゼーション洗浄条件−６ｘＳＳＣ、３０℃。 本発明のタンパク質は、Ｇ−タンパク質リンク受容体スーパーファミリーを含 む７−トランスメンブラン（ＴＭ）ドメイン（ＧＰＣ−Ｒ′または７−ＴＭ受容 体）の典型である構造的特徴を有することが分かった。すなわち、成長ホルモン 分泌促進薬ファミリーの受容体は、ＧＰＣ−Ｒファミリーの受容体の新規メンバ ーを構成する。本発明のＧＨＳＲそのものは、７個のトランスメンブラン領域、 ３個の細胞内および細胞外ループ、ならびにＧＰＣ−Ｒタンパク質シグナル配列 など、ＧＰＣ−Ｒの一般的特徴を有することが分かった。ＴＭドメインおよびＧ ＰＣ−Ｒタンパク質特徴的配列は、図３および８のＩ型ＧＨＳ受容体のタンパク 質配列中に符号で示す。全ての領域が機能に必要であるわけではなく、従って、 本発明は、１以上の必須でないドメインに欠ける機能性受容体も含む。 本発明のＧＨＳＲは、ラットおよびヒトのニューロテンシン 受容体（約３２％が同一）ならびにラットおよびヒトＴＲＨ受容体（約３０％が 同一）などの以前にクローン化されたＧＰＣ−受容体と配列相同性をいくらか共 有している。 本発明のＧＨＳＲを、単離し、Xenopus(アフリカツメガエル)卵母細胞での発 現クローン化法を使用して解析した。クローニングは、３つの因子により困難で あった。第一に、本発明前は、タンパク質の生化学的特徴および細胞内シグナル 化／エフェクター経路に関して利用できる情報がほとんどなかった。すなわち、 ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、またはＰＣＲを利用するための、縮 重オリゴヌクレオチドの設計のためのタンパク質配列情報の使用に依存するクロ ーニング法が、有効に利用できなかった。従って、本発明によれば、受容体の生 物活性を測定する必要があった。 第二に、成長ホルモン分泌促進薬受容体は、豊富には生じない。すなわち、他 のほとんどの膜受容体よりも約１０倍低い濃度で細胞膜上に存在する。本発明に 従って受容体をうまくクローン化するためには、ＧＨＳＲがスクリーニングした いｃＤＮＡライブラリーにおいて確実に提示されることを徹底的に注意した。こ のために、未分解で純粋な完全ポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡの 単離、および全長分子の産生を最大にするためのｃＤＮＡ合成の最適化を必要と した。さらに、機能的なｃＤＮＡクローンが得られる確率を高めるために、通常 よりもサイズの大きいライブラリーをスクリーニングする必要があった（約0.5 〜1×10⁷クローン）。 第三に、この受容体を発現する永久セルラインは知られていない。従って、一 次下垂体組織をｍＲＮＡ源またはタンパク質源として使用しなければならなかっ た。これは、ほとんどの一次組織が、所与の受容体を、組織培養またはいくつか の腫瘍物質で維持され得る不死化セルラインよりも少ない量で発現するので、さ らに障害をもたらした。さらに、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築するためのブ タ下垂体の外科的除去および生物学的に活性な完全ｍＲＮＡの抽出は、組織培養 セルラインからのｍＲＮＡの抽出よりもかなり困難である。新鮮な組織を連続的 に得ることの必要性とともに、動物間および調製間のその固有の変異性と関連す る問題がある。従って、本発明の受容体を発現するセルラインの開発は、本発明 の重要な側面である。 本発明のさらに別の側面は、その受容体を含むｃＤＮＡライブラリー部分を同 定するために使用できる、極めて感受性が高 く、強固で信頼性があり、スループットの高いスクリーニングアッセイの開発で ある。このアッセイは、本出願とともに1995年12月13日に出願された、審査中の 特許出願No.60/008,584（代理人No.19590PV2）に記載され、クレームされている 。 簡単に述べると、成長ホルモン分泌促進薬受容体をコードするｃＤＮＡの同定 能は、本発明に従って成された二つの発見、すなわち、１）成長ホルモン分泌促 進薬受容体−リガンド結合がＧタンパク質を介して伝達されること、および２） 受容体活性を検出するためには、特定のＧタンパク質サブユニットＧα₁₁が細胞 に存在しなければならないこと、に依存した。これらの二つの発見がなされた場 合にのみ、ＧＨＳＲをコードするＤＮＡ配列の存在を検出するためのアッセイが 発明できた。 ＧＨＳＲがリガンド（成長ホルモン分泌促進薬）に結合すると、細胞に存在す るＧ−タンパク質が、細胞内シグナル化分子（ジアシルグリセロールおよびイノ シトール三リン酸）を放出し、次いでその分子がカルシウムの可動化を促進する 生化学的カスケードを開始する酵素であるホスファチジルイノシトール−特異的 ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）を活性化する。これは、アッセイの基礎とし て使用できる。カルシウム濃度の変 化に応答し得る検出分子、例えばクラゲの光タンパク質であるエクオリンなどを 、ｃＤＮＡ発現ライブラリー由来の10,000個までのＲＮＡ（そのうちの少なくと も１つはＧＨＳＲをコードすることができる）の複合プールとともに細胞に導入 する。その細胞を次いで、化合物Ａまた化合物Ｂなどの公知成長ホルモン分泌促 進薬にさらす。１以上のＲＮＡがＧＨＳＲをコードする場合は分泌促進薬リガン ドが受容体に結合し、Ｇ−タンパク質が活性化され、カルシウムレベルが変動し て、エクオリンが測定可能な生物発光を生じる。一度陽性結果が得られたら、そ の操作を、ＧＨＳＲをコードするＲＮＡを生じ得る単一のクローンが同定される まで、ＲＮＡプールの一部分（例えば、約1,000、次いで約500、次いで約50、次 いで純粋なクローン）に対して繰り返すことができる。 この一般的プロトコールをブタｃＤＮＡ発現ライブラリーとともにXenopus卵 母細胞で使用することにより、ブタＧＨＳＲをコードする核酸を含むクローン７ −３を同定した。ｃＤＮＡクローンの挿入物は、大きさが約1.5kbであり、推定 上のイニシエーターメチオニン（ＭＥＴ）の下流であり、302個のアミノ酸（Ｍ_r ＝34,516）をコードするオープンリーディングフレ ーム（ＯＲＦ）を含む。ＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列を図１および２に 示す。クローン７−３のタンパク質配列に対してヒドロパシー分析（例えば、Ky te-Doolittle; Eisenberg，Schwartz，KomaronおよびWall）を行うと、予測され る６個のトランスメンブランドメインのみが推定上のＭＥＴイニシエーターの下 流に存在する。