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JP2003535564A - ベクター構築物の細胞ｄｎａとの非相同組換えによる内因性遺伝子の発現 - Google Patents

ベクター構築物の細胞ｄｎａとの非相同組換えによる内因性遺伝子の発現

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JP2003535564A
JP2003535564A JP2000512942A JP2000512942A JP2003535564A JP 2003535564 A JP2003535564 A JP 2003535564A JP 2000512942 A JP2000512942 A JP 2000512942A JP 2000512942 A JP2000512942 A JP 2000512942A JP 2003535564 A JP2003535564 A JP 2003535564A
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アサーシス，インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般には、遺伝子の発現を活性化すること、またはｉｎｓｉｔｕでの組換え法によって遺伝子を過剰発現させることに関する。本発明はまた、一般には、細胞において通常見出されるレベルよりも高いレベルで、内因性遺伝子を細胞において発現させるための方法に関する。本発明の１つの実施形態において、内因性遺伝子の発現が、遺伝子の発現を活性化する調節配列の非相同組換えまたは非正統的組換えによる細胞への組み込みの後に活性化または増大される。別の実施形態において、内因性遺伝子の発現は、１つまたは複数の増幅可能なマーカーを同時に組み込み、そして組み込まれたベクターに存在する１つまたは複数の増幅可能なマーカーのコピー数の増大について選択することによってさらに増大させることができる。本発明はまた、標的配列が組み込みに必要とされないので、現在の方法で発見することができない遺伝子の同定および発現を行うための方法を提供する。本発明はまた、膜貫通タンパク質をコードする核酸分子（特に、ｃＤＮＡ分子）の単離方法、および異種の膜貫通タンパク質であり得るそのような膜貫通タンパク質を発現する細胞の単離方法を提供する。本発明はまた、単離された遺伝子、遺伝子産物、核酸分子、およびそのような遺伝子、遺伝子産物および核酸分子を含む組成物に関する。これらは、様々な治療的適用および診断的適用において使用することができる。従って、本発明によって、ヒトの疾患および発達に関連する遺伝子を含む内因性遺伝子の活性化および単離を、遺伝子の配列、構造、機能または発現の特徴に関する事前の知識を用いることなく行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明の技術分野は、遺伝子発現の活性化またはｉｎ ｓｉｔｕ組換え法によ
る遺伝子の過剰発現の誘発である。本発明は、細胞に通常見られるよりも高いレ
ベルでの細胞における内在性遺伝子の発現に関する。遺伝子の発現は、遺伝子の
発現を活性化する調節配列が、非相同的（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）また
は非正統的（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）組換えにより組込まれた後に、活性化
または増加する。標的配列が組込みに全く必要ないため、この方法により、現在
の方法では発見できない遺伝子の同定および発現が可能となる。従って、ヒトの
疾病および発達に関連する遺伝子産物が、よく特徴づけられた遺伝子からだけで
なく、シークエンスされておらず、実際、その存在が知られていない遺伝子から
も得ることができる。本法は、治療および診断のための該遺伝子の遺伝子産物を
提供する。
【０００２】 （背景技術） ヒトの疾病に関連する新規遺伝子の同定および過剰発現は、新規な治療薬の開
発に向けて重要なステップである。タンパク質を過剰発現する細胞のライブラリ
ーの創製に対する現在のアプローチは、ｃＤＮＡの産生およびクローニングを基
本とする。従って、このアプローチを使用して新規な遺伝子を同定するためには
、遺伝子が、ライブラリーの作成に使用した細胞中に発現されていなければなら
ない。遺伝子はまた、ライブラリー中に妥当に示されるに十分なレベルで発現さ
れなければならない。これは、多くの遺伝子が非常に少ない量で、僅かな細胞個
体群中に、または短い発達期間中にしか発現されていないため問題である。
【０００３】 さらに、いくつかのｍＲＮＡはサイズが大きいために、生物学的に活性なタン
パク質を発現できる全長ｃＤＮＡ分子を産生することは困難であるか、または不
可能である。全長ｃＤＮＡ分子の欠乏はまた、小さなｍＲＮＡにおいても観察さ
れ、逆転写により産生するのが困難であるか、または細菌における繁殖中に不安
定であるメッセージ中の配列と関連があると考えられている。結果として、最も
完全なｃＤＮＡライブラリーでさえ、あり得る遺伝子の全セットの一部のみしか
発現しない。
【０００４】 最後に、多くのｃＤＮＡライブラリーが細菌ベクターで産生される。生物学的
に活性な哺乳動物タンパク質を発現するためにこれらのベクターを使用すること
は、ほとんどの哺乳動物タンパク質が正しく折りたたまれず、および／または細
菌中で不適切にグリコシル化されるために、極めて限定されている。
【０００５】 それ故、生物学的に活性なタンパク質の忠実な発現を容易にし得る、タンパク
質発現のより代表的なライブラリーの創製法は、極めて価値がある。
【０００６】 現在のタンパク質過剰発現法は、目的の遺伝子をクローニングし、それを適切
なプロモーター／エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、およびスプライス部
位の隣の構築物中に配置し、構築物を適当な宿主細胞に導入することを含む。
【０００７】 別のアプローチは、強力なプロモーターまたは他の調節配列を、前もって同定
した遺伝子に標的化することにより、遺伝子発現を活性化するための相同的組換
えの使用を含む。
【０００８】 ＷＯ９０／１４０９２には、哺乳動物細胞において、目的のタンパク質をコー
ドする遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕ修飾が記載されている。本出願は、目的のタンパ
ク質をコードする遺伝子の部位特異的修飾用の一本鎖オリゴヌクレオチドが記載
されている。マーカーも含み得る。しかし、この方法は、実質的に標的部位に相
同的なオリゴヌクレオチド配列が提供される場合に限定される。従って、この方
法は、部位特異的修飾および相同的組換えによる活性化に必要とされる部位の知
識を必要とする。新規な遺伝子は、この方法では発見できない。
【０００９】 ＷＯ９１／０６６６７には、哺乳動物遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕ発現法が記載さ
れている。この方法を用いて、増幅遺伝子を、相同的組換えにより標的遺伝子の
隣に導入する。次いで、細胞を適当な培地で増殖すると、増幅遺伝子および標的
遺伝子の両方が増幅され、標的遺伝子の発現が増強する。上記のように、増幅遺
伝子の導入法は、相同的組換えに限定され、配列（または存在）が知られていな
い新規な遺伝子の活性化には有用ではない。
【００１０】 ＷＯ９１／０１１４０には、相同的組換えによる細胞の修飾による内在性遺伝
子の不活性化が記載されている。これらの方法により、相同的組換えを使用して
、遺伝子を修飾して不活性化し、遺伝子療法におけるドナーとして利用できる細
胞が産生される。
【００１１】 ＷＯ９２／２０８０８には、ゲノム標的部位のｉｎ ｓｉｔｕ修飾法が記載さ
れている。修飾は、小さく、例えば、ＤＮＡにおける単一の塩基の変化として記
載される。この方法は、標的化のための相同的ＤＮＡを使用したゲノム修飾に依
拠する。
【００１２】 ＷＯ９２／１９２５５には、相同的組換え（ここでＤＮＡ配列はゲノムまたは
大きなゲノムフラグメントに組込まれる）により達成された、標的遺伝子の発現
を増強する方法が記載されている。次いで、この修飾された配列は、発現させる
ために、二次宿主に移すことができる。増幅遺伝子は、標的遺伝子の隣に組込む
ことができ、よって標的領域は発現増強のために増幅され得る。相同的組換えは
、この標的化アプローチに必要である。
【００１３】 ＷＯ９３／０９２２２には、所望の産物をコードする内在性遺伝子の活性化に
よりタンパク質を生成する方法が記載されている。調節領域を、相同的組換えに
より標的化し、発現が望ましい遺伝子と通常関連する領域を置換または無効化す
る。この無効化または置換により、正常よりも高いレベルでの遺伝子の発現が引
き起こされる。
【００１４】 ＷＯ９４／１２６５０には、細胞においてｉｎ ｓｉｔｕで内在性遺伝子の発
現を活性化および内在性遺伝子を増幅する方法を記載し、ここでこの遺伝子は細
胞において発現されていないか、または所望のレベルで発現されていない。細胞
を、細胞に存在する配列を修復、変化、欠失、または置換する、あるいは細胞の
内在性遺伝子と正常に機能的に結合していない調節配列である外来性ＤＮＡ配列
とトランスフェクトさせる。これを行うために、前以って選択した部位でゲノム
ＤＮＡ配列と相同的なＤＮＡ配列を使用して、内在性遺伝子を標的化する。さら
に、選択マーカーをコードする増幅ＤＮＡも含めることができる。相同的に組換
えた細胞を、増幅に選択した条件下で培養することにより、内在性遺伝子および
増幅マーカーの両方が共増幅され、遺伝子の発現は増加する。
【００１５】 ＷＯ９５／３１５６０には、相同的組換え用のＤＮＡ構築物が記載されている
。この構築物は、標的配列、調節配列、エキソン、および不対スプライスドナー
部位を含む。標的化は、細胞におけるゲノム配列と構築物の相同的組換えにより
達成され、インビトロ(ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）
でのタンパク質の産生が可能となる。
【００１６】 ＷＯ９６／２９４１１には、相同的組換えにより、ゲノムの前以って選択した
部位に導入した、外来性調節配列、コードまたは非コード、外来性エキソン、お
よびスプライスドナー部位を使用する方法が記載されている。本出願において、
導入されたＤＮＡは、外来性調節領域の制御下の転写物が、トロンボポエチン、
デオキシリボヌクレアーゼＩ、またはβ−インターフェロン遺伝子のいずれかに
存在する、外来性エキソンおよび内在性エキソンの両方を含むように位置し、そ
の結果、外来性および外来性エキソンが機能的に結合した転写物が生成する。新
規な転写単位が、相同的組換えにより産生される。
【００１７】 米国特許第５，２７２，０７１号には、細胞において正常に発現される遺伝子
の発現を促進できるＤＮＡ調節エレメントを挿入することによる、細胞における
転写的にサイレントな遺伝子の転写活性化が記載されている。調節エレメントを
、正常なサイレント遺伝子と機能的に結合するように挿入する。挿入は、正常な
サイレント遺伝子（標的ＤＮＡ）のセグメントを有するＤＮＡ構築物および所望
の転写を誘導するために使用したＤＮＡ調節エレメントを創製することにより、
相同的組換えを用いて達成される。
【００１８】 米国特許第５，５７８，４６１号には、相同的組換えによる哺乳動物標的遺伝
子発現の活性化を議論する。ＤＮＡ配列を、ゲノムまたは大きなゲノムフラグメ
ントに組込み、標的遺伝子の発現を増強する。次いで、修飾された構築物を二次
宿主に移すことができる。増幅遺伝子を標的遺伝子の隣に組込むことができ、よ
って標的領域は発現増強のために増幅される。
【００１９】 上記のアプローチは両方共（クローニングによる、またはインビボでの相同的
組換えによる過剰発現構築物の構築）、過剰発現し得る前に、遺伝子をクローン
化しおよびシークエンスする必要がある。さらに、相同的組換えを使用すると、
ゲノム配列および構造も知らなければならない。
【００２０】 残念なことに、多くの遺伝子は未だに同定および／またはシークエンスされて
いない。従って、以前にクローン化されたかどうか、配列および構造が既知であ
るかどうかに関わらず、目的の遺伝子を過剰発現する方法が有用である。
【００２１】 （発明の開示） 本発明は、それ故、一般的に、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法
に関し、これは、転写調節配列を含むベクターを細胞に導入し、ベクターを非相
同的組換えにより細胞のゲノムに取込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発
現させることを含む。この方法は、内在性遺伝子の配列の、またはさらには遺伝
子の存在の予備知識を必要としない。
【００２２】 本発明はまた、非相同的組換えにより、遺伝子発現を活性化または遺伝子を過
剰発現させる、新規なベクター構築物を包含する。新規な構築物には、相同的な
標的配列がない。すなわち、宿主細胞ＤＮＡを標的とし、その標的部位において
相同的組換えを促進するヌクレオチド配列を含まず、導入された転写調節配列を
介して細胞性遺伝子の過剰発現を引き起こす。
【００２３】 新規なベクター構築物は、不対スプライスドナー配列(unpaired splice donor
sequence)に機能的に結合した転写調節配列を含むベクターを含み、さらに、１
つ以上の増幅可能なマーカーを含む。
【００２４】 新規なベクター構築物は、翻訳開始コドンとシグナル分泌配列と不対スプライ
スドナー部位とに機能的に結合した転写調節配列を有する構築物と、翻訳開始コ
ドンとエピトープタグと不対スプライスドナー部位とに機能的に結合した転写調
節配列を有する構築物と、翻訳開始コドンとシグナル配列とエピトープタグとに
機能的に結合した転写調節配列および不対スプライスドナー部位を含む構築物と
、翻訳開始コドンとシグナル分泌配列とエピトープタグと配列特異的プロテアー
ゼ部位に機能的に結合した転写調節配列および不対スプライスドナー部位を有す
る構築物とを含む。
【００２５】 ベクター構築物は、組換え宿主細胞選択のための１つ以上の選択マーカーを含
むことができる。あるいは、選択は、活性化内在性遺伝子産物により付与される
特性に関する表現型選択により実施できる。
【００２６】 これらのベクター、および実際本明細書に開示した任意のベクター、およびそ
の技術分野における通常の当業者により容易に認識されるベクターの変形を、本
明細書に記載した任意の方法に使用して、これらの方法により産生できる任意の
組成物を形成することができる。
【００２７】 本発明のベクター構築物で使用した転写調節配列は、プロモーターを含むがこ
れに限定されない。好ましい実施形態において、プロモーターはウイルス性プロ
モーターである。非常に好ましい実施形態において、ウイルス性プロモーターは
、サイトメガロウイルス最初期プロモーターである。別の実施形態において、プ
ロモーターは、細胞性、非ウイルス性プロモーターまたは誘導性プロモーターで
ある。
【００２８】 本発明のベクター構築物に使用した転写調節配列は、エンハンサーを含み得る
がこれに限定されない。好ましい実施形態において、エンハンサーはウイルス性
エンハンサーである。非常に好ましい実施形態において、ウイルス性エンハンサ
ーは、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーである。別の実施形態において
、エンハンサーは細胞性非ウイルス性エンハンサーである。
【００２９】 本明細書に記載した方法の好ましい実施形態において、ベクター構築物は、線
状ＲＮＡまたはＤＮＡであるか、またはこれを含み得る。
【００３０】 ベクターを含む細胞は、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【００３１】 遺伝子を過剰発現する細胞は、活性化されたまたはその発現が増加した内在性
遺伝子の遺伝子産物（また、本明細書では互換的に「発現産物」とも呼ぶ）の所
望の量が、細胞により産生されるに好ましい条件下で、インビトロで培養できる
。次いで、発現産物を単離および精製して、例えば、タンパク質療法または薬物
探索に使用することができる。
【００３２】 あるいは、所望の遺伝子産物を発現する細胞に、インビボで遺伝子産物を発現
させることができる。本発明の、あるかかる態様において、ゲノムに取込まれた
本発明のベクター構築物を含む細胞を、真核生物（例えば脊椎動物、特に哺乳動
物、より特定するとヒト）に、その真核生物におけるインビボでの細胞による遺
伝子の過剰発現または活性化に好ましい条件下で導入し得る。関連した、かかる
本発明の態様において、真核生物に導入する前に、細胞を単離およびクローン化
し得る。
【００３３】 本発明はまた、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは
、転写調節配列および１つ以上の増幅マーカーを含むベクターを、細胞に導入し
、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに組込ませ、細胞において内在
性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【００３４】 ベクターを含む細胞は、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【００３５】 遺伝子を過剰発現する細胞を培養して、内在性遺伝子を増幅する。次いで、細
胞をインビトロで培養し、活性化またはその発現が増加した、増幅した内在性遺
伝子の遺伝子産物の所望量を産生することができる。次いで、遺伝子産物を単離
および精製できる。
【００３６】 あるいは、増幅後、細胞に、内在性遺伝子を発現させ、インビボで所望量の遺
伝子産物を産生させることができる。
【００３７】 しかし、本明細書に記載の方法に使用した任意のベクターは、１つ以上の増幅
