JPH11502122A

JPH11502122A - タンパク質生産および輸送

Info

Publication number: JPH11502122A
Application number: JP8528475A
Authority: JP
Inventors: ダグラスエイ．トレコ; マイケルダブリュー．ハートレイン; ブライアンエム．ヒュージ; リチャードエフ．セルダン
Original assignee: トランスカーヨティックセラピーズインク．
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1996-03-12
Publication date: 1999-02-23
Also published as: MY134810A; IL117468A0; ZA962116B; CA2215618A1; AU725832B2; AR003112A1; WO1996029411A1; EP0815232A1; AU5362596A; US6270989B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、相同組換えによって、トロンボポイエチン、DNase Ｉおよびβ-インターフェロンをコードする新規な遺伝子を生産するための、ヒトDNA配列、ターゲティング構築物および方法に関する。該ターゲティング構築物は、少なくとも(a)ターゲティング配列、(b)制御配列、(c)エクソンおよび(d)スプライス−供与部位を含む。該ターゲティング構築物は、新規遺伝子を形成するために内生の遺伝子配列と相同組換えをすることができる。したがって、該遺伝子の導入により、相同組換え細胞が生産される。該相同組換え細胞は、新規遺伝子の転写と生産されるmRNAの翻訳を可能にする条件下で維持され、結果として、トロンボポイエチン、DNase Ｉまたはβ-インターフェロンが生産される。本発明はさらに、相同組換え細胞からトロンボポイエチン、DNase Ｉまたはβ-インターフェロンを含む製薬的に有用な調製物を生産する方法、およびトロンボポイエチン、DNase Ｉまたはβ-インターフェロンを生産する相同組換え細胞を、治療目的にて患者に投与することよりなる遺伝子治療の方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質生産および輸送発明の背景現在行われている治療用タンパク質の投与による病気治療法には、タンパク質をインビトロで生産して従来の薬物輸送法（たとえば、静脈、皮下または筋肉注射、または鼻腔内または気管内へのエアロゾル投与）を用いる方法、および最近では遺伝子治療法がある。血小板の不全症の治療に有用と思われるタンパク質のひとつにトロンボポイエチン（TPO）がある。血小板は、小さい（直径２〜３ミクロン）、核をもたない細胞であり、血管の損傷部位に接着しそこで凝集することにより、一次止血に重要な役割を果たしている。加えて血小板は、血液凝固、炎症および癒傷過程の重要な構成要素である因子を放出する。循環血小板レベルが著しく低い（血小板減少症）患者では、軽度の外傷によって表面部（たとえば、皮膚、粘膜、尿生殖器系、および胃腸管）に出血を起こし、自然に起こる、または外傷に原因する大出血による死の危険にさらされている。血小板の医学的役割および血小板不全症の原因論については説明されている（cf.Hematology:Clinical and Laboratory Pr actice，Eds．R.L.Bickら、pp.1337〜1339、Mosby，St.Louis(1993); Harrison' s Principles of Internal Medicine，Eds，J.D．Wilsonら、11th Ed.，pp．150 0〜1505，McGraw Hill，New York，1991）。血小板減少症は、骨髄による血小板生産の減少、脾臓における血小板の腐骨形成、または血小板破壊の加速により起こるのかもしれない。骨髄による血小板生産の減少は、放射線照射、またはガン治療中の細胞毒性薬物の投与による造血前駆細胞の破壊が原因かもしれない。加えて、アルコール、エストロゲン、およびチアジド利尿剤が血小板生産を抑制する可能性がある（薬物誘発性血小板減少症）。さらに、悪性細胞の骨髄への浸潤、先天性非巨核球形成不全（congenital a megakaryocytic hypoplasia）、およびとう骨（radii）のない血小板減少症（TA R症候群）も、血小板生産の低下を引き起こす可能性がある。血小板の脾臓腐骨形成の増進は、肝臓病、脊髄増殖性またはリンパ球増殖性の不全症の場合のような腫瘍細胞の脾臓への浸潤、およびGaucher病など、さまざまな症状を伴う脾腫の結果として起こるかもしれない。血小板破壊の加速および血小板減少症は、血管炎、溶血性尿毒症、多発性血管内凝固、および血管内に心臓弁などの補綴器具があることなどに起因する場合もある。加えて、ある種のウイルス性感染症、薬物、および自己免疫不全症も免疫性の血小板減少症につながる。この場合、血小板は抗体、免疫複合体、または補体に表面を覆われ、急速に循環系から消滅していく。サルファチアゾール、ノボビオシン、ディジトキシン、含砒剤、およびメチルドーパを含む多くの薬物が免疫反応を導き、免疫性の血小板減少症を起こす可能性がある。血小板減少症は、現在では血小板濃縮物の輸液で治療されることがもっとも多いが、免疫性の血小板減少症の場合には副腎皮質ステロイド療法または血漿瀉血（プラズマフェレーゼ）も有効である。血小板濃縮物による治療は適当なドナーが得られるか否かで厳しい制限があり、また血液に起因する感染症の危険性もある。輸液による治療に代わる方法として、血小板不全症は、核を有する前駆体細胞であり血小板に変化する巨核細胞の増殖と成熟を促進する造血性成長因子により治療できる可能性がある。最近では、巨核細胞を作り出す活性を示す形成不能の（aplastic）ブタ血漿より精製されたタンパク質の類似体をコードするcDNAが、ヒト、マウス、およびイヌで単離された（de Sauvage，F．J.ら、Nature 369:53 3〜538(1994); Lok，S．ら、Nature 369: 565〜568(1994); Bartley，T.D.ら、C ell 77:1117〜1124(1994)）。コードされているタンパク質、トロンボポイエチン（TPO）は、巨核細胞の増殖と成熟を刺激し、実験動物に注射すればインビボで血小板生産を誘導する。治療上の特性を有する他のタンパク質の生産と輸送の方法が必要である。たとえば、組換えβ-インターフェロンは再発-緩解を繰り返す多発性（multiple）硬化症の患者の悪化に有効な薬である（MS; Kelly，C.L.およびSmeltzer，S.C．J. Neuroscience Nursing 26:52〜56(1994)）。さらに、非感染の培養ヒト繊維芽細胞より単離したβ-インターフェロンが、急性非A非B型肝炎が慢性疾患に進行するのを防ぐための効果的な手段であると報告されている（Omata M.ら、Lancet 3 38:914〜915(1991)）。別の例として、組換えヒトDNase Iに、繊維症（CF）患者の唾液の粘性の低下（Shak，S.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:9188〜9192）、およびCF患者の肺機能の改善や呼吸器不全の悪化を抑制する効果があることが示されている（Fu chs，H.J.ら、New Engl．J．Med．331:637〜642(1994)）。さらに、DNase Iは、慢性気管支炎や肺炎など他の呼吸器不全の患者においても呼吸機能の改善に効果があることが示唆されている（Shak，S.ら、op．cit.）。 TPO、β-インターフェロン、およびDNase Iが、たとえば、血小板減少症、MS 、およびCFの治療においてそれぞれ有効である一方、先行技術で開示された遺伝子工学技術を用いる治療用タンパク質の生産は、適当なプロモーターの制御のもとで外来のクローン化遺伝子またはcDNAを発現する哺乳類の細胞から組換えタンパク質を精製するという、従来の組換えDNA手法に限られている。目的のタンパク質をコードする外来DNAはウイルスベクター、環状プラスミドDNAまたは線状DN A断片の形で細胞に導入される。Chinese Hamster Ovary（CHO）細胞系およびそれに由来する細胞系（Gottesman，M.，M.Meth．Enzymol．151:3〜8(1987)）またはNSOなどのマウス細胞系（Galfre，G.およびMilstein，C.，Meth．Enzymol．73 (B):3〜46(1981)）、またはP3X63Ag8.653（Kearney，J.ら、J．Immunol．123:15 48〜1550(1979)）が一般に使用される。こうしてヒトの治療用タンパク質は、ヒト以外の起源を有する細胞から発現、精製することにより生産される。多くの場合、ヒトの治療用タンパク質はヒトの細胞から生産するのが望ましい。たとえば、タンパク質の糖化パターンが通常ヒト細胞で見いだされるパターンと似ていることが求められる場合などである。加えて、ヒト細胞内でのヒトタンパク質の発現は、症状を緩和、または病気を治すために、患者の細胞に手を加えて目的の治療用タンパク質を生産させるという、遺伝子治療法の開発において重要である。明らかに、これらのヒトタンパク質をヒト細胞内で生産するための新しい方法が開発されれば、治療上有効な広範囲の生産物が得られるようになり、患者に恩恵をもたらすことになると考えられる。この目的を達するために、当技術分野の研究者が提案する方法の一つは、相同組換え、またはジーン・ターゲティングを利用してクローン化した外来性の制御因子（すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を細胞のゲノム上のあらかじめ選んでおいた部位に導入し、制御因子が近傍の遺伝子の発現を活性化し、最終的にその遺伝子にコードされるタンパク質を生産させる、というものである。この方法は、米国特許第5,272,07 1号および国際公開公報第91/06666号、第90/11354号に示されている。発明の概要本明細書に説明するのは、新規の転写単位を細胞内ゲノム中に作成してTPO、D Nase I、およびβ-インターフェロンを生産するための新しい方法で、当技術分野の既存の方法とは劇的に異なっており、哺乳類細胞内での発現を行えることが大きな利点である。この方法は、外来の調節配列、コードするまたはコードしない外来のエクソン、およびスプライシング供与部位を、ゲノム内のあらかじめ選択した位置に、相同組換えにより導入することができる、という事実に基づいている。生じた細胞は標的（targeted）細胞または相同組換え細胞と呼ばれる。導入するDNAの位置は、外来の調節領域による調節のもとで、転写産物が外来のエクソン、およびTPO、DNase Iまたはβ-インターフェロン遺伝子に存在する内生のエクソンの両方を含むように決めるため、転写産物内で外来および内生のエクソンが機能的に結合される。相同組換えにより作りだされた新規の転写単位は、 TPO、DNase Iまたはβ-インターフェロンをコードする、元からある内生のエクソンを用いることにより、これらと同起源のコード配列を少しも導入することなく、これらのタンパク質のヒト細胞内での生産を可能にする。本発明はさらにインビトロでのTPO、DNase Iまたはβ-インターフェロン生産のための、および、遺伝子治療によるTPO、DNase Iまたはβ-インターフェロンの生産と輸送を行うための、改良した材料および方法にも関する。本発明の方法は、遺伝子の活性化によるTPO、DNase Iまたはβ-インターフェロンの生産を教えるものであるが、対応するタンパク質をコードするDNA配列はこれらのタンパク質をコードする外来DNAを細胞に感染させるというものではない。そのかわりに、これらの遺伝子のひとつの上流にある非コード配列、もしくは遺伝子の内部にあるコードまたは非コード配列を用い、遺伝子ターゲティングによって新規の転写単位を作りだし、TPO、DNase Iまたはβ-インターフェロンを発現させる。TPO、DNase Iまたはβ-インターフェロン遺伝子の上流の配列、ヒトTPO、 DNase Iまたはβ-インターフェロン遺伝子の内部にある非コード配列（イントロンおよび5’末端非翻訳配列）、およびこれらの配列をTPO、DNase Iまたはβ-インターフェロンの生産に利用する方法を明らかにすることが本発明の目的である。本明細書に説明する方法は、外来および内生のエクソンが機能的に結合された新規の遺伝子を作り出すことにより、TPO、DNase Iまたはβ-インターフェロンタンパク質生産を教えるものである。外来の構成因子を細胞の染色体DNAに導入する結果、内生の遺伝子にコードされるタンパク質の発現が活性化される。遺伝子発現を別の形で変化させること、たとえば元のままの細胞内で発現する遺伝子の発現を増加したり、調節や誘導のパターンを元の細胞内とは異なるように変えたり、また元の細胞で発現する遺伝子の発現を低下（または停止）させたりといったことも実現できるかもしれない。たとえば、インビトロでのタンパク質生産を行うことが望ましい場合、またはTPO、DNase Iまたはβ-インターフェロン以外のタンパク質を、これらのタンパク質を自然に生産するタイプの細胞を用いて生産して遺伝子治療を行う場合などである。こういった状況では、TPO、DNase I またはβ-インターフェロンの発現を停止させることが望ましいと思われる。本発明はさらに、TPO、DNase Iまたはβ-インターフェロン遺伝子を活性化する方法に有用なDNA構築物にも関する。このDNA構築物は以下のものを含む；(a) 標的配列；(b)調節配列；(c)エクソン；および(d)対合していないスプライシング供与部位。このDNA構築物中の標的配列は、目的の遺伝子の内部および／または上流に存在する染色体DNAに由来し、因子(a)〜(d)の組み込みを導いて、因子( b)〜(d)を目的の内生遺伝子の配列に機能的に結合させる。別の態様では、DNA構築物は以下のものを含む：(a)標的配列、(b)調節配列、(c)エクソン、(d)スプライシング供与部位、(e)イントロン、および(f)スプライシング受容部位。このDN A構築物においては標的配列は目的の遺伝子の内部および／または上流に存在する染色体DNAに由来し、因子(a)〜(f)の組み込みを導き、因子(b)〜(f)を目的の内生遺伝子に機能的に結合させる。標的配列は、細胞の染色体DNA上の、TPO、β -インターフェロンまたはDNase I遺伝子の上流にあらかじめ選択された部位と相同であり、そこで相同組換えが起こる。この構築物においては、エクソンは通常調節配列の3’側であり、スプライシング供与部位はエクソンの３’側である。このタイプの構築物は係属中の米国特許出願第07/985,586号および米国特許出願第08/243,391号に開示されており、全て本明細書に参考文献として示されている。以下は、TPO遺伝子の上流配列を改変して、元の非感染状態においてはTPOを検出可能量発現しない一次、二次、または不死化細胞内でTPOを発現させるという、本発明の２つの態様についての説明である。態様１（図１）においては、標的とする構築物は２つの標的配列を含んでいる。第一、第二の標的配列ともに、TP Oをコードする領域の上流の配列と相同であり、第一の標的配列は第二の標的配列の５’側に位置している。標的とする構築物には調節領域、エクソン（この場合には非コード配列を含み、CAP部位から始まる）、および対合しないスプライシング供与部位も含まれている。TPOを生産する新規の転写単位を作り出す相同組換えの現象を図１に示す。態様２（図２）においても、標的となる構築物は２つの標的配列を含む。第一の標的配列は、内生のTPOコード領域の上流配列に相同であり、第二の標的配列はTPO遺伝子の第二のイントロンに相同である。標的となる構築物には、調節領域、エクソン（この場合にはヒト成長ホルモン（hGH）遺伝子由来のコードするエクソン）、および対合しないスプライシング供与部位も含まれる。TPOを生産する新規の転写単位を作り出す相同組換え現象を図２に示す。これら２つの態様において、ターゲティングの産物は、外来のエクソンが、内生TPO遺伝子のエクソン２（態様１）またはエクソン３（態様２）の上流に位置づけられた成熟mRNAを生成する新規の転写単位である。転写、スプライシング、翻訳および翻訳後のシグナルペプチド開裂の結果生じるのが、成熟TPOである。態様１および２は、挿入されるターゲティング構築物の調節配列の相対的な位置、およびプロセシングを受けた最終的な転写産物の生産に必要なスプライシングのパターンが異なっている。本発明はさらに、構築物を上記の通り、宿主細胞の染色体DNAに相同組換えにより導入して相同組換え細胞を作り出すことにより、T PO、β-インターフェロンまたはDNase Iを、インビトロで、またはインビボで生産する方法に関する。相同組換え細胞は次に、TPO、DNase Iまたはβ-インターフェロンを転写、翻訳および分泌できる条件下に維持される。本発明はさらに、相同的組換え細胞を産生するために、相同的組換えにより宿主細胞の染色体DNAへ上記の構築物を組み込むことにより、TPO、β-インターフェロン、またはDNase Ｉをインビトロもしくはインビボで産生する方法に関する。その後、相同的組換え細胞は、転写、翻訳およびTPO、β-インターフェロン、またはDNase Iの選抜の条件下で維持される。本発明はまた、TPO、β-インターフェロンまたはDNase Iの生産に有用な、相同組換えを起こした一次または二次細胞（すなわち、非不死化細胞）および相同組換えを起こした不死化細胞などの細胞、これらの細胞を作る方法、これらの細胞をインビトロのタンパク質生産に利用する方法、および遺伝子治療の方法に関する。本発明の相同組換え細胞は、脊椎動物、とくに哺乳類、とくにヒトを起源とするものである。本発明の方法により作り出された相同組換え細胞は、相同組換え細胞に目的の遺伝子を高レベルで、または対応する細胞の相同組換えを起こしていない状態とは異なる調節または誘導パターンにより、発現させる外来のDN Aを含む。ひとつの態様においては、活性化されたTPO、β-インターフェロン、またはDN ase I遺伝子は、選択マーカー遺伝子を含めることによりさらに増幅することができる。