クローン７−３においてコードされる最も長いＯＲＦの翻訳は、 353個のアミノ酸（Ｍ_r＝39,787）のタンパク質をコードする。しかし、このより 長いリーディングフレームについては見かけのＭＥＴイニシエーターを特定する ことができない（図３）。このより長いリーディングフレームは、７個のトラン スメンブランセグメントが 353個アミノ酸タンパク質（そこにはＴＭ１の上流 に位置するＭＥＴ翻訳開始コドンが存在しない）においてコードされているので 、重要である。さらに、このより長いタンパク質はまた、その予測されるＴＭ１ ドメインにおいて公知のＧ−タンパク質共役受容体と相同性を共有する（図３お よび次の節）。すなわち、クローン７−３はそのアミノ末端で切断されているが 、完全に機能性であり、それは、クローン７−３がしかし、天然のＧＨＳＲの機 能的に等価なものの一態様であることを示 す。 得られたｃＤＮＡクローン（または、例えばほんの１５ヌクレオチド長さのよ り短い部分）は、核酸がハイブリダイズできるように十分類似している他の受容 体を見いだすためのハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをプローブす るために使用でき、特に、他の種に由来するライブラリーをスクリーニングする ために有用である。この方法を使用して、さらにヒト、ブタおよびラットのＧＨ ＳＲｃＤＮＡをクローン化し、それらのヌクレオチド配列を決定した。さらに、 ｃＤＮＡのゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、Ｉ型受容体（下記参照 ）が、かなり保存されている１個の遺伝子によってコードされていることを示し た。ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ニワトリおよび無脊椎動物のＤ ＮＡは全て、高ストリンジェンシーでの後ハイブリダイゼーション条件で単一の ハイブリダイズ種を生じた。従って、本発明は、特定の種に限定されるものでは ない。 ブタ下垂体ライブラリー、ヒト下垂体ライブラリーおよびラット下垂体ライブ ラリーをブタＧＨＳＲクローン７−３のオープンリーディングフレームから誘導 される放射線標識したｃＤ ＮＡとハイブリダイズした。２１の陽性ヒトＧＨＳＲｃＤＮＡが単離され、５個 のブタライブラリープールは、強いハイブリダイゼーションシグナルを生じ、サ ザンブロット上での挿入物サイズによって判定するとクローン７−３よりも大き い挿入物を有するクローンを含んでいた。単一のラットｃＤＮＡクローンも単離 された。 ヌクレオチド配列分析により、ヒトおよびブタの両方のＧＨＳＲｃＤＮＡに対 して２つの型のｃＤＮＡが示された。第一(Ｉ型)は、７個のトランスメンブラン ドメインをコードするクローン７−３によって表されるタンパク質をコードする 。全長オープンリーディングフレームは、クローン７−３の予想される最も大き いオープンリーディングフレーム（353アミノ酸）よりも１３アミノ酸だけ延び ていると思われる。第二（II型）は、Ｉ型ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の３’端 の第６トランスメンブランドメイン（ＴＭ−６）の予想される２番目のアミノ酸 のすぐ後ろで変化している。 II型ｃＤＮＡでは、ＴＭ−６が切断され、ほんの２４アミノ酸の短い隣接リー ディングフレームに融合し、その後ろに翻訳終結コドンが続く。ブタのクローン １３７５は、II型ｃＤＮＡ 一例である（図４および５）。ＴＭ−６を越えたこれらの２４アミノ酸は、ヒト およびブタのｃＤＮＡ間で比較すると、かなり保存されている。ヒトＧＨＳＲの Ｉ型およびII型のＤＮＡおよびアミノ酸配列を図６〜１２に示す。ヒトＩ型受容 体をコードする全長ｃＤＮＡ、すなわち、フレーム内終結コドンが前にある有利 な文脈でイニシエーターＭＥＴを有する７−ＴＭドメインをコードする分子を単 離し、クローン１１３０４と命名する。全長Ｉ型ＧＨＳＲに対するクローン１１ ３０４の予想されるＯＲＦは、366アミノ酸（Ｍ_r＝41,198；図２２）である。全 長ヒトII型ｃＤＮＡは、289アミノ酸（Ｍ_r＝32,156；図９および１０）のポリペ プチドをコードする。 核酸およびタンパク質の両レベルで行った配列決定は、ＩおよびII型のＧＨＳ Ｒが互いに、かつ種を越えてかなり関係していることを示している（図１３〜１ ６）。ヒトおよびブタＧＨＳＲ配列は、アミノ酸レベルで９３％が同一であり、 ９８％が類似している。 ブタＩ型クローン７−３の欠けているアミノ末端延長部をコードするヌクレオ チド配列は、予想される全長ヒトＩ型クローンならびにヒトおよびブタII型ｃＤ ＮＡから誘導される。全長 クローンのリーディングフレームは、クローン７−３のアミノ末端配列を越えて １３アミノ酸だけ延びており、この配列は、ヒトおよびブタの間で比較すると、 １２／１３アミノ酸残基で保存されていた。アミノ末端延長部は、Kosakの規則 による有利な文脈で翻訳開始メチオニンを含み、さらに上流のリーディングフレ ームは終結コドンによって中断されている。Ｉ型およびII型のブタおよびヒトｃ ＤＮＡクローンの模式的な物理的マップを図１７に示す。 ラットクローンもさらに調べた。配列分析は、スプライス−ドナー部位に対応 するnt 790に非コードイントロン配列が存在することを示した（図２３、２４お よび２５を参照）。Ｇ／ＧＴスプライス−ドナー部位は、予想されるトランスメ ンブランドメイン５（ロイシン263）の完了の２アミノ酸後に生じる。すなわち 、ｒＧＨＳＲは、アミノ末端セグメント（細胞外ドメイン、ＴＭ−１〜ＴＭ−５ および最初の２個の細胞内および細胞外ループを含む）およびカルボキシ末端セ グメント（ＴＭ−６、ＴＭ−７、第三の細胞内および細胞外ループ、ならびに細 胞内ドメインを含む）に分けられる。挿入部位およびフランキングＤＮＡ配列は かなり保存され、ヒトおよびブタの両方のＩ型 およびII型ｃＤＮＡにも存在する。 ラットＧＨＳＲタンパク質をコードする完全オープンリーディングフレームを ヒトおよびブタの相同体と比較すると、配列の同一性が高いことが分かる（ラッ ト対ヒト：95.1％；ラット対ブタ：93.4％）。 ヒトＧＨＳＲは、蛍光in situハイブリダイゼーション分析〔ＦＩＳＨ；Cytog enet，Cell Genet 69: 196(1995)に記載〕によって細胞遺伝バンド3Q26.2に対応 させることができる。