マーカーを含むことができると理解される。そこで、ベクターおよび目的のＤＮ
Ａ（すなわち過剰発現した遺伝子を含む）の両方の増幅が細胞で生じ、内在性遺
伝子のさらなる発現増強が得られる。従って、方法は、内在性遺伝子を増幅する
段階を含むことができる。
【００３８】 本発明はまた、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは
、転写調節配列および不対スプライスド供与配列を含むベクターを、細胞に導入
し、ベクターを細胞の非相同的組換えによりゲノムに組込ませ、細胞において内
在性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【００３９】 ベクターを含む細胞を、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【００４０】 遺伝子を過剰発現する細胞を、インビトロで培養し、その発現が活性化または
増加した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望量を産生できる。次いで、遺伝子産物
を単離および精製できる。
【００４１】 あるいは、細胞に、インビボで所望の遺伝子産物を発現させることができる。
【００４２】 ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列から構成できる。
【００４３】 ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列および１つ以上の増幅マーカーか
ら構成できる。
【００４４】 ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列およびスプライスドナー配列から
構成できる。
【００４５】 本発明の任意のベクター構築物はまた、分泌シグナル配列を含むことができる
。分泌シグナル配列は、活性化された内在性タンパク質に機能的に結合するよう
に構築物中に配置している。よって、目的のタンパク質の分泌が細胞において生
じ、そのタンパク質の精製が容易となる。従って、方法は、タンパク質発現産物
が細胞から分泌される段階を含むことができる。
【００４６】 本発明はまた、上記の任意の方法により作成した細胞を包含する。本発明は、
ベクター構築物を含む細胞、ベクター構築物が細胞ゲノムに組込まれた細胞、お
よび内在性遺伝子から所望の遺伝子産物を過剰発現（この過剰発現は導入された
転写調節配列により生じる）している細胞を包含する。
【００４７】 細胞を単離およびクローン化できる。
【００４８】 方法は、例えば真菌、植物または動物などの、真核起源の任意の細胞において
実施することができる。好ましい実施形態において、本発明の方法は、脊椎を有
する細胞、特に、哺乳動物細胞（ラット、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギお
よびヒト細胞を含むがこれに限定されない）、およびより特定するとヒト細胞に
おいて実施し得る。
【００４９】 上記の方法により作成した単一の細胞は、単一の遺伝子または１つ以上の遺伝
子を過剰発現することができる。細胞における１つ以上の遺伝子を、単一の型の
構築物をゲノムの複数の位置に組込むことにより活性化できる。同様に、細胞に
おける１つ以上の遺伝子を、複数の構築物（すなわち１つ以上の型の構築物）を
ゲノムの複数の位置に組込むことにより活性化できる。それ故、細胞は、唯一の
型のベクター構築物または異なる型の構築物を含むことができ、各々、内在性遺
伝子を活性化できる。
【００５０】 本発明はまた、以下を１つ以上行うことにより、上記した細胞を作成する方法
に関する。１つ以上の本発明のベクター構築物の細胞への導入、導入した構築物
の非相同的組換えによる細胞のゲノムへの組込み、細胞における１つ以上の内在
性遺伝子の過剰発現、および細胞の単離およびクローニング。本発明はまた、か
かる方法により産生した細胞（これは単離した細胞であり得る）にも関する。
【００５１】 本発明はまた、特徴づけられた（例えばシークエンスされた）、特徴づけられ
ていない（例えば、その機能は既知であるが、クローン化またはシークエンスさ
れていない遺伝子）、または過剰発現前にはその存在が知られていなかった遺伝
子である、内在性細胞遺伝子などの遺伝子を過剰発現するための上記した細胞の
使用法を包含する。細胞を使用して、インビトロまたはインビボで所望量の発現
産物を産生できる。所望であれば、次いで、この発現産物を、例えば細胞溶解に
より、または増殖培地からの単離により、単離および精製することができる（ベ
クターが分泌シグナル配列を含む場合）。
【００５２】 本発明はまた、上記の方法により作成した細胞のライブラリーを包含する。ラ
イブラリーは、単一のトランスフェクション実験から全クローン、または単一の
トランスフェクション実験からの部分集合のクローンを包含できる。部分集合は
、同一遺伝子または１つ以上の遺伝子、例えば１集合の遺伝子を過剰発現するこ
とができる。トランスフェクションは、単一の構築物を用いて、または１つ以上
の構築物を用いて実施することができる。
【００５３】 ライブラリーはまた、２つ以上のトランスフェクション実験からの全ての組換
え細胞を合わせることにより、単一のトランスフェクション実験からの細胞の１
つ以上の部分集合を合わせることにより、または別々のトランスフェクション実
験からの細胞の部分集合を合わせることにより形成できる。得られたライブラリ
ーは、同一の遺伝子、または１つ以上の遺伝子、例えば１集合の遺伝子を発現で
きる。再度、各これらの個々のトランスフェクションにおいて、ユニークな構築
物または１つ以上の構築物も使用できる。
【００５４】 ライブラリーは、同一の細胞型または異なる細胞型から形成できる。
【００５５】 本発明はまた、同一または異なるトランスフェクション実験から、細胞の様々
な部分集合を選択することにより、ライブラリーを作成する方法に関する。
【００５６】 本発明はまた、内在性遺伝子を過剰発現または活性化するために、またはかか
る過剰発現または活性化した遺伝子の遺伝子発現産物を得るために、上記の細胞
または細胞のライブラリーを使用する方法に関する。本発明のこの態様により、
細胞またはライブラリーは、遺伝子の発現についてスクリーニングし得、所望の
遺伝子産物を発現する細胞を選択し得る。次いで、細胞を使用して、その後の使
用のために遺伝子産物を単離または精製できる。細胞における発現は、細胞によ
る内在性遺伝子の発現産物の産生に好ましい条件下で、インビトロで細胞を培養
することにより、または細胞に遺伝子をインビボで発現させることにより行うこ
とができる。
【００５７】 本発明の好ましい実施形態において、方法は、発現産物を単離または精製する
プロセスを含む。非常に好ましい実施形態において、内在性遺伝子産物を発現す
る細胞を、市販、特に診断、治療および薬物探索使用のために、十分量の遺伝子
産物の産生に好ましい条件下で培養する。
【００５８】 いずれの方法も、さらに、ベクター組込み前または同時に、二本鎖破壊を細胞
のゲノムＤＮＡに導入することを含むことができる。
【００５９】 本発明の他の好ましい実施形態は、以下の図面および本発明の明細書、および
請求の範囲に照らして、その技術分野における通常の当業者には明らかである。
【００６０】 （発明を実施するための最良の形態） 非相同的組換えによる遺伝子の活性化には、他の遺伝子活性化法よりも非常に
多くの利点がある。以前のタンパク質過剰発現法とは異なり、本明細書に記載し
た方法は、目的の遺伝子をクローン化（細胞から単離）する必要がない。また、
過剰発現する遺伝子のＤＮＡ配列または構造の知識（すなわち、ＯＲＦ、イント
ロン、エキソン、または上流および下流調節エレメントの配列）、または遺伝子
発現パターン（すなわち、組織特異性、発現調節等）の知識を全く必要としない
。さらに、この方法は、目的の遺伝子のゲノム組織に関する知識を全く必要とし
ない（すなわちイントロンおよびエキソン構造）。
【００６１】 従って、本発明の方法は、相同的組換えのための標的ヌクレオチド配列を含ま
ないベクター構築物に関する。標的配列により、細胞性ＤＮＡ上の前もって決定
した部位における細胞性ＤＮＡとベクターＤＮＡの相同的組換えが可能となり（
その部位はベクターの配列と相同性を有する）、前もって決定した部位での相同
的組換えにより、転写調節配列がゲノムに導入され、続いて内在性遺伝子の活性
化が起こる。
【００６２】 本発明の方法は、前もって決定した部位でのベクターの組込みに関するもので
はない。代わりに、本法は、非相同的または「非正統的」組換えにより、本発明
のベクター構築物の細胞性ＤＮＡ（例えば細胞ゲノム）への組込みに関する。
【００６３】 本明細書に記載のベクターは標的配列を含まない。標的配列は、活性化する遺
伝子内または活性化する遺伝子の上流の配列または配列群と相同性を有するベク
ター上の配列であり（ここで、上流領域は、目的の遺伝子の同一のコード鎖上の
最初の機能的スプライス受容部位まで、およびこれを含む）、この相同性を用い
て、目的の遺伝子を活性化する転写調節配列を、活性化する遺伝子を含む細胞の
ゲノムに組込む。内在性遺伝子を活性化するためのエンハンサー組込みベクター
の場合、ベクターは、エンハンサー機能が有効な距離範囲において、目的の遺伝
子の上流または下流のゲノム内（または目的の遺伝子内）のどの配列も相同性を
含まない。
【００６４】 それ故、本法は、慣用的および現在利用可能なクローニング技術を使用して見
落とした、または見落とし得る、新規な遺伝子を同定できる。本明細書に記載し
た構築物および方法の使用により、知られていないおよび／または特徴づけられ
ていない遺伝子を、迅速に同定および過剰発現でき、タンパク質を産生できる。
タンパク質は、とりわけ、ヒト治療剤および診断剤として、および薬物探索の標
的として使用される。
【００６５】 この方法はまた、タンパク質をインビトロまたはインビボで産生するための、
既知および／または特徴づけられている遺伝子の過剰発現を行うことができる。
【００６６】 「既知」遺伝子は、遺伝子の特徴づけのレベルに関する。本発明により、特徴
づけられている遺伝子の発現、並びに、特徴づけられていない遺伝子の発現が可
能となる。様々なレベルの特徴づけが可能である。これらは、詳細な特徴づけ（
例えばクローニング、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質シークエンス
）、および遺伝子の調節および機能のクローン化配列への関連を含む（例えば、
プロモーターおよびエンハンサー配列の認識、オープンリーディングフレーム、
イントロン等の機能）。特徴づけは、例えば遺伝子のマッピングおよび機能の関
連づけ、部分的アミノ酸またはヌクレオチド配列の獲得、または精製タンパク質
の獲得および機能の確認などのように詳細度を低くし得る。特徴づけは、ヌクレ
オチドまたはアミノ酸配列が既知であるか、またはタンパク質を単離したが、そ
の機能は知られていない場合には、最小限であってもよい。あるいは、機能は、
既知であるが、関連するタンパク質またはヌクレオチド配列は知られていないか
、または既知であるが機能と相関させなくてもよい。最後に、遺伝子の存在およ
びその機能の両方が知られていないという点で特徴づけが全くないこともあり得
る。本発明により、任意の様々な特有の特徴づけ度合いにおける任意の遺伝子の
発現が可能となる。
【００６７】 多くの異なるタンパク質（また、本明細書では互換的に「遺伝子産物」または
「発現産物」とも呼ぶ）を、単一の活性化構築物により、および１セットのトラ
ンスフェクションで活性化および過剰発現することができる。従って、１セット
のトランスフェクション体（ライブラリー）における単一の細胞または異なる細
胞は、同一または異なる構築物でトランスフェクションした後、１つ以上のタン
パク質を過剰発現できる。以前の活性化法は、活性化する各遺伝子につき、ユニ
ークな構築物を創製することが必要である。
【００６８】 さらに、単一の遺伝子に隣接する多くの異なる組込み部位を、単一の構築物を
使用して同時に創製および試験することができる。これにより、タンパク質発現
のための、活性化構築物の最適なゲノム位置を迅速に決定できる。
【００６９】 以前の方法を使用すると、目的の遺伝子の５'端を、配列および構造に関して
広範に特徴づけなければならなかった。産生する各活性化構築物について、適当
な標的配列を単離しなければならなかった。通常、これは、活性化する細胞とし
て、同一のヒトまたは動物の実験室株から単離された同質遺伝子的配列でなけれ
ばならない。ある場合には、このＤＮＡは、目的の遺伝子から５０ｋｂまたはそ
れ以上であり得る。従って、各標的構築物の産生は、至難の量の内在性遺伝子の
クローニングおよびシークエンスを必要とする。しかし、配列および構造情報は
、本発明の方法では必要ではないので、知られていない配列および特徴づけられ
ていない上流領域を有する遺伝子を活性化できる。
【００７０】 これは、細胞性ＤＮＡと外来性ＤＮＡ配列の非相同的組換えを使用したｉｎ
ｓｉｔｕ遺伝子活性化を使用すると可能となる。非相同的組換えを使用したｉｎ
ｓｉｔｕ遺伝子活性化を達成するために必要な方法および組成物（例えばベク
ター構築物）は、本発明により提供される。
【００７１】 ＤＮＡ分子は、その遺伝内容をいくつかの異なるおよび別個の機構（相同的組
換え、部位特異的組換え、および非相同的／非正統的組換えを含む）により再分
配するために再結合できる。相同的組換えは、配列が非常に類似しているＤＮＡ
の伸展間の組換えを含む。相同的組換えは、遺伝物質の再分配前に、相同的配列
間のその長さに沿った対形成を含むことが実証された。クロスオーバーの正確な
部位は、相同的セグメントの任意の点であり得る。組換えの効率は、相同的標的
配列の長さ（ホープ（Ｈｏｐｅ）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１３：３９９（
１９９１）；レッディー（Ｒｅｄｄｙ）等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６５：１５０７
（１９９１））、２つの組換え配列の間の配列同一度（フォン・メルフナー（ｖ
ｏｎ Ｍｅｌｃｈｎｅｒ）等、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ６：９１９（１９９２）
）、および構築物上に存在する非相同的ＤＮＡに対する相同的ＤＮＡの比（レト
ソン（Ｌｅｔｓｏｎ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１７：７５９（１９８７））に比
例する。
【００７２】 一方、部位特異的組換えは、特異的ＤＮＡ配列により示される、前もって決定
した部位における遺伝物質の交換を含む。この反応において、タンパク質リコン
ビナーゼは、組換えシグナル配列に結合し、鎖切断を創製し、ＤＮＡ鎖交換を容
易にする。Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換えは、部位特異的組換えの例である。
【００７３】 非相同的／非正統的組換え（例えば本発明の方法により有利に使用したもの）
は、有意な配列相同性を共有せず、部位特異的組換え配列において生じない、遺
伝物質の連結（交換または再分配）を含む。非相同的組換えの例は、非相同的部
位での外来性ＤＮＡの染色体への取込み、染色体転座および欠失、ＤＮＡ末端連
結、染色体末端の二本鎖破壊修復、架橋−破壊融合、およびトランスフェクトし
た配列のコンカテマー化を含む。ほとんどの場合、非相同的組換えは、「自由Ｄ
ＮＡ末端」の連結を通して生じると考えられている。自由末端は、二次ＤＮＡ末
端に直接、または修復またはプロセシング後に、連結できる末端を含むＤＮＡ分
子である。ＤＮＡ末端は、５'突出、３'突出、または平滑断端からなり得る。
【００７４】 本明細書に使用したように、レトロウイルス挿入および他の転位反応は、厳密
ではない形の非相同的組換えと考えられる。これらの反応は、組換え分子間の相
同性の使用を含まない。さらに、部位特異的組換えと異なり、これらの型の組換
え反応は、個別の部位間で生じない。代わりに、特異的タンパク質／ＤＮＡ複合
体が、唯１つの組換え対（すなわち、レトロウイルスまたはトランスポゾン）上
に必要とされ、第二のＤＮＡ対（すなわち細胞ゲノム）は通常比較的に非特異的
である。結果として、これらの「ベクター」は、標的化様式のように細胞ゲノム
に取込まれず、それ故、それらを使用して本発明に記載の活性化構築物を送達す
ることができる。
【００７５】 本明細書に記載の方法に有用なベクター構築物は、理想的には、細胞のゲノム
配列と非相同的組換えを受けて、その細胞において内在性遺伝子を過剰発現する
、転写調節配列を含み得る。本発明のベクター構築物はまた、相同的標的配列を
欠失している。すなわち、それらは、宿主細胞ＤＮＡを標的化し、その標的部位
で相同的組換えを促進する、ＤＮＡ配列を含まない。従って、本発明のベクター
構築物の細胞ゲノムへの取込みは、非相同的組換えにより生じ、組込まれたベク
ター構築物上に含まれる導入された転写調節配列を介して細胞性遺伝子の過剰発
現を導くことができる。
【００７６】 本発明は、一般的に、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、
これは、転写調節配列を含むベクターを細胞に導入し、ベクターを非相同的組換
えにより細胞のゲノムに取込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させる
ことを含む。この方法は、内在性遺伝子の配列の、またはさらには遺伝子の存在
の予備知識を必要としない。しかし、活性化する遺伝子の配列が既知である場合
、構築物を操作して、適当な配置のベクターエレメント（例えば、開始コドンの
位置、内在性遺伝子の最初のエキソンに存在するコドンの添加、および適当なリ
ーディングフレーム）を含ませ、最大過剰発現および／または適当なタンパク質
配列を達成することができる。
【００７７】 本発明のある実施形態において、ベクターを含む細胞を、遺伝子の発現につい