選択マーカー遺伝子とは、何コピーも増幅された選択マーカー遺伝子を含む細胞を、適当な選択薬物の存在のもとで細胞を培養することにより、選抜できるようにするという性質を有する。活性化された遺伝子は、増幅可能な選択マーカーとともに、同一方向につながって増幅される。活性化された遺伝子を多コピー含む細胞はインビトロタンパク質生産、および遺伝子治療に有用である。本発明の相同組換え細胞は、ヒトおよび動物でさまざまに応用できる。ひとつの態様においては、細胞をヒトまたは動物に移植して、ヒトまたは動物でタンパク質の輸送を行わせることができる。たとえば、TPO、DNase I、またはβ-インターフェロンをヒトにおいて系統的にまたは局所的に輸送することができ、病気の治療（TPOは血小板減少症、DNase IはCF、またはβ-インターフェロンはMSの治療）において治療上の恩恵をもたらす。加えて、非ヒト細胞由来のTPO、DNase Iまたはβ-インターフェロンを発現する、相同組換え非ヒト細胞を作成できるかもしれず、TPO、DNase I、またはβ-インターフェロンを発現するヒトまたは非ヒト細胞は、防護機器（barrier devices）内に封じ込めてヒトまたは動物に移植し、治療に用いることができるかもしれない。図面の簡単な説明図１は、新規の転写単位を作り出すことにより、TPO遺伝子を転写段階で活性化するための戦略の図解である；太線：標的配列；細線：イントロンおよび５’ 上流領域；格子模様の四角：調節配列；斑点の四角：エクソン配列の非コード部分；黒四角：エクソン配列のコード部分；白抜き四角：スプライシング部位。標的となる構築物内の、外来エクソンのスプライシング供与部位（SD）、および外来エクソンのスプライシングに関与する、TPOエクソン２に隣接するスプライシング受容部位（SA）を示す。図２は、新規の転写単位を作り出すことにより、TPO遺伝子を転写段階で活性化するための戦略の図解である；太線：標的配列；細線：イントロン１および５ ’上流配列；格子模様の四角：調節配列；斑点の四角：エクソン配列の非コード部分；黒四角：エクソン配列のコード部分；白抜き四角：スプライシング部位。標的となる構築物内の、外来エクソンのスプライシング供与部位（SD）、および外来エクソンのスプライシングに関与する、TPOエクソン３に隣接するスプライシング受容部位（SA）を示す。図３は、ヒトトロンボポイエチン（TPO）遺伝子の５’隣接領域およびエクソン１、２、および３を含む、6,943塩基対のゲノムXbaI断片を示す。XbaI断片を実線で示し、エクソン１、２、および３を黒塗りの四角で示す。ApaI、BamHI、H indIII、EcoRI、NotI、SfiIおよびXbaI認識配列を示す。塩基にはhTPO ATG開始コドンから番号を振った。図４A〜４Dは、既知のcDNA配列（de Sauvageら、op．cit.）の５’側に存在するヒトTPO座の4,488塩基対のゲノムDNAの塩基配列（配列番号３）を示す。塩基数をそれぞれの線の最初に示す。番号はATG開始コドンの位置を１として振った（図５A〜５B参照）。塩基が不明な部分は、以下の記号で示した；R=AまたはG（プリン）；H=A,C,またはT；V=A,C,またはG；N=A,C,G,またはT；K=GまたはT；S=G またはC；W=AまたはT。ApaI、BamHI、HindIII、NotI、SfiIおよびXbaIならびにそれらに対応する塩基の位置は、上記の配列に示した。図５A〜５Bは、既知のcDNA配列（de Sauvageら、op．cit.）の５’末端の位置から下流に伸びた、ヒトTPO座の2,455塩基対のゲノムDNAの塩基配列（配列番号４）を示す。塩基の番号はそれぞれの線の最初に示す。番号はポジション１のAT G開始コドンに基づいて振った。エクソン１、イントロン１、エクソン２、イントロン２、エクソン３、およびイントロン３の一部を示す。エクソン１、２、および３は下線で、およびエクソン２、および３のコード部分は下線を引いたトリプレットで示す。イントロンとエクソンの境界は、報告されているcDNAの配列から推定した（deSauvageら、op．cit.）。ApaI、EcoRI、およびXbaIの認識部位、ならびにそれらに対応する塩基の位置を上記の配列に示す。図６は、例２に説明する、標的となる構築物pTPO1を用いたヒトTPO遺伝子の活性化のための戦略の図解である。dhfrおよびneoマーカーの位置、外来のCMVプロモーターおよびTPOエクソン１〜３を示す。太線：標的配列；細線：イントロンおよび５’上流領域；格子模様の四角：CMVプロモーター；斑点の四角：エクソン配列の非コード部分；黒四角：エクソン配列のコード部分；白抜き四角：スプライシング部位。標的となる構築物内の外来エクソンのスプライシング供与部位（SD）、およびTPOエクソン３に隣接して外来エクソンのスプライシングに関与するスプライシング受容部位（SA）を示す。標的となる構築物の構築に関係する BamHI（B）、NotI（N）、ClaI（C）、XhoI（X）、およびXbaIの認識部位に印を付けた。図７は、例２に説明する、標的となる構築物pTPO2を用いたヒトTPO遺伝子の活性化のための戦略の図解である。dhfrおよびneoマーカー、外来CMVプロモーターおよびTPOエクソン１〜３の位置を示す。太線：標的配列；細線：イントロンおよび５’上流領域；格子模様の四角：CMVプロモーター；大きい斑点の四角：CMV IE遺伝子エクソンの非コード部分；小さい斑点の四角：TPOエクソン２および３配列のコード部分；白抜き四角：スプライシング部位。標的となる構築物内の非コードエクソンに隣接するスプライシング供与部位（SD）およびスプライシング受容部位（SA）、およびTPOエクソン２に隣接して、３’外来エクソンの対合していないスプライシング供与部位までのスプライシングに関与するスプライシング受容部位（SA）を示す。標的となる構築物の構築に関係するBamHI（B）、Hind III（H）、NotI（N）、ClaI（C）、SalI（S）、EcoRI（R）およびXbaI認識部位に印を付けた。図８は、例２に説明する、標的となる構築物pTPO3を用いたヒトTPO遺伝子の活性化のための戦略の図解である。dhfrおよびneoマーカー、外来CMVプロモーターおよびTPOエクソン１〜３の位置を示す。太線：標的配列；細線：イントロンおよび５’上流領域；格子模様の四角：CMVプロモーター；斑点の四角：TPOエクソン１および２のエクソン配列の非コード部分；黒四角：エクソン配列のコード部分（標的となる構築物内および新規の転写単位内のhGHエクソン１に対応するエクソンコード部分に印を付けた）；白抜き四角：スプライシング部位。標的となる構築物内の外来エクソンのスプライシング供与部位（SD）、およびTPOエクソン３に隣接して外来エクソンのスプライシングに関与するスプライシング受容部位（SA）を示す。標的となる構築物の構築に関係するBamHI（B）、HindIII（H）、ClaI（C）、XhoI(X)、EcoRI（R）およびXbaI認識部位に印を付けた。図９は、ヒトDNase I遺伝子の５’隣接領域、エクソン１および２、ならびにエクソン２の下流の配列を含む約8kbのHincII断片の図解である。HincII断片を実線で示し、エクソン１および２をsolidの長方形で示す。ApaI、BamHI、HincII 、EspI、SphI、およびSmaI認識部位を示す。塩基にはAUG開始コドンから番号を振った。エクソン２の上流に位置する塩基の位置は図１０および１１に示すDNA 配列に基づいている。図１０A〜１０Bは、既知のcDNA配列（Shak,S.ら、op．cit.）の５’側に存在するヒトDNase I座の4,042塩基対を含むDNAの塩基配列（配列番号１７）を示す。塩基の番号はそれぞれの線の最初に示した。番号は、ポジション１（図１１参照）のATG開始コドンに基づいて振った。ApaI、BamHI、HincII、EspI、およびSp hIの認識部位、および対応する塩基の位置を上記の配列に示す。図１１は、既知のcDNA配列（Shak,S.ら、op．cit.）の５’末端から下流に伸ばしたヒトDNase I座の810塩基対のDNAの塩基配列（配列番号１８）を示す。エクソン１、イントロン１、およびエクソン２の一部を示す。エクソン１および２の配列は下線を引き、コード部分の配列は下線を引いたトリプレットで示す。CA P部位と思われる位置、およびAUG開始コドンを示す。イントロンとエクソンの境界は、報告されているcDNAの配列（Shak,S.ら、op．cit.）から推定した。図１２は、相同組換えによるヒトDNase Iの活性化のための戦略を示す。標的断片はpDNaseI由来の4633塩基対のBamHI断片で、以下のものを含む；第1162塩基（BamHI部位）から第860塩基（Apal部位）の283塩基対の５’標的配列、増幅可能なdfhr発現単位、neo遺伝子、CMV IEプロモーター、CAP部位、ノンコドン(non -codon)エクソン、対合しないスプライシング供与部位および第860塩基（EspI部位）から第468塩基（BamHI部位）までの363塩基対の標的配列。dfhr発現単位およびneo遺伝子は白抜き矢印でしめし、その向きは転写の方向を表す。CMVプロモーター、TATAボックス、CAP部位およびスプライシング供与配列（SD）の位置を示す。標的断片を宿主となる細胞のゲノムに相同組換えで導入することにより、 DNase I遺伝子が活性化される。標的遺伝子の産物を図の下方のパネルに示す。非コード５’エクソン、DNase I遺伝子のキメラのイントロンおよびエクソン２を含むmRNA前駆体を細い矢印で示す。図１３は、ヒトβ-インターフェロン遺伝子の５’隣接領域、コード領域および３’非翻訳領域を含む9,939塩基対の図解である。５’および３’隣接領域をは実線で示し、翻訳領域をsolidの四角で示す。BalI、BglII、EcoRIおよびPvuII 認識配列の塩基の位置を示す。塩基はβ-インターフェロンのATG翻訳開始コドン（図１５参照）から番号を振った。図１４A〜１４Gは、既知の配列（GenBank HUMIFNB1F）の５’側に存在する、ヒトβ-インターフェロン座の8,355塩基対のDNAの塩基配列（配列番号23）を示す。塩基数はそれぞれの線の最初に示す。番号は、ATG開始コドンの位置を１として振った（図１５参照）。BglII、EcoRIおよびPvuII認識部位ならびにそれらに対応する塩基の位置を上記の配列に示す。図１５A〜１５Bは、既知の配列（GenBank HUMIFNB1F）の５’末端より下流に伸ばした、ヒトβ-インターフェロン座の1,584塩基対のDNAの塩基配列（配列番号24）を示す。塩基数はそれぞれの線の最初に示す。番号は、ATG開始コドンの位置を１として振った。翻訳領域は下線を引き、コード配列は下線を引いたトリプレット（３文字表記）で示す。CAP部位およびAUG開始コドンの位置を示す。Ba lI、BglIIおよびPvuIIの認識部位およびそれらに対応する塩基の位置を上記の配列に示す。図１６は、例７に説明する、標的となる構築物pIFNb-1を用いた相同組換えによるヒトβ-インターフェロン遺伝子の活性化の戦略の説明図である。TATAボックス、CAP部位、dhfrおよびneoマーカー、外来CHVプロモーター、およびβ-インターフェロン５’隣接領域およびコード配列の位置を示す。太線：標的配列；細線：イントロン、β-インターフェロン５’および３’非コード配列；黒塗りの四角：CMVプロモーター；斜線の四角：内生β-インターフェロン翻訳領域；格子模様の四角：非コードのCMVエクソン１およびキメラのエクソン２。外来エクソンのスプライシング供与部位（SD）およびキメラのエクソン２に隣接したスプライシング受容部位（SA）を示す。標的となる構築物の構築に関係するBamHI、Eco RI、HincII、NdeIおよびPvuIIの認識部位に印を付けた。発明の詳細な説明以上に述べた本発明は、内生のTPO、DNase Iまたはβ-インターフェロン遺伝子を活性化することにより、ヒト細胞内でTPO、DNase I、またはβ-インターフェロンを発現させるための方法に関する。本発明では、相同組換えを利用して、調節領域、エクソン、およびスプライシング供与部位を、TPO、DNase Iまたはβ -インターフェロンをコードする内生エクソンの上流に挿入し、生じた相同組換え細胞内で働く新規の転写単位を作り出す。本発明はさらに、この方法により作成された相同組換え細胞、およびこれらの相同組換え細胞の利用にも関する。関連する態様では、活性化されたTPO、DNase Iまたはβ-インターフェロン遺伝子は活性化された後に増幅され、活性化された遺伝子の発現が促進される。本発明は、細胞内における目的の内生遺伝子の調節または活性は、その転写産物において外来および内生のエクソンが結合して外来プロモーターの支配下におかれるような新規の遺伝子を創出することにより改変できる、という発見に基づいている。この方法は、以下のものを含むDNA構築物を、細胞のゲノム内のあらかじめ選択された部位に、相同組換えにより挿入することにより実践されている：(a)ひとつ以上の標的配列；(b)調節配列；(c)エクソンおよび(d)標的配列が目的の内生遺伝子の内部および／または上流の染色体DNAに由来し、因子(a)〜(d) の組み込みを導いて因子(b)〜(d)を内生遺伝子に機能的に結合させるための、対合していないスプライシング供与部位。もう一つの態様では、DNA構築物は以下のものを含む：(a)ひとつ以上の標的配列、(b)調節配列、(c)エクソン、(d)スプライシング供与部位、(e)イントロン、および(f)標的配列が目的の内生遺伝子の内部および／または上流の染色体DNAに由来し、因子(a)〜(f)の組み込みを導いて因子( b)〜(f)を内生遺伝子の最初のエクソンに機能的に結合させるための、スプライシング受容部位。本発明は特に、標的となる構築物の構築に使用しうる新規のDNA配列に関する。TPO、およびDNase I遺伝子の翻訳領域の内部および上流の、およびβ-インターフェロン遺伝子の翻訳領域上流の非コードゲノムDNA配列は、今回初めてクローン化され説明されている。これらの配列またはこれらの配列を含むDNA断片は、相同組換えによる遺伝子活性化に有用なDNA構築物内の標的配列として使用できるかもしれない。概して、標的配列は最低約20塩基対の長さを有する。配列の長さは、目的のゲノムDNA配列との相同組換えを選択的に促進するように決定される。ゲノムDNAの配列を解析し既知のcDNA配列と比較することにより、標的となる構築物の構築に不可欠な特性が明らかとなる。たとえば、ヒトTPO遺伝子の第一のエクソンが完全に非コードであること、また翻訳が内生遺伝子の第二のエクソンの内部で開始されることが、初めて示されている。この情報は、本明細書に説明した遺伝子活性化用構築物の設計のために重要である。この構築物においては、外来エクソンから内生の第二のエクソンまでスプライシングされるよう、外来のエクソンが非コードであるか、または、外来のコードエクソンをスプライシングするために、TPO遺伝子の内生の第３のエクソンまでスプライシングされるような位置に、外来のコードエクソンが挿入されるようにターゲティングを行う必要がある。さらに、ヒトTPO遺伝子の上流の約6.3kbのDNA配列のクローン化により、遺伝子活性化用構築物の開発に有用な標的配列が得られている。図４は、既知のcDNA配列（de Sauvage，F．J.ら、op．cit）の５’側に存在するヒトTPO座の約4.5kbの新規のDNA配列を示す。図５は既知のcDNA配列の５’側境界から３’ 方向に伸ばした、ヒトTPO座の約2.5kbのDNA配列を示す。図５のイントロンの配列（第1815〜145塩基、第14〜245塩基、および第374〜570塩基の位置）は新規である。図４および５の新規の配列を含むDNA構築物、またはこれらの配列に由来する断片は、本明細書に開示した通り相同組換えに有用である。同様に、ヒトDNase I遺伝子の第一のエクソンが全く非コードであることが初めて示されている。この情報は、本明細書に説明した標的となる構築物の設計に重要である。たとえば、例５には、イントロンで区切られた２つの非コードエクソンを含むターゲティング構築物で、DNase Iのエクソン１の上流に挿入されるものについて説明されている。このように配置することにより、外来のイントロン、または外来エクソンおよび内生の第二のエクソンの間にあるイントロンの長さを変えることで、プロモーターの位置を最適化できる一方、最初の転写産物が適切にスプライシングされ、翻訳が正しい位置から開始されて、機能するDNase Iが合成されるようになる。図１０は、既知のcDNA配列（Shak，S.ら、op．cit. ）の５’側に存在するヒトDNase I座の約4kbの新規のDNA配列を示す。図１１は、既知のcDNA配列との５’側の境界から３’方向に伸びた、ヒトDNaseI座の約0. 8kbのDNA配列を示す。図１１のイントロンの配列（第328〜2塩基の位置）は新規である。図１０および１１の新規の配列を含むDNA構築物、またはこれらの配列に由来する断片は、本明細書に説明した相同組換えに有用である。最後に、β-インターフェロン遺伝子（イントロンを欠くことが知られている遺伝子）の上流領域の解析をクローン化および塩基配列決定し、詳細な制限酵素地図を作成した。以前は、翻訳開始コドンの上流のDNAは、わずか357塩基対しか解析されていなかった（GenBank エントリーHUMIFNB1F参照）。今回のクローニングと塩基配列解析により、標的となる構築物の設計と構築に役立つ、遺伝子の上流約9.6kbのゲノムDNAが得られた（例７）。図１４は、既知の配列の５’側に存在するβ-インターフェロン座の約8.4kbの新規のDNA配列を示す（GenBank エントリーHUMIFNB1F）。図１４の新規の配列、またはこれらの配列に由来する断片を含むDNA構築物は、本明細書に開示した通り相同組換えに有用である。以下に、本発明のDNA構築物、本発明のDNA構築物を含む因子（セクションA）、相同組換え細胞の作成のための、DNA構築物を使用する方法（セクションB）、標的遺伝子および生じた産物の構造（セクションC）、作成された相同組換え細胞（セクションEおよびF）、および本明細書に説明した構築物および方法の利点 (セクションＧ)について明確に説明（define）する。