マウス遺伝子は、3A3上に位置する。 卵母細胞で発現させたヒトおよびブタＩ型ｃＲＮＡは機能的であり、エクオリ ン生物発光アッセイでは、1mM〜0.1nMと低い範囲の化合物Ａ濃度に対応する。Ｔ Ｍ−６で切断されるヒトまたはブタII型誘導ｃＲＮＡは、卵母細胞に注入すると 反応を示さなかった。これらのｃＲＮＡは、ＧＨＳに結合し得るが、細胞内シグ ナル伝達経路は有効に活性化することができない受容体サブタイプを表す。さら に、II型受容体は、他のタンパク質と相互作用し、従って、機能的ＧＨＳＲを再 構成する可能性がある。リガンド−結合活性を有する可能性があるが、シグナル 伝達においては活性でないこれらのタンパク質は、リガンド −結合アッセイに対して特に有用である。これらの場合、細胞膜上に突然変異体 タンパク質を過剰発現させ、推定上の標識したリガンドの結合能をテストするこ ともできる。構成的に高アフィニティー状態にある非シグナル化突然変異体を使 用することにより、結合を測定することができるが、有害な代謝結果は生じない 。このように、非シグナル化突然変異体は、本発明の重要な側面である。 ヒトＩ型、ブタＩ型およびラットの受容体の卵母細胞でのエクオリン生物発光 アッセイにおける薬理学的解析を図１８、１９および２６にまとめる。ペプチド および非ペプチド生物活性ＧＨＳは、天然の下垂体受容体について認められた効 力と同様のランク順で活性であった。Ｉ型ＧＨＳＲ（ブタクローン７−３につい て示す）が完全に機能的なＧＨＳＲをコードすることの独立した確証的証拠は、 クローン３−７が哺乳類ＣＯＳ−７細胞において一過性に発現されると、高アフ ィニティーで（Ｋ_D〜0.2nM）、飽和可能な（Ｂ_max〜80fmol/mgタンパク質）、特 異的結合（＞90％が50nMの未標識化合物Ａによって置き換えられる）が³⁵Ｓ−化 合物Ａについて認められるという発見によって示される（図２０および２１）。 本発明のＧＨＳＲ受容体は、緩和なまたは中程度の後ハイブリダイゼーション 洗浄条件下でのＧＨＳＲｃＤＮＡのゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションに よって同定できる。この分析では、少数のハイブリダイズバンドを生じる。この 方法で使用できる適切なヒトゲノムライブラリーはＰＡＣ（Nature Genetics 6: 84（1994）に記載）であり、適切なマウスゲノムライブラリーはＢＡＣ（Proc N atl Acad Sci USA 89:8794（1992）に記載）である。 ＧＨＳＲに対する相同性の度合が高いことにより、本発明のＧＨＳＲは、ＧＨ ＳＲと同様に機能し、同様の生物学的活性を有すると考えられる。そして、生物 の成長に関与する生物学的・生理学的経路の理解において有用である。また、成 長ホルモン分泌促進薬アゴニストおよびアンタゴニストについての調査のために 使用でき、特に、特定したリガンドの特異性をテストするために使用できる。 α、βおよびγサブユニットから成るヘテロ三量体Ｇタンパク質は、細胞表面 受容体から細胞内エフェクター（ホスホリパーゼＣおよびアデニル酸シクラーゼ など）へ情報を中継する役目をする。Ｇ−タンパク質αサブユニットは、受容体 −リガン ド相互作用によって活性化される細胞内シグナル伝達経路の必須成分である。リ ガンド誘導ＧＰＣＲ活性化のプロセスにおいて、三量体ＧαβγのＧαサブユニ ットは、その結合したＧＤＰをＧＴＰと交換し、βγヘテロ二量体から解離する 。解離したサブユニットは、しばしばβγ複合体と共同して、活性シグナル伝達 体として作用し、こうして細胞内シグナル伝達経路の活性化が開始される。定義 により、Ｇタンパク質相互作用を介して細胞内で共役している細胞表面受容体を ＧＰＣ−Ｒ′と言う。この相互作用は、主としてシグナル伝達プロセスに関与す るＧ−α（Ｇα）サブユニットの型に関して主に解析されている。Ｇαサブユニ ットは、配列の一致に基づいてサブファミリーに分類され、それらが結合するエ フェクターの主な型が解析されている。すなわち、Ｇ_s：アデニル酸シクラーゼ を活性化する；Ｇ_i/o/t：アデニル酸シクラーゼを阻害する；Ｇ_q/l1：ＰＩ−Ｐ ＬＣを活性化する；およびＧ_12/13：エフェクター未知である。 異種細胞におけるいくつかの受容体の発現は、ある種のＧαサブユニットの共 発現によって増加することが示されている。この観察により、ＧＨＳ−誘導され る機能応答がXenopus卵母 細胞系において測定できるかどうかを試験するための、ＧＨＳＲ源（ブタポリ〔 Ａ⁺〕ｍＲＮＡ）と共に、いくつかのサブファミリーのＧαサブユニットを使用 することの合理的な根拠が形成された。ＧＨＳ−誘導される応答が検出され、こ の系におけるＧα₁₁共発現に厳密に依存することが見いだされた。これは、相互 作用の特異性を概説する先例のない発見である。すなわち、本発明の別の側面は 、ＧＨＳＲも発現する細胞においてＧα₁₁タンパク質サブユニットを共発現させ 、細胞をＧＨＳにさらし、応答を検出することを含むＧＨＳ応答の検出法である 。 本明細書に記載するアッセイを使用して検出されるリガンドは、成長ホルモン 欠損症の子供、筋骨格障害がある年配の患者、股関節骨折からの回復期にある年 配の患者および骨粗鬆症において認められるような、成長ホルモンが不足してい るときに生じる症状の治療において使用できる。 ＧＨＳＲおよび断片は免疫原性である。すなわち、本発明の別の側面は、ＧＨ ＳＲまたはＧＨＳＲ断片に結合し得る抗体および抗体断片である。これらの抗体 は、モノクローナル抗体であってもよく、また、ハイブリドーマ技術または組換 え法を使 用して産生することができる。それらは、アッセイ系の一部として使用でき、ま たは細胞膜上に存在するＧＨＳＲの機能の推定に使用できる。 本発明のさらに別の側面は、ＧＨＳＲヌクレオチドに結合し、受容体の機能ま たは発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 本発明のさらに別の側面は、ＧＨＳＲをコードする核酸を細胞に導入し、ＧＨ ＳＲを発現させることを含む、細胞膜上のＧＨＳＲの量を増加させる方法である 。 ＧＨＳ受容体、好ましくは固体支持体上に固定したＧＨＳ受容体は、例えば成 長ホルモン分泌促進薬の治療を受けている患者における生理学的液体、例えば血 清などの体液、および組織抽出物中の成長ホルモン分泌促進薬またはその代謝物 の濃度の測定に対して診断的に使用できる。 ＧＨＳ受容体の患者への投与は、成長ホルモン分泌促進薬投与後の流れに沿っ たシグナルを増加させて、成長ホルモン分泌促進薬の必要用量を低下させること により成長ホルモン分泌促進薬の正味の効果を増加させ、または治療中の成長ホ ルモン分泌促進薬の過剰投与の影響を減少させるという目的に対しても 使用できる。 