てスクリーニングし得る。
【００７８】 遺伝子を過剰発現する細胞は、活性化されたまたはその発現が増加した内在性
遺伝子の遺伝子産物の所望の量が、細胞により産生されるに好ましい条件下で、
インビトロで培養できる。所望であれば、次いで、発現産物を単離および精製し
て、例えば、タンパク質療法または薬物探索に使用することができる。
【００７９】 あるいは、所望の遺伝子産物を発現する細胞に、インビボで遺伝子産物を発現
させることができる。
【００８０】 ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列から構成できる。
【００８１】 あるいは、ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列および１つ以上の増幅
マーカーから構成できる。
【００８２】 本発明は、それ故、また、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関
し、これは、転写調節配列および増幅マーカーを含むベクターを細胞に導入し、
ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに取込ませ、細胞において内在性
遺伝子を過剰発現させることを含む。
【００８３】 ベクターを含む細胞は、遺伝子発現用についてスクリーニングする。
【００８４】 遺伝子を過剰発現する細胞を培養して、内在性遺伝子を増幅する。次いで、細
胞をインビトロで培養し、活性化またはその発現が増加した、増幅した内在性遺
伝子の遺伝子産物の所望量を産生することができる。次いで、遺伝子産物を単離
および精製できる。
【００８５】 あるいは、増幅後、細胞に、内在性遺伝子を発現させ、インビボで所望量の遺
伝子産物を産生させることができる。
【００８６】 ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列およびスプライスドナー配列から
構成できる。
【００８７】 本発明は、それ故、また、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関
し、これは、転写調節配列および不対スプライスドナー配列を含むベクターを、
細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに組込ませ、細胞
において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【００８８】 ベクターを含む細胞を、遺伝子の発現についてスクリーニングする。
【００８９】 遺伝子を過剰発現する細胞を、インビトロで培養し、その発現が活性化または
増加した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望量を産生できる。次いで、遺伝子産物
を単離および精製できる。
【００９０】 あるいは、細胞に、インビボで所望の遺伝子産物を発現させることができる。
【００９１】 ベクター構築物は、本質的に、不対スプライスドナー配列に機能的に結合した
転写調節配列から構成でき、また、増幅マーカーも含むことができる。
【００９２】 他の活性化ベクターは、転写調節配列、並びに翻訳開始コドンを含むエキソン
配列を有する構築物；転写調節配列、並びに翻訳開始コドンおよび分泌シグナル
配列を含むエキソン配列；転写調節配列、並びに翻訳開始コドンおよびエピトー
プタグを含むエキソン配列を有する構築物；転写調節配列、並びに翻訳開始コド
ン、シグナル配列およびエピトープタグを含むエキソン配列を有する構築物；転
写調節配列、並びに翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、およ
び配列特異的プロテアーゼ部位を有するエキソン配列を含む構築物を含む。各上
記の構築物において、構築物上のエキソンは、不対スプライスドナー部位のすぐ
上流に位置する。
【００９３】 構築物はまた、調節配列、ポリＡシグナルを欠失した選択マーカー、内部リボ
ソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ
）（ｉｒｅｓ）、および不対スプライスドナー部位を含むことができる（図４）
。開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および／またはプロテアー
ゼ開裂部位が、任意により、ｉｒｅｓと不対スプライスドナー配列の間に含まれ
得る。この構築物が遺伝子の上流に組込まれた場合、ポリＡ部位が内在性遺伝子
により供給されるため、選択マーカーは効果的に発現される。加えて、ｉｒｅｓ
によりタンパク質翻訳が下流オープンリーディングフレーム（すなわち内在性遺
伝子）で開始可能となるので、下流の遺伝子もまた発現される。従って、この活
性化構築物により産生されたメッセージは、ポリシストロン性である。この構築
物の利点は、遺伝子の近辺並びに適当な配向で起こらない組込み事象は、薬剤耐
性コロニーを産生しないことである。この理由は、（内在性遺伝子により供給さ
れた）ポリＡテイルがないので、ネオマイシン耐性遺伝子が効果的に発現されな
いからである。非産生的な組込み事象の数を減少させることにより、ライブラリ
ーの複雑性を、その範囲（活性化される遺伝子の数）に影響を及ぼすことなく減
らすことができ、これはスクリーニングのプロセスを容易にする。
【００９４】 この構築物の別の実施形態において、ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え配列を、調節配列
とｎｅｏ開始コドンの間並びにｉｒｅｓと不対スプライスドナー部位の間（ｉｒ
ｅｓと開始コドンの間、存在する場合）に含むことができる。目的の遺伝子を活
性化した細胞を単離した後、細胞をｃｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミ
ドを用いてトランスフェクトすることにより、ｎｅｏ遺伝子およびｉｒｅｓを除
去することができる。これにより、ポリシストロン性メッセージの産生が削除さ
れ、組込まれた活性化構築物上の調節配列から直接、内在性遺伝子を発現するこ
とができる。哺乳動物染色体から遺伝子エレメントを欠失することを容易にする
Ｃｒｅ組換えの使用が、記載されている（グ（Ｇｕ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
５：１０３（１９９４）：サウアー（Ｓａｕｅｒ）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ ２２５：８９０−９００（１９９３））。
【００９５】 従って、本明細書に記載の方法に有用な構築物は、以下を含むがこれに限定さ
れない（また図１から４参照）。 １） 調節配列、並びに翻訳開始コドンを欠失したエキソンを有する構築物。 ２） 調節配列、並びに翻訳開始コドンを欠失したエキソンをスプライスドナー
部位と共に有する構築物。 ３） 調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関し
て）の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する
構築物。 ４） 調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関し
て）の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する
構築物。 ５） 調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関し
て）の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する
構築物。 ６） 調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関し
て）の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライス
ドナー部位と共に有する構築物。 ７） 調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関し
て）の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライス
ドナー部位と共に有する構築物。 ８） 調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関し
て）の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライス
ドナー部位と共に有する構築物。 ９） 調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関し
て）の（５'から３'）翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを不
対スプライスドナー部位と共に有する構築物。 １０） 調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関
して）の（５'から３'）翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを
不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。 １１） 調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関
して）の（５'から３'）翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを
不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。 １２） 調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関
して）の（５'から３'）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープ
タグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。 １３） 調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関
して）の（５'から３'）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープ
タグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。 １４） 調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関
して）の（５'から３'）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープ
タグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。 １５） 調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関
して）の（５'から３'）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、
および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位
と共に有する構築物。 １６） 調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関
して）の（５'から３'）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、
および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位
と共に有する構築物。 １７） 調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関
して）の（５'から３'）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、
および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位
と共に有する構築物。 １８） 選択マーカーに結合した調節配列を、内部リボソーム侵入部位、および
不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。 １９） ｃｒｅ／ｌｏｘ組換えシグナルが、ａ）調節配列と選択マーカーのオー
プンリーディングフレームとの間およびｂ）ｉｒｅｓと不対スプライスドナー部
位との間に位置する構築物１８。 ２０） 停止コドンを欠失した緑蛍光タンパク質を含むエキソンに機能的に結合
した調節配列を不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
【００９６】 しかし、本明細書に記載の方法に使用した任意のベクターは、１つ以上（すな
わち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上、最も好ましくは１つま
たは２つ）の増幅マーカーを含むことができると理解する。従って、方法は、内
在性遺伝子を増幅する段階を含むことができる。活性化構築物上に１つ以上の増
幅マーカーを配置することにより、活性化された細胞において目的の遺伝子と１
つ以上の増幅マーカーの並置が生じる。一旦活性化された細胞が単離されれば、
目的の遺伝子および活性化構築物の両方を含む遺伝子座のコピー数が増加した細
胞を選択することにより、さらに発現を増加させることができる。これは、当業
者に周知の選択法により、例えば、遺伝子構築物またはベクター上に含まれる１
つ以上の増幅マーカーに特異的な１つ以上の選択剤を含む選択培養培地で、細胞
を培養することにより達成できる。
【００９７】 上記の任意のベクターの非相同的組込みにより内在性遺伝子を活性化した後、
組込まれたベクター上に位置する増幅マーカーのコピーが増加したものを選択す
ることにより、内在性遺伝子の発現をさらに増加させ得る。かかるアプローチは
、組込まれたベクター上の１つの増幅マーカーを使用して達成し得るが、別の実
施形態において、本発明は、２つ以上（すなわち、２つ、３つ、４つ、５つ、ま
たはそれ以上、最も好ましくは２つ）の増幅マーカーを、ベクター上に含ませて
、ベクターおよび目的のフランキング遺伝子が増幅した細胞をより効率的に選択
し易くし得る方法を提供する。このアプローチは、ベクター上に含まれる１つ以
上の機能的内在性増幅マーカーのコピーを有する細胞において特に有用である。
なぜなら、この選択法により、ベクターにコードされた増幅マーカーではなく、
内在性増幅マーカーを間違えて増幅した細胞を単離できるからである。このアプ
ローチはまた、遺伝子増幅に関与しない機構により、選択剤に対する耐性を発達
させた細胞に対して選択するのに有用である。２つ以上の増幅マーカーを使用し
たアプローチが、これらの状況では有利である。なぜなら、組込まれたベクター
および目的のフランキング遺伝子を増幅することなく、２つ以上の選択剤に対す
る耐性（２つ以上の増幅マーカーによりコードされた耐性）を細胞が発達させる
可能性は、任意の単一の選択剤に対する耐性を細胞が発達させる可能性よりも有
意に低いからである。従って、２つ以上のベクターによりコードされた増幅マー
カーを、同時または順次選択することにより、最終的に単離された細胞が、多く
の割合で、増幅されたベクターおよび目的の遺伝子を含む。
【００９８】 従って、別の実施形態において、本発明のベクターは、２つ以上（すなわち、
２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上、最も好ましくは２つ）の増幅マーカ
ーを含み得る。このアプローチにより、発現の活性化後にベクター配列および隣
接する目的の遺伝子のより効率的な増幅が可能となる。
【００９９】 本ベクターの構築に使用し得る増幅マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクター
ゼ、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒド
ロ−オロターゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼを含むがこれに限定され
ない。
【０１００】 また、本明細書に記載した任意の構築物は、増幅マーカーの代わりに、または
それと共に、真核ウイルス性複製起源を含み得ると理解される。ウイルス性複製
起源の存在により、組込みベクターおよび隣接する内在性遺伝子をエピソームと
して単離でき、および／または適当なウイルス性複製タンパク質を導入すれば多
くのコピー数を増幅できる。有用なウイルス性起源の例は、ＳＶ ４０ ｏｒｉ
およびＥＢＶ ｏｒｉ Ｐを含むがこれに限定されない。
【０１０１】 本発明はまた、本明細書で開示した構築物が、本質的に、これらの構築物につ
いて特記した成分から構成される実施形態を包含する。また、上記の構築物は、
本明細書に記載の方法に有用な構築物の例であるが、本発明はかかる構築物の機
能性等価体も含むことを理解する。
【０１０２】 「ベクター」なる語は、一般的に、ヌクレオチド配列を細胞に導入する媒体を
意味すると理解される。任意の特定の配列に限定する意図はない。ベクターはそ
れ自体、内在性遺伝子を活性化するヌクレオチド配列であり得るか、または内在
性遺伝子を活性化する配列を含み得る。従って、ベクターは、本質的に、活性化
に必要なこれらの配列のみを含む単純な線形または環形ポリヌクレオチドであり
得るか、または大きなポリヌクレオチド、または他の構築物（例えば、ＤＮＡま
たはＲＮＡウイルスゲノム、全ビリオン、または非常に重要なヌクレオチド配列
の細胞への導入に使用する他の生物学的構築物）におけるこれらの配列であり得
る。