A ．DNA構築物本発明のDNA構築物は、少なくとも以下の構成因子を含む：標的配列；調節配列；エクソンおよびスプライシング供与部位。この構築物においては、エクソンは調節配列の３’に、スプライシング供与部位はエクソンの３’側にある。加えて、スプライシング供与部位に隣接するエクソンに先立って（つまり５’側に）、複数のエクソンおよび／またはイントロンがあってもよい。エクソン、イントロン、およびスプライシング供与部位はひとまとめにして、構築物の「構造的因子(structural elements)」と表す。これは、ゲノムDNAおよび標的となる構築物のDNA間の相同組換えにより作成される新規の遺伝子の構造を規定するのに重要であるためである。本明細書に説明したように、選択可能な、および／または増幅可能なマーカーなど、別の構築物構成因子が加わることもしばしばある。構築物の中のDNAは、外来DNAと称され、本発明のDNA構築物についてと同様、本明細書に説明した方法により細胞に導入されるDNA、と本明細書に定義される。外来DNAは内生のDNAと同一または異なる配列を含みうる。内生DNAとは、本明細書では元の状態の細胞内に存在するDNAと定義される。構築物のDNAは、自然に発生する、または遺伝子工学技術または合成法を用いて作り出された供給源より得ることができる。１．ターゲティング配列ターゲティング配列は、興味対象の遺伝子を有する選択された細胞のゲノムに相同組換えを可能にするDNA配列である。ターゲティング配列は、一般的に、対象となる細胞のゲノム中に存在するDNA配列と相同である（すなわち、同一または充分に類似している）DNA配列である（例えば、転写開始部位の上流、遺伝子を含有する転写領域内、または遺伝子の転写終止部位の下流に位置するコード領域または非コード領域DNA、または前もった修飾によってゲノム中に存在する配列）。したがって、ターゲティング配列と細胞DNAは相同組換えを起こすことができる。一般的に、２つの配列は、一方の配列のDNA鎖が他方の配列のDNA鎖と、配列類似性の検定に一般的に使用される条件下において（例えば、Ausubelら、C urrent Prptocols in Molecular Biology，Wiley，New York，NY.（1987）を参照）ハイブリダイズすることができる場合、相同と記載される。使用されるターゲティング配列は、DNA構築物中の該DNAが挿入されるべき部位に関連して選択され、それはゲノムまたはcDNA配列から由来することができる。典型的には、ターゲティング配列は、少なくとも約２０塩基対の長さである。その配列の大きさは、目的のゲノム配列との相同組換えを選択的に推進する大きさとして選定される。ひとつまたはそれ以上のターゲティング配列が利用されうる。例えば、環状のプラスミドまたはDNAフラグメントは、好ましくは、単一のターゲティング配列が利用される。直鎖状のプラスミドまたはDNAフラグメントは、好ましくは、２つのターゲティング配列が利用される。その２つのターゲティング配列の間には、ゲノムに挿入されるべき外来のDNAが存在する。ターゲティング配列は、内生遺伝子内（例えば、エクソンおよび／またはおよび／またはイントロン配列内）、内生プロモーター配列内、または内生プロモーター配列の上流に存在することができる。ターゲティング配列は、現在既知または配列決定された遺伝子領域、および／または構造的に未知であるが、当技術分野の経験者に利用可能な制限酵素やクローニング手法によりマップすることができる、さらに上流領域を含むことができる。２．制御配列 DNA構築物の制御配列は、プロモーター（構成性または誘導性プロモーター）、エンハンサー、Scaffold-attachment 領域または matrix attachment 領域（McKnight，R.A.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6943〜6947(1992); Phi- Van，L．and Str.tling，W.H．EMBO J．7:655〜664（1988)）、ネガティブ制御エレメント、locus control 領域（Pondel，M．D．ら、Nucl．Acids Res．20:23 7〜243(1992); Li，Q．and Stamatoyannopoulos，G．Bood 84: 1399〜1401(1994 )）、転写因子結合部位、または上記配列の組み合わせを含む。３．DNA構築物の構造的エレメント a．エクソンとイントロン本明細書において、エクソンは、RNAにコピーされ、成熟mRNA分子中に存在するDNA配列として定義される。イントロンは、２つのエクソン間に存在するひとつまたはそれ以上のヌクレオチドで、mRNA分子の形成過程で前駆RNAからスプライシングによって除去される配列として定義される。本発明のDNA構築物は、ひとつまたはそれ以上のエクソンを含む。該エクソンは、随意に、ひとつまたはそれ以上のアミノ酸をコードするDNA、および／またはひとつのアミノ酸を部分的にコードするDNA（すなわち、コドンのひとつまたは２つの塩基）を含みうる。外来のエクソンが、ひとつまたはそれ以上のアミノ酸、および／またはひとつのアミノ酸を部分的にコードしている場所において、該 DNA構築物は、転写とスプライシングの際に、読み枠が内生遺伝子のコード領域の２番目または引き続くエクソンとin-frame であるように設計される。本明細書において、in-frameとは、例えば、１番目のエクソンと２番目のエクソンのコード領域が結合される際に、２番目のエクソンから由来するmRNA部分の適切な読み枠が変化しないようにヌクレオチドを結合することを意味する。トロンボポイエチン遺伝子およびDNase I遺伝子を活性化する場合、外来エクソンは、好ましくは、エクソンがCAP部位および非コード配列を含んでいるいかなる遺伝子からでも由来することができる。例としては、ＣＭＶimmediate-earl y遺伝子、および濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）遺伝子の第１番エクソンを含む。天然のイントロンを有さないβ-インターフェロンの場合は、DNA構築物中に、好ましくは、ひとつのイントロンで分離されている２つの外来の非コード性エクソンが存在する。 b．スプライス部位真核細胞のmRNA中に含まれるイントロンは、スプライス-供与部位およびスプライス-アクセプター部位と命名されるシグナルの認識によって除去される。スプライス-供与部位は、ひとつのエクソンの他のエクソンに対するスプライシングを指示する配列である。典型的には、１番目のエクソンは、２番目のエクソンの５’側に存在しており、１番目のエクソンの３’部位にオーバーラップして接しているスプライス-供与部位は、２番目のエクソンの５’部位に接しているスプライス-アクセプター部位を認識する。スプライス-供与部位は、(A/C)AGGURAG U（本明細書でRはプリンヌクレオチドを示す）で代表される特徴的なコンセンサス配列を有する。その配列は、４番目と５番目に必ずGU を有している(Jackson ，I.J.，Nucleic Acids Research 19:3715〜3798(1991))。該スプライス-ドナーコンセンサス部位の最初の３つの塩基は、エクソンの最後の３つの塩基である。スプライス-供与部位は、機能的には、mRNAスプライシング経路で適切な反応をもたらす能力によって定義される。本明細書において、不対合スプライス-供与部位は、ターゲティング構築物中に存在し、その３’側にスプライス-アクセプター部位を有していないスプライス-供与部位と定義される。ターゲティング配列とゲノムDNA間の相同組換えにおいて、不対合スプライス-供与部位は、結果として、内生のスプライス-アクセプター部位へのスプライシングをもたらす。スプライス-アクセプター部位は、スプライス-供与部位同様、ひとつのエクソンの他のエクソンへのスプライシングを指示する配列である。スプライス-供与部位と一緒に活動しながら、スプライシング装置は、イントロン除去のためにスプライス-アクセプター部位を利用する。スプライス-アクセプター部位は、YYYY YYYYYYNYAGで代表される特徴的な配列を有する。本明細書で、Yはピリミジン、N はヌクレオチドを示す(Jackson，I.J.，Nucleic Acids Research 19:3715〜3798 (1991))。 c．選択と増幅のためのマーカー遺伝子ターゲティング事象の同定は、典型的には、ターゲティングDNA構築物中に含まれるひとつまたはそれ以上の選択マーカー遺伝子の利用によって容易にすることができる。ターゲティング事象の同定のための、ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーの両方の使用は、関連特許出願（米国特許出願第08/2 43,391号、第07/985,586号、第07/789,188号、PCT/US93/11704、およびPCT/US92 /09627）の中に記載されている。本発明によって生産された新規な転写ユニットの多数コピーを含む相同組換え細胞は、選択マーカー遺伝子の多数コピーを有する細胞が、適切な選択試薬の存在下で培養されることによって選択されうる特性を有する増幅性マーカー遺伝子を、該ターゲティングDNA構築物中に含むことによって単離されうる。該新規転写ユニットは、増幅した選択マーカー遺伝子とともに一列に増幅され、目的タンパク質の高レベル生産を可能にする。増幅性マーカー遺伝子とそれらの利用は、米国特許出願第08/243,391号、第07/985,586号および PCT/US93/11704 に記載されている。ひとつの態様において、ポジティブ選択マーカーである neo（バクテリアのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）が、ターゲティングDNA構築物を安定的に組み込んだ細胞の選択に使用され、マウスの dhfr（ジヒドロ葉酸還元酵素）遺伝子が、相同組換え細胞中に存在する新規転写ユニットを引き続き増幅させるために使用される。 d．ターゲティング構築物の追加エレメント本明細書で示されるように、遺伝子ターゲティングは、細胞トロンボポイエチン、β-インターフェロン、またはDNase Iに相当する内生遺伝子の遺伝子内（例えば、エクソンおよび／またはイントロン配列内）、内生プロモーター配列内、または内生プロモーター配列の上流に制御配列を挿入するために使用することができる。また一方で、または追加的に、ターゲティング構築物は、トロンボポイエチン、β-インターフェロン、またはDNase Iの各タンパク質またはそのRNA分子の構造や安定性に影響する配列を含むように設計することができる。例えば、 RNA安定化エレメント、スプライス部位、および／またはRNAリーダー配列が、RN A分子の機能、安定性、および／または翻訳活性を改善させたり変化させるために修飾されうる。シグナル配列、活性部位、および／または構造的配列のようなタンパク質配列もまた、タンパク質の糖結合、輸送、分泌、または機能特性を促進したり修飾するために、変化されうる。この方法にしたがって、発現タンパク質やRNA分子の構造的、または機能的特性の改変が、外来DNAの導入によってもたらされる。ひとつの態様において、該方法は、他のタンパク質の構造ドメイン、酵素活性ドメイン、またはリガンドまたはリセプター結合ドメインが、トロンボポイエチン，DNase Iまたは β-インターフェロンに融合されている融合タンパク質をコードしている新規な転写ユニットを創出するために使用することができる。これらの場合において、外来のコード遺伝子は、内生のトロンボポイエチン，DNase Iまたは β-インターフェロン遺伝子のコード配列とin-frame の配置でATG開始コドンを含んでいる。例えば、外来遺伝子は、トロンボポイエチンまたはDNase Iを膜に結合することができる配列、細胞分泌を促進するために設計されたシグナルペプチドの一部分、リーダー配列、酵素領域、膜貫通領域、コファクター結合領域、または他の機能領域をコードすることができる。該DNA構築物はまた、バクテリアの複製開始点、バクテリアの抗生物質耐性マーカー、または他の選択マーカーを含むことができる。それらは、バクテリアや他の適当なクローニング／宿主システムにおいて、大容量のプラスミド増殖を可能にする。B ．トランスフェクションと相同組換え本方法にしたがって、該構築物は、トランスフェクションされる細胞の染色体 DNAまたは核DNA中に、単一のDNA構築物として、または分離したDNA配列として組み込まれる。細胞としては、一次細胞、二次細胞、または不死化細胞が用いられる。ターゲティングDNA構築物は、単一DNA構築物として、または分離した構築物として細胞に導入される。該DNA構築物の全長は、構成成分の数と各成分の長さにしたがって変化し、一般的には、少なくとも約２００ヌクレオチドを有する。さらに該DNAは、直鎖の２本鎖として（一本鎖領域を端に有する場合を含めて）、一本鎖として、または環状DNAとして導入されることができる。本発明における全ての構築物は、トランスフェクションされた細胞を得る目的で細胞に導入される。トランスフェクションされた細胞は、当技術分野でよく知られている相同組換えを許容する条件下で維持される（reviewed in Capecchi ，M．R.，Science 244:1288〜1292(1989)）。相同組換え細胞が、該DNAの転写のために充分な条件下で維持される時、プロモーターの場合を例にすると、ターゲティング構築物によって導入されたその制御領域は、相同組換えによって形成された新規な転写ユニットの発現を活性化する。該DNA構築物は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、micro projectile bombardment，リン酸カルシウム沈殿、およびリポソーム-、ポリブレン-、またはDEAEデキストラン-利用法を含む様々な物理的、または化学的方法によって、細胞に導入されうる。C ．標的とされる遺伝子と生産物該ターゲティング構築物は、相同組換えにより導入された時、またはトロンボポイエチン、β-インターフェロン、またはDNase I遺伝子を含む細胞にターゲティングされた時、新規な転写ユニットを形成し、結果としてトロンボポイエチン、β-インターフェロン、またはDNase Iの発現をもたらす。ゲノム中の標的とされる部位において、外来の制御配列は、転写を開始するCA P部位に機能的に結合される。機能的に結合とは、外来の制御配列、エクソン、スプライシング-供与部位、および随意に、イントロン配列とスプライス-アクセプター部位が、内生遺伝子に対して、その制御エレメントが適切な一次RNA転写物（CAP部位で開始し、外来のエクソンと内生のトロンボポイエチン，DNase Iまたはβ-インターフェロン遺伝子を含む）の生産を指示するような位置に、適切に標的とされる配置として定義される。機能的に結合された配置においては、ターゲティング構築物のスプライス-供与部位は、外来エクソンと内生エクソンのスプライス-アクセプター部位の間のスプライシングを指示する。したがって、その完全にスプライスされた成熟転写物は、目的タンパク質の生産を可能にする。ひとつの態様においては、スプライシングがトロンボポイエチンまたはDNase I遺伝子の内生エクソンに対して生じるようにするために、スプライス-アクセプター部位は内生である。他の態様において、イントロンとスプライス-アクセプター部位は、β-インターフェロン遺伝子を活性化するために用いられるターゲティング構築物中に含まれている。そしてそのターゲティング構築物由来の導入イントロンは、スプライシングによって除去される。D ．相同組換え細胞ターゲティングにより、ターゲティング構築物の制御配列および構造配列が細胞のゲノムに挿入され、外来の制御配列によって制御される新規な転写ユニットが創出される。ゲノムDNAと導入されるDNAの間の相同組換えは、結果として、ヒトの一次細胞、二次細胞または不死化細胞、または他の哺乳動物細胞の相同組換え細胞をもたらす。それらの細胞では、内生遺伝子の発現を改変することのできる外来配列が、内生のトロンボポイエチン，DNase Iまたは β-インターフェロン遺伝子に対して機能的に結合されている。特に、本発明は、外来の制御配列とひとつのエクソン（スプライス-供与部位が接している）を含有する相同組換え細胞を含む。それら外来の制御配列とひとつのエクソンは、ターゲティングDNA構築物によって、前もって決定された部位に導入され、内生遺伝子のコード領域へ機能的に結合されている。随意に、多数の外来エクソン（コード領域または非コード領域）およびイントロンが、内生遺伝子のエクソンに機能的に結合されうる。得られた相同組換え細胞は、もし適切であれば、増幅性マーカーと新規転写ユニットをコードしているDNAの増幅を可能にするように選択された条件下にて培養される。遺伝子増幅の有無に関わらず、この方法で生産された細胞は、当技術分野でよく知られている、トロンボポイエチン、β-インターフェロン、またはDNase Iの発現に適した条件下で培養される。本発明のターゲティング構築物と方法は、例えば、一次細胞または二次細胞株（それらは、培養下で有限の平均集団倍化数（mean population doublings）を示し、不死化されていない）、および不死化細胞系（それらは、培養下でみかけ上無限の寿命を示す）を用いて実施されうる。一次および二次細胞は、例えば、線維芽細胞、角化細胞、上皮細胞（例えば、乳腺上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液細胞（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、筋肉細胞、およびこれら体細胞の前駆細胞を含む。相同組換え細胞が遺伝子治療に使用される場合には、一次細胞は、好ましくは、その相同組換え細胞が投与される患者から採取される。しかしながら、一次細胞は、同種のドナー（レシピエント以外）からも採取することができる。