下記実施例によって本発明をさらに説明するが、下記実施例は本発明を限定す るものではない。 実施例１卵母細胞の調製および選択 Xenopus laevis卵母細胞を単離し、Arenaら、1991，Mol．Pharmacol．40，368 -374（引用により本明細書に組み入れる。）によって以前に記載された標準的方 法を使用して注入した。成熟した雌のXenopus laevisカエル（Xenopus One,Ann Arbor,MIから購入）を0.17％のメタンスルホン酸トリカインで麻酔し、卵巣を外 科的に取り出し、カルシウムの入っていないＯＲ−２培地（82.5mMのＮａＣｌ、 2mMのＫＣｌ、2.5mMのピルビン酸ナトリウム、1mMのＭｇＣｌ₂、100m/mlのペニ シリン、1mg/mlのストレプトマイシン、5mMのＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝7.5；Specialt y Media，NJ製のＮＤ−９６）を含む60mmの培養皿（Falcon）に入れた。卵巣葉 を開き、数回洗浄して、カルシウムを含まないＯＲ−２でコラゲナーゼＡ消化（ Boehringer-Mannheim;0.2％、18℃で２〜３時間）により嚢から卵母細胞を離し た。小胞層の約50％が取り出されると、Ｖお よびＶＩ期の卵母細胞を選択し、カルシウムを含むＮＤ−８６（86mMのＮａＣｌ 、2mMのＫＣｌ、1mMのＭｇＣｌ₂、1.8mMのＣａＣｌ₂、2.5mMのピルビン酸ナトリ ウム、0.5mMのテオピリン、0.1mMのゲンタマイシン、5mMのＨＥＰＥＳ〔ｐＨ＝7 .5〕）に入れた。注入の各回について、典型的には３〜５匹のカエルを、対照の Ｇ−タンパク質リンク受容体（ヒトゴナドトロピン放出ホルモン受容体）の発現 能力および活性あるホスホリパーゼＣ細胞内シグナル化経路の発生能力（ホスホ リパーゼＣの活性化によってカルシウム可動化を促進する１％のニワトリ血清と ともにインキュベート）について予備試験した。これらの結果に基づいて、通常 は卵母細胞単離の24〜48時間後の卵母細胞について１〜２匹のカエルをライブラ リープール注入（25ng（複合プール）〜0.5ng（純粋なクローン）の濃度の50nl のｃＲＮＡ）用に選択した。 実施例２ｍＲＮＡ単離 ブタ（50〜80kg、ヨークシャー株）下垂体（動物屠殺の１〜２分以内に液体窒 素で急速凍結）由来の全ＲＮＡを改良フェノール：チオシアン酸グアニジニウム 法（Chomczynskiら、1987， Anal.Biochem.162:156-159）により製造者（Molecular Research Center，Cinci nnati，OH）の指示に従ってＴＲＩ−試薬ＬＳを使用して調製した。典型的には 、5mgの全ＲＮＡが、湿重量3.5gの下垂体組織から得られた。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ をオリゴ（ｄＴ）セルロース（Pharmacia,Piscataway,NJ）上でのカラムクロマ トグラフィー（２回）によって全ＲＮＡから単離した。全ＲＮＡからのポリ（Ａ ）⁺ｍＲＮＡの収率は、通常は0.5％であった。他の組織からのＲＮＡも同様に単 離した。 実施例３ｃＤＮＡライブラリー構築 ｃＤＮＡの第一の鎖を、オリゴ（ｄＴ）／Not Iプライマー−アダプターとと もに製造者の指示に従ってＭ−ＭＬＶ ＲＮＡse(−)逆転写酵素(Superscript,G IBCO-BRL,Gaithersberg,MD)を使用してポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡから合成した。ｃＤ ＮＡの第二の鎖を合成した後、二本鎖ｃＤＮＡを次の工程にかけた。すなわち、 １）EcoR Iアダプターへの連結、２）Not I消化および３）大きいｃＤＮＡの濃 縮およびSephacryl S-500カラム(Pharmacia)上でのゲル濾過クロマトグラフィー による過剰なアダプターの除去である。高分子量ｃＤＮＡに対応する画分を、 EcoR I/Not I消化したｐＳＶ−７に連結した。ｐＳＶ−７は、トランスフェショ ン（ＳＶ−４０プロモーターにより駆動される）により哺乳類細胞で、およびin vitro転写産物（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターから開始される）を使用 して卵母細胞でクローン化ｃＤＮＡを発現することができる真核生物発現ベクタ ーである。ｐＳＶ−７は、ｐＳＧ−５(Stratagene，La Jolla，CA; Green，S.ら 、1988 Nucleic Acids Res．16:369)の多重クローニング部位を拡張した多重ク ローニング部位で置き換えることにより構築した。連結したベクター：ｃＤＮＡ を、1×10⁶pfu/10ng二本鎖ｃＤＮＡの形質転換効率で電気穿孔法により大腸菌株 ＤＨ１０Ｂ(GIBCO-BRL)に入れて形質転換した。ライブラリーは、約3×10⁶個の 独立クローンを含み、その95％以上が平均サイズが約1.65kb(0.8〜2.8kbの範囲) の挿入物を有していた。非増幅のライブラリーストックは、必要になるまで−70 ℃のグリセロール中で凍結した。ライブラリーのアリコートを固体状態法の改良 （Kriegler，M.，Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual Stockt on Press，NY 1990）によってスクリーニングする前に一度増幅した。ライブラ リーストックは、ＬＢプレート上で力価測定した後、500〜1000コ ロニーの同等物を、14mlの丸底ポリエチレン管（Falcon）において、0.3％のア ガロースおよび100mg/mlのカルベニシリンを含む13mlの2×ＹＴ培地に添加した 。細菌懸濁物を氷水浴で１時間氷冷して懸濁物を固化した後、垂直にて37℃で24 時間、増殖させた。得られた細菌コロニーを2000xg、室温で10分間遠心分離を行 うことにより採取し、3mlの2×ＹＴ／カルベニシリンに再懸濁させた。凍結スト ック（５％）およびプラスミドＤＮＡ調製用のアリコートを得た。 実施例４プラスミドＤＮＡ調製およびｃＲＮＡ転写 プラスミドＤＮＡを、製造者（Promega Biotech，Madison，WI）の指示に従っ てWizard Miniprepキットを使用して、固体状態で増殖させた細菌（各500個の独 立したクローンの1000プール）のペレットから精製した。