【０１０３】 ベクターは、天然に存在するか、または遺伝子工学または合成プロセスにより
創製されたＤＮＡ配列を含むことができる。
【０１０４】 構築物は細胞のゲノムへの非相同的組込み時に、内在性遺伝子の発現を活性化
できる。内在性遺伝子の発現により、組込み部位（例えば上流領域対イントロン
２）に依存して、全長のタンパク質が産生されるか、または端を切り取った生物
学的に活性な形の内在性タンパク質が得られる。活性化される遺伝子は、周知の
遺伝子（例えば以前にクローン化または特徴づけられた）または知られていない
遺伝子（以前にクローン化または特徴づけられていない）であり得る。遺伝子の
機能は、既知であるか、または知られていない。
【０１０５】 周知の活性を有するタンパク質の例は、サイトカイン、成長因子、神経伝達物
質、酵素、構造タンパク質、細胞表面レセプター、細胞内レセプター、ホルモン
、抗体、および転写因子を含むがこれに限定されない。本法により産生できる既
知タンパク質の特殊な例は、エリスロポエチン、インシュリン、成長ホルモン、
グルコセレブロシダーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、顆粒球コロニ
ー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−
ＣＳＦ）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−
γ、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、イ
ンターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１０、インタ
ーロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インタ
ーロイキン−１４、ＴＧＦ−β、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝
固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、ＴＳＨ−β、骨成長因子
−２、骨成長因子−７、腫瘍壊死因子、α−１アンチトリプシン、抗トロンビン
ＩＩＩ、白血病阻害因子、グルカゴン、プロテインＣ、プロテインキナーゼＣ、
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子、卵胞刺激ホルモ
ンβ、ウロキナーゼ、神経成長因子、インシュリン様成長因子、インシュリノト
ロピン、副甲状腺ホルモン、ラクトフェリン、補体阻害剤、血小板由来成長因子
、ケラチノサイト成長因子、肝細胞成長因子、内皮細胞成長因子、ニューロトロ
ピン−３、トロンボポエチン、絨毛ゴナドトロピン、トロンボモジュリン、αグ
ルコシダーゼ、上皮成長因子、および繊維芽細胞成長因子を含むがこれに限定さ
れない。本発明はまた、トランスメンブランタンパク質を発現する様々な遺伝子
の活性化、およびかかるタンパク質［上記したような成長因子、ホルモン、神経
伝達物質およびサイトカインの細胞表面レセプター、トランスメンブランイオン
チャネル、コレステロールレセプター、リポタンパク質（ＬＤＬおよびＨＤＬを
含む）および他の脂質部分のレセプター、インテグリンおよび他の細胞外マトリ
ックスレセプター、細胞骨格固定タンパク質、免疫グロブリンレセプター、ＣＤ
抗原（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ３４抗原を含む）、および
当業者に周知の他の細胞表面トランスメンブラン構造および機能タンパク質を含
むがこれに限定されない］の産生および単離を可能とする。通常の当業者には理
解されるように、当業者に周知の他の細胞性タンパク質およびレセプターはまた
、本発明の方法により産生し得る。
【０１０６】 本明細書に記載した方法の利点の１つは、事実上任意の遺伝子を活性化できる
ことである。しかし、遺伝子は様々なゲノム構造（様々なイントロン／エキソン
境界および開始コドンの位置）を有するので、細胞個体群内の様々な遺伝子を最
も多く活性化するために、多様な活性化構築物が提供される。
【０１０７】 これらの構築物は、別々に細胞にトランスフェクトさせ、ライブラリーを産生
できる。各ライブラリーは、独特な１セットの活性化された遺伝子を有する細胞
を含む。ある遺伝子は、数個の異なる活性化構築物により活性化される。加えて
、遺伝子の一部を活性化することにより、端を切り取った生物学的に活性なタン
パク質を産生できる。端を切り取ったタンパク質は、例えば、活性化構築物を、
第二エキソンの上流ではなく内在性遺伝子の中間のイントロンまたはエキソンに
組込むことにより産生できる。
【０１０８】 また、異なる構築物の使用により、活性化された遺伝子を新しい配列を含むよ
うに修飾することができる。例えば、分泌シグナル配列を、活性化構築物上に含
ませて、活性化された遺伝子の分泌を容易にすることができる。ある場合には、
イントロン／エキソン構造または目的の遺伝子に依存して、分泌シグナル配列は
、内在性遺伝子のシグナル配列の全部または一部を置換できる。他の場合には、
シグナル配列により、通常は細胞内に位置するタンパク質の分泌が可能となる。
【０１０９】 ベクター上の調節配列は、構成プロモーターであり得る。あるいは、プロモー
ターは誘導性であり得る。誘導プロモーターの使用により、基礎レベルの低い活
性化されたタンパク質が、慣用的な培養および増殖の間に、細胞により産生され
ることが可能となる。よって、細胞を、例えば製造またはスクリーニング中に、
大量の所望のタンパク質を産生するために誘導し得る。誘導プロモーターの例は
、テトラサイクリン誘導プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターを含
むがこれに限定されない。
【０１１０】 本発明の好ましい実施形態において、ベクター上の調節配列は、組織特異的プ
ロモーターまたはエンハンサーであり得る。
【０１１１】 ベクター上の調節配列は、細胞性またはウイルス性ゲノムから単離できる。細
胞性調節配列の例は、アクチン遺伝子、メタロチオネインＩ遺伝子、免疫グロブ
リン遺伝子、カゼインＩ遺伝子、血清アルブミン遺伝子、コラーゲン遺伝子、グ
ロビン遺伝子、ラミニン遺伝子、スペクトリン遺伝子、アンキリン遺伝子、ナト
リウム／カリウムＡＴＰアーゼ遺伝子およびチューブリン遺伝子由来の調節エレ
メントを含むがこれに限定されない。ウイルス性調節配列の例は、サイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子、アデノウイルス後期遺伝子、ＳＶ４０遺伝子
、レトロウイルスＬＴＲ、およびヘルペスウイルス遺伝子由来の調節エレメント
を含むがこれに限定されない。典型的には、調節配列は、ＮＦ−ｋＢ、ＳＰ−１
、ＴＡＴＡ結合タンパク質、ＡＰ−１、およびＣＡＡＴ結合タンパク質などの転
写因子の結合部位を含む。機能的には、調節配列は、内在性遺伝子の転写を、促
進、増強、または別様に変化させる能力により定義される。
【０１１２】 好ましい実施形態において、調節配列は、ウイルス性プロモーターである。非
常に好ましい実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ最初期遺伝子プロモー
ターである。別の実施形態において、調節エレメントは、細胞性、非ウイルス性
プロモーターである。
【０１１３】 好ましい実施形態において、調節エレメントは、エンハンサーを含む。非常に
好ましい実施形態において、エンハンサーは、サイトメガロウイルス最初期遺伝
子エンハンサーである。別の実施形態において、エンハンサーは細胞性、非ウイ
ルス性エンハンサーである。
【０１１４】 転写調節配列は、骨格付着領域またはマトリックス付着部位、負の調節エレメ
ント、および転写因子結合部位から構成できる。調節配列はまた遺伝子座制御領
域も含むことができる。
【０１１５】 本発明は、レトロウイルス転写調節配列、例えば長末端反復配列の使用を包含
する。しかし、これらを使用する場合、それらは活性化する内在性遺伝子（すな
わち転写調節配列が再結合して活性化する細胞性遺伝子）の転写のプロモーター
またはエンハンサーとして、転写調節配列の機能に実質的に作用する任意のレト
ロウイルス配列に必ずしも結合しているわけではない。
【０１１６】 構築物は、ベクター上のエキソン配列に機能的に結合していない調節配列を含
み得る。例えば、調節配列がエンハンサーである場合、それを内在性遺伝子の近
く（例えば、上流、下流、またはイントロン中）に組込むと、その内在性プロモ
ーターから遺伝子の発現を刺激することができる。この活性化機構により、ベク
ター由来のエキソン配列は、活性化された遺伝子の転写物には存在していない。
【０１１７】 あるいは、調節エレメントは、エキソンに機能的に結合し得る。エキソンは、
天然の配列であり得るか、または非天然であり得る（例えば合成により製造）。
最初のエキソンに開始コドンを欠失した内在性遺伝子を活性化するために（例え
ば卵胞刺激ホルモン−β）、開始コドンは、好ましくはベクター上のエキソンか
ら削除する。最初のエキソンに開始コドンを含む内在性遺伝子を活性化するため
に（例えば、エリスロポエチンおよび成長ホルモン）、ベクター上のエキソンは
、好ましくは、開始コドン、通常ＡＴＧ、および好ましくは効率的な翻訳開始部
位を含む（コザック（Ｋｏｚａｋ）、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６：９４７（
１９８７））。エキソンは、開始コドンの後に追加のコドンを含み得る。これら
のコドンは、天然遺伝子由来であり得るか、または非天然であり得る（例えば合
成）。コドンは、活性化する内在性遺伝子の最初のエキソンに存在するコドンと
同一であり得る。あるいは、コドンは、内在性遺伝子の最初のコドンに存在する
コドンとは異なり得る。例えば、コドンは、エピトープタグ、シグナル分泌配列
、トランスメンブランドメイン、選択マーカー、またはスクリーニングマーカー
であり得る。任意により、不対スプライスドナー部位が、エキソン配列のすぐ３
'側に存在し得る。活性化する遺伝子の構造が既知である場合、ベクターのコド
ンが、スプライシング後に内在性遺伝子の第二エキソンのコドンと共にフレーム
内になるように、スプライスドナー部位を位置的にベクターエキソンの隣に配置
する。活性化する内在性遺伝子の構造が既知である場合、各々異なるリーディン
グフレームを含む別々の構築物を使用する。
【０１１８】 機能的結合は、指定された配列（群）を介した転写を可能とする配置と定義す
る。例えば、エキソン配列に機能的に結合した調節配列は、エキソン配列が転写
されることを示す。開始コドンがベクター上に存在する場合、機能的結合はまた
、ベクターエキソン由来のオープンリーディングフレームが、内在性遺伝子のオ
ープンリーディングフレームと共にフレーム内にあることを示す。非相同的組込
み後、ベクター上の調節配列（例えばプロモーター）は、内在性遺伝子に機能的
に連結し、通常ＣＡＰ部位と呼ばれる部位で転写開始を容易にする。転写は、ベ
クター上のエキソンエレメントを介して（存在する場合、開始コドン、オープン
リーディングフレーム、および／または不対スプライスドナー部位を介して）、
および内在性遺伝子を介して進行する。この機能的結合により産生された初期転
写物は、スプライスを受けて、ベクターおよび内在性遺伝子の両方由来のエキソ
ン配列を含むキメラ転写物を創製する。この転写物は、翻訳されて内在性タンパ
ク質を産生できる。
【０１１９】 エキソンまたは「エキソン配列」は、成熟ＲＮＡ分子に存在する任意の転写さ
れた配列と定義する。ベクター上のエキソンは、例えば５'非翻訳領域などの非
翻訳配列を含み得る。あるいは、または非翻訳配列と共に、エキソンは、開始コ
ドンおよびオープンリーディングフレームなどのコード配列を含み得る。オープ
ンリーディングフレームは、天然アミノ酸配列または非天然アミノ酸配列（例え
ば合成コドン）をコードできる。オープンリーディングフレームはまた、シグナ
ル分泌配列、エピトープタグ、エキソン、選択マーカー、スクリーニングマーカ
ー、または内在性遺伝子にスプライスされた場合にオープンリーディングフレー
ムを保存するように機能するヌクレオチドをコードし得る。
【０１２０】 初期転写物のスプライシング（このプロセスによりイントロンが除去される）
は、それぞれ、イントロンの５'および３'末端に位置する、スプライスドナー部
位およびスプライス受容部位により指図される。スプライスドナー部位の共通配
列は、（Ａ／Ｃ）ＡＧ ＧＵＲＡＧＵ（ここでＲはプリンヌクレオチドを示す）
であり、１−３位のヌクレオチドは、エキソンに位置し、ヌクレオチドＧＵＲＡ
ＧＵはイントロンに位置する。
【０１２１】 不対スプライスドナー部位は、本明細書において、下流スプライス受容部位を
含まない、活性化構築物上に存在するスプライスドナー部位として定義する。ベ
クターを非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに組込む場合、不対スプライス
ドナー部位は、内在性遺伝子由来のスプライス受容部位と対を形成する。次いで
、ベクター由来のスプライスドナー部位は、内在性遺伝子由来のスプライス受容
部位と共に、ベクタースプライスドナー部位と内在性スプライス受容部位の間の
全ての配列の切出しを指図する。これらの介入配列の切出しにより、内在性タン
パク質の翻訳を妨害する配列が除去される。
【０１２２】 本明細書で使用した上流および下流なる語は、それぞれ、コード鎖に関して５
'または３'方向にあることを意味する。遺伝子の「上流領域」なる語は、第二エ
キソンの５'核酸配列（コード鎖に関して）から、同コード鎖を有する最初に隣
接する遺伝子の最後のエキソンまでを含むと定義する。機能的に、上流領域は、
非相同的組込みベクターを内在性遺伝子に機能的に結合可能な、内在性遺伝子の
第二エキソンの５'部位である。
【０１２３】 ベクター構築物は、非相同的に組込んだ活性化構築物を含む細胞の同定および
単離を容易にする選択マーカーを含むことができる。選択マーカーの例は、ネオ
マイシン耐性（ｎｅｏ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（
ＨＲＲＴ）、プロマイシン（ｐａｃ）、ジヒドロ−オロターゼグルタミンシンセ
ターゼ（ＧＳ）、ヒスチジンＤ（ｈｉｓＤ）、カルバモイルリン酸シンターゼ（
ＣＡＤ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、多剤耐性１（ｍｄｒ１）、
アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、およびアデノシンデアミナーゼ（ａｄａ）をコ
ードする遺伝子を含む。
【０１２４】 あるいは、ベクターは、選択マーカーの代わりに、または加えて、スクリーニ
ングマーカーを含むことができる。スクリーニングマーカーにより、ベクターを
含む細胞を、薬物または他の選択的圧力下に配置することなく、単離できる。ス
クリーニングマーカーの例は、細胞表面タンパク質、蛍光タンパク質、および酵
素をコードする遺伝子を含む。ベクター含有細胞を、例えば、ベクターにコード
された酵素により蛍光産物に変換可能な細胞表面タンパク質または基質に、蛍光
標識した抗体を使用してＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離装置）により単離し得る。
【０１２５】 あるいは、選択は、内在性遺伝子産物により付与される特性に関する表現型選
択により実施できる。それ故、活性化構築物は、内在性遺伝子自体により付与さ
れる「マーカー」以外の選択マーカーを欠損し得る。この実施形態において、活
性化された細胞は、活性化された遺伝子により付与される表現型に基づき選択可
能である。選択表現型の例は、細胞増殖、成長因子依存性成長、コロニー形成、
細胞分化（例えば、神経細胞、筋肉細胞、上皮細胞等への分化）、足場非依存性
成長、細胞性因子の活性化（例えば、キナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼ等）、
細胞表面レセプター／タンパク質の発現、細胞間接着の増加または減少、遊走、
細胞活性化（例えば、休止対活性化Ｔ細胞）を含む。
【０１２６】 トランスフェクトした細胞について、安定な組込み体を選択することなく、遺
伝子活性化産物のスクリーニングを行う場合、選択マーカーは構築物から削除し
得る。これは、安定な組込み体の効率が高い場合に特に有用である。
【０１２７】 ベクターは、組込みベクターおよび隣接する活性化された内在性遺伝子のコピ
ーの増加した細胞の選択を可能とするために、１つ以上（すなわち、１つ、２つ
、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上、最も好ましくは１つまたは２つ）の増幅
マーカーを含み得る。増幅マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ）、アデノシンデアミナーゼ（ａｄａ）、ジヒドロ−オロターゼグルタミンシ
ンセターゼ（ＧＳ）、およびカルバモイルリン酸シンターゼ（ＣＡＤ）を含むが
これに限定されない。
【０１２８】 ベクターは、遺伝子増幅に有用な真核ウイルス性複製起源を含み得る。これら
の起源は、増幅マーカーの代わりに、または共に存在し得る。
【０１２９】 ベクターはまた、微生物において構築物の繁殖に有用な遺伝子エレメントを含
み得る。有用な遺伝子エレメントの例は、微生物複製起源および抗生物質耐性マ
ーカーを含む。
【０１３０】 これらのベクター、および本明細書で開示した任意のベクター、およびその技
術分野における通常の当業者により認識される明らかなベクターを、本明細書に
記載した任意の方法に使用して、これらの方法により産生できる任意の組成物を
形成することができる。
【０１３１】 構築物の細胞ゲノムへの非相同的組込みにより、ベクター由来の調節エレメン
トと内在性遺伝子由来のエキソンの間に機能的な結合が形成される。好ましい実