本発明のDNA構築物および方法が適用される不死化ヒト細胞系の例は、HT1080 細胞（ATCC CCL 121）、Hela 細胞およびその派生細胞（ATCC CCL 2，2.1 および 2.2）、MCF-7 乳ガン細胞（ATCC BTH 22 ）、K-562 白血病細胞（ATCC CCL 243）、KB ガン細胞（ATCC CCL 17）、2780AD 卵巣ガン細胞（Van der Blick，A．M.ら、Cancer Res，48:5927〜5932(1988)）、Raji 細胞（ATCC CCL 86）、WiDr 結腸腺ガン細胞（ATCC CCL 218）、SW620 結腸腺ガン細胞（ATCC CCL 227）、Jurkat 細胞（ATCC TIB 152）、Namalwa 細胞（ATCC CRL 1432）、HL-60 細胞（ATCC CCL 240）、Daudi 細胞（ATCC CCL 21 3）、RPMI 8226 細胞（ATCC CCL 155）、U-937細胞（ATCC CRL 1593）、Bowes 黒色種細胞（ATCC CRL 9607）、WI-38VA13 subline 2R4細胞（ATCC CLL 75.1）、およびMOLT-4細胞（ATCC CRL 1582）、またヒト細胞と他種細胞の融合によって生産されるヘテロハイブリドーマを含むが、それらに限定されるものではない。WI-38（ATCC CCL 75）、および MRC-5（ATCC CCL 171）のような二次ヒト線維芽細胞株も使用されうる。本発明の方法を実施するために使用される細胞タイプに関するさらなる議論は、米国特許出願第08/243,391号、第07/985,586号、第07/789,188号、第07/911,533号、第07/787,840号、PCT/US93/11704、およびPCT/US92/09627に記載されている。E ．インビボタンパク質生産内生のトロンボポイエチン、β-インターフェロン、またはDNase I遺伝子の発現特性が改変されている本発明の相同組換え細胞は、相同組換え細胞系の集団として、相同組換え一次細胞または二次細胞の集団として、相同組換えクローン細胞系や細胞株として、相同組換え異種細胞系や細胞株として、および前記カテゴリーに含まれる。相同組換え細胞の少なくともひとつが含まれる細胞混合物として、遺伝子治療に有用である。相同組換え一次細胞、クローン細胞株、または異種細胞株は、生理的に適切なレベルの目的産物を発現または利用可能にするために、その充分量を適切な経路を用いて、異常または望ましくない状態が処置または阻止されるべき患者に投与される。生理的に適切なレベルとは、体内で正常に生産されるべきレベルに近似するレベルか、もしくは結果として、異常または望ましくない状態の改善をもたらすレベルである。相同組換え細胞を、インビボタンパク質生産を目的として患者に導入する遺伝子治療法は、米国特許出願第08/2 43,391号、第07/985,586号、第07/789,188号、第07/911,533号、PCT/US93/11704 、およびPCT/US92/09627に記載されている。ひとつの態様において、本発明は、体内で充分効果の出る量のトロンボポイエチンを生産するために必要な充分量の相同組換え細胞を体内に導入することで、トロンボポイエチンを哺乳動物に供給する方法に関する。他の態様においては、呼吸困難の軽減のためにDNase Iをインビボで分泌させることを目的として、DNase Iを発現している相同組換え細胞が、cystic fibros is 患者の気管および肺に投与される。３つ目の態様としては、病気に伴う苦痛の激化を軽減することを目的として、 β-インターフェロンをインビボ分泌させるために、相同組換え細胞が、multipl e sclerosis の患者に移植される。F ．インビトロタンパク質生産本発明にしたがって生産された相同組換え細胞は、トロンボポイエチン、β- インターフェロン、またはDNase Iのインビトロ生産にも使用することができる。該細胞は、当技術分野でよく知られているタンパク質発現のための条件下で維持される。該方法を使用して発現されたタンパク質は、細胞溶解物または細胞培養上清から精製される。該方法にしたがって生産されたタンパク質は、製薬的に有用な形態で調製され、当技術分野でよく知られている一般的な投薬経路（例えば、口、血管内、筋肉内、鼻内、気管内、または皮下）によって、ヒトまたはヒト以外の動物に投与される。本明細書で記載されているように、相同組換え細胞は、ヒト由来の不死化細胞、一次細胞または二次細胞でありうる。他の種由来の細胞の使用は、ヒト以外のトロンボポイエチン、DNase Ｉまたはβ-インターフェロンが治療において有用である場合のように、ヒト以外の細胞がタンパク質生産の目的のために利点がある場合に望ましい。G ．利点本発明の方法、DNA構築物、細胞、および生産されるタンパク質は、現在遺伝子ターゲティング分野で実施されている方法に比較して、多能であり、多くの利点を有している。外来の制御配列および他の構造配列を、様々な場所（正常遺伝子のコード領域部位に直接的に融合させることから、その遺伝子の転写領域から 30 kilobase以上上流に至るまで）、に位置させることによって、内生のトロンボポイエチン、β-インターフェロン、またはDNase I遺伝子の発現を活性化する能力は、細胞における遺伝子発現にとって利点がある。例えば、正常ではサイレンスかまたはネガティブに遺伝子を制御している領域の上流または下流に、制御エレメントを位置づけることができる。そのような領域の上流または下流への制御エレメントの配置は、正常では転写を阻害する優勢的なネガティブ効果を無効にすることができる。さらに、正常では転写を阻害するか、もしくは遺伝子発現に対して有害な効果を有するDNA領域が、本明細書で記載されたターゲティング構築物の使用によって除去されうる。本発明はまた、正常なイントロン配列のもとでタンパク質が発現されることを可能にする。正常なイントロン配列は、哺乳動物細胞における遺伝子発現において、重要な役割を担っていることが示されている（cf．Korb，H.ら、Nucl．Acids Res．21: 5901〜5908(1993)）。さらにまた、プロモーター機能は、局所環境に強く依存することが知られているので、その機能発現のための最適局所環境を発見するために、広範囲の位置が探索されるかもしれない。しかしながら ,哺乳動物DNAの中には、ATG開始コドンが頻繁に出現するので（ヒトDNAの nearest-neighbor dinucleotide frequencie s（隣接ジヌクレオチド頻度分析）によると、約４８塩基対に１回の割合）、転写は、遺伝子上流の勝手な位置から単純に開始することはできず、また勝手に、本来のATG開始コドンの前方に長いリーダー配列を含む転写物を生産することはできない。それは、その長いリーダー配列中にある、頻繁に出現するATGコドンが、正しい遺伝子産物の翻訳を妨害し、メッセージを無用なものにしてしまうからである。したがって、外来エクソン、スプライス-供与部位、および随意に、イントロンとスプライス-アクセプター部位を、制御領域を含むターゲティング構築物に組み込むことは、生産されるmRNA中に不適切なATG開始コドンが形成されてしまうのを防止する必要性からくる限界なしに、制御領域の機能のための最適位置を同定することによって、遺伝子発現を最適化することを可能にする。このことは、構築物の配置において、非常に大きな柔軟性を提供し、他の方法を用いた場合と比較して、より広範囲な遺伝子群の活性化を可能にする。例えば、米国特許第5,272,071号および国際公開公報第91/06666号、第91/06667号および第9 0/11354号は、内生遺伝子のコード領域の上流に制御配列を挿入するための相同組換え方法を記載している。これらの方法においては、上述のようなATG開始コドンの頻繁な出現による制限によって、非常に少数の位置のみが、遺伝子発現のためのプロモーター挿入のために利用できる。本発明は、当技術分野で利用できる方法と比較して、さらに利点を提供する。例えば、相同組換えの利用は、結果として、新規な転写ユニットが、相同組換えを起こした全ての細胞の同一位置に存在する細胞の生産をもたらす。したがって、該新規転写ユニットは、独立に得られた全ての相同組換え細胞の中で、同様に機能することができる。このことは、高精度で予測できる性質を有する細胞の生産を可能にする。インビトロタンパク質生産の場合、目的遺伝子の行動（例えば、発現や増幅の特性）を制御することのできる細胞を開発することが望ましく、また大量生産に用いられる個々の細胞間に多様性がほとんど無いことが望ましい。インビボタンパク質生産や遺伝子治療の場合、個々の患者において、特性が予測できて均一である細胞の開発が可能であることが望ましい。このことは、インビボにおいて、目的タンパク質の適切なレベルを達成する上での高度な正確性を可能にし、それは、病気を処置するための、制御された再現性のある方法へと導く。上述のDNA構築物は、外来の制御エレメントおよび構造エレメントを内生のコード配列に対して、機能的に結合するために有用である。それによって、新規な転写ユニットが正確に創出され、外来制御エレメントと内生遺伝子の相対的配置に柔軟性がもたらされ、最後には、治療目的のために遺伝子発現を制御するための高度に制御されたシステムが可能となる。本発明は、次の実施例によって例示されるが、それらに限定されるものではない。実施例実施例１：TPO遺伝子のクローニングと5’フランキング配列の同定ヒトトロンボポイエチン遺伝子はヒトゲノムDNAライブラリーから単離された。このライブラリーは男性のリンパ球DNAをMboIで部分的に消化し、バクテリオファージベクターであるラムダEMBL3（Clontech，Palo Alto，CA; Cat．#HL1006 d）の中にクローン化された。スクリーニングのために、オリゴヌクレオチド1.1 と1.2を用いてヒトゲノムDNAのPCR増幅により、プローブが単離された。オリゴ 1.1(TPO センス鎖)(配列番号：１) 5’AATTGCTCCT CGTGGTCATG CTTCT オリゴ 1.2(TPO アンチセンス鎖)(配列番号：２) 5’CTGTGAAGGA CATGGGAGTC A これらプライマーは知られているTPO mRNA配列（de Sauvage，F．J.ら、Natur e 369:533〜538(1994)）を用いて設計された。増幅されたプローブ（プローブA ；120 bp）はポリメラーゼ連鎖反応により³²P dCTPで標識され、ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするために使用された。フィルターは 68℃で６時間、125 mM Na₂HPO₄（pH7.2）、250mM NaCl、10% PEG 8000、7% SDS、１mM EDTAの中でハイブリダイズされた。フィルターは500 mlの20 mM Na₂HPO₄（pH7.2）、１ mM E DTA、5% SDSで２回洗浄し、その後500 mlの20 mM Na₂HPO₄（pH7.2）、１mM EDTA 、1% SDSで４回洗浄した。洗浄緩衝液は前もって56℃に温められ、洗浄は一回の洗浄あたり室温でおよそ５分間、ロータリーシェーカーで行った。ハイブリダイズしているシグナルは、増感スクリーンとともに-80℃でのオートラジオグラフィーにより同定された。一回の実験で、およそ1.4ｘ10⁶個のファージがスクリーニングされ、７つの陽性シグナルが得られた。陽性シグナルに対応するファージのプラークはプラーク精製された。プローブAを用いた低密度スクリーニングによる引き続く２回のプラーク精製で、5B、25A、25B、および28Bと名付られた４つのファージがさらなる解析のために保存された。プラーク精製されたファージは増幅され、塩化セシウム勾配超遠心法（Yamamoto K.R.ら、Virology 40:734(1 970)）により単離され、DNAが単離された。ライブラリーのスクリーニング、リコンビナントバクテリオファージのプラーク精製、バクテリオファージDNAの単離は標準的な手法を用いて行われた（Ausubelら、Current Protocols inMolecul ar Biology、Wiley、New York、NY．(1987)）。 TPOの上流にあるおよそ4.3kbの転写されないDNAに加えて、エクソン1、イントロン1、エクソン2、イントロン2、エクソン3およびイントロン3の一部を含むおよそ6.9 kbのXbaI 断片が、制限酵素とプローブAを用いたサザンハイブリダイゼーション解析により同定された。この断片はゲノムのクローンのひとつ（28B）から単離されたもので、さらなる解析のためにプラスミドpBSIISK+（Stratagene Inc.、La Jolla、CA）にサブクローンされた。結果として得たクローンであるp BS(X)/5'Thromb.8およびpBS(X)/5'Thromb.2では、このプラスミドのバックボーンに関して逆方向に6.9kbのXbaI断片がはいっている。制限酵素地図を作ることにより、図３に示される制限酵素地図が得られた。この断片のうち、知られているcDNA配列の5'端の上流にある部分の塩基配列が図４に示されている（配列番号３）。6.9 kbのXbaI断片のうち、知られているcDNA配列の5'端の下流にある部分の塩基配列が図４に示されている（配列番号３）。本明細書にあるクローン化されたゲノム配列と、出版されているcDNA配列（de Sauage，F.J.ら、Nature 369: 533〜538(1994)）とを比較すると、長さとしてTPO遺伝子の5'端は、少なくとも1 07bpの非翻訳領域のエクソン（エクソン1）、158 bpの第二エクソン（エクソン2 ）128 bp の第三エクソン（エクソン3）を含むことが明らかとなった。エクソン2の3'端にある13塩基対は、TPOのシグナルペプチドの最初の４つと、５番目のアミノ酸の一部をコードする。エクソン3は、21アミノ酸のシグナルペプチドの残りと、成熟TPOポリペプチドの一部をコードする。エクソン1と2はイントロン1（1671 bp ）およびエクソン2と3はイントロン2（231 bp）によって分断されている。図５に報告される塩基配列とde Sauvageらにより出版される塩基配列では２カ所の相違がある：塩基番号-134および-124での塩基はde SauvageらによりC残基と報告されているが、図5ではT残基として示されている。これらの残基はTPOの翻訳配列のそとであり、配列のポリモルフィズム、または出版された配列の編集時での誤りによるものとして説明されうる。いずれにせよ、このわずかな差は本明細書に説明される発明を実行する当業者の能力に影響を与えない。実施例２：活性化のための標的プラスミドの作製とTPO遺伝子の増幅 TPO遺伝子の活性化は図６〜８に示されるとおり、多くの戦略により遂行されうる。図６に示されている戦略では、制御領域、非翻訳領域、およびTPO翻訳領域上流の機能的ではあるが組になっていないスプライシングの供与部位を受容する細胞のゲノムの中に挿入するために、標的となる断片が挿入される。限定的には、この断片が由来するターゲティング構築物（pRTPO1）はTPO遺伝子上流の配列に相同的な第一の標的配列、増幅可能なマーカー遺伝子、選択可能なマーカー遺伝子、制御領域、CAP部位、非翻訳領域、組になっていないスプライシングの供与部位、および下流の配列に対応する第二の標的配列を含むように設計される。この戦略により相同的に組換えられた細胞は、相同的組換えによりTPO遺伝子の上流に導入される非翻訳領域のエクソン、第二の標的配列および第二の標的配列とTPO遺伝子のエクソン２の間のあらゆる配列、ならびに残りのエクソン、イントロン、およびTPO遺伝子の3'非翻訳領域を含むmRNAの前駆体を産生する（図６）。このメッセージのスプライシングの結果として外来性の非翻訳領域のエクソンに内在性のTPO遺伝子のエクソン２が融合したものができ、翻訳されたときにTPOを産生する。この戦略では第一および第二標的配列は通常の標的遺伝子の上流であるが、これは必要とはされない（下記参照）。このターゲティング構築物のイントロンの大きさ、および従ってこの遺伝子の翻訳領域に比較しての制御領域の位置は、制御領域の機能を最適化するために様々である。プラスミドpRTPO1は以下のように作製される。TPO上流領域の制限酵素地図（図３）を基礎として、3.5 kbのBamHI断片がサブクローンpBS(X)/5'Thromb.8（例１）から単離されうる。この断片はBamHIで消化したプラスミドpBS（Stratagene ，Inc.、La Jolla、CA）に連結され、pBS-TPO1を生成するためにコンピテント大腸菌細胞が形質転換される。この断片はTPOエクソン１の上流にある配列を含む。次に、0.73 kbの断片がhGHの発現構築物であるpXGH308から増幅されるが、これは、オリゴヌクレオチド2.1と2.2を用いてGenbankの配列HUMGHCSAの塩基番号5 225にはじまり塩基番号7322に終わるhGH配列に融合されているような、Genbank の配列HS5MIEPの塩基番号546にはじまり塩基番号2105に終わるCMVの極く初期の（IE）遺伝子プロモーター領域を持っている（CMVのIE遺伝子の起源は本質的でなく、他のCMV IEプロモーターを基礎とするプラスミドが利用されうるし、また野生型のCMV DNAも利用されうる）。オリゴ2.1（37 bp、配列番号：５）はキャップ部位（Genbank配列HEHCMVP1）から相対的に-614のところでCMV IEプロモーターにハイブリダイズし、5'端のところで部分的に重複しているXhoI部位が引き続くようなNotI部位を含む。オリゴ2.2（36 bp、配列番号：６）はキャップ部位から相対的に+131のところでCMV IEプロモーターにハイブリダイズし、CMV IE遺伝子のイントロンの最初の10塩基対を含み、5'端にNotI部位がある。結果として得られたPCR断片はNotIで消化され、ゲルで精製される。プラスミドpBS-TPO1は、TPOエクソン１の上流の単一部位を切断するような（図３）NotIで消化され、消化されたDNAは上述のように調製されたCMVプロモーター断片に連結され、コンピテント大腸菌細胞に形質転換される。