14mlの固体状態増幅物 からのプラスミドＤＮＡの収量は5〜10mgであった。ｃＲＮＡ合成のための調製 では、4mgのＤＮＡをNot Iで消化し、得られた線状化したＤＮＡから、プロテイ ナーゼＫ処理(10mg、37℃で１時間)、続いてフェノール（ｘ２）、クロロホルム ／イソアミルアルコール（ｘ２）抽出およびエタノール沈殿（ｘ２） によって、タンパク質およびＲＮaseを除いた。ＤＮＡを、ＲＮaseを含まない約 15mlの水に再懸濁し、必要になるまで−70℃で保存した。ｃＲＮＡを改良したPr omega Biotech製のキットを使用して合成した。各50mlの反応物は、5mlの線状化 プラスミド（約1mg）、40mMのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝7.5）、6mMのＭｇＣｌ₂、 2mMのスペルミジン、10mMのＮａＣｌ、10mMのＤＴＴ、0.05mg/mlのウシ血清アル ブミン、２単位／mlのＲＮasin、各800mMのＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ、200mM のＧＴＰ、800mMのｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、80単位のＴ７ＲＮＡポリ メラーゼおよびＴＣＡ沈殿による合成ＲＮＡの定量のためのトレーサーとしての 約20,000cpmの³²Ｐ−ＣＴＰを含んでいた。反応は、30℃で３時間インキュベー トし、ＲＮaseを含まない20単位のＤＮaseを添加し、インキュベートを37℃でさ らに15分間行った。ｃＲＮＡをフェノール（ｘ２）、クロロホルム／イソアミル アルコール抽出およびエタノール沈殿（ｘ２）によって精製し、使用直前に、Ｒ Ｎaseを含まない水に500ng/mlの濃度で再懸濁した。 実施例５エクオリン生物発光アッセイ（ＡＢＡ）およびクローンの同定 ＡＢＡは、Ｇ−タンパク質αサブユニットＧα１１（2ng／卵）を補充したエ クオリンｃＲＮＡ（2ng／卵）を含むライブラリープールｃＲＮＡ（500〜10,000 のプールサイズに対して25ng/卵）の注入を必要とする。エクオリンおよびＧα_{1 1} プラスミドからの合成転写体の安定化を容易にするために、発現ベクターｐＣ ＤＮＡ−３をカセットの挿入(ポリリンカーのApa I制限酵素部位に挿入)により 改変して（ｐｃＤＮＡ−３ｖ２と言う）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター から開始する全てのｃＲＮＡ上にポリ（Ａ）域を付加した。このカセットは、（ ５’→３’へ）Bgl II部位、ｐＡ（20）およびプラスミドの線状化に使用できる Sfi I部位を含む。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、最適化したKos ak翻訳開始配列(Inouye，S.ら、1985，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:3154-31 58)を有するエクオリンｃＤＮＡのオープンリーディングフレームに対応するＤ ＮＡ断片を生成させた。このＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ−３ｖ２のEcoR I/Kpn I部位 でEcoR IおよびKpn Iにより線状化したｐＣＤＮＡ−３ｖ２に連結した。Ｇα₁₁ ｃＤＮＡをｐＣＭＶ−５ベクターからCla I/Not I断片として切り出し(Woon，C. ら、1989，J．Biol．Chem．264: 5687-93)、クレノウＤＮＡ ポリメラーゼで平滑末端にし、ｐｃＤＮＡ−３ｖ２のEcoR V部位に挿入した。ｃ ＲＮＡを、モーター付き「Nanoject」インジェクター（Drummond Sci．Co.，Bro omall，PA.）を使用して50nlの体積で卵母細胞に注入した。注入針は、Flaming/ Brownマイクロピペットプラー、Ｐ−８７型（Sutter Instrument Co）を使用し て１工程で引き抜き、鋭角が生じるように先端を53xの倍率を使用して折った。 針の外径は＜3mmである。注入後、卵母細胞をＮＤ−９６培地でインキュベート し、18℃の暗所で静かに旋回振とうを行った。卵母細胞を（異種ＲＮＡの発現に 必要な実験および時間に応じて）24〜48時間インキュベートした後、発現したエ クオリンに必須発色団のcoelenterazineを「充填」した。卵母細胞を3mlの充填 培地を含む35mmの皿に移し、18℃の暗所で静かに旋回振とうを行いながら２〜３ 時間インキュベートすることにより coelenterazineを卵母細胞に充填した。充 填培地は、ＯＲ−２培地(カルシウムを含まない)に10mMのcoelenterazine(Molec ular Probes，Inc.，Eugene，OR.)および30mMの還元グルタチオンを含んでいた 。次いで、卵母細胞を上記したカルシウム培地とともにＮＤ−８６培地に戻し、 生物発光測定を開始するまで旋回振とうを行いながら暗 所でインキュベートを続けた。卵母細胞におけるＧＨＳＲ発現の測定は、Autolu mat-PC Controlソフトウェア（Wallac Inc.，Gaithersburg，MD）を動かすＰＣ に連結したBerthold Luminometer LB953(Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)を使 用して行った。卵母細胞（単独または対）を、Ｃａ⁺⁺を含まない2.9mlのＯＲ− ２培地を含むプラスチック管（75×12mm、Sarstedt）に移した。各ｃＲＮＡプー ルを、卵母細胞を含む最低３本の管を使用して試験した。生物発光測定は、0.1m lの30mM ＭＫ−６７７の注入（最終濃度は1mM）によって惹起し、記録は、ＩＰ₃ −媒介応答と一致する動力学応答を観察するために、２分間続けた。 プールＳ10−20を、未分画のブタ下垂体ｃＤＮＡライブラリーから調製し、各 々1000クローンの10プールで構成した。Ｓ10−20は、２つの発光測定装置で正の シグナルを与え、次いで成分プールの活性を個々に試験した。1000クローンの10 プールからは、プールＳ271のみが正の応答を与えた。このプールは、P541およ びP542と命名した500クローンの２つのプールから作った。それらのプールの一 方のみ（P541）が、再び、1mMの化合物Ａの存在下で正の生物発光シグナルを与 えた。