施形態において、ベクター調節配列の挿入を使用して、内在性遺伝子の発現をア
ップレギュレートする。遺伝子発現のアップレギュレーションは、転写的にサン
レントな遺伝子の転写的に活性な遺伝子への変換を含む。また、転写的にはすで
に活性であるが、所望よりも少ないレベルのタンパク質を産生する遺伝子につい
ての遺伝子発現の増強も含む。他の実施形態において、内在性遺伝子の発現は、
発現のダウンレギュレーション、誘導性表現型の創製、または発現の組織特異性
の変化など別様に影響され得る。
【０１３２】 本発明によると、遺伝子発現生成物のインビトロでの生成方法は、たとえば、
（ａ）本発明のベクターを細胞へ導入する；（ｂ）非相同組換により、ベクター
の細胞をゲノムに組込む；（ｃ）ベクターに含まれる転写調節配列によって、遺
伝子をアップレギュレートして、細胞内の内在性遺伝子を過剰発現させる；（ｄ
）内在性遺伝子を過剰発現させるために、細胞をスクリーニングする；（ｅ）細
胞による内在性遺伝子の発現生成物の生成に適した条件下で、細胞を培養する；
ことで構成される。このような本発明のインビトロ方法はさらに、単離遺伝子発
現生成物を生成するために、発現生成物の単離を含む。このような方法では、こ
れに限定されるわけではないが、クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、Ｌ
Ｃ、イオン交換、親和性、サイズ排除など）、沈降（硫酸アンモニウム沈降、免
疫沈降など）、電気泳動、通常の当業者に周知のタンパク質単離および精製の別
の方法を含む、周知のあらゆるタンパク質分離方法を有利に利用できる。
【０１３３】 同様に、遺伝子発現生成物のインビボ生成方法は、たとえば、（ａ）本発明の
ベクターを細胞へ導入する；（ｂ）非相同組換により、ベクターの細胞をゲノム
に組込む；（ｃ）ベクターに含まれる転写調節配列によって、遺伝子をアップレ
ギュレートして、細胞内の内在性遺伝子を過剰発現させる；（ｄ）内在性遺伝子
を過剰発現させるために、細胞をスクリーニングする；（ｅ）単離およびクロー
ン化された細胞を、真核生物のインビボ細胞による内在性遺伝子の過剰発現に適
した条件下で、真核生物に導入する；ことで構成される。本発明のこの側面によ
り、菌類（特に酵母）、植物、動物、さらに好ましくは動物、またさらに好まし
くは脊椎動物、もっとも好ましくは哺乳類、特にヒトを含む、あらゆる真核生物
を有利に使用できる。ある関連する実施例において、本発明は、細胞を真核生物
に導入する前に細胞の単離とクローニングを含む方法を提供する。
【０１３４】 本明細書で使用するように、細胞またはインビトロの細胞による、発現生成物
の「生成に有利な条件」、遺伝子の「過剰発現に有利な条件」、遺伝子の「活性
化に有利な条件」という表現は、インビトロの細胞による、発現生成物の生成、
遺伝子の過剰発現または活性化を実現・促進または助長する、適切な環境・物理
・栄養または生化学に関するパラメータのいずれかおよびすべてを指す。このよ
うな条件はもちろん、インビトロの細胞による、発現性生物の生成、あるいは遺
伝子の過剰発現または活性化に適した、あるいは実現・促進または助長する、培
地、インキュベーション、照明、湿度などを含む。同様に、本明細書で使用する
ように、細胞またはインビボの細胞による、発現生成物の「生成に有利な条件」
、遺伝子の「過剰発現に有利な条件」、遺伝子の「活性化に有利な条件」という
表現は、インビボで真核生物内の細胞による、発現性生物の生成、遺伝子の過剰
発現または活性化を実現・促進または助長する、細胞を含む動物を維持するため
の、適切な環境・物理・栄養・生化学・行動・遺伝子および感情に関するパラメ
ータのいずれかおよびすべてを指す。所与の条件セットがインビトロまたはイン
ビボで、遺伝子の発現、活性化または過剰発現にとって有利かどうかは、以下で
説明および例証するスクリーニング法、あるいは遺伝子の発現、活性化または過
剰発現を測定するための当業界において通常の、他の方法を用いて、通常の当業
者が決定できる。
【０１３５】 本発明は、上記の方法のいずれかを用いて作成した細胞も含む。本発明は、ベ
クター作成物、ベクター生成物が組込まれた細胞、内在性遺伝子による過剰発現
する所期の遺伝子生成物である細胞、導入された転写調節配列によって引き起こ
される過剰発現を含む。
【０１３６】 本発明で使用される細胞は、任意の真核種から得ることができ、一次化、二次
化、不死化できる。さらに細胞は、インビボのいずれの組織から得てもよい。単
離および活性化する細胞を得るための、有用な組織の例として、これに限定され
るわけではないが、肝臓、腎臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、筋肉、肺、脳、精巣
、卵巣、島、腸、骨髄、皮膚、骨、胆嚢、前立腺、膀胱、胎仔、免疫および造血
系が挙げられる。細胞の種類としては、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、幹細
胞、卵胞細胞が挙げられる。しかし、本発明を用いて遺伝子発現を活性化するに
は、いずれの細胞または細胞の種類でも使用できる。
【０１３７】 本方法は、菌類、植物または動物などの、真核起源のいずれの細胞内でも実施
できる。好ましい実施例として、脊椎動物、特に哺乳類、そしてさらに好ましく
はヒトが挙げられる。
【０１３８】 作成物は、一次、二次または不死化細胞に組込める。一次細胞とは、脊椎動物
から単離されて、継代培養されていない細胞である。二次細胞とは、継代培養さ
れたが、不死化されていない一次細胞である。不死化細胞とは、見かけ上は無期
限に継代培養可能な細胞系である。
【０１３９】 好ましい実施例では、細胞は不死化細胞系である。不死化細胞系の例として、
これに限定されるわけではないが、ＨＴ１０８０、ＨｅＬａ、Ｊｕｒｋａｔ、２
９３セル、ＫＢ癌、Ｔ８４結腸上皮細胞系、Ｒａｊｉ、Ｈｅｐ Ｇ２またはＨｅ
ｐ ３Ｂ肝癌細胞系、Ａ２０５８黒色腫、Ｕ９３７リンパ腫、Ｗ１３８繊維芽細
胞細胞系、体細胞雑種、融合細胞が挙げられる。
【０１４０】 本発明で用いる細胞は、これに限定されるわけではないが、（ラット、マウス
、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびヒトなどの）哺乳類細胞、鳥類細胞、魚類細
胞、両生類細胞、は虫類細胞、植物細胞、酵母細胞を含む、任意の真核種から得
られる。特定の種による内在性遺伝子または遺伝子生成物の過剰発現は、その種
の細胞内での遺伝子発現を活性化することによって発生することが好ましい。た
とえば、内在性ヒトタンパク質を過剰発現させるには、ヒト細胞を用いる。同様
に、ウシタンパク質を過剰発現させるには、たとえばウシ成長ホルモン、ウシ細
胞を用いる。
【０１４１】 細胞は真核生物のどの組織から得てもよい。単離・活性化する細胞を得る、有
用な脊椎動物の組織としてはたとえば、これに限定されるわけではないが、肝臓
、腎臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、筋肉、肺、脳、免疫系（リンパ腺を含む）、
精巣、卵巣、島、腸、胃、骨髄、皮膚、骨、胆嚢、前立腺、膀胱、接合体、胎仔
、造血組織が挙げられる。有用な脊椎動物の細胞の種類としては、これに限定さ
れるわけではないが、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、生殖細胞（すなわち、
精母細胞／精子および卵母細胞）、幹細胞、卵胞細胞が挙げられる。単離・活性
化する細胞を得る、植物組織としてはたとえば、これに限定されるわけではない
が、葉組織、子房組織、雄ずい組織、雌ずい組織、根組織、塊茎、配偶子、胚な
どが挙げられる。しかし、通常の当業者は、本発明を用いて遺伝子発現を活性化
するのに、あらゆる真核細胞または細胞種類を使用できることを認識するであろ
う。
【０１４２】 説明したいずれかの方法を用いて生成した細胞はすべて、必要な遺伝子生成物
の発現のためのスクリーニングと、細胞内で過剰発現する遺伝子生成物の必要量
の供給に有効である。細胞は、単離・クローニングできる。
【０１４３】 本方法で生成された細胞は、インビトロ（たとえば、タンパク質療法として使
用）またはインビボ（たとえば、細胞療法で使用）でタンパク質を生成するのに
用いられる。
【０１４４】 工業用の培養および生成条件は、分析用途（クローニング、タンパク質または
核酸シークエンシング、抗体培養、Ｘ線結晶分析、酵素学的分析など）に細胞を
培養・調整するのに用いる条件によって変化することが多い。ローラーボトルで
培養する場合の細胞のスケールアップには、細胞を固定する表面積の増加も含ま
れる。そのため、工業用の培養では、マイクロキャリアビーズを追加して表面積
を増加することが多い。撹拌培養での細胞のスケールアップには、体積を大幅に
増加させることが含まれる。マイクロキャリアおよび撹拌培養では、５リットル
以上必要になることもある。興味のあるタンパク質の固有効力（比活性）によっ
て、体積は１から１０リットルと少なくなることもある。１０から１５リットル
が最も普通である。しかし、５０から１００リットルまで必要な場合もあり、体
積が１０，０００から１５，０００リットルにもなることがある。場合によって
は、さらに大きな体積が必要なこともある。細胞は、多数、たとえば５０から１
００個のＴフラスコでも培養できる。
【０１４５】 培養条件にもかかわらず、工業規模のタンパク質精製は、分析目的の精製によ
ってもかなり変化する。工業用の実際的な状況でのタンパク質精製は、最初は、
約１０4細胞／ｍｌで、１０リットルの細胞の細胞量同等物である。細胞精製を
開始する細胞量同等物は、最高１０6または１０7細胞／ｍｌで、１０リットルの
細胞にもなり得る。しかし、通常の当業者は、本方法においては、最初の細胞量
同等物が多くても少なくても有利に利用できることを認識するであろう。
【０１４６】 特に最終生成物を臨床的に使用する際の、別の工業用の培養条件は、意図され
た培地が血清をまったく、あるいは細胞培養に必要な量含まない、無血清培地で
細胞を培養することである。これは明白に、好ましくない毒性汚染物質（ウィル
スなど）あるいは、たとえば精製を複雑にするタンパク質などの他の種類の汚染
物質の共精製を防ぐ。細胞培養用の無血清培地、このような培地の市販供給元、
無血清培地での細胞の培養方法は、通常の当業者には周知である。
【０１４７】 上記の方法で作成した１個の細胞は、１個あるいは複数の遺伝子を過剰発現で
きる。複数の遺伝子は、同一の細胞内に作成物を１個組込むか、作成物を複数（
すなわち、複数の種類の作成物）組込むことによって活性化できる。そのため、
細胞は１種類のベクター作成物のみか、さまざまな種類の作成物を含むことが可
能で、それぞれ内在性遺伝子を活性化できる。
【０１４８】 本発明は、以下の１つまたは複数による、上で説明した細胞作成方法も対象と
している：１個以上のベクター作成物を導入する；導入した作成物を、非相同的
組換によって細胞のゲノムに組込む；細胞内で１個以上の内在性遺伝子を過剰発
現させる；細胞を単離・クローニングする。
【０１４９】 「形質移入」という語は、本明細書では便宜上、ポリヌクレオチドの細胞への
導入を説明する際に用いている。しかし、一般に、ポリヌクレオチドの細胞への
導入を指すのに、この語が明確に使用されていることを理解すべきであり、本明
細書では、（その明確な意味によるのと同様に）電気穿孔法、リポソーム仲介導
入、レトロウィルス仲介導入などの、他の方法による導入を指すことも意図して
いる。
【０１５０】 ベクターは、当業者に周知の多数の方法によって細胞に導入できる。これには
、以下に限定されるわけではないが、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈降、ＤＥ
ＡＥデキストラン、リポフェクション、レセプタ仲介取込、ポリブレン、粒子照
射、マイクロインジェクションが含まれる。あるいは、ベクターは（複製可能ま
たは不可能な）ウィルス性粒子として細胞に送達できる。核酸の送達に有用なウ
ィルスとしてはたとえば、これに限定されるわけではないが、アデノウイルス、
アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス
が挙げられる。核酸分子の細胞への送達に適した、通常の当業者に周知の他のウ
ィルスが、本方法で同様に使用されることがある。
【０１５１】 形質移入の後、細胞は当業者に周知の、ベクターと宿主細胞のゲノムとの非相
同組込に適した条件下で培養される。非相同的に組込まれたベクターを含む細胞
は、当業者に周知の、活性化された内在性遺伝子の発現を促す条件下でさらに培
養される。
【０１５２】 ベクター作成物は、単一のＤＮＡ作成物、あるいは独立した作成物として細胞
に導入され、コンカテマとなる。
【０１５３】 好ましい例では、ベクター作成物が二本鎖ＤＮＡベクター作成物であるのに対
して、ベクター作成物には、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの組合せ
、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの組合せも含まれる
。したがってたとえば、ベクター作成物は、逆転写酵素によってｃＤＮＡに転換
される一本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＤＮＡに転換されるｃＤＮＡ、最終的に宿主細胞ゲ
ノムと組換を行う二本鎖ＤＮＡとなる。
【０１５４】 好ましい例では、作成物は細胞への導入前に直線化される。活性化作成物の直
線化によって、組込過程で染色体末端と反応可能な、ＤＮＡ遊離末端が作成され
る。一般に、作成物は調節要素（および、存在する場合は、エクソンおよびスプ
ライスドナー配列）の下流で直線化される。直線化はたとえば、調節配列の下流
に独特の制限部位を配置したり、形質移入前に該当する制限酵素で作成物を処理
することによって促進できる。要求されない場合は、作成物の直線化部位と、基
部の最も機能的な要素（不対スプライスドナー配列）の間に「スペーサ」配列を
配置すると都合がよい。スペーサ配列が存在すると、形質移入過程におけるヌク
レオチド鎖分解による劣化から、ベクターの重要な機能要素が保護される。この
スペーサは、本明細書で説明したベクターの必須機能を変化させないヌクレオチ
ド配列によって構成できる。
【０１５５】 内在性遺伝子発現を活性化するには、環状作成物も使用できる。環状プラスミ
ドは、細胞への形質移入時に宿主細胞ゲノムに組込可能なことは、当業者に周知
である。形質移入過程で、おそらくＤＮＡの切断が環状プラスミドで発生するた
め、遊離ＤＮＡ末端が染色体末端に結合できるようになる。作成物ではこれらの
切断の一部は、不可欠なベクター機能を破壊しない位置（たとえば、切断は調節
配列の下流で発生する）で発生するため、内在性遺伝子を活性化できる配置で作
成物を染色体に組込むことができる。上で述べたように、スペーサ配列が作成物
に配置される場合がある（たとえば、調節配列の下流）。宿主細胞ゲノムへの組
込後、形質移入の間に、スペーサ領域で発生した切断が、内在性遺伝子の活性化
に適した作成物の部位に遊離末端を生成する。
【０１５６】 本発明は、上で説明した方法で作成した細胞のライブラリも含む。ライブラリ
は、１回の形質移入実験のクローンすべてか、１回の形質移入実験によるクロー
ンのサブセットを含むことができる。サブセットは、同一の遺伝子あるいは複数
の遺伝子、たとえば遺伝子のクラスを過剰発現できる。形質移入は、１種類の作
成物か、複数の種類の作成物によって行うことも可能である。
【０１５７】 ライブラリは、２回以上の形質移入実験による組換細胞すべてを組合わせるか
、１回の形質移入実験による細胞の１個以上のサブセットを組合わせるか、別々
の形質移入実験による細胞のサブセットを組合わせて作成することも可能である
。得られたライブラリは、同一の遺伝子か、複数の遺伝子、たとえば遺伝子のク
ラスを発現できる。これらの各形質移入において再度、独特の作成物あるいは複
数の作成物を使用できる。
【０１５８】 ライブラリは、同一の細胞種類または異なる細胞種類から作成できる。
【０１５９】 ライブラリは、自然なＤＮＡ切断、あるいは、照射、制限酵素および／または
ＤＮＡ切断剤を、ともに（同じ細胞に）または個あるいは（細胞の各グループに
適用し、セルを組合わせてライブラリを作成する）に適用して起こった切断で染
色体に組込まれた１種類の活性化作成物を含む、１種類のセルから構成できる。
このライブラリは、照射、制限酵素および／またはＤＮＡ切断剤を、ともに（同
じ細胞に）または個あるいは（細胞の各グループに適用し、セルを組合わせてラ
イブラリを作成する）適用して処理した細胞のゲノムに組込まれた１個または複
数の作成物を含む、複数の種類の細胞で構成できる。
【０１６０】 本発明は、同一または別個の形質移入実験による細胞の各種サブセットを選択
してライブラリを作成する方法も対象とする。たとえば、（作成物２０を形質移
入した細胞において、緑蛍光タンパク質の存在によって判定した）核核因子を発
現する細胞はすべて、活性化核因子を用いて細胞のライブラリを作成するために
プールできる。同様に、膜や分泌タンパク質を発現する細胞もプールできる。細
胞は、たとえば成長因子独立成長、成長因子独立増殖、コロニー形成、細胞分化
（たとえば神経細胞、筋肉細胞、上皮細胞などへの分化）、足場独立成長、細胞
因子（たとえば、キナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼなど）の活性化、細胞間の
癒着・移入の獲得・損失、細胞活性化（たとえば、静止対活性化Ｔ細胞）などの
表現型によってもグループ化できる。
【０１６１】 本発明は、内在性細胞を過剰発現するために細胞のライブラリを用いる方法も
対象としている。このライブラリは遺伝子の発現についてスクリーニングされ、
必要な遺伝子生成物を発現する細胞が選択される。その後、この細胞を用いて、
遺伝子生成物を後で使用するために精製する。細胞をインビトロで培養するか、
インビボで細胞に遺伝子を発現させることによって、細胞を発現できる。