pBS-TPO1のNotI部位で挿入されたCMVプロモーターの挿入を含むコロニーは、この挿入の向きを確認するために制限酵素解析により解析され、転写の方向がTPOエクソンの向きであるようにCMVプロモーターの方向を合わせたひとつの組換えプラスミドが同定され、pBS-TPO2と名付けられた。オリゴ2.1（配列番号：５）オリゴ2.2（配列番号：６）次に、安定にトランスフェクトされたヒト細胞を単離するときの選択可能なマーカーとしての使用のため、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）遺伝子がpBS-TPO2に挿入される。プラスミドpMClneoPolyA［Thomas，K.R.とCapecc hi,M.R．Cell 51:503〜512(1987)；Stratagene Inc.、La Jolla、CAから入手可能］はBamHIで消化され、大腸菌DNAポリメラーゼのKlenow断片での処理により、平滑末端とされた。そのあとで、処理されたDNAは、BamHI部位がリンカーの付加により再生されないよう選択された、5’GGATCGATCCという配列の二重鎖の１０塩基対ClaIリンカーに連結された。結果として得られたDNAはClaIで消化され、消化されたDNAは再環化を促進するために希釈状態で連結され、コンピテント大腸菌細胞に形質転換される。形質転換されたコロニーに対し、neo遺伝子の3'端にClaI部位の挿入があるようなプラスミドpMClneoPolyAの誘導体を有する細胞を同定するため、制限酵素消化で解析が行われる。このプラスミドはpMClneo-Cと名付けられる。pMClneo-CはXhoIとSalIで消化され、neoの発現ユニットを有するおよそ1.1 kbの断片がゲルで精製される。プラスミドpBS-TPO2はCMVプロモーターの5'端にあるPCRにより導入された唯一のXhoI部位のところで消化され、消化されたDNAはneo遺伝子を有する精製されたXhoI-SalI断片に連結され、コンピテント大腸菌細胞に形質転換される。pBS-TPO2のXhol部位のところで挿入されたne o遺伝子の挿入があるコロニーは挿入の向きを確認するために制限酵素解析により解析され、neo遺伝子の転写方向がCMVの逆向きであるように方向を合わせたひとつの組換えプラスミドが同定され、pBS-TPO3と名付けられた。最終的に、ターゲティング構築物pTPO1は、pBS-TPO3のneo遺伝子の5'端に位置するClaI部位で（標的となるヒト細胞で増幅を目的とした選択をするために）dh frの発現ユニットを挿入させることにより作製された。dhfrの発現ユニットを得るには、プラスミド構築物pFSCIS9080［Eatonら、Biochemistry 25:8343〜8347( 1986)］がEcoRIとSalIで消化される。２kbのdhfrを含む断片がこの消化産物から精製され、DNAポリメラーゼIのKlenow断片で処理することにより平滑末端にされる。その後でClaIリンカー（New England Biolabs、Beverly、MA）が平滑末端になったdhfr断片に連結される。この連結反応の産物がClaI消化され、ClaI消化されたpBS-TPO3に連結される。この連結反応液の一部で大腸菌が形質転換され、アンピシリン選択プレート上に接種される。細菌コロニーは挿入されたdhfr断片の方向を決定するため、制限酵素消化により解析される。転写方向がneo遺伝子の逆向きになっているdhfrを有する一つのプラスミドがpRTPO1と名付けられる。培養されたヒト細胞におけるTPOローカスを標的とするために、pBSプラスミドのバックボーンから標的DNA、neo遺伝子、dhfr遺伝子、CMVプロモーター、およびスプライシングの供与部位を有する標的断片を分離するために、pRTPO1はBamHIで消化される。 TPO遺伝子の活性化のための第二の戦略は図７に示されている。この戦略では、制御領域、非翻訳領域エクソン、スプライシングの供与部位、イントロン、スプライシングのアクセプター部位、第二の非翻訳領域エクソン、およびTPO翻訳領域の上流にある機能をもち、組になっていないスプライシングの供与部位の挿入のため、受容する細胞のゲノムに標的となっている断片が挿入される。限定的にはこの断片が由来するターゲティング構築物（pRTPO2）は、TPO遺伝子上流の配列に相同的な第一の標的配列、増幅可能なマーカー遺伝子、選択可能なマーカー遺伝子、制御領域、CAP部位、非翻訳領域エクソン、スプライシングの供与部位、イントロン、スプライシングのアクセプター部位、第二の非翻訳領域エクソン、組になっていないスプライシングの供与部位、および第一の標的配列の下流であるがTPOエクソン2の上流であるような配列に対応する、第２の標的配列を含むように設計される。この戦略により相同的に組換えられた細胞は、イントロンで分断された第一、第二の非翻訳領域の外来性エクソン、第二の標的となる配列、および第二の標的配列とTPO遺伝子のエクソン２の間のあらゆる配列、ならびに残りのエクソン、イントロン、およびTPO遺伝子の3'非翻訳領域に対応するmRN Aの前駆体を産生する（図7）。このメッセージのスプライシングの結果として、第二の非翻訳領域の外来性エクソンに内在性のTPO遺伝子のエクソン２が融合したものができ、翻訳されたときにTPOを産生することになる。この戦略では第一および第二の標的配列は通常の標的遺伝子の上流であるが、これは必要とはされない（下記参照）。このターゲティング構築物のイントロンの大きさ、および従ってこの遺伝子の翻訳領域に比較しての制御領域の位置は、制御領域の機能を最適化するために様々である。プラスミドpRTPO2は以下のように作製される。TPO上流領域の制限酵素地図（図３）を基礎として、1.8 kbのBamHI-EcoRI 断片がサブクローンpBS(X)/5'Throm b.8（例１）から単離されうる。この断片はBamHIとEcoRIで消化したプラスミドp BS（Stratagene，Inc.、La Jol la、CA）に連結され、pBS-TPO4を生成するためにコンピテント大腸菌細胞が形質転換される。この断片はTPOエクソン１を含むがTPO翻訳領域配列を持たない。次に、Genbankの配列HS5MIEPの塩基番号546にはじまり塩基番号2105に終わるC MVのIEプロモーター配列を、エクソン1と一部のイントロン1を含むTPO遺伝子由来の配列に融合するために、オリゴヌクレオチド2.3から2.6までがPCRで用いられる。これらプライマーの特性は以下の通りである：2.3（配列番号：７）は、G enbankの配列HS5MIEPの塩基番号546（キャップ部位から相対的に-614のところ）にはじまるCMVのIEプロモーターのある部分に相同的な30塩基のオリゴヌクレオチドであり、5'端にXhoI部位を含む；2.4（配列番号：8）および2.5（配列番号：9）はCMV（Genbankの配列HS5MIEPの塩基番号2100）とTPO（TPOの翻訳開始部位から相対的に塩基番号-1881）の融合体と特徴付けられるような60塩基の相補的であるようなプライマーである；2.6（配列番号：10）は長さ27塩基であり、TPO の翻訳開始部位から相対的に塩基番号-1374のところでTPOイントロン1内で終結するTPO配列に類似しており、本来のApaI部位を含む。オリゴ2.3（配列番号：７）オリゴ2.4（配列番号：8） 5’catgggtctt ttctgcagtc accgtccttg CTACCCATCT GCTCCCCAGA GGGCTGCCTG オリゴ2.5（配列番号：9） 5’CAGGCAGCCC TCTGGGGAGC AGATGGGTAG caaggacggt gactgcagaa aagacccatg オリゴ2.6（配列番号：10）オリゴ 2.3〜2.6：小文字でタイプされている塩基はCMV配列を意味する；大文字でタイプされている塩基はTPO配列を意味する。これらのプライマーはCMV IEとTPO配列との融合体を含む2.1 kbのDNA断片を増幅するために使用される。融合断片は最初に、hGHの発現構築物であるpXGH308から1.6 kbの断片を増幅するためにオリゴ2.3と2.4を用いることにより生成されるが、この断片は、Genbankの配列HUMGHCSAの塩基番号5225にはじまり塩基番号732 2に終わるhGH配列に融合されているような、Genbankの配列HS5MIEPの塩基番号54 6にはじまり塩基番号2105に終わるCMVの極く初期の（IE）遺伝子プロモーター領域を持っている（CMVのIE遺伝子の起源は本質的でなく、他のCMV IEプロモーターを基礎とするプラスミドが利用されうるし、また野生型のCMV DNAも利用されうる）。それからpBS(X)/5'Thromb.8（例１）に由来するTPOのエクソン1とTPOのイントロン1の一部分を含む0.54 kbの断片を増幅するために、オリゴ2.5と2.6が用いられる。ふたつの増幅された断片はそれから結合され、さらにオリゴ2.3および2.6を用いて増幅される。結果として得られる産物である2.1 kbのPCR断片は XhoIとApaIで消化され、ゲルで精製される。プラスミドpMCneo-C（上記をみよ）はSalIとXhoIで消化され、1.1 kbのneoを含む断片がゲルで精製される。その後精製された2.1 kbのPCR断片、および1.1 kbのneo断片は混合され、SalIとApaIで切断されたpBS-TPO4（上記）に連結される。連結反応混合液で大腸菌細胞を形質転換し、融合断片とneo遺伝子のそれぞれの単一の挿入があるプラスミドが同定され、neo遺伝子の3'端のところにSalI部位を有するこのプラスミドがpBS-TPO4 のポリリンカーにあるSalI 部位への連結反応により再度生成される。結果として生じるプラスミドはpBS-TPO5と名付けられる。その後、（標的となるヒト細胞で増幅を目的とした選択をするために）dhfrの発現ユニットがpBS-TPO5のneo遺伝子の5'端にあるClaI部位のところに挿入される。このdhfrの発現ユニットはpFSCIS9080［Eatonら、Biochemistry 25:8343〜8 347(1986)］からEcoRIおよびSalIでの消化により単離される。dhfrの発現ユニットを含む2 kb断片はこの消化産物から精製され、DNAポリメラーゼIのKlenow断片で処理することにより平滑末端にされる。その後でClaIリンカー（New England Bi olabs、Beverly、MA）が平滑末端になったdhfr断片に連結される。この連結反応の産物がClaI消化され、ClaI消化されたpBS-TPO5に連結される。この連結反応液の一部で大腸菌が形質転換され、アンピシリン選択プレート上に接種される。細菌コロニーは挿入されたdhfr断片の方向を決定するため、制限酵素消化により解析される。転写方向がneo遺伝子の転写方向と逆向きになっているdhfrを有する一つのプラスミドがpBS-TPO6と名付けられる。プラスミドpRTPO2を完成させるために、プラスミドpBS(X)/5'Thromb.8（例１）はBamHIで部分消化され、SalIリンカーに連結される。結果として得られるDNA はその後SalIとHindIIIで消化され、TPO遺伝子の上流配列を含む3.7 kbの断片が第二の標的配列として利用するために単離される。この断片は標的プラスミドpR TPO2を生成するために、HindIII-SalIで消化したpBS-TPO6に連結される。培養されたヒト細胞内のTPOローカスを標的とするために、pBSプラスミドのバックボーンから標的となるDNA、neo遺伝子、dhfr遺伝子、およびCMVプロモーターを含む標的断片を分離するために、pRTPO2はHindIIIとEcoRIで消化される。 TPO遺伝子の活性化のための第三の戦略は図８に示されている。この戦略では、正常なTPOの制御領域、外来性制御領域を有するTPOエクソン1、TPOイントロン 1、およびエクソン2、翻訳領域、ならびに機能的ではあるが組になっていないスプライシングの供与部位の置き換えのため、標的断片が受容する細胞のゲノムの中に導入される。限定的には、この断片が由来するターゲティング構築物（pRTP O3）はTPO遺伝子上流の配列に相同的な第一の標的配列、増幅可能なマーカー遺伝子、選択可能なマーカー遺伝子、制御領域、CAP部位、ヒト成長ホルモン（hGH ）シグナルペプチドの最初の３1/3アミノ酸をコードする配列を含むエクソン、組になっていないスプライシングの供与部位、およびTPOイントロン2配列に対応する第二の標的配列を含む酔うに設計される。この戦略により相同的に組換えられた細胞は、外来遺伝子をコードするエクソン、TPO遺伝子のイントロン２、TPO 遺伝子のエクソン３、ならびに残りのエクソン、イントロン、およびTPO遺伝子の3'非翻訳領域に対応するmRNAの前駆体を産生する（図８）。このメッセージのスプライシングの結果として外来遺伝子をコードするエクソンに内在性のTPO遺伝子のエクソン３が融合したものができ、翻訳されたときにシグナルペプチドの最初の３つのアミノ酸がhGH由来であるような融合蛋白質を産生する。この戦略では第一の標的配列は通常の標的遺伝子の上流であるが、一方第二標的配列はこの遺伝子の範囲内で、エクソン２と３の間にある。最初の標的配列の位置と標的となっている事象により置き換えられたり欠損したりする上流のDNAの量は制御領域の機能を最適化するために様々である。プラスミドpRTPO3は次のように作製される：Genbankの配列HS5HIEPの塩基番号 546にはじまり塩基番号2105に終わるCMVのIEプロモーター配列を、hGHシグナルペプチドの最初の３1/3アミノ酸をコードするヒト成長ホルモン遺伝子、スプライシングの供与部位、およびTPO遺伝子の第二イントロンからの配列に融合するためのPCRで、オリゴヌクレオチド2.8から2.11が使用される。これらプライマーの特性は以下の通りである：オリゴ2.3（配列番号：11）は、Genbankの配列HS5M IEPの塩基番号546（キャップ部位から相対的に-614のところ）にはじまるCMVのI Eプロモーターのある部分に相同的な30塩基のオリゴヌクレオチドであり、5'端にXhoI部位を含む；2.9（配列番号：12）および2.10（配列番号：13）はCMV（Ge nbankの配列HS5MIEPの塩基番号2100）とhGH配列（hGHの翻訳開始部位から相対的に塩基番号-10；Genbankに登録されているHUMGHCSAのhGH遺伝子N配列をみよ）の融合体と特徴付けられる、69塩基の相補的であるようなプライマーである；これらプライマーはまた、TPOイントロン2の最初の29塩基（TPOの翻訳開始部位から相対的に塩基番号+14から+42まで）を含み、スプライシングの供与部位を含む； 2.11（配列番号：14）は長さ45塩基であり、TPOの翻訳開始部位から相対的に塩基番号+182のところではじまるTPOイントロン2および拡張されている上流域内の TPO配列に類似しており、5'端に本来のEcoRI部位を含む。融合断片は最初に、野生型の極く初期の遺伝子およびプロモーター配列を含む CMVウイルスDNAに由来する0.7 kb断片を増幅するために、オリゴ2.8と2.9を用いることにより生成される（CMVのIE遺伝子の起源は本質的でなく、他のCMV IEプロモーターを基礎とするプラスミドが利用されうる）。それからプラスミドpBS( X)/5'Thromb.8（例１）に由来するTPOのイントロン2の一部分を含む0.17 kbの断片を増幅するために、オリゴ2.10と2.11が用いられる。ふたつの増幅された断片はそれから結合され、さらにオリゴ2.8および2.11を用いて増幅される。結果として得られる産物である0.9 kbのPCR断片はXhoIとEcoRIで消化され、ゲルで精製される。次に、プラスミドpBS(X)/5'Thromb.8（例１）はBamHIで部分消化され、XhoI リンカーに連結される。結果として得られるDNAはその後XhoIとHindIIIで消化され、TPO遺伝子の上流配列を含む3.9kbの断片が第二の標的配列として利用するために単離される。この断片はTPOの翻訳開始部位から相対的に-5985から-2095までの配列を含む（図３）。単離された断片はその後上記により精製された0.9 kb の融合断片およびHindIIIとEcoRIで消化したプラスミドpBS（Stratagene，Inc. 、La Jolla、CA）を含む混合液内部で連結され、pBS-TPO7を生成するためにコンピテント大腸菌細胞が形質転換される。 neoの選択マーカー遺伝子の挿入のため、プラスミドpMCneo-C（上記をみよ）はXhoIとSalIで消化され、XhoIで消化されたpBS-TPO7に連結される。連結反応混合液で大腸菌細胞を形質転換し、転写の方向がCMVプロモーターと逆向きにneo遺伝子の単一の挿入があるプラスミドを同定するため、制限酵素解析によりコロニーが解析される。このプラスミドはpBS-TPO8と名付けられる。その後、（標的となるヒト細胞で増幅を目的とした選択をするために）dhfrの発現ユニットがpBS-TPO8のneo遺伝子の5'端にあるClaI部位のところに挿入される。このdhfrの発現ユニットはpF8SCIS9080［Eatonら、Biochemistry 25:8343〜 8347(1986)］からEcoRIおよびSalIでの消化により単離される。dhfrの発現ユニットを含む2 kb断片はこの消化産物から精製され、DNAポリメラーゼIのKlenow断片で処理することにより平滑末端にされる。その後でClaIリンカー（New Englan d Biolabs、Beverly、MA）が平滑末端になったdhfr断片に連結される。この連結反応の産物がClaI消化され、ClaI消化されたpBS-TPO8に連結される。この連結反応液の一部で大腸菌が形質転換され、アンピシリン選択プレート上に接種される。細菌コロニーは挿入されたdhfr断片の方向を決定するため、制限酵素消化により解析される。転写方向がneo遺伝子の転写方向と逆向きになっているdhfrを有する一つのプラスミドがpRTPO3と名付けられる。培養されたヒト細胞内のTPOローカスを標的とするために、pBSプラスミドのバックボーンから標的となるDNA、 neo遺伝子、dhfr遺伝子、CHVプロモーター、およびhGHをコードするDNAを含む標的断片を分離するために、pRTPO3はEcoRIとHindIIIで消化される。