このと き、希釈物を100mg/mlのカルベニシリンを含むLB寒天プレート上にプレーテイン グして、１プレートにつき約50コロニーが生じる得るように、細菌の力価をP541 のグリセロールストックで測定した。全部で1527のコロニーを拾い上げ、34個の プレートから複製した。次いで、最初のプレート上のコロニーを洗い流し、プラ スミドを単離し、ｃＲＮＡを合成して、卵母細胞に注入した。34個のプレートの うち８個から調製したｃＲＮＡは、卵母細胞において正のシグナルを生じた。２ つのプレートを選択し、これらのプレートから個々のコロニーを増殖させ、プラ スミドを単離し、ｃＲＮＡを調製して卵母細胞に注入した。各プレートから１個 のクローナル単離物（クローン７−３および２８−１８と命名）が、1mMの化合 物Ａに対して正の生物発光応答を生じた。クローン７−３をさらに解析した。 実施例６受容体の解析 ＤＮＡ配列決定を両方の鎖について、自動化Applied Biosystems装置（ＡＢＩ モデル373）の使用により、およびSequenase II(US Biochemical，Cleveland，O H)を使用するジデオキシチェーンターミネーション法による手動で行った。 ＧＨＳＲヌクレオチドおよびタンパク質配列のデータベース研究(Genbank 88,EM BL 42,Swiss-Prot 31,PIR 40,dEST,Prosite,dbGPCR)、配列整列および分析は、 ＧＣＧ Sequence Analysis Software Package（Madison，WI; pileup、ペプチ ド構造およびモチーフプログラム）、FASTAおよびBLAST研究プログラム、ならび にIntelligenetics（San Francisco，CA;タンパク質分析プログラム）製のＰＣ ／Ｇeneソフトウェア一式を使用して行った。ノーザンブロット分析は、上記し たように調製した全（20mg/レーン）またはポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡ（5〜10mg/レー ン）を使用して行った。ＲＮＡを、2.2Mのホルムアルデヒドを含む1％アガロー スゲル上で分画し、ニトロセルロース膜に対してブロットした。サザンブロット は、クローン７−３(nt 291〜1132)によって予想されるＯＲＦの大部分を含むＰ ＣＲ発生プローブとハイブリダイズした。プローブは、10⁹dpm/mgより大きい比 活性になるように〔ａ〕³²Ｐ−ｄＣＴＰをランダムに入れることにより放射線標 識した。サザンブロットは、5×ＳＳＣ、5×デンハルト溶液、250mg/mlのｔＲＮ Ａ、1％のグリシン、0.075％のＳＤＳ、50mMのＮａＰＯ₄（ｐＨ６）および50％ のホルムアミド中、42℃で４時間、前ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼー ションは、5×ＳＳＣ、1×デンハルト 溶液、0.1％のＳＤＳ、50mMのＮａＰＯ₄（ｐＨ６）および50％のホルムアミド中 、42℃で20時間行った。ＲＮＡブロットを2×ＳＳＣ、0.2％のＳＤＳ中、42℃お よび−70℃で洗浄した。ＲＮＡサイズマーカーは２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡお よびin vitro転写したＲＮＡマーカー（Novagen）であった。いくつかの種に由 来するEcoR IおよびHind III消化したゲノムＤＮＡを含むナイロン膜（Clontech ; 10mg/レーン）を6×ＳＳＰＥ、10×デンハルト、1％のＳＤＳおよび50％のホ ルムアミド中、30℃で24時間ハイブリダイズさせた。ゲノムブロットを室温の6 ×ＳＳＰＥで２回、55℃の6×ＳＳＰＥで２回、および55℃の4×ＳＳＰＥで２回 洗浄した。ブタｃＤＮＡライブラリー（上述）由来の別のブタＧＨＳＲクローン を、スロット−ブロット装置（ScheicherおよびSchuell）においてナイロン膜に 固定したプラスミドＤＮＡ（各500クローンのプール中）にハイブリダイズさせ ることにより特定した。次いで、純粋なクローナル単離物をコロニーハイブリダ イゼーションによって特定した。さらに５’方向に伸長するブタＧＨＳＲクロー ンを、５’ＲＡＣＥ法(Frohman，M.A.，1993，Methods Enzymol．218:340-358， 引用により本明細書に組み入れる。)を使用し、ブタ下垂体ポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡ を鋳型として使用することによ り特定した。 実施例７ヒトＧＨＳＲ ブタＧＨＳＲのヒト下垂体相同体を製造者の指示に従ってベクターλＺＡＰII （Stratagene）中に構築した市販のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする ことにより得た。約1.86×10⁶のファージを最初にプレーティングし、ブタクロ ーン７−３(上述)のランダム−プライマー標識した部分をハイブリダイゼーショ ンプローブとして使用することによりスクリーニングした。２１の陽性クローン をプラーク精製した。これらのクローン由来の挿入物を、製造者（Stratagene） 記載のヘルパーファージとの共感染によってバクテリオファージからファージミ ドpBluescript II SKに切り出した。ヒトクローンを、ブタクローンについて上 述したように解析した。 実施例８アッセイ 哺乳類細胞（ＣＯＳ−７）を、Lipofectamine(GIBCO-BRL; Hawley-Nelson，P ．1993，Focus 15:73)を使用してＧＨＳＲ発現プラスミドによりトランスフェク ションした。トランスフェ クションは、60mmの皿中、８mgのLipofectamineおよび32mgのＧＨＳＲプラスミ ドＤＮＡとともに80%集密度の細胞（約4×10⁵細胞）上で行った。 ブタ下垂体膜およびＧＨＳＲ発現プラスミドでトランスフェクションしたＣＯ Ｓ−７細胞から調製した粗製膜への³⁵Ｓ−化合物Ａの結合を行った。ＣＯＳ−７ トランスフェクション産物由来の粗製細胞膜を氷上、48時間の後トランスフェク ションで調製した。各60mmの皿を3mlのＰＢＳで２回、1mlのホモジナイゼーショ ン緩衝液（50mMのトリス−ＨＣｌ〔ｐＨ7.4〕、5mMのＭｇＣｌ₂、2.5mMのＥＤＴ Ａ、30mg/mlのバシトラシン）で１回洗浄した。