【０１６２】 本発明はまた、新規遺伝子および遺伝子生成物を識別するためにライブラリを
用いる方法も対象としている。
【０１６３】 本発明はさらに、非相同組込のパターンを刺激またはこれに作用する作用薬を
用いて細胞を処理することによって、遺伝子活性化の効率を高める方法も対象と
している。細胞発現パターン、クロマチン構造、メチル化パターンは、細胞の種
類によって劇的に異なることが実証されている。同じ細胞種類の異なる細胞系で
も、大きく異なる場合がある。これらの違いは、ＤＮＡ切断パターンと修復過程
の両方に影響を与え、非相同組込に大きく影響する。たとえば、ＤＮＡのクロマ
チン化された範囲（不活性遺伝子と結合しやすい特性）は、制限酵素と化学薬品
による切断に対する耐性が大きい一方、照射による切断を受けやすい。
【０１６４】 さらに、不活性遺伝子はメチル化できる。この場合、ＣｐＧメチル化によって
ブロックされる制限酵素は、不活性遺伝子付近のメチル化部位を開裂できず、メ
チル化感受性酵素を用いて遺伝子を活性化するのがさらに困難になる。これらの
問題は、さまざまなＤＮＡ切断剤を用いて複数の細胞系の活性化ライブラリを作
成すれば回避できる。ライブラリを作成すると、より完全な組込パターンを作成
でき、与えられた遺伝子が活性化される可能性は最大となる。
【０１６５】 本発明の方法には、２本鎖切断を、過剰発現される内在性遺伝子を含む細胞の
ＤＮＡに導入することが含まれる。これらの方法は、ベクター組込の前か同時に
、２本鎖切断を細胞内のゲノムＤＮＡを導入する。ＤＮＡ切断の機構は、ゲノム
内のＤＮＡ切断パターンに著しく影響を及ぼす。結果として、自然に、または照
射、制限酵素、ブレオマイシン、または他の切断剤によって人為的に引き起こさ
れたＤＮＡ切断は、異なる位置に発生可能である。
【０１６６】 組込効率を向上させ、組込部位のランダムな分布を改善するために、形質移入
の前か後に、少量、普通、大量の照射で細胞を処理できる。形質移入されたＤＮ
Ａは、人為的に２本鎖切断させることによって、宿主細胞の染色体にＤＮＡ修復
過程の一部として組込可能である。通常、組込部位として作用する２本鎖切断を
作成することは、律速段階である。そのため、照射（または他のＤＮＡ破壊剤）
を用いた染色体切断を増やすことによって、所与の形質移入で多数の構成要素が
得られる。さらに、照射によるＤＮＡ切断の機構は、自然切断とは異なる。
【０１６７】 照射は、高エネルギーの光子がＤＮＡ分子にぶつかったときに、ＤＮＡ切断を
直接引き起こす。照射はその代わりに、細胞内の化合物を活性化し、この化合物
がＤＮＡ鎖と反応し、ＤＮＡ鎖を切断させる。一方、自然切断は、細胞内に生成
された反応性化合物（スーパーオキシドおよび過酸化物など）とＤＮＡ分子の相
互作用によって発生すると考えられる。しかし、細胞内のＤＮＡは、むき出しの
除タンパクポリマーとして存在しているのではなく、代わりにクロマチンに結合
し、凝集状態で存在している。結果として、一部の領域が、２本鎖を切断させる
、細胞内の作用薬に接触できくなる。照射によって生じた光子の波長は、ＤＮＡ
の凝集領域にぶつかるほど短いため、自然切断で示したよりも下のＤＮＡ領域に
切断を引き起こす。したがって、照射はＤＮＡの異なる切断パターンを作成可能
で、次に、異なる組込パターンが生成される。
【０１６８】 結果として、細胞内の同一の活性化作成物を用いて作成したライブラリは、照
射処理を行っても、行わなくても、活性化遺伝子の異なるセットを潜在的に含む
。最終的に、照射処理によって、非相同組込の効率は最大５から１０倍上昇し、
少ない細胞を用いて完全なライブラリを作成できる。したがって、照射処理は遺
伝子活性化効率を高め、形質移入細胞において新たな組込と活性化パターンを生
成する。有用な照射の種類としては、α、β、γ、ｘ線、紫外線照射がある。有
用な照射量は細胞の種類によって異なるが、一般に、細胞生存度が０．１から９
９％となる照射量範囲が有用である。ＨＴ１０８０細胞の場合、これは137Ｃｓ
源による約０．１から１０００ｒａｄの照射量に相当する。他の照射量も、組込
頻度が増加したり、組込部位のパターンが変化する限りは有用である。
【０１６９】 形質移入細胞で染色体切断を人為的に引き起こすには、照射以外にも、制限酵
素を用いることができる。照射と同様に、ＤＮＡ制限酵素は染色体を切断させ、
次にこれが形質移入ＤＮＡの組込部位として作用する。ＤＮＡ切断がこのように
増えると、活性化作成物の組込全体の効率が上昇する。さらに、制限酵素による
切断の機構は照射の場合とは異なり、染色体切断のパターンも異なると考えられ
る。
【０１７０】 制限酵素は、光子と比べると比較的大きな分子で、ＤＮＡを破壊する能力を持
つ小型の代謝物質である。結果として、制限酵素は、ゲノム全体としてよりも、
あまり凝集していない領域を切断しやすくする。興味のある遺伝子がゲノム内の
接触可能な領域内にある場合は、細胞を制限酵素で処理すれば、興味のある遺伝
子の上流に活性化作成物が組込まれる可能性を高めることができる。制限酵素は
具体的な配列を認識するため、そして、所与の制限部位が興味のある遺伝子の上
流にない場合があるため、さまざまな制限酵素を使用できる。各酵素は宿主染色
体の開裂部位に影響を及ぼす、各種特性（たとえば、大きさ、安定性、メチル化
部位の開裂能力、最適反応条件）を備えているため、いろいろな制限酵素を使用
することも重要である。各酵素は、開裂可能な制限部位の分布が異なるため、さ
まざまな組込パターンを作成する。
【０１７１】 したがって、活性化作成物導入の前、導入中、導入後に制限酵素（または制限
酵素を発現可能なプラスミド）を導入すると、異なるセットの遺伝子が活性化さ
れる。最終的に、制限酵素が引き起こした会列によって、組み込み効率が最大５
から１０倍に上昇し（Ｙｏｒｉｆｕｊｉら、Ｍｕｔ． Ｒｅｓ． ２４３：１２
１（１９９０））、より少ない細胞を形質移入して、完全なライブラリを作成で
きる。このため、制限酵素を用いて新しい組込パターンを作成し、自然切断ある
いは他の人為的に引き起こされた切断での非相同組換によって作成されたライブ
ラリで活性化できなかった遺伝子を活性化できる。
【０１７２】 制限酵素を用いて、活性化作成物をゲノム内の必要な場所にバイアス組込でき
る。たとえば、平均で５０から１０００キロベースごとに真核ＤＮＡを開裂する
複数の希少制限酵素について記述されている。希少制限認識配列が偶然、興味の
ある遺伝子の上流に位置する場合、活性化作成物との形質移入の際に制限酵素を
導入することによって、ＤＮＡ切断は、優先的に興味のある遺伝子の上流で起こ
る。そして、この切断裂は、活性化作成物の組込部位として作用することがある
。興味のある遺伝子内あるいは付近の適当な位置で開裂させる酵素ならどれでも
よく、部位はゲノムの残りの部分に過少表現されるか、ゲノム付近に過剰表現さ
れる（たとえば、ＣｐＧを含む制限部位）。以前認識されていない遺伝子の場合
、８ｂｐの認識部位（たとえば、ＮｏｔＩ、ＳｆｔＩ、ＰｍｅＩ、ＳｗａＩ、Ｓ
ｓｅＩ、ＳｒｆＩ、ＳｇｒＡＩ、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ、ＳｇｆＩ、Ｓｓｅ８３８
７Ｉ）を備えた制限酵素、ＣｐＧを含む部位（たとえば、ＥａｇＩ、Ｂｓｉ−Ｗ
Ｉ、ＭｌｕＩ、ＢｓｓＨＩＩ）を認識する酵素、他の希少な切断酵素を使用でき
る。
【０１７３】 このようにして、ある種の活性化遺伝子について強化した、「バイアス」ライ
ブラリを作成できる。この点について、ＣｐＧジヌクレオチドを含む制限酵素部
位は、一般にゲノムでは過少表現されるが、遺伝子活性化にまさに有用な場所の
、多くの遺伝子の５’末端ではＣｐＧ島の形で過剰表現されるため、特に有用で
ある。したがって、これらの部位を認識する酵素は、遺伝子配列の５’末端で優
先的に開裂する。
【０１７４】 制限酵素は複数の方法によって、宿主細胞に導入できる。制限酵素はまず、電
気穿孔法によって細胞に導入できる（Ｙｏｒｉｆｕｊｉら、Ｍｕｔ． Ｒｅｓ．
２４３：１２１（１９９０）；Ｗｉｎｅｇａｒら、Ｍｕｔ． Ｒｅｓ． ２２
５：４９（１９８９））。一般に、細胞に導入される制限酵素の量は、電気穿孔
媒体の濃度に比例する。電圧、静電容量、抵抗を調節して、各細胞系に対するパ
ルス条件を最適化する必要がある。次に、制限酵素は、真核調節要素の制御下で
酵素をコード化するプラスミドから、一時的に発現できる。生成される酵素のレ
ベルは、誘導プロモータを用いたり、誘導強度を変化させて制御できる。場合に
よっては、（酵素の毒性によって）生成される制限酵素の量を制限することが望
ましいこともある。このような場合、弱い、または突然変異のプロモータ、スプ
ライス部位、翻訳開始コドン、ポリＡ尾部を用いて、生成される制限酵素の量を
低下させることができる。３番目に、制限酵素は、細胞膜に融着するか、細胞膜
を透過する作用薬を導入できる。リポソームおよびストレプトリジン（Ｐｉｍｐ
ｌｉｋａｒら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２５：１０２５（１９９４）
）は、この種の作用薬の例である。最後に機械的穿孔（Ｂｅｃｋｅｒら、Ｃｅｌ
ｌ ５０：５２３−５３４（１９８７））とマイクロインジェクションを用いて
、ヌクレアーゼと他のタンパク質を細胞に導入することも可能である。しかし、
活性酵素を生体細胞に導入可能な方法ならすべて適切である。
【０１７５】 ブレオマイシンと他のＤＮＡ破壊作用薬が誘発したＤＮＡ切断によっても、異
なるＤＮＡ切断パターンが生成できる。そのため、細胞内で２本鎖切断を生成可
能な作用薬およびインキュベーション条件は、効率の上昇および／または非相同
組換部位の変更に役立つ。ＤＮＡ切断化学薬品の種類の例として、これに限定さ
れるわけではないが、過酸化物、他のフリーラジカル生成化合物、アルキル化剤
、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍薬、酸、置換ヌクレオチド、エネジエン（ｅ
ｎｅｄｉｙｎｅ）抗体が挙げられる。
【０１７６】 具体的なＤＮＡ切断化学薬品の例としては、これに限定されるわけではないが
、ブレオマイシン、過酸化水素、クメンヒドロペルオキシド、ｔ−ブチルヒドロ
ペルオキシド、（アニリン、１−ナフチルアミンまたは１−ナフトールと反応さ
せた）次亜塩素酸、硝酸、リン酸、ドキソルビシン、９−デオキシドキソルビシ
ン、ジメチル−６−ドキソルビシン、５−イミノダウノルビシン、アドリアマイ
シン、４’−（９−アクリジニルアミノ）メタンスルフォン−ｍ−アニシジン、
ネオカルチノスタチン、８−メトキシカフェイン、エトポシド、エリプチシン、
イドクスウリジン、ブロモデオキシウリジンが挙げられる。
【０１７７】 照射あるいはブレオマイシンなどの、少量のＤＮＡ切断作用剤に細胞を事前に
露出させておくと、細胞内のＤＮＡ修復機構を引き起こすことが可能である。形
質移入の約２４時間前にこれらの作用剤で細胞を事前処理すると、細胞は、ＤＮ
Ａ切断の修復と形質移入後のＤＮＡ組込がさらに効率よく行える。さらに、ＬＤ
５０（露出された細胞の致死率が５０％となる量）が事前処理後は高くなるため
、照射や他のＤＮＡ切断剤の量を多く使用することもできる。これにより、複数
の投与量でランダムな活性化ライブラリが作成され、宿主細胞の染色体内の組込
部位の種々の分布が生じる。
【０１７８】 （スクリーニング） いったん活性化ライブラリ（または複数のライブラリ）が作成されると、多く
のアッセイを用いてスクリーニングが可能である。興味のあるタンパク質（たと
えば、分泌されたウィルス細胞内タンパク質）の特性とライブラリを作成するの
に用いる活性化作成物の性質によって、以下で説明するアッセイのいずれか、あ
るいはすべてを利用できる。他のアッセイ形式も使用できる。
【０１７９】 （ＥＬＩＳＡ） 酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、活性化タンパク質を検
出できる。活性化遺伝子生成物が分泌されると、活性化ライブラリ細胞のプール
による培養上清が、興味のあるタンパク質に固有の結合抗体を含むウェルでイン
キュベートされる。細胞または細胞のグループが興味のある遺伝子を活性化する
と、タンパク質が培地に分泌される。ライブラリクローンのプール（プールは、
１から１００，０００を超えるライブラリメンバの範囲でよい）をスクリーニン
グすると、興味のある遺伝子を活性化した細胞を含むプールが識別できる。それ
から、同朋選択、限界希釈、または当業者に周知の他の技術によって、興味のあ
る細胞を他のライブラリ メンバから精製できる。分泌されたタンパク質に加え
て、ＥＬＩＳＡは、細胞間および膜結合タンパク質を発現する細胞のスクリーニ
ングに用いることができる。このような場合、培養上清をスクーリンニングする
代わりに、少数の細胞をライブラリプール（各細胞は、プールごとに少なくとも
１００から１，０００回表現される）から除去し、溶解・清澄させ、抗体で被覆
したウェルに加える。
【０１８０】 （ＥＬＩＳＡ スポット アッセイ） ＥＬＩＳＡスポットは、興味のあるタンパク質に固有の抗体で被覆される。被
覆後、ウェルを１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間、３７℃でブロックする。ブロッ
ク後、ランダム活性化ライブラリから１００，０００から５００，０００の細胞
を各ウェルに加える（プール全体の最高１０％を表現）。一般に、各ウェルにプ
ール１個を宛てる。興味のあるタンパク質を発現する細胞の頻度が１／１０００
０の場合（すなわち、プールが１０，０００個のクローンで構成されている場合
、その中の１個が興味のあるタンパク質を発現する）、ウェル当たり５００，０
００個の細胞で被覆すると、５０個の特異性の細胞が得られる。細胞は、動かし
たり、分散させたりせずに、３７℃で２４から４８時間、ウェルでインキュベー
トする。インキュベーション後、細胞を除去し、プレートをＰＢＳ／０．０５％
Ｔｗｅｅｎ ２０で３回、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで３回洗浄する。第２の抗体を
適当な濃度でウェルに加え、室温で２時間か、４℃で１６時間インキュベートす
る。これらの抗体はビオチン化するか、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（
ＨＲＰ）で直接標識できる。第２の抗体を除去し、プレートをＰＢＳ／１％ＢＳ
Ａで洗浄する。ＨＲＰで標識した、第３の抗体またはストレプトアビジンを加え
、室温で１時間インキュベートする。
【０１８１】 （ＦＡＣＳアッセイ） 蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を用いて、ランダム活性化ライブラリを多
くの方法でスクリーニングできる。興味のある遺伝子が細胞表面タンパク質をコ
ード化する場合、蛍光標識された抗体を活性化ライブラリによる細胞と共にイン
キュベートする。興味のある遺伝子が分泌タンパク質をコード化する場合、細胞
をビオチン化して、興味のあるタンパク質に固有の抗体に結合したストレプトア
ビジンとインキュベートできる（Ｍａｎｚら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：１９２１（１９９５））。インキュベーション
後、細胞を高濃度のゼラチン（またはアガロースやメチルセルロースなど、他の
ポリマー）に入れて、分泌タンパク質の拡散を抑える。タンパク質が細胞から分
泌されると、細胞表面に結合している抗体によって捕捉される。そして、興味の
あるタンパク質の存在は、蛍光標識された第２の抗体によって検出される。細胞
は、分泌タンパク質と膜結合タンパク質の両方について、蛍光シグナルに従って
分類される。その後、蛍光細胞は単離、伸張され、さらにＦＡＣＳ、限界希釈、
または、当業者に周知の他の細胞精製技術によって濃縮される。
【０１８２】 （磁気ビーズ分離） この技術の原理は、ＦＡＣと類似している。（上で説明した）膜結合タンパク
質や捕捉された分泌タンパク質は、活性化ライブラリを、興味のあるタンパク質
固有の抗体結合磁気ビーズでインキュベートすることで検出される。タンパク質
が細胞表面にある場合、磁気ビーズはその細胞に結びつく。磁石を用いると、興
味のあるタンパク質を発現する細胞を、ライブラリ中の他の細胞から精製できる
。これらの細胞をビーズから除去し、伸張、分析し、必要ならばさらに精製する
。
【０１８３】 （ＲＴ−ＰＣＲ） （少なくともプール中の各クローン数と等しい）少数の細胞を収集・溶解して
、ＲＮＡを精製する。単離後、逆転写酵素を用いて、ＲＮＡが逆転写される。こ
のとき、興味のあるｃＤＮＡに固有のプライマーを用いて、ＰＣＲが行われる。
【０１８４】 あるいは、活性化作成物内の合成エクソンと内在性遺伝子のエクソンに渡るプ
ライマーを使用できる。このプライマーは、興味のある、内在的に発現された遺
伝子をハイブリダイズおよび増幅しない。逆に、活性化作成物が興味のある遺伝
子と活性化された遺伝子の発現の上流で組込まれた場合、このプライマーは、遺
伝子に固有の第２プライマーとともに、内在性遺伝子によるエクソンにスプライ
スされた合成エクソンの存在によって、活性化遺伝子を増幅する。したがって、
この方法は、通常、興味のある遺伝子を必要なレベルよりも低レベルで発現させ
る細胞内で、活性化された遺伝子を検出するのに使用できる。
【０１８５】 （表現型選択） 本例では、活性化遺伝子に付与された表現型に基づいて細胞を選択できる。選
択可能な表現型の例としては、増殖、成長因子独立成長、コロニー形成、細胞分
化（たとえば、神経細胞、筋肉細胞、上皮細胞など）、足場独立成長、細胞因子
の活性化（たとえば、キナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼなど）、細胞間の癒着
・移入の獲得・損失、細胞活性化（たとえば、静止対活性化Ｔ細胞）が挙げられ
る。上で説明したような表現型を示す活性化細胞を単離することが重要なのは、
組込作成物による内在性遺伝子の活性化がおそらく、認められた細胞表現型の原