オリゴ2.8（配列番号：11）オリゴ2.9（配列番号：12） 5'cgcggattcc ccgtgccaag CCTAGCGGCA ATGGCTACAG GTGAGAACAC ACCTGAGGGG CTAG GGCCA オリゴ2.10（配列番号：13） 5'TGGCCCTAGC CCCTCAGGTG TGTTCTCACC TGTAGCCATT GCCGCTAGGc ttggcacggg gaatccgcg オリゴ2.11（配列番号：14）オリゴ2.8〜2.11：小文字でタイプされている塩基はCMV配列を示し、大文字で太字でない塩基はTPO配列を示し、太字の塩基はhGHエクソン1配列を示す。 TPO遺伝子を標的とし、活性化するための別のアプローチも行われうる。例えば、第一および第二の標的配列はTPO遺伝子の第一または第二イントロン内の配列に対応し、標的配列はTPO翻訳領域配列を含んでもよい。いかなる活性化の戦略においても、第二の標的配列は、遺伝子の正常な上流領域の一部が相同的組換えで欠損されるように、正常な遺伝子の第一の標的配列にすぐ隣接しておかれたり、近くにおかれたりする必要はない。さらに、ひとつの標的配列がこの遺伝子の上流であり、ひとつがTPO遺伝子のエクソンまたはイントロンの範囲であってもよい。選択可能なマーカー遺伝子は随意であり、増幅可能なマーカー遺伝子は増幅が望ましいときにのみ必要とされる。増幅可能なマーカー遺伝子および選択可能なマーカー遺伝子は同じ遺伝子でありうるし、その位置関係は逆であってもよく、一つまたは両方ともターゲティング構築物のイントロンの内部におかれてもよい。増幅可能なマーカー遺伝子および選択にふさわしい選択可能なマーカー遺伝子は本明細書に説明されている。限定的なCAP部位の結合は随意である。制御領域、CAP部位、第一の非翻訳領域エクソン、スプライシングの供与部位、イントロン、第二の非翻訳領域エクソン、およびすプライシングのアクセプター部位はヒト延長因子−la（EF-la；Genbank配列HUMEF1A)遺伝子もしくはサイトメガロウイルス (CMV；Genbank配列HEHCMVP1)の極く初期の遺伝子から完全なユニットとして単離されうるし、または構成要素は異なる遺伝子から単離された適切な構成要素から組立てられうる。いずれの場合においても、外来性遺伝子のエクソンは正常なTP O遺伝子の最初のエクソンと同じであっても違っていてもよいし、複数の非翻訳領域のエクソンがターゲティング構築物に存在していてもよい。本明細書に説明されているように、多くの選択可能、および増幅可能なマーカーがターゲティング構築物に使用されうるし、活性化は多数の細胞種で効果的でありうる。実施例３：不死化した細胞株におけるTPO遺伝子の活性化と増幅によりTPOのインビトロ産生初代、２代め、または不死化したヒト細胞のトランスフェクションとTPOを発現する相同的に組換えられた細胞の単離は参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第08/243,391号に説明されている方法を用いて行われうる。相同的に組換えられた細胞は、その明細書に例示されているPCRスクリーニング戦略により、当業者に利用可能な出版された方法（例えばHim,H-SとSmithies,O.、Nucl ．Acids Res．16:8887〜8903(1988)参照）で同定されうるTPOを発現する細胞の同定はまた、TPOの構造または特性を基礎とする様々な試験法を用いて行われうる。例えば、TPOはインビトロまたはインビボでの巨核球細胞形成試験法（de Sa uvageら、Nature369：533〜538(1994)）により機能的に同定されうる。または、 TPOはTPOに対するレセプターであるc-mplリガンドを発現する細胞の増殖刺激により試験されうる。この試験法では、Ba/F3-mpl細胞（de Sauvageら、Nature369 ：533〜538(1994)）のような細胞がTPOにさらされ、³H-チミジンの取り込みにより細胞増殖が探知される。TPOはまた、インビボでの血小板産生効果を通じて、直接的な血小板計測値または血小板への35Sの取り込みによって試験されうる。最後に、TPO分子の一部に対応するペプチドが、ELISA試験法で使用するために抗 TPO抗体を産生する目的で合成されうる。増幅可能なマーカー遺伝子の増幅されたコピーおよび活性化されたTPOローカスを有する細胞の単離は参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第07 /9 85,586号に説明されているように行われる。実施例４：ヒトDNase I遺伝子のクローニングと5'フランキング配列の同定ヒトDNase I遺伝子はヒトゲノムDNAライブラリーから単離された。このライブラリー(Clontech，Palo Alto，CA; Cat．#HL1006d)は、男性のリンパ球DNAをMbo Iで部分的に消化し、バクテリオファージベクターであるラムダEMBL3（Clontech ，Palo Alto,CA; Cat．#HL1006d）の中にクローン化することにより作製された。ライブラリーのスクリーニングのために、オリゴヌクレオチド4.1と4.2を用いてヒトゲノムDNAのPCR増幅により、DNAプローブが単離された。オリゴ 4.1（配列番号：15） 5'TGCCTTGAAG TGCTTCTTCA オリゴ 4.2（TPO アンチセンス鎖）（配列番号：16） 5'CCTCAGAGAT GACGAGAATG C これらプライマーは出版されているDNaseＩmRNA配列（Shak S.ら、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 87：9188〜9192(1990)）を基礎として設計された。増幅されたプローブ（プローブA；126 bp）はPCRにより³²P dCTPで標識され、バクテリオファージラムダのゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするために使用された。フィルターは 68℃で16時間、125 mM Na₂HPO₄(pH7.2)、250mM NaCl、10% PE G8000、7% SDS、1mM EDTAの中でハイブリダイズされた。フィルターは500 mlの2 0 mM Na₂HPO₄(pH7.2)、5% SDS、１mM EDTAで２回洗浄し、その後500 mlの20 mM Na₂HPO₄(pH7.2)、1% SDS、１mM EDTAで４回洗浄した。洗浄緩衝液は前もって56 ℃に温められ、洗浄は一回の洗浄あたりおよそ５分間、室温でロータリーシェーカーで行った。ハイブリダイゼーションのシグナルは、増感スクリーンとともに -80℃でのオートラジオグラフィーにより同定された。この実験で、およそ1 ｘ1 0⁶個のファージがスクリーニングされ、18個の陽性シグナルが得られた。陽性シグナルの10個に対応するバクテリオファージのプラークは低濃度で接種され、プローブAを用いた第二回めのスクリーニングを受けた。４つのファージ（2a、3b 、4c、および14aと名付けられた）二次スクリーニングに続いて陽性のハイブリダイゼーションシグナルを与え、さらなる解析のために保存された。プラーク精製されたファージは増幅され、引き続く塩化セシウム勾配超遠心法（Yamamoto K .R.ら、Virology 40:734(1970)）により単離され、DNAが単離された。ライブラリーのスクリーニング、リコンビナントバクテリオファージのプラーク精製、バクテリオファージDNAの単離は標準的な手法を用いて行われた（Ausubelら、Current Pr otocols in Molecular Biology、Wiley、New York、NY.(1987)）。制限酵素とプローブAを用いたサザンハイブリダイゼーション解析を基礎とすると、ふたつのファージ（4cと14a）は、DNase Iのエクソン1の上流にあるおよそ4kbの非転写DNAに加え、エクソン1、イントロン1、エクソン2、イントロン2、イントロン2と下流のDNase Iのエクソンに対応する翻訳領域および非翻訳領域配列を含むおよそ8kbの共通のHincII断片を有する。この断片はひとつのゲノムのクローン（4c）から単離され、さらなる解析のためにプラスミドpBSIISK+（Stra tagene Inc.、La Jolla、CA）にサブクローンされた。結果として得たクローンp BS/4C.2Hincの制限酵素地図が、図９に示される制限酵素地図を生成するために利用された。知られているcDNA配列の5'端の上流にある転写されないDNase Iの5 '領域の塩基配列が図10に示されている（配列番号：17）。エクソン1、イントロン1、および一部のエクソン2を含む知られているcDNA配列の5'端の下流にある塩基配列は図11に示されている（配列番号：18）。本明細書にあるクローン化されたゲノム配列と、出版されているcDNA配列（Shak S.ら、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA87：9188〜9192(1990)）とを比較すると、DNase I遺伝子の5'端は142bpの非翻訳領域のエクソン（エクソン1）と少なくとも341 bpの第二エクソン（エクソン2）を含むことが明らかとなる。エクソン2は、エクソン2の5'端の1 bp下流にあるAUG翻訳開始コドンではじまる22アミノ酸のシグナルペプチドと成熟DNase Iペプチドの一部をコードしている。エクソン1と2は長さ336 bpのイントロン1により分断されている。実施例５：DNase I遺伝子の活性化と増幅のための標的プラスミドの構築 DNase I遺伝子の活性化は図12に概略が示されている戦略により行われうる。この戦略では、制御領域、およびDNase I翻訳領域の上流にある機能をもち、組になっていないスプライシングの供与部位の挿入のため、受容する細胞のゲノムに標的となっている断片が挿入される。限定的にはこの断片が由来するターゲティング構築物（pDNasel)は、DNase I遺伝子上流の配列に相同的な5'標的配列、選択可能なマーカー遺伝子、増幅可能なマーカー遺伝子、制御領域、CAP部位、非翻訳領域エクソン、組になっていないスプライシングの供与部位、および5'標的配列の下流であるがDNase Iエクソン1の上流であるような配列に対応する3'標的配列を含むように設計される。この戦略に従い、相同的組換えによるターゲティング構築物の組み込みによって、DNase I遺伝子上流に導入される非翻訳領域エクソン、3'標的配列、3'標的配列とDNaseI遺伝子のエクソン2の間の任意の配列、ならびにDNase I遺伝子の残りのエクソン、イントロン、および3'非翻訳領域を含むmRNA前駆体を産生するような組換え細胞が生成される（図12）。この転写物のスプライシングにより、結果として外来性の非翻訳領域エクソンに内在性のDN ase I遺伝子が融合ができる。DNase Iは成熟mRNAの翻訳により産生される。この戦略に従うと、5'および3'の標的配列はともに内在性の標的遺伝子の上流にある。ターゲティング構築物のキメライントロンの大きさは、翻訳領域配列に相対的な制御領域の位置として記述されるが、制御領域の機能を最適化するために変動しうる。プラスミドpCND1は活性化カセットを含むが、以下のように構築される：1555b p（オリゴ5.2の5'端に9 bpの合成されたHindIIIの認識部位を含む大きさ）の断片はオリゴ5.1と5.2を用いて増幅される。増幅された断片は、EMBL配列X17403（ヒトサイトメガロウイルスAD169株）の塩基番号172,783にはじまり塩基番号174, 328におわるような、CMV IEプロモーター、CMV IEエクソン1（非翻訳領域エクソン）および827bpのCMVIEイントロン1を含む。（このCMVIE遺伝子の由来は本質的ではなく、CMV IEプロモーターを基礎とするプラスミドまたは野生株のCMV DNA が利用されうる）オリゴ5.1（21bp、配列番号：19）はCAP部位に相対的に-598（ EMBL配列X17403）に位置するCMV IEプロモーターにハイブリダイズする。オリゴ 5.2（32 bp、配列番号：20）はCAP部位に相対的に+946のところでハイブリダイズする23塩基を含み、オリゴの5'にある付加的な9 bpは合成されたHindIII認識配列を生成する。1555 bpのPCR産物はHindIIIで消化され、結果として生ずる155 1 bp断片は精製され、下記に説明されている連結反応に使用される。次に、安定にトランスフェクトされたヒト細胞を単離するときの選択可能なマーカーとしての使用のため、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）遺伝子がpBSneo から単離される。プラスミドpBSneoのneo遺伝子はpMClneoPolyA［Thomas，K.R. とCapecch i,M.R．Cell 51:503〜512(1987)；Stratagene Inc.、La Jolla、CAから入手可能］をBamHIとXhoIで消化することにより得られた。プラスミドpMClneoPolyAはBam HIで消化され、大腸菌DNAポリメラーゼのKlenow断片で、平滑末端とされた。結果として得られたDNAはXhoIで消化され、平滑末端とされたBamHI-XhoI断片はHin cIIとXhoIで消化したプラスミドpBSIISK+にクローン化された。pBSneoに組み込まれているneo遺伝子の単離のために、プラスミドpBSneoはXhoIで消化され、大腸菌DNAポリメラーゼのKlenow断片での処理により平滑末端とされる。この結果生じるDNAはHindIIIで消化され、neo発現ユニットを含む1165 bp断片はゲルで精製される。1165 bpのneo断片および1551 bpのCMVプロモーター断片は連結され、連結反応産物はHindIIIで消化され、二つの断片の平滑末端連結反応で生ずる271 6 bpのHindIII断片がゲルで精製される。2716 bpのHindIII産物はHindIIIで消化されたプラスミドpBSIISK+（Stratagene Inc.、La Jolla、CA）に連結され、大腸菌にエレクトロポレーションされる。pBSIISK+のHindIII部位に挿入のあるコロニーは、挿入の向きを確認するために制限酵素解析により解析される。オリゴ 5.2の配列（CMV IEのCAP部位に相対的に+946）がpBSIISK+のポリリンカー内部の SalI認識配列に近位であるようにCMVプロモーターが方向付けられている一つの組換えプラスミドが同定され、pCN1と名付けられる。オリゴ5.1（配列番号：19） 5'GACATTGATT ATTGACTAGT T オリゴ5.2（配列番号：20） 5'TTTAAGCTTC TGCAGAAAAG ACCCATGGAA AG 次にdhfrの発現ユニットがpCN1のneo遺伝子の3'端に位置するClaI部位のところで挿入される。dhfrの発現ユニットはプラスミドpF8CIS9080（Eatonら、Bioch emistry 25:8343〜8347(1986)）をEcoRIとSalIで消化することにより得られる。結果として生じる2 kbの断片は消化産物から精製され、大腸菌DNAポリメラーゼのKlenow断片で平滑末端とされた。ClaIリンカー（5’CCATCGATGG（NEB 1088；N ew England Biolabs、Beverly、MA)）は平滑末端とされたdhfr断片に連結され、連結産物はClaIで消化される。pCN1はClaIで消化され、このClaI dhfrを含む断片がpCN1のClaI部位に連結される。連結反応の一部は大腸菌にエレクトロポレーションされ、pCN1のClaI部位に挿入が組み込まれているコロニーが挿入部位と挿入方向を決定するために制限酵素解析により解析される。neo遺伝子の3'端にdhfrの発現ユニットを持ち、同一の転写方向を有するプラスミドが同定され、pCND1と名付けられる。プラスミドpDNaselは以下のように構築される：DNase I遺伝子の上流領域の制限酵素地図（図9）を基に、664 bpのBamHI断片（図８の-1161から-498まで）がサブクローンpBS/4C.2Hinc2から単離されうる。この断片は、ポリリンカーのApa I認識配列が破壊されているプラスミドpBSIISK+dApaI（pBSIISK+の改変；Strata gene，Inc.、La Jolla、CA）をBamHIで消化したものに連結される。pBSIISK+dAp aIは、pBSIISK+をApaIで消化し、T4DNAポリメラーゼで突出末端を平滑末端に改変し、環化されたプラスミドを生成するための連結反応を行い構築される。pBSI ISK+dApaIへの664 bpのBamHI断片の連結に引き続き、連結産物はpBS-DNaselを生成するために大腸菌にエレクトロポレーションされる。この断片を含む配列には DNaselエクソン1の上流で、AUG翻訳開始コドン（塩基番号+1）に関して-1162から-498までは存在する。CMVの極く初期の（IE）プロモーター領域、CMV IEのCAP 部位、非翻訳領域エクソン、組になっていないスプライシングの供与部位、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（neo）、選択可能マーカー遺伝子、（標的とされるヒト細胞で、増幅を目的とする選択をするために）dhfr発現ユニットを含む活性化カセットは、pBS-DNaselの664 bpのBamHI断片（DNase Iの上流領域）の一つしかないApaI部位にクローン化される（図12をみよ）。限定的には活性化カセットを含むプラスミドpCND1は、dhfr発現ユニットの下流をせつだんするSalIと、CMV IE CAP部位の242 bp下流を切断するEspIで消化される。活性化カセットを含む3,955 bpのSalI-EspI断片はこの消化産物から精製され、突出末端は、大腸菌DNAポリメラーゼのKlenow断片での処理により平滑末端とされる。この断片は、ApaIで消化し、T4DNAポリメラーゼ処理により平滑末端とされたプラスミドpBS-DNaseIに連結され、大脳菌にエレクトロポレーションされる。