各皿に0.5mlのホモジナイゼーシ ョン緩衝液を添加し、細胞を破壊した後、Polytron装置（Brinkmann，Syosset， NY; 設定４で10秒のバースト３回）を使用してホモジナイズして細胞を除去した 。次いでそのホモジネートを、11,000xg、０℃で20分間遠心分離し、得られた粗 製膜ペレット（主に細胞膜および核を含む）を、0.06%のＢＳＡ(0.1ml/60mm皿) を補充したホモジナイゼーション緩衝液に再懸濁し、氷上で保持した。結合反応 を、20℃で１時間、0.1mlの膜懸濁物、10mlの³⁵Ｓ−化合物Ａ（0.05〜1nM；比活 性は約900Ci/mmol）、 10mlの競合薬および380〜390mlのホモジナイゼーション緩衝液を含む総量0.5ml 中で行った。結合した放射性リガンドを急速真空濾過（Brandel48−ウェル細胞 採取器）により、0.5％のポリエチレンイミンで１時間前処理したＧＦ／Ｃフィ ルターで分離した。フィルターに膜懸濁物を適用した後、そのフィルターは、氷 冷した50mMのトリス−ＨＣｌ〔ｐＨ7.4〕、10mMのＭｇＣｌ₂、2.5mMのＥＤＴＡ および0.015％のトリトンX-100から成る3mlで３回洗浄し、フィルター上の結合 した放射能をシンチレーション計数により定量した。特異的結合（全体の＞90％ ）は、全結合と50nMの標識していない化合物Ａの存在下で行った非特異的結合と の間の差として定義する。 実施例９比活性の高い放射性リガンド〔３５Ｓ〕−化合物Ａの調製 〔³⁵Ｓ〕−化合物Ａを、Dean DCら、1995，Allen J，Voges R(編)Synthesis a nd Applications of Isotopically Labelled Compounds，John Wiley & Sons，N ew York，pp．795-801の記載に従って塩化メタン〔３５Ｓ〕スルホニルを使用し 、適切な前駆体であるＮ−〔１（Ｒ）−〔（１，２−ジヒドロスピロ〔３Ｈ−イ ンドール−３，４’−ピペリジン〕−１’−イル）−カ ルボニル〕−２−（フェニル−メチルオキシ）エチル〕−２−アミノ−ｔ−ブト キシカルボニル−２−メチルプロパン−アミドから調製した。半調製ＨＰＬＣに よる精製（Zorbax SB-フェニルカラム、68％ＭｅＯＨ／水、0.1％ＴＦＡ、5ml／ 分）の後、ジクロロメタン中15％トリフルオロ酢酸を使用してＮ−ｔ−ＢＯＣ解 離（25℃、３時間）を行うと、ほぼ定量的収量で〔メチルスルホニル−³⁵Ｓ〕化 合物Ａが得られた。ＨＰＬＣ精製（Hamilton PRP-14.6×250mmカラム、1mMのＨ Ｃｌを含む50→75％の直線勾配のメタノール−水で30分間、1.3ml／分）により 、リガンドが＞99％の放射化学純度で得られた。構造は、標識していない化合物 ＡによるＨＰＬＣ共溶離およびマススペクトル分析により確立した。後者の方法 でも、約1000Ci/mmolの比活性が示された。 実施例１０ラット成長ホルモン分泌促進薬受容体（ＧＨＳＲ）Ｉａ型をコードするＤＮＡ ラットＧＨＳＲＩａ型を単離するために、低められたストリンジェンシーで行 う交差ハイブリダイゼーションの方法を利用した。一度増幅したラット下垂体ｃ ＤＮＡライブラリーの λｇｔ１１（RL1051b; Clontech，Palo Alto，CA）中約10⁶ファージプラークを 、大腸菌株Ｙ1090r^-上にプレーティングした。プラークを、最大強度Nytran(Sch leicher & Schuell，Keene，NH)に移し、変性させ、中和し、ブタＧＨＳＲのク ローン７−３の全コード領域および未翻訳領域を含む1.6kbのEcoRI/NotI断片を 用いてスクリーニングした。膜を30℃、前ハイブリダイゼーション溶液（50％ホ ルムアミド、2×デンハルト、5×ＳＳＰＥ、0.1％のＳＤＳ、100mg/mlのサケ精 子ＤＮＡ）中で３時間インキュベートした後、1×10⁶cpm/mlの〔³²Ｐ〕−標識し たプローブとともにハイブリダイゼーション溶液（50％ホルムアミド、2×デン ハルト、5×ＳＳＰＥ、0.1％のＳＤＳ、10％の硫酸デキストラン、100mg/mlのサ ケ精子ＤＮＡ）中で一夜インキュベートした。プローブは、ランダムプライミン グキット(Gibco BRL，Gaithersburg，ND)を使用して〔³²Ｐ〕ｄＣＴＰで標識し た。ハイブリダイズさせた後、ブロットを各2×ＳＳＣ、0.1％のＳＤＳで２回洗 浄した（24℃、次いで37℃、最後に55℃）。プラーク精製を３回行った後、１個 の陽性クローンが単離された。約200pfu/150mm皿の増殖を一夜行った後、ＧＨＳ Ｒを含むファージを1×λ緩衝液（0.1MのＮａＣｌ、0.01M のＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、35mMのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.5）によりプレートプラ ークから溶離させた。10,000xgで10分間遠心分離して破片を除去した後、ファー ジ溶液を24℃で30分間、1mg/mlのＲＮＡseＡおよびＤＮＡseＩで処理し、次いで 氷上で２時間、20％のＰＥＧ（8000）／2MのＮａＣｌにより沈殿させ、10,000xg で20分間遠心分離して採取した。ファージＤＮＡは、68℃で１時間、0.1％のＳ ＤＳ、30mMのＥＤＴＡ、50mg/mlのプロテアーゼＫ中でインキュベートし、次い でフェノール（３回）およびクロロホルム（２回）抽出した後、イソプロパノー ルで一夜沈殿させることにより単離した。ＧＨＳＲ ＤＮＡ挿入物（〜6.4kb） をλｇｔ１１からプラスミドベクターLitmus 28（New England Biolabs，Beverl y，MA）にサブクローン化した。2mgのファージＤＮＡを10分間65℃に加熱した後 、37℃で一夜、100単位のBsiWI(New England Biolabs，Beverly，MA)で消化した 。6.5kbの断片をゲル精製し、電気溶離してフェノール／クロロホルム抽出した 後、BsiWI消化したLitmus 28ベクターに連結した。 二本鎖ＤＮＡの両方の鎖の配列決定を、ABI PRISM染料ターミネーションサイ クルシークエンス法迅速反応キット（Perkin Elmer; Foster City，CA）を使用して ABI 373自動シークエンサー上で行った 。 ラットＧＨＳＲ Ｉａ型タンパク質配列をコードする完全なＯＲＦとヒトおよ びブタＧＨＳＲ相同体との比較により、配列の同一性が高いことが示された（ラ ット対ヒト：95.1％；ラット対ブタ：93.4％）。 