因であるためである。したがって、活性化遺伝子は、認められた表現型を処理し
たり、誘起するために重要な治療薬または薬ターゲットとなる。
【０１８６】 上記の各アッセイの感受性は、ライブラリ細胞の遺伝子発現を一時的にアップ
レギュレートすることで、効果的に高めることができる。これは、たとえばライ
ブラリにＰＭＡおよび腫瘍壊死因子αを加えることによって、ＮＦ−κＢ部位を
含むプロモータに対して実施できる。別個に、あるいはＰＭＡおよびＴＮＦ−α
とともに、酪酸ナトリウムを加えると、さらに遺伝子発現を高めることができる
。これらの試薬を加えると、興味のあるタンパク質の発現が増加するため、興味
のある遺伝子活性化細胞を識別するために、より感受性の低いアッセイを使用で
きるようになる。
【０１８７】 多くの遺伝子の活性化を最大にする目的で活性化ライブラリが作成されるため
、ライブラリクローンをプールに構成することは有用である。各プールは、１０
０，０００を超える各クローンで構成できる。したがって、あるプールでは、多
くの活性化タンパク質が、多くの場合、希薄濃度で生成される（プール全体の大
きさと、特定の活性化タンパク質を生成する、プール内の細胞数が限られている
ことによる）。したがって、スクリーニング前のタンパク質濃縮は、スクリーニ
ングアッセイにおいて活性化タンパク質を検出する機能を効果的に高める。濃縮
について特に有用な方法は、限外濾過である；しかし、他の方法も使用できる。
たとえば、タンパク質は、存在する大半またはすべてのタンパク質を結合する条
件で、イオン交換、疎水性、色素、ヒドロキシアパタイト、レクチンおよび他の
適当な樹脂に吸着させて、非特異的に、または半特異的に濃縮できる。その後、
結合タンパク質はスクリーニング前に、少量で除去できる。この方法は、タンパ
ク質の濃縮を促進するために、無血清培地で細胞を培養する場合に有利である。
【０１８８】 別の例では、活性化作成物に含められる有用な配列は、エピトープタグである
。エピトープタグは、活性化タンパク質の親和性精製（たとえば、免疫親和性ま
たはキレート基質）を可能にするアミノ酸配列で構成できる。そのため、活性化
作成物にエピトープタグを含ませると、活性化ライブラリによる活性化タンパク
質すべてが精製できる。活性化タンパク質を他の細胞や培地タンパク質から精製
することによって、新規タンパク質と酵素の活性のスクリーニングが行いやすく
なる。ある例では、活性化タンパク質の精製後、エピトープタグを除去すること
が好ましい場合もある。これは、プロテアーゼ認識配列（たとえば、因子ＩＩａ
またはエンテロキナーゼ開裂部位）を、活性化作成物のエピトープタグより下流
に組込むことで実施できる。精製された活性化タンパク質を適当なプロテアーゼ
とインキュベートすると、タンパク質からエピトープタグが放出される。
【０１８９】 エピトープタグ配列が活性化作成物上に位置するライブラリでは、活性化タン
パク質はすべて、親和性精製を用いて、他の細胞タンパク質および培地タンパク
質から精製できる。親和性精製は活性化タンパク質を濃縮するだけでなく、これ
らのタンパク質を、ライブラリをスクリーニングするのに用いられるアッセイを
妨害する可能性のある他の作業から精製する。
【０１９０】 興味のある遺伝子を過剰発現する細胞を含むクローンのプールが確認されると
、活性化細胞を単離する手段を行える。活性化細胞の単離は、当業者に周知のさ
まざまな方法で実施できる。細胞精製方法の例としては、限界希釈、蛍光細胞分
析分離、磁気ビーズ分離、同胞選択、クローニングリングを用いた単一コロニー
精製が挙げられる。
【０１９１】 本発明の好ましい例では、発現生成物を精製する過程が含まれる。非常に好ま
しい例では、内在性遺伝子生成物を発現する細胞は、工業用途、特に診断・治療
・薬剤発見用途に利用できる量の遺伝子生成物が生成されるように培養される。
【０１９２】 本明細書に記載する方法で使用するベクターはすべて、増幅可能なマーカーを
含むことができる。その結果、ベクターと（たとえば、過剰発現遺伝子を含む）
興味のあるＤＮＡの両方の増幅が細胞内で起こり、内在性遺伝子の発現がさらに
高められる。したがって、内在性遺伝子を増幅する手段を方法に含めてもよい。
【０１９３】 活性化細胞が単離されると、興味のある遺伝子と活性化作成物の両方を含む座
位を増幅して、発現をさらに強化することができる。これは、以下に示す方法を
単独で、あるいは組合わせることによって、実施できる。
【０１９４】 増幅可能マーカーは、さらに多いコピー数の場合に選択可能な遺伝子である。
増幅可能マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素、アデノシンデアミナー
ゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒドロ−オロターゼ、カルバミ
ルリン酸シンターゼが挙げられる。これらの例の場合、増幅マーカーとフランキ
ング配列（興味のある遺伝子を含む）の多いコピー数は、増幅マーカーによって
作用を受ける薬剤や毒代謝物を使用するために選択できる。一般に、薬剤や毒代
謝物濃度が上昇すると、増幅可能マーカーの少数のコピーを含む細胞が死に、こ
れに対して、マーカーのコピーを多数含む細胞は生存し、コロニーを形成する。
これらのコロニーは、単離、伸張され、興味のある遺伝子の生成の上昇をレベル
について分析できる。
【０１９５】 活性化作成物の増幅可能マーカーの配置は、活性化細胞内の興味のある細胞と
増幅可能マーカーと並列になる。コピー数を増やした増幅可能マーカーと興味の
ある遺伝子を含む活性化細胞は、増量した選択性薬剤（通常は薬剤または代謝物
）の存在下で、細胞を培養することによって選択できる。たとえば、ジヒドロ葉
酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の増幅は、メトトレキサートを用いて選択できる。
【０１９６】 薬剤耐性コロニーは、増加させた各薬剤濃度において発生するため、各コロニ
ーは、増幅可能なマーカーおよび興味のある遺伝子のコピー数に関して選択・特
徴付けが可能で、興味のある遺伝子の発現について分析できる。活性化遺伝子発
現が最高レベルのコロニーはそれぞれ、より高い薬剤濃度でさらに増幅するため
に選択できる。最高の薬剤濃度では、クローンが発現する、興味のあるタンパク
質の量は著しく増加する。
【０１９７】 ＤＨＦＲを増幅する場合、複数の異なる濃度のメトトレキセートで約１ｘ１０7 の細胞をプレートさせると都合がよい。メトトレキセートの有効所期濃度は、
約５から１００ｎＭの範囲である。しかし、メトトレキセートの最適濃度は、各
細胞系と組込部位について経験的に決定する必要がある。メトトレキセート含有
培地での培養後、メトトレキセートの最高濃度によるコロニーを選んで、興味の
ある遺伝子発現の増加について分析する。その後、最高濃度のメトトレキセート
によるクローンは、ＤＨＦＲと興味のある遺伝子をさらに増幅するために選択す
る、さらに高濃度のメトトレキセート中で培養する。遺伝子増幅の程度が最高の
クローンには、マイクロモルおよびミリモル範囲のメトトレキセート濃度を使用
できる。
【０１９８】 複製のウィルス起点（たとえば、ｏｒｉ Ｐまたはヒト細胞のＳＶ４０、マウ
ス細胞のｐｏｌｙｏｍａ ｏｒｉ）を活性化作成物に配置すると、活性化細胞内
の興味ある遺伝子と複製のウィルス起点が並列になる。そして、起点とフランキ
ング配列は、ウィルス複製タンパク質をトランスに導入することで増幅できる。
たとえば、ｏｒｉ Ｐ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスの複製起点）を用い
ると、ＥＢＮＡ−Ｉが一時的、または安定して発現できる。ＥＢＮＡ−Ｉは、組
込まれたｏｒｉ Ｐ座位から複製を開始する。複製は、起点から双方向に広がる
。各複製生成物が作成されると、これも複製を開始できる。結果として、ウィル
ス起点と、興味のある遺伝子を含むフランキングゲノム配列のコピーが多数作成
される。コピー数が多くなると、細胞が興味のある遺伝子をより多く生成できる
。
【０１９９】 複製生成物はある頻度で組換を行って、興味のある遺伝子を含む、フランキン
グゲノム配列を含む環状分子を生成する。興味のある遺伝子を持つ環状分子を含
む細胞は、Ｈｉｒｔ抽出とサザンブロッティングによる１回の細胞クローニング
と分析で単離できる。精製を行うと、コピー数を増やした（通常１０から５０コ
ピー）エピソームゲノム座位を含む細胞を、培養により繁殖できる。より多く増
殖するためには、元の作成物の第１の起点に隣接する第２の起点を含めることに
より、エピソームをさらに増加できる。たとえば、Ｔ抗原を用いて、ｏｒｉ Ｐ
／ＳＶ４０エピソームのコピー数を最大１，０００まで増加できる（Ｈｅｉｎｚ
ｅｌら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３７３８（１９８８））。このようにコピ
ー数を実質的に増加させると、タンパク質の発現を劇的に高めることができる。
【０２００】 本発明は、インビボとインビトロの両方での、内在的遺伝子の過剰発現を含む
。そのため、細胞は、遺伝子生成物の必要量を精製するためにインビトロで使用
するか、その遺伝子生成物を無傷の動物に提供するためにインビボで使用するこ
とが可能である。
【０２０１】 本発明は、本明細書に記載した方法によって生成されたタンパク質も含む。タ
ンパク質は、既知、あるいは以前未知であった遺伝子のいずれかから生成できる
。本方法で作成可能な周知のタンパク質の例としては、これに限定されるわけで
はないが、エリスロポイエチン、インシュリン、成長ホルモン、グルコセレブロ
シダーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／
マクロファージ刺激因子、インターフェロンα、インターフェロンβ、インター
フェロンγ、インターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン
−１１、インターロイキン−１２、ＴＧＦβ、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子Ｖ
ＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、ＴＳＨ−β
、骨成長因子−２、骨成長因子−７、腫瘍壊死因子、アルファ−１ 抗トリプシ
ン、抗トロンビンＩＩＩ、白血病抑制因子、グルカゴン、プロテインＣ、プロテ
インキナーゼＣ、マクロファージコロニー刺激因子、幹細胞因子、卵胞刺激ホル
モンβ、ウロキナーゼ、神経成長因子、インシュリン様成長因子、インシュリノ
トロピン、副甲状腺ホルモン、ラクトフェリン、補体阻害剤、血小板由来成長因
子、ケラチノサイト成長因子、ニューロトロピンー３、トロンボポイエチン、絨
毛膜ゴナドトロピン、トロンボモジュリン、アルファグルコシダーゼ、上皮成長
因子、ＦＧＦ、マクロファージコロニー刺激因子、上記の各タンパク質のための
細胞表面レセプタが挙げられる。
【０２０２】 活性化細胞によるタンパク質生成物を生成する場合、当業者に周知の、いずれ
のタンパク質生成方法を用いてもよい。
【０２０３】 （活性化された膜タンパク質コード遺伝子を含む細胞の単離） 膜関連タンパク質をコードする遺伝子は、医薬品開発の観点から特に興味深い
。これらの遺伝子およびこれら遺伝子のコードするタンパク質は、例えば、コン
ビナトリアルケミストリーライブラリーやハイスループットスクリーニングアッ
セイを用いて、低分子の医薬品を開発するのに利用可能である。また、これらの
タンパク質やその可溶型タンパク質（例えば、膜貫通領域を欠いた切断型）は、
ヒトや動物において治療的に活性のある医薬品として利用可能である。膜タンパ
ク質の同定は、ツーハイブリッド研究法やアフィニティーキャプチャー技術を用
いて、新規リガンド（例えば、サイトカイン、成長因子、および他のエフェクタ
ー分子）を同定するのにも利用可能である。他にも多くの膜タンパク質利用法が
考えられる。
【０２０４】 内在性膜タンパク質コード遺伝子を同定するための現在の研究法は、ｃＤＮＡ
ライブラリーからの遺伝子の単離とシークエンシングを含む。次に、タンパク質
の膜貫通領域を同定できる疎水性プロットを用いて、ＯＲＦ解析により内在性膜
タンパク質を同定する。残念ながら、ｃＤＮＡライブラリーを作製した細胞内で
内在性膜タンパク質をコードする遺伝子が発現されていなければ、この方法を用
いてその遺伝子は同定できない。さらに、多くの遺伝子は、発生段階の短い時期
に、およびまたは非常に低レベルで、非常に限られた細胞でのみ発現する。その
結果、現在利用できる研究法では、これらの遺伝子を効率的に同定することがで
きない。
【０２０５】 本発明により、遺伝子の配列、構造、機能、あるいは発現の性質の知識なしに
、内在性遺伝子を活性化することができる。この開示した方法を用いて、遺伝子
は転写レベルでのみ、あるいは転写と翻訳の両レベルで活性化される。その結果
、組み込みベクターを含む細胞内で、活性化内在性遺伝子にコードされるタンパ
ク質が産生される。さらに、ここで開示した特異的ベクターを用いることにより
、活性化内在性遺伝子から産生されるタンパク質に、例えばエピトープタグを含
むなどの修飾ができる。他のベクター（例えば、上記したベクター１２から１７
）は、エピトープタグの上流にシグナルペプチドをコードする。このベクターは
、内在性膜タンパク質の発現を活性化した細胞を単離するのに利用できる（以下
の例５を参照）。このベクターは、通常では分泌されないタンパク質を分泌させ
るのにも利用できる。
【０２０６】 このように、本発明は、細胞の内在性膜タンパク質や膜貫通タンパク質をコー
ドする内在性遺伝子を同定する方法にも関連する。本発明のこのような方法は、
一つあるいはそれ以上のステップからなる。例えば、本発明のこのような一方法
は、（ａ）本発明の一つあるいはそれ以上のベクターを細胞に導入し； （ｂ）
非相同的組換えにより、ベクターを細胞のゲノムに組み込み；（ｃ）組み込まれ
たベクターコンストラクト内に含まれる転写制御配列によって遺伝子をアップレ
ギュレートションし、内在性遺伝子を過剰発現させ；（ｄ）内在性遺伝子を過剰
発現する細胞をスクリーニングし；（ｅ）活性化遺伝子をキャラクタライズし、
細胞の内在性膜タンパク質をコードする遺伝子として同定する。というステップ
からなる。関連実施態様として、本発明は、活性化遺伝子のキャラクタライズ以
前にさらに細胞からの活性化遺伝子の単離を含む方法を提供する。
【０２０７】 内在性膜タンパク質コード遺伝子を同定するため、細胞のゲノムに組み込むベ
クターは、開始コドン、シグナル配列、およびエピトープタグを含むエキソン配
列に連結した制御配列を含み、その下流には不対スプライスドナー部位がくる。
組み込みと内在性遺伝子の活性化により、ベクター由来のシグナルペプチドとエ
ピトープタグが下流の内在性遺伝子のエキソンにコードされるタンパク質に融合
したキメラタンパク質が産生される。このキメラタンパク質は、ベクターのコー
ドするシグナルペプチドが存在するため分泌経路へと向けられ、タンパク質の翻
訳終了後はそのタンパク質が分泌される。しかしながら、活性化内在性遺伝子が
内在性膜タンパク質をコードし、その遺伝子の膜貫通領域がベクターの組み込み
部位の３'側に位置するエキソンにコードされる場合には、このキメラタンパク
質は細胞表面へ行き、エピトープタグが細胞表面上に提示される。周知の細胞単
離法（例えば、フローサイトメトリーによるソーティング、マグネチックビーズ
による細胞ソーティング、免疫吸着、あるいは当業者に周知の他の方法）により
、エピトープタグに対する抗体を用いて、エピトープタグを提示し内在性膜タン
パク質コード遺伝子を活性化した細胞を全体の中から単離することができる。こ
れらの細胞は、次に膜タンパク質の機能の研究に利用できる。また、例えば、ベ
クターのコードするエキソンに特異的なＤＮＡプローブでハイブリダイゼーショ
ンし、これらの細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするな
どの周知方法を利用して、あるいはここで示した遺伝子コンストラクトを用いて
、さらに細胞から活性化遺伝子を単離できる。
【０２０８】 ベクターのエキソンにコードされるエピトープタグは、抗体に結合可能な短い
ペプチド、物質に結合可能な短いペプチド（例えば、ポリヒスチジン／二価金属
イオン担体、マルトース結合タンパク質／マルトース担体、グルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼ／グルタチオン担体）、あるいは内在性膜タンパク質由来の細
胞外ドメイン（膜貫通ドメインを欠く）で抗体やリガンドの存在するものである
。しかしながら、当業者に周知の他のタイプのエピトープタグも、本発明に準じ
て同等に利用できると考えられる。
【０２０９】 ここで示した方法や応用に対して他にも適当な修飾と適応があることは当業者
には容易に明白なことであり、本発明あるいはその実施態様の範囲を逸脱するこ
となく行える。本発明をここに詳細に記述したが、以下の例を参照することによ
ってより明確に理解されよう。これは実例の目的でのみここに包含したものであ
り、本発明を限定するものではない。
【例】
【０２１０】 （例１：内在性遺伝子発現を活性化するための細胞のトランスフェクション
） （方法:pRIG-1の構築） ヒトDHFRは、PCRにて作製したHT1080細胞由来cDNAから、プライマーDHFR-F1(5'
TCCTTCGAAGCTTGTCATGGTTGGTTCGCTAAACTGCAT 3')(SEQ ID NO:1)およびDHFR-R1(5'
AAACTTAAGATCGATTAATCATTCTTCTCATATACTTCAA 3')(SEQ ID NO:2)を用いてPCRに
より増幅し、pTARGETTM(Promega)のT部位にクローニングしてpTARGET:DHFRを作製
したPREP9をNheIとXbaIで切断してRSVプロモーターを単離し、pT
ARGET:DHFRのNheＩ切断部位に挿入してpTgT:RSV+DHFRを作製した。オリゴヌク