pBS-DN aselの平滑末端とされたApaI部位で挿入された活性化カセットの挿入を含むコロニーは、挿入の方向を確認するために制限酵素解析により解析される。転写の向きがDNaseIのエクソン1の方向であるようにCMVプロモーターが位置づけられているひとつの組換えプラスミドが同定され、pDNaselと名付けられる。プラスミドpDNaselはヒト細胞にトランスフェクションするために、BamHIで消化される。初代、２代め、または不死化されたヒト細胞のトランスフェクションと、DNaselを発現する相同的に組換えられた細胞は、米国特許出願第08/243,391 号に説明されている方法を用いて行われうるもので、参照として本明細書に組み入れられる。相同的に組換えられた細胞は、その明細書に例示されているPCRスクリーニング戦略により、当業者に利用可能な出版された方法（例えばHim,H-S とSmithies,O.、Nucl.Acids Res．16:8887〜8903(1988)参照）で同定されうる。 DNase Iを発現する細胞の同定はまた、DNaseIの構造または特質を基に、様々な試験法を用いて行われうる。例えば、DNase Iはインビトロ酵素試験（Kunitz、J ．Gen．Physiol．33：349(1950)）により機能的に、またはELASA試験法で抗DNas eI抗体を使用する事により同定されうる。増幅可能なマーカー遺伝子の増幅されたコピーおよび活性化されたDNase Iローカスを有する細胞の単離は、参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第07/985,586号に説明されているように行われる。実施例６：ヒトβ-インターフェロン遺伝子のクローニングと5'フランキング配列の同定ヒトβ-インターフェロン遺伝子はヒトゲノムDNAライブラリーから単離された。このライブラリー(Clontech，Palo Alto，CA; Cat．#HL1006d)は、MboIで部分的に消化した男性のリンパ球DNAを、バクテリオファージラムダのベクターであるEMBL3の中にクローン化することにより作製された。ライブラリーのスクリーニングのために、オリゴヌクレオチド6.1と6.2を用いてヒトゲノムDNAのPCR増幅により、DNAプローブが単離された。オリゴ6.1（配列番号：21） 5’TGCTCTGGCA CAACAGGTAG オリゴ6.2（配列番号：22） 5’CATAGATGGT CAATGCGGC これらプライマーは出版されているβ-インターフェロンmRNA配列（May，L.T. とSehgal，P.B、J．Interferon Res．5：521〜526(1985)）を基に設計された。増幅されたプローブ（プローブA；290 bp）はPCRにより³²P dCTPで標識され、バクテリオファージラムダのゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするために使用された。フィルターは 68℃で16時間、125 mM Na₂HPO₄（pH7.2）、250mM Na Cl、10% PEG 8000、7%SDS、１mM EDTAの中でハイブリダイズされた。フィルターは500 mlの20 mM Na₂HPO₄(pH7.2)、5% SDS、１mM EDTAで２回洗浄し、その後500 mlの20 mM Na₂HPO₄(pH7.2)、1% SDS、１mM EDTAで４回洗浄した。洗浄緩衝液は前もって56℃に温められ、洗浄は一回の洗浄あたりおよそ５分間、室温でロータリーシェーカーで行った。ハイブリダイゼーションのシグナルは、増感スクリーンとともに-80℃でのオートラジオグラフィーにより可視化された。この実験で、およそ1 ｘ10⁶個のファージがスクリーニングされ、6個の陽性シグナルが得られた。陽性シグナルに対応するバクテリオファージのプラークは低濃度で接種され、プローブAを用いた第二回めのスクリーニングを受けた。5つのファージ（1a 、2a、2b、11a、および12aと名付けられた）が二次スクリーニングに続いて陽性のハイブリダイゼーションシグナルを与え、さらなる解析のために保存された。プラーク精製されたファージは増幅され、引き続く塩化セシウム勾配超遠心法（ Yamamoto K.R.ら、Virology 40:734(1970)）により単離され、DNAが単離された。ライブラリーのスクリーニング、リコンビナントバクテリオファージのプラーク精製、バクテリオファージDNAの単離は標準的な手法を用いて行われた（Ausub elら、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley、New York、NY．(1987 )）。制限酵素消化とプローブAを用いたサザンブロット解析を基に、すべての５つのファージ（1a、2a、2b、11a、および12a）は、β-インターフェロン（561 bp ）をコードする全配列を含むおよそ10kbの共通のHindIII断片と、β-インターフェロン遺伝子の上流にあるおよそ9 kbの転写されないDNAを有することが示された。この断片はひとつのゲノムのクローン（1a）から単離され、さらなる解析のためにプラスミドpBSIISK+（Stratagene Inc.、La Jolla、CA）にサブクローンされた。結果として得たクローンpBS-H3/Bint.11-3とpBS-H3/Bint.11-3は、プラスミドバックボーンに関して逆向きに10 kbのHindIII断片を組み込んでいる。その制限酵素地図が図13に示される制限酵素地図を生成するために利用された。すでに報告されている配列（Genbankに登録されているHUMIFNBIF）の上流にある8,355 bpの DNAの塩基配列が図14に示されている（配列番号：23）。β-インターフェロン翻訳領域の上流356 bpのDNAに対応する塩基配列、β-インターフェロン翻訳領域、および666 bpの3'非翻訳配列の塩基配列が図15に示されている（配列番号：24）。本明細書にあるクローン化されたゲノム配列と、出版されているcDNA配列（Ma y，L.T.とSehgal，P.B、J．Interferon Res．5：521〜526(1985)）とを比較すると、β-インターフェロン遺伝子はその同じ由来のmRNAと同じ長さの561 bpの翻訳領域を含むことが確認される（イントロンがない）。β-インターフェロン遺伝子は、CAP部位の82 bp下流にあるAUG翻訳開始コドンにはじまる、21アミノ酸のシグナル配列と120アミノ酸の成熟ペプチドをコードしている。実施例７：β-インターフェロン遺伝子の活性化と増幅のための標的プラスミドの構築 β-インターフェロン遺伝子の活性化は図16に概略が示されている戦略により行われうる。この戦略では、内在性のβ-インターフェロン制御領域を、外来性の制御領域、非翻訳領域エクソン、イントロン、および非翻訳領域エクソン由来の配列を含む（CMV IE遺伝子のエクソン2に由来する）キメラエクソン配列、ならびにβ-インターフェロン5'非翻訳領域由来の配列と置換するために、受容する細胞のゲノムに標的となる断片が導入される。限定的にはこの断片が由来するターゲティング構築物（pIFNβ-1）は、β-インターフェロン遺伝子上流の配列に相同的な5'標的配列、選択可能なマーカー遺伝子、増幅可能なマーカー遺伝子、制御領域、CAP部位、非翻訳領域エクソン、イントロン、CMV IE遺伝子のエクソン2配列を含むキメラエクソン配列、およびβ-インターフェロン5'非翻訳領域 DNA、ならびにβ-インターフェロン翻訳領域上流のDNAに相同的な3'標的配列を含むように設計される。この戦略に従い、相同的組換えによるターゲティング構築物の組み込みによって、β-インターフェロン遺伝子上流に導入される非翻訳領域エクソン、イントロン、CMV IEエクソン配列にβ-インターフェロン5'非翻訳領域と全β-インターフェロン遺伝子翻訳領域が融合しているキメラエクソン、およびβ-インターフェロン遺伝子の3'非翻訳領域を含むmRNA前駆体を産生するような組換え細胞が生成される（図16）。このキメラエクソンは、β-インターフェロン遺伝子の5 'フランキング領域（AUG翻訳開始コドンに関して塩基番号-173）に結合している 17 bpのCMV IEのエクソン2（EMBL配列X17403の塩基番号172,782から塩基番号174 ,766まで）を含む。この転写物のスプライシングにより、結果として外来性の非翻訳領域エクソンが内在性のβ-インターフェロン遺伝子の全翻訳領域配列を含むエクソン2に融合したものができる。β-インターフェロンは成熟mRNAの翻訳により産生される。この戦略に従うと、5'の標的配列は内在性の標的遺伝子の上流にあり、3'の標的配列はβ-インターフェロン5'非翻訳領域内にある。制御領域の5'フランキング配列に相対的な位置は、制御領域の機能を最適化するために（例えば、ターゲティング構築物内部のイントロンの大きさを変えることにより）変動しうる。プラスミドpIFNβ-1は以下のように構築される：182 bpの断片（オリゴ7.1の5 '端にある9bpの合成されたBamHI認識部位を含む大きさ）はオリゴ7.1と7.2を用いてpBS-H3/Bint.11-3から増幅される。増幅された断片は3'標的配列の用をなす（図16）。オリゴ7.1（21bp、配列番号：25）はβ-インターフェロンのAUG翻訳開始コドンに関して塩基番号-173のところでβ-インターフェロンの5'非転写領域にハイブリダイズする（図15）。オリゴ7.2（30 bp、配列番号：26）はAUG翻訳開始コドンに相対的に塩基番号-1のところでβ-インターフェロンの5'非翻訳領域にハイブリダイズする21塩基を含み（図16をみよ）、合成されたBamHI認識配列を作るようにオリゴの5'端に9bpの付加を有する。182 bpのPCR産物が精製され、以下に説明されるような連結反応に使用される。次に、1571 bp（オリゴ7.3 の5'端にある8 bpの合成SmaI認識配列を含む大きさ）の断片がオリゴ7.3と7.4を用いて増幅される。この増幅された断片は、EMBL配列X17403（ヒトサイトメガロウイルスAD169株）の塩基番号172,328にはじまり塩基番号174,766でおわるような、CMV IEプロモーター、CMV IEエクソン1（非翻訳領域エクソン）、CMV IEイントロン1、および17 bpのCMV IEエクソン2を含む。（このCMVIE遺伝子の由来は本質的ではなく、CMV IEプロモーターを基礎とするプラスミドまたは野生株のCM V DNAが利用されうる。）オリゴ7.3（29 bp、配列番号：27）はCAP部位に相対的に-598（EMBL配列X17403）に位置するCMV IEプロモーターにハイブリダイズする 21塩基を含み、オリゴの5'端はまた8 bpの合成SmaI認識配列を含む。オリゴ7.4 （21bp、配列番号：２ 8）はCAP部位に相対的に+965のところでCMV IEプロモーターにハイブリダイズする。CMV IEプロモーター、CMV IEエクソン1、CMV IEイントロン1、および23 bp のCMV IEエクソン2を含む1571 bpのPCR産物はゲルで精製され、β-インターフェロンの5'フランキング領域を含む182 bpの断片に連結される。この連結反応産物はBamHIとSmaIで消化され、β-インターフェロン配列（AUG翻訳開始コドンに関して塩基番号-173）のCMV IE配列（CMV IE CAP部位に相対的に-598）への連結反応の結果生ずる1742 bpのBamHI-SmaI断片がゲルで精製される。1742 bpのBamHI- SmaI断片はBamHIとSmaIで消化されたプラスミドpBSIISK+（Stratagene Inc.、La Jolla、CA）に連結され、大腸菌にエレクトロポレーションされる。pBSIISK+に挿入を有するコロニーは、挿入の構造を確認するために制限酵素解析により解析される。一つの組換えプラスミドが同定され、pBS-CBと名付けられる。オリゴ7.1（配列番号：25） 5'TGACATAGGA AAACTGAAAG G オリゴ7.2（配列番号：26） 5'TTTGGATCCG TTGACAACAC GAACAGTGTC G オリゴ7.3（配列番号：27） 5'TTTCCCGGGA CATTGATTAT TGACTAGTT オリゴ7.4（配列番号：28） 5'CGTGTCAAGG ACGGTGACTG C 安定にトランスフェクトされたヒト細胞を単離するための選択可能なマーカーとしての使用のため、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）遺伝子がプラスミドpBSneoから単離される。プラスミドpBSneoのneo遺伝子はpMClneo-Pol yA（Thomas,K.R.とCapecchi,M.R．Cell 51:503〜512(1987)）のBamHIとXhoIでの消化により得られた。プラスミドpMClneoPolyAはBamHIで消化され、大腸菌DNAポリメラーゼのKlenow断片で、平滑末端とされた。結果として得られたDNAはXhoI で消化され、平滑末端とされたBamHI-XhoI断片はHincIIとXhoIで消化したプラスミドpBSIISK+にクローン化された。pBSneoに組み込まれているneo遺伝子の単離のために、プラスミドpBSneoはXhoIで消化され、大腸菌DNAポリメラーゼのKleno w断片での処理により平滑末端とされる。この結果生じるDNAはHindIIIで消化され、ne o発現ユニットを含む1165 bpの断片はゲルで精製される。この1165 bpの断片はS maIとHindIIIで消化されたプラスミドpBS-CBに連結され、大腸菌にエレクトロポレーションされる。pBS-CBに挿入を含むコロニーは挿入の向きを確認するために制限酵素解析により解析される。一つの組換えプラスミドが同定され、pBS-CBN と名付けられる。次に、dhfrの発現ユニットがpBS-CBNのneo遺伝子の3'端に位置するClaI部位のところで挿入される。dhfrの発現ユニットはプラスミドpF8CIS9080（Eatonら、B iochemistry 25:8343〜8347(1986)）をEcoRIとSalIで消化することにより得られる。結果として生じる2 kbの断片は消化産物から精製され、大腸菌DNAポリメラーゼのKlenow断片で平滑末端とされた。ClaIリンカー（5'CCATCGATGG；NEB 1088 、New England Biolabs、Beverly、MA)）は平滑末端とされたdhfr断片に連結され、連結産物はClaIで消化され、精製される。このClaI dhfrを含む断片がClaI で消化されたプラスミドpBS-CBNに連結される。連結反応の一部は大腸菌にエレクトロポレーションされ、pBS-CBNのClaI部位に挿入が組み込まれているコロニーが挿入部位と挿入方向を決定するために制限酵素解析により解析される。neo 遺伝子の3'端にdhfrの発現ユニットを持ち、neo遺伝子と同一の転写方向を有するプラスミドが同定され、pBS-CBNDと名付けられる。最後に、ターゲティング構築物は、プラスミドpBS-CBNDのdhfr発現ユニット3' 端に位置する一つしかないSalI部位に、5'標的配列（図16）を挿入することにより作製される。5'標的配列を得るためには、プラスミドpBS-H3/Bint.11-3はEcoR IとPvuIIで消化され、結果として得られる1.2 kbの断片が精製され、EcoRIとSma Iで消化されたプラスミドpBSIISK+（Stratagene Inc.、La Jolla、CA）に連結され、大腸菌にエレクトロポレーションされる。pBSIISK+に挿入を有するコロニーが制限酵素解析により解析され、挿入を有する一つのプラスミドが保存され、pB S-BI5と名付けられる。プラスミドpBS-BI5はSpeIとEcoRVで消化され、DNAポリメラーゼのKlenow断片で平滑末端とされる。結果として得られる1.2 kbの断片はSa lIで切断し、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenow断片で平滑末端とされたプラスミドpBS-CBNDに連結される。平滑末端連結反応液の一部は大腸菌にエレクトロポレーションされ、pBS-CBNDのSalI部位に挿入が組み込まれているコロニーが挿入方向を決定するために制限酵素解析により解析される。dhfr発現ユニットの3'端に EcoRI部位を有するプラスミドが同定され、pIFNβ-1と名付けられる。プラスミドpIFNβ-1はヒト細胞にトランスフェクションを行うために、BamHI で消化される。初代、２代め、または不死化されたヒト細胞のトランスフェクションと、β-インターフェロンを発現する相同的に組換えられた細胞の単離は、米国特許出願第08/243,391号に説明されている方法を用いて行われうるもので、参照として本明細書に組み入れられる。相同的に組換えられた細胞は、その明細書に例示されているPCRスクリーニング戦略により、当業者に利用可能な出版された方法（例えば、Him,H-SとSmithies，O.、Nucl.Acids Res．16:8887〜8903（ 1988）参照）で同定されうる。β-インターフェロンを発現する細胞の同定はまた、β-インターフェロンの構造または特質を基に、様々な試験法を用いて行われうる。例えば、β-インターフェロンはインビトロ逆受動的血球凝集反応試験（Accurate Chemical Corp.、Westbury、NY）、マウス腹膜マクロファージによるスーパーオキシドアニオン産生の刺激（Colligan，J.E.ら、Current Protocol s in Immunology（免疫学の現在のプロトコール）、Wiley、NewYork、NY(1994) ）、またはELASA試験法で抗β-インターフェロン抗体を使用する事により同定されうる。増幅可能なマーカー遺伝子の増幅されたコピーおよび活性化されたβ-インターフェロンローカスを有する細胞の単離は、参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第07/985,586号に説明されているように行われる。同等物当業者は、日常的な実験法以上の方法を使用せずに、本明細書に説明されている発明の限定的な態様に多くの同等物があることを認識または確信できると思われる。このような同等物は以下の請求により包含されることが意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＡＡ６１Ｋ 37/54 ＡＢＭＣ１２Ｎ 5/10 37/66 ＡＢＹ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ヒュージブライアンエム. アメリカ合衆国マサチューセッツ州ベバリークリフトンアベニュー 17 (72)発明者セルダンリチャードエフ. アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウェレスリーブリストルロード 106