配列の比較および機能的発現の研究のために、ラットＧＨＳＲＩａ型に対する 完全なＯＲＦ（介在配列はない）をコードする連続ＤＮＡ断片を生成させた。Ｐ ＣＲを利用してEcoRI（５’）およびHpaI（３’）制限部位を付加したMet-1から Val-260までのアミノ末端断片を合成し、カルボキシ末端断片は、DraI（５’） およびNotI（３’）制限部位を付加したLys-261からThr-364までを生成させた。 ＯＲＦ構築体は、EcoRI/NotI−消化ｐＳＶ７、EcoRI/HpaI−消化ＮＨ₂−末端断 片およびDraI/NotI−消化Ｃ末端断片と３回連結することにより、哺乳類発現ベ クターｐＳＶ７中で組み立てた。 ＯＲＦ構築体の機能活性は、60mmの皿で培養したエクオリン発現レポーターセ ルライン（293-AEQ17）に5mgのプラスミドＤＮＡをトランスフェクション（Iipo fectamine（GIBCO/BRL） を使用）することにより評価した。約40時間発現を行った後、細胞中のエクオリ ンにcoelenterazinneを２時間充填し、細胞を採取して洗浄し、低速遠心分離に よりペレット化して発光測定管に入れた。機能活性を、化合物Ａに依存する細胞 内カルシウムの可動化および同時に発生するカルシウムにより誘導されるエクオ リン生物発光を測定することにより求めた。図２６に示すように、３回ともサン プルは化合物Ａ誘導発光応答を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 カリー，ドリス・エフ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニュー・126 (72)発明者 フエイナー，スコツト・デイー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニュー・126 (72)発明者 ハワード，アンドリユー・デイー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニュー・126 (72)発明者 リベレイター，ポール・エイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニュー・126 (72)発明者 シエーフアー，ジエイムズ・エム アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニュー・126 (72)発明者 フアン・デル・プルーフ，レオナルドス アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニュー・126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．受容体同伴タンパク質を含まない、成長ホルモンファミリーの受容体のメン バーである受容体。 ２．受容体同伴を含まない、成長ホルモン分泌促進薬受容体。 ３．ヒトに由来する、請求項２に記載の成長ホルモン分泌促進薬受容体。 ４．ブタに由来する、請求項２に記載の成長ホルモン分泌促進薬受容体。 ５．ラットに由来する、請求項２に記載の成長ホルモン分泌促進薬受容体。 ６．受容体同伴タンパク質を含まない、成長ホルモン分泌促進薬関連受容体。 ７．単離した成長ホルモン分泌促進薬受容体。 ８．ヒトに由来する、請求項７に記載の成長ホルモン分泌促進薬受容体。 ９．ブタに由来する、請求項７に記載の成長ホルモン分泌促進薬受容体。 １０．ラットに由来する、請求項７に記載の成長ホルモン分泌 促進薬受容体。 １１．全長の受容体を含む、または図３もしくは５のいずれか一方に示すアミノ 酸配列を含む、請求項４または９に記載の受容体。 １２．図７、８、１０または２２のいずれか一つに示すアミノ酸配列を含む、請 求項３または８に記載の受容体。 １３．図２５に示すアミノ酸配列を含む請求項５または１０に記載の受容体。 １４．請求項１の受容体の機能的等価物。 １５．請求項２の受容体の機能的等価物。 １６．請求項６の受容体の機能的等価物。 １７．成長ホルモン分泌促進薬ファミリーの受容体のメンバーである受容体をコ ードする核酸であって、同伴する核酸を含まない核酸。 １８．成長ホルモン分泌促進薬受容体または機能的等価物をコードする核酸であ って、同伴する核酸を含まない核酸。 １９．ヒト成長ホルモン分泌促進薬受容体または機能的等価物をコードする請求 項１８に記載の核酸。 ２０．ブタ成長ホルモン分泌促進薬受容体または機能的等価物 をコードする請求項１８に記載の核酸。 ２１．ラット成長ホルモン分泌促進薬受容体または機能的等価物をコードする請 求項１８に記載の核酸。 ２２．成長ホルモン分泌促進薬関連受容体をコードする請求項１７に記載の核酸 。 ２３．ＤＮＡである、請求項１８に記載の核酸。 ２４．図１または４のいずれか一つに示す、請求項２３に記載の核酸。 ２５．図６、９または１１のいずれか一つに示す、請求項２３に記載の核酸。 ２６．図２３または２４のいずれか一方に示す、請求項２３に記載の核酸。 ２７．ＲＮＡである、請求項１８に記載の核酸。 ２８．成長ホルモン分泌促進薬ファミリーの受容体のメンバーである受容体をコ ードする核酸を含むベクター。 ２９．成長ホルモン分泌促進薬受容体または機能的等価物をコードする核酸を含 むベクター。 ３０．プラスミド、改変ウイルス、酵母人工染色体、バクテリオファージ、コス ミドおよび転位性要素から成る群から選択さ れる、請求項２９に記載のベクター。 ３１．核酸がヒト成長ホルモン分泌促進薬受容体または機能的等価物をコードす る、請求項２９に記載のベクター。 ３２．核酸がブタ成長ホルモン分泌促進薬受容体または機能的等価物をコードす る、請求項２９に記載のベクター。 ３３．核酸がラット成長ホルモン分泌促進薬受容体または機能的等価物をコード する、請求項２９に記載のベクター。 ３４．核酸が成長ホルモン分泌促進薬関連受容体をコードする、請求項２８に記 載のベクター。 ３５．請求項２８に記載のベクターを含む宿主細胞。 ３６．請求項２８に記載のベクターを含む宿主細胞。 ３７．核酸がヒト成長ホルモン分泌促進薬受容体または機能的等価物をコードす る、請求項３６に記載の宿主細胞。 ３８．核酸がブタ成長ホルモン分泌促進薬受容体または機能的等価物をコードす る、請求項３６に記載の宿主細胞。 ３９．核酸がラット成長ホルモン分泌促進薬受容体または機能的等価物をコード する、請求項３６に記載の宿主細胞。 ４０．ＧＨＳＲファミリーに属し、低められたストリンジェンシーでのハイブリ ダイゼーションにおいて、ヒト、ブタまたは ラットのいずれかのＧＨＳＲをコードするヌクレオチドとハイブリダイズするＧ ＰＣＲクローンをコードする核酸。