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞中で構造遺伝子の発現を調節する（例えば、変化させる）ための、以下の段階を含む方法：（ａ）標的配列、調節配列、および、スプライス供与部位を含むDNA構築物を提供する段階、（ｂ）挿入された構築物が、予め選択された長さの介在DNAによって調節配列と構造遺伝子とが切り離された構造をとり、介在DNAから生じるRNAが、一次転写産物の転写後スプライシングの過程で取り除かれるように置かれたスプライス供与部位を有するような、相同組換え細胞を作出するために、構造遺伝子に関連した予め選択した部位での相同的組換えによって構築物を細胞の中に挿入することにより、調節配列と構造遺伝子との間に介在DNA配列を定着させる段階、および、（ｃ）段階（ｂ）で選択された介在DNAの長さを変化させることにより、構造遺伝子の発現を調節する段階。２．相同的組換えによって細胞の染色体DNAに挿入すると、トロンボポイエチン（thrombopoietin）をコードする遺伝子の発現を変更することができる、請求項１記載の方法で用いるための、以下を含むDNA構築物：（ａ）トロンボポイエチン遺伝子の内側または上流のゲノムDNAにハイブリダイズするDNAを含む標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エクソン、および、（ｄ）対形成していないスプライス供与部位。３．調節配列にプロモーターが含まれる、請求項２記載のDNA構築物。４．選抜マーカー遺伝子をさらに含む、請求項２または請求項３記載のDNA構築物。５．増幅可能なマーカー遺伝子をさらに含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載のDNA構築物。６．トロンボポイエチン遺伝子の内側または上流のゲノムDNAにハイブリダイズするDNAを含む第二の標的遺伝子をさらに含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載のDNA構築物。７．標的配列が、配列番号：３、配列番号：４、もしくはそれらの断片からなる群より選択されるか、または配列番号：３、配列番号：４、もしくはそれらの断片からなる群より選択される配列にハイブリダイズする配列である、請求項２〜６のいずれか一項に記載のDNA構築物。８．標的配列が、配列番号：３の断片であり、少なくとも約20塩基対である、請求項７記載のDNA構築物。９．標的配列が、配列番号：４の断片であり、少なくとも約20塩基対である、請求項７記載のDNA構築物。１０．標的配列が、少なくとも約20塩基対であり、図５（配列番号：４）のヌクレオチドの、約-1815から-145、14から245、または374から570の間にある配列である、請求項９記載のDNA構築物。１１．少なくとも約20塩基対であり、配列番号：３の配列、その断片、および配列番号：３にハイブリダイズする配列からなる群より選択される、請求項２〜１０いずれか一項に記載の構築物の一部として用いるための単離DNA分子。１２．少なくとも約20塩基対であり、図５（配列番号：４）のヌクレオチドの、約-1815から-145、14から245、または374から570の間にある配列と、図５（配列番号：４）のヌクレオチドの、約-1815から-145、14から245、または374から570 の間にある配列にハイブリダイズする配列とからなる群より選択される、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の構築物の一部として用いるための単離DNA分子。１３．トロンボポイエチン遺伝子の発現に変更が加えられている、相同的組換え細胞を産生するための、以下の段階を含む方法：（ａ）トロンボポイエチン遺伝子を含む細胞を、請求項２〜１０のいずれか一項に記載のDNA構築物でトランスフェクションする段階、および、（ｂ）相同的組換えに適した条件下でトランスフェクションした細胞を維持する段階。１４．請求項１３記載の方法によって作出された相同的組換え細胞。１５．外来の調節領域、外来のエクソン、およびトロンボポイエチン遺伝子の内生のスプライス受容部位に機能的に結合させた外来の対形成していないスプライス供与部位を含み、トロンボポイエチンを発現する、請求項１記載の方法によって得られる相同的組換え細胞。１６．外来の調節領域、外来のエクソン、および外来の対形成していないスプライス供与部位が、トロンボポイエチン遺伝子の第２または第３エクソンの内生のスプライス受容部位に機能的に結合されている、請求項１５記載の相同的組換え細胞。１７．トロンボポイエチンを産生するのに適した条件の下で、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の相同的組換え細胞を維持する段階を含む、トロンボポイエチンを産生するための方法。１８．トロンボポイエチン遺伝子の発現に変更が加えられている、トロンボポイエチンを産生するための、以下の段階を含む方法：（ａ）トロンボポイエチン遺伝子を含む細胞を、請求項２〜１０のいずれか一項に記載のDNA構築物でトランスフェクションする段階、および、（ｂ）相同的組換えに適した条件下でトランスフェクションした細胞を維持する段階、および、（ｃ）段階（ｂ）で産生された相同的組換え細胞を、トロンボポイエチンを産生するのに適した条件の下で維持する段階。１９．請求項１７または１８記載の方法によって産生されるトロンボポイエチン。２０．請求項１９記載のトロンボポイエチンを含む薬学的組成物。２１．請求項１４から１６のいずれか一項に記載の相同的組換え細胞を、哺乳動物において治療的有効量のトロンボポイエチンを産生させるのに充分な数量投与することを含む、トロンボポイエチンを必要とする哺乳動物にトロンボポイエチンを提供する方法。２２．相同的組換えによって細胞の染色体DNAに挿入すると、DNase Iをコードする遺伝子の発現を変更することができる、請求項１記載の方法で用いるための、以下を含むDNA構築物：（ａ）DNase I遺伝子の内側または上流のゲノムDNAにハイブリダイズするDNAを含む標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エクソン、および、（ｄ）対形成していないスプライス供与部位。２３．調節配列にプロモーターが含まれる、請求項２２記載のDNA構築物。２４．選抜マーカー遺伝子をさらに含む、請求項２２または２３記載のDNA構築物。２５．増幅可能なマーカー遺伝子をさらに含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のDNA構築物。２６．DNase I遺伝子の内側または上流のゲノムDNAにハイブリダイズするDNAを含む第二の標的配列をさらに含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のDN A構築物。２７．標的配列が、配列番号：１７、配列番号：１８、もしくはそれらの断片からなる群より選択されるか、または、配列番号：１７、配列番号：１８、もしくはそれらの断片からなる群より選択される配列にハイブリダイズする配列である、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載のDNA構築物。２８．標的配列が、配列番号：１７の断片であり、少なくとも約20塩基対である、請求項２７記載のDNA構築物。２９．標的配列が、配列番号：１８の断片であり、少なくとも約20塩基対である、請求項２７記載のDNA構築物。３０．標的配列が、少なくとも約20塩基対であり、図１１（配列番号：１８）のヌクレオチドの、約-328から-2の間にある配列である、請求項２９記載のDNA構築物。３１．少なくとも約20塩基対であり、配列番号：１７の配列、その断片、および配列番号：１７にハイブリダイズする配列からなる群より選択される、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の構築物の一部として用いるための単離DNA分子。３２．少なくとも約20塩基対であり、図１１（配列番号：１８）のヌクレオチドの、約-328から-2の間にある配列と、図１１（配列番号：１８）のヌクレオチドの、約-328から-2の間にある配列にハイブリダイズする配列とからなる群より選択される、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の構築物の一部として用いるための単離DNA分子。３３．DNase I遺伝子の発現に変更が加えられている、相同組換え細胞を産生するための、以下の段階を含む方法：（ａ）DNase I遺伝子を含む細胞を、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載のD NA構築物でトランスフェクションする段階、および、（ｂ）相同的組換えに適した条件下でトランスフェクションした細胞を維持する段階。３４．請求項３３記載の方法によって作出された相同的組換え細胞。３５．外来の調節領域、外来のエクソン、および、DNase I遺伝子の内生のスプライス受容部位に機能的に結合した外来の対形成していないスプライス供与部位を含み、DNase Iを発現する、請求項１記載の方法によって得られる相同的組換え細胞。３６．外来の調節領域、外来のエクソン、および外来の対形成していないスプライス供与部位が、DNase I遺伝子の第２エクソンの内生のスプライス受容部位に機能的に結合されている、請求項３５記載の相同的組換え細胞。３７．DNase Iを産生するのに適した条件下で、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の相同的組換え細胞を維持する段階を含む、DNase Iを産生するための方法。３８．DNase I遺伝子の発現に変更が加えられている、DNase Iを産生するための、以下の段階を含む方法：（ａ）DNase I遺伝子を含む細胞を、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載のD NA構築物でトランスフェクションする段階、および、（ｂ）相同的組換えに適した条件下でトランスフェクンョンした細胞を維持する段階、および、（ｃ）段階（ｂ）で産生された相同的組換え細胞を、DNase Iを産生するのに適した条件の下で維持する段階。３９．請求項３７または３８記載の方法によって産生されるDNase I。４０．請求項３９記載のDNase Iを含む薬学的組成物。４１．請求項３４から３６のいずれか一項に記載の相同的組換え細胞を、哺乳動物において治療的有効量のDNase Iを産生させるのに充分な数量投与することを含む、DNase Iを必要とする哺乳動物にDNase Iを提供する方法。４２．相同的組換えによって細胞の染色体DNAに挿入すると、β-インターフェロンをコードする遺伝子の発現を変更することができる、請求項１記載の方法で用いるための、以下を含むDNA構築物：（ａ）β-インターフェロン遺伝子の内側または上流のゲノムDNAにハイブリダイズするDNAを含む標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エクソン、（ｄ）スプライス供与部位（ｅ）イントロン、および、（ｆ）スプライス受容部位。４３．調節配列にプロモーターが含まれる、請求項４２記載のDNA構築物。４４．選抜マーカー遺伝子をさらに含む、請求項４２または請求項４３記載のDN A構築物。４５．増幅可能なマーカー遺伝子をさらに含む、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載のDNA構築物。４６．β-インターフェロン遺伝子の内側または上流のゲノムDNAにハイブリダイズするDNAを含む第二の標的配列をさらに含む、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載のDNA構築物。４７．標的配列が、配列番号：２３、配列番号：２４、もしくはそれらの断片からなる群より選択されるか、または、配列番号：２３、配列番号：２４、もしくはそれらの断片からなる群より選択される配列にハイブリダイズする配列である、請求項４２記載のDNA構築物。４８．標的配列が、配列番号：２３の断片であり、少なくとも約20塩基対である、請求項４７記載のDNA構築物。４９．標的配列が、配列番号：２４の断片であり、少なくとも約20塩基対である、請求項４７記載のDNA構築物。５０．少なくとも約20塩基対であり、配列番号：２３の配列、その断片、および配列番号：２３にハイブリダイズする配列からなる群より選択される、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の構築物の一部として用いるための単離DNA分子。５１．β-インターフェロン遺伝子の発現に変更が加えられている相同的組換え組胞を産生するための、以下の段階を含む方法：（ａ）β-インターフェロン遺伝子を含む細胞を、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載のDNA構築物でトランスフェクションする段階、および、（ｂ）相同的組換えに適した条件下でトランスフェクションした細胞を維持する段階。５２．請求項５１記載の方法によって作出された相同的組換え細胞。５３．外来の調節領域、外来のエクソン、外来のスプライス供与部位、ならびに、β-インターフェロン遺伝子に機能的に結合させた外来イントロンおよび外来スプライス受容部位を含み、β-インターフェロンを発現する、請求項１記載の方法によって得られる相同的組換え細胞。５４．β-インターフェロンを産生するのに適した条件の下で、請求項５２または５３記載の相同的組換え細胞を維持する段階を含む、β-インターフェロンを産生するための方法。５５．β-インターフェロン遺伝子の発現に変更が加えられている、β-インターフェロンを産生するための、以下の段階を含む方法：（ａ）β-インターフェロン遺伝子を含む細胞を、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載のDNA構築物でトランスフェクションする段階、および、（ｂ）相同的組換えに適した条件下でトランスフェクションした細胞を維持する段階、および、（ｃ）段階（ｂ）で産生された相同的組換え細胞を、β-インターフェロンを産生するのに適した条件の下で維持する段階。５６．請求項５４または５５記載の方法によって産生されるβ-インターフェロン。５７．請求項５６記載のβ-インターフェロンを含む薬学的組成物。５８．請求項５２または請求項５３記載の相同的組換え細胞を、哺乳動物において治療的有効量のβ-インターフェロンを産生させるのに充分な数量投与することを含む、β-インターフェロンを必要とする哺乳動物にβ-インターフェロンを提供する方法。５９．例えば、（ａ）遺伝子治療、（ｂ）哺乳動物において有効量のTPOを産生させるのに充分な数量の相同的組換え細胞を、哺乳動物中に導入することによって、哺乳動物にTPOを提供すること、（ｃ）呼吸器疾患を軽減するための、インビボでのDNase Iの分泌をもたらすために、DNase Iを発現する相同的組換え細胞を、嚢胞性線維症患者の気管および肺に投与すること、（ｄ）多発性硬化症に関連する増悪を減少させるための、β-インターフェロンのインビボでの分泌をもたらすために、β-インターフェロンを発現する相同的組換え細胞を、多発性硬化症に罹患した患者に移植すること、（ｅ）請求項１８、３８または５５で定義されている段階を含む、TPO、β-インターフェロン、または、DNase Iの患者への輸送、などの治療において用いるための、請求項２〜１０、２２〜３０、もしくは４２〜４９のいずれか一項に記載のDNA構築物、請求項１１〜１２、３１〜３２、もしくは５０のいずれか一項に記載の単離DNA、請求項１４〜１６、３４〜３６、もしくは５２〜５３のいずれか一項に記載の細胞、請求項１９記載のトロンボポイエチン、請求項３９記載のDNase、請求項５６記載のβ-インターフェロン、または、請求項２０、４０、もしくは５７記載の薬学的組成物。６０．請求項２〜１０、２２〜３０、もしくは４２〜４９のいずれか一項に記載のDNA構築物、請求項１１〜１２、３１〜３２、もしくは５０のいずれか一項に記載の単離DNA、請求項１４〜１６、３４〜３６、もしくは５２〜５３のいずれか一項に記載の細胞、請求項１９記載のトロンボポイエチン、請求項３９記載の DNase、または、請求項５６記載のβ-インターフェロンを含む、移植片（例えば、自己移植片、同種移植片、または異種移植片）。６１．例えば請求項５９（ａ）から（ｅ）に列挙されている治療などの、治療に用いるための請求項６０記載の移植片。６２．請求項２〜１０、２２〜３０、もしくは４２〜４９のいずれか一項に記載のDNA構築物、請求項１１〜１２、３１〜３２、もしくは５０のいずれか一項に記載の単離DNA、請求項１４〜１６、３４〜３６、もしくは５２〜５３のいずれか一項に記載の細胞、請求項１９記載のトロンボポイエチン、請求項３９記載のDN ase、または、請求項５６記載のβ-インターフェロンを含む薬学的組成物または装置において、例えば、関門装置、ネブライザー、アトマイザー、または経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、気管内、もしくは皮下の経路による輸送に適した形状にあるものをさらに含む、組成物または装置。