レオチドJH169(5' ATCCACCATGGCTACAGGTGAGTACTCG 3')(SEQ ID NO:3)とJH170(5'
GATCCGAGTACTCACCTGTAGCCATGGTGGATTTAA 3')(SEQ ID NO:4)をアニーリングして
pTgT: RSV+DHFRのI-Ppo-IとNheI切断部位に挿入し、pTgT: RSV+DHFR+Exlを作
製した。プライマーTet F1(5' GGCGAGATCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAAT 3')(SEQ ID
NO:5)およびTet F2(5' GGCCAGATCTGCTACCTTAAGAGAGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAA
3')(SEQ ID NO:6)を用いて、PBR322のヌクレオチド230から508番に相当する279b
pの領域をPCRにより増幅した。増幅した産物をBglIIで切断し、pTgT: RS
V+ RSV+DHFR+ExlのBamHI切断部位に挿入してpRIG-1を作製した。
【０２１１】 （トランスフェクション：ＨＴ１０８０細胞でのｐＲＩＧ−１遺伝子活性化
ライブラリーの作製） 遺伝子発現を活性化するため、上記したコンストラクトのグループ内から適し
た活性化コンストラクトを選択する。次に、当業者に周知のいずれかのトランス
フェクション法により、選択した活性化コンストラクトを細胞に導入する。トラ
ンスフェクション法の例として、エレクトロポレーション法、リポフェクション
法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、および受容体依存性エ
ンドサイトーシス法が挙げられる。細胞への導入に続き、ＤＮＡは非相同的組換
えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれる。組み込みは、自然に生じた染色体の
切れ目、あるいは人為的に誘発した染色体の切れ目で起こる。
【０２１２】 （方法） ｐＲＩＧ−１によるヒト細胞のトランスフェクション。ＨＴ１０８０細胞のＨ
ＰＲＴ−サブクローンであるＨＨ１細胞２ｘ１０9コを、１５０ｍｍ組織培養プ
レートで９０％コンフルエントになるまで培養した。細胞から培地を除去し、培
養上清として保存した（以下を参照）。トリプシンで短時間インキュベーション
することによりプレートから細胞を剥がし、培地／１０％ウシ胎児血清を添加し
てトリプシンを中和し、Ｊｏｕａｎ遠心機で５分間、１，０００Ｒｐｍで遠心分
離して沈殿させた。１ｘＰＢＳで細胞を洗浄し、カウントし、上記のように再度
沈殿させた。最終的に２．５ｘ１０7コ細胞／ｍｌになるように、１ｘＰＢＳ（
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｃａｔ ＃１４２００−０７５）で細胞の沈殿を再懸濁
した。次に、細胞を137Ｃｓ由来の５０ラドのγ照射に曝露した。ｐＲＩＧ−１
はＢａｍＨＩにより直鎖状にし、フェノール／クロロホルムで精製し、エタノー
ルにより沈殿させ、ＰＢＳに再懸濁した。精製し直鎖状にした活性化コンストラ
クトを、最終濃度４０μｇ／ｍｌになるように細胞懸濁液に添加した。次にＤＮ
Ａ／照射細胞混合液を混合し、０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット
（Ｂｉｏｒａｄ）に４００μｌずつ分注した。エレクトロポレーション装置（Ｂ
ｉｏｒａｄ）を用いて、キュベットを２５０ｖｏｌｔｓ，６００μファラッド，
５０オームでパルスした。電気的パルスの後、細胞を室温で１０分間インキュベ
ーションし、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含むα
ＭＥＭ／１０％ＦＢＳに加えた。続いて、約７ｘ１０6コ細胞／３５ｍｌのαＭ
ＥＭ／１０％ＦＢＳ／ペニシリンストレプトマイシン（３３％培養上清／６７％
新鮮培地）を含むプレートの割合で、細胞をプレーティングした。３７℃で２４
時間インキュベーションした後、６０ｍｇ／ｍｌストックから最終濃度が５００
μｇ／ｍｌになるように、それぞれのプレートにＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ
）を添加した。４日間の選択後、培地を新鮮なαＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ／ペニ
シリンストレプトマイシン／５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８で置換した。さらに７
から１０日間細胞をインキュベーションし、新規タンパク質因子の存在について
培養上清をアッセイした、あるいは後に解析するため−８０℃にて保存した。薬
剤耐性のクローンは、後に解析するため液体窒素で保存した。
【０２１３】 (例２：ＤＮＡ組み込みの頻度とランダム性を増加させるための電離放射線
の利用) 方法：９０％コンフルエントの段階でＨＨ１細胞を回収し、１ｘＰＢＳで洗
浄し、７．５ｘ１０6コ細胞／ｍｌになるように１ｘＰＢＳで再懸濁した。細胞
に、１５μｇの直鎖状化ＤＮＡ（ｐＲＩＧ−１）を添加し混合した。それぞれの
キュベットに４００μｌずつ分注し、エレクトロポレーション装置（Ｂｉｏｒａ
ｄ）を用いて、２５０ｖｏｌｔｓ，６００μファラッド，５０オームでパルスし
た。電気的パルス後、細胞を室温で１０分間インキュベーションし、２．５ｍｌ
のαＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ／１ｘペニシリンストレプトマイシンに加えた。そ
れぞれショックをかけたうち３００μｌの細胞を、直ちに、あるいはトランスフ
ェクション後１時間または４時間の時点で０，５０，５００，５０００ラドで照
射した。照射後直ちに、細胞を完全培地で組織培養プレートにプレーティングし
た。プレーティングから２４時間後、Ｇ４１８を最終濃度５００μｇ／ｍｌにな
るよう培養細胞に添加した。選択から７日後、培養液を５００μｇ／ｍｌのＧ４
１８を含む新鮮完全培地に置換した。選択から１０日後、プレートから培地を除
去し、コロニーをクーマシーブルー／９０％メタノール／１０％酢酸で染色し、
５０細胞以上からなるコロニーをカウントした。
【０２１４】 (例３：ゲノムにランダムの、半ランダムの、あるいはターゲットした）切
れ目を生じるための制限酵素の利用) 方法：９０％コンフルエントの段階でＨＨ１細胞を回収し、１ｘＰＢＳで洗
浄し、７．５ｘ１０6コ細胞／ｍｌになるように１ｘＰＢＳで再懸濁した。組み
込み効率をテストするため、１５μｇの直鎖状化ＤＮＡ（ＰＧＫ−βｇｅｏ）を
それぞれ４００μｌずつ分注した細胞に添加し、混合した。いくつかの分注細胞
については、続いて制限酵素、ＸｂａＩ，ＮｏｔＩ，ＨｉｎｄIII，ＩｐｐｏＩ
（１０から５００ｕｎｉｔｓ）を別々の細胞／ＤＮＡ混合液に添加した。それぞ
れのキュベットに４００μｌずつ分注し、エレクトロポレーション装置（Ｂｉｏ
ｒａｄ）を用いて、２５０ｖｏｌｔｓ，６００μファラッド，５０オームでパル
スした。電気的パルス後、細胞を室温で１０分間インキュベーションし、２．５
ｍｌのαＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／１ｘペニシリンストレプトマイシンに加えた。
それぞれショックをかけた全量２．５ｍｌの細胞のうち、３００μｌを完全培地
で組織培養プレートにプレーティングした。プレーティングから２４時間後、Ｇ
４１８を最終濃度６００μｇ／ｍｌになるよう培養細胞に添加した。選択から７
日後、培養液を６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む新鮮完全培地に置換した。選
択から１０日後、プレートから培地を除去し、コロニーをクーマシーブルー／９
０％メタノール／１０％酢酸で染色し、５０細胞以上からなるコロニーをカウン
トした。
【０２１５】 (例４：組み込みベクター上に位置する二つの増幅可能マーカーを選択する
ことによる増幅) ベクターを宿主細胞のゲノムへ組み込んだ後、組み込みベクター上に位置する
一つあるいはそれ以上の増幅可能マーカーを同時にあるいは連続して選択するこ
とにより、遺伝子座のコピー数が増幅される。例えば、二つの増幅可能マーカー
を含むベクターがゲノムに組み込まれると、ベクター上に位置する両増幅可能マ
ーカーを選択することにより、規定の遺伝子（すなわち、ベクター組み込み部位
に位置する遺伝子）の発現は増加し得る。この研究法により、適当な遺伝子座（
すなわち、組み込みベクターを含む遺伝子座）を増幅する細胞のクローンを非常
に容易に単離できる。
【０２１６】 非相同的組換えによりベクターがゲノムに組み込まれると、独自の位置に組み
込みベクターを含む個々の細胞クローンを、ゲノムの他の位置に組み込みベクタ
ーを含む他細胞から単離することができる。あるいは、混合した細胞集団でも増
幅の選択が可能である。
【０２１７】 組み込みベクターを含む細胞は、次に一次増幅可能マーカーに特異的な一次選
択薬剤の存在下で培養する。この薬剤により、ベクターあるいは内在性染色体上
の増幅可能マーカーを増幅した細胞が選択される。次に、これらの細胞を二次増
幅可能マーカーに特異的な二次選択薬剤の存在下で培養することにより、二次選
択マーカーの増幅について選択する。ベクターと隣接するゲノムＤＮＡを増幅し
た細胞はこの二次選択ステップにおいて生存するが、内在性一次増幅可能マーカ
ーを増幅した細胞、あるいは非特異的耐性を獲得した細胞は生存できない。２つ
以上（例えば、３つ、４つ、５つ、あるいはそれ以上）の増幅可能マーカーを含
むベクターが細胞ゲノムに組み込まれた場合には、同様の方法でさらなる選択を
行うこともあり、その場合、組み込みベクター上に含まれるさらなる増幅マーカ
ーに特異的な選択薬剤の存在下で連続して培養する。選択後、生存細胞で目的遺
伝子の発現レベルについてアッセイし、最も高いレベルで発現している細胞を選
んでさらに増幅させる。代わりに、両方（２つの増幅可能マーカーを用いた場合
）あるいはすべて（２つ以上の増幅可能マーカーを用いた場合）の選択薬剤に耐
性の細胞プールを、個々のクローンを単離しないでさらに培養することもできる
。その後、これらの細胞を拡大培養し、より高い濃度（通常、２倍高）の一次選
択薬剤存在下で培養する。目的の発現レベルが得られるまで、この過程を続ける
。
【０２１８】 あるいは、組み込みベクターを含む細胞を両方（２つを用いた場合）またはす
べて（２つ以上を用いた場合）の増幅可能マーカーで同時に選択することもでき
る。同時選択は、両方（２つのマーカーを用いた場合）またはすべて（２つ以上
のマーカーを用いた場合）の選択薬剤をトランスフェクションした細胞を培養す
る選択培地に添加して行う。生存細胞の大多数が、増幅した組み込みベクターを
有する。次にこれらのクローンを個々にスクリーニングし、最も発現レベルの高
い細胞を同定するか、またはプールして用いることもできる。さらに、それぞれ
の選択薬剤をより高い濃度（通常、２倍高）で細胞にかける。続いて、生存細胞
で発現レベルについてアッセイする。目的の発現レベルが得られるまで、この過
程を繰り返す。
【０２１９】 どちらの選択ストラテジー（つまり、同時あるいは連続選択）においても、細
胞毒性のない低濃度から細胞の大多数が死滅する高濃度まで薬剤の力価測定を行
い、選択薬剤の初期濃度を個々に決定する。一般的には、はっきりと区別のでき
るコロニー（例えば、プレーティングした１００，０００コの細胞当たり数百コ
のコロニー）を生じる濃度を初期濃度として選ぶ。
【０２２０】 （例５：膜貫通タンパク質をコードするｃＤＮＡの単離） pRIG8R1-CD2(図5A〜5D; SEQ ID NO:7), pRIG8R2-CD2(図6A〜6C; SEQ ID NO:8),
およびpRIG8R3-CD2(図7A〜7C; SEQ ID NO:9)ベクターは、不対スプライスドナ
ー部位の上流にあるエキソンに連結して働くＣＭＶ前初期遺伝子プロモーターを
含む。ベクター上のエキソンはＣＤ２の細胞外ドメイン（フレームの合う終止コ
ドンを欠く）に連結したシグナルペプチドをコードする。それぞれのベクターは
、スプライスドナー部位について異なるリーディングフレームにあるＣＤ２をコ
ードする。
【０２２１】 活性化遺伝子のライブラリーを作製するため、２ｘ１０7コの細胞を137Ｃｓ源
にて５０ラドで照射し、１５μｇの直鎖状化ｐＲＩＧ８Ｒ１−ＣＤ２（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：７）をエレクトロポレーションした。ｐＲＩＧ８Ｒ２−ＣＤ２（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、さらにｐＲＩＧ８Ｒ３−ＣＤ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：９）を用いて、別々に同様の操作を行った。トランスフェクション後、３つの
細胞グループを混合し、ディッシュ当たり５ｘ１０6コのトランスフェクション
細胞となるように１５０ｍｍディッシュにプレーティングして、ライブラリー＃
１を作製した。トランスフェクションから２４時間後、ライブラリー＃１を５０
０μｇ／ｍｌのＧ４１８で１４日間選択した。ホスト細胞のゲノムにベクターを
組み込んだ薬剤耐性クローンを混合し、分注し、解析のため凍結した。３ｘ１０7 コの細胞，３ｘ１０7コの細胞，および１ｘ１０7コの細胞をそれぞれｐＲＩＧ
８Ｒ１−ＣＤ２，ｐＲＩＧ８Ｒ２−ＣＤ２，およびｐＲＩＧ８Ｒ３−ＣＤ２でト
ランスフェクションし、あとは上記と同様の操作を行い、ライブラリー＃２を作
製した。
【０２２２】 活性化した内在性膜タンパク質コード遺伝子を含む細胞を単離するため、それ
ぞれのライブラリーから３ｘ１０6コの細胞を培養し、以下のように処理した。 ４ｍｌのトリプシンＥＤＴＡで細胞をトリプシン処理した。 細胞が遊離した後、８ｍｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳを添加してト
リプシンを中和した。 無菌のＰＢＳで細胞を１回洗浄し、８００ｘｇで７分間、遠心分離して回
収した。 細胞ペレットを２ｍｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁した。 １ｍｌをソーティングに用い、もう１ｍｌを５００μｇ／ｍｌＧ４１８を含むア
ルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳで再度プレーティングして拡大培養し、保存した。 ソーティングに用いる細胞を無菌のアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳで１回
洗浄し、８００ｘｇで７分間、遠心分離して回収した。 上清を除去し、ペレットを１ｍｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸
濁した。アイソタイプコントロールでの染色用に、１００μｌの細胞を除去した
。 ９００μｌの細胞に２００μｌの抗ＣＤ２ ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇ
ｅｎ カタログ＃３００５４Ｘ）を添加し、もう一方で１００μｌの細胞に２０
μｌのマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタ
ログ＃３３８１４Ｘ）を添加した。細胞を氷上で２０分間インキュベーションし
た。 抗ヒトＣＤ２ ＦＩＴＣで染色した細胞を含むチューブに、５ｍｌのＰＢ
Ｓ／１０％ＦＢＳを添加した。アイソタイプコントロールには、９００μｌのＰ
ＢＳ／１０％ＦＢＳを添加した。６００ｘｇで６分間遠心分離することにより、
細胞を回収した。 チュから上清を除去した。アイソタイプコントロールで染色した細胞を５
００μｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁し、抗ＣＤ２ ＦＩＴＣで染
色した細胞を１．５ｍｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁した。
【０２２３】 ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ； Ｍｏｕｔａｉ
ｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により、連続して５回、細胞をソーティングした。それぞ
れのソーティングにおいて、全細胞中最も強い蛍光性を示す表示したパーセンテ
ージの細胞（以下を参照）を回収し、拡大培養して、再度ソーティングした。ネ
ガティブコントロールとして、ＨＴ １０８０細胞をソーティングした。それぞ
れのソーティング段階において、以下の細胞集団をソーティングして回収した。
【０２２４】
【表１】 それぞれのライブラリーについて各最終ソーティングした細胞を拡大培養し、
液体窒素で保存した。
【０２２５】 （ＦＡＣＳソーティングした細胞からの活性化遺伝子の単離） 上記のように細胞をソーティングした後、ソーティングした細胞からＰＣＲベ
ースのクローニング法により活性化遺伝子を単離した。しかし、ＦＡＣＳソーテ
ィングした細胞から活性化遺伝子を単離するためには、遺伝子クローニングのい
ずれの周知方法も同様に用いることができる。
【０２２６】 以下のプロトコールにより遺伝子を単離した。 （１） ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ １０００ ｍＲＮＡ 単離キッ
ト（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、ライブラリー＃１および＃２由来の３ｘ１０7
コのＣＤ２＋細胞（上記のように、ＦＡＣＳにより５回ソーティングした）から
ｍＲＮＡを単離した。 （２） ｍＲＮＡを単離した後、０．５μｌの単離ｍＲＮＡを９９．５μｌの水
に希釈し、ＯＤ260測定によりｍＲＮＡ濃度を定量した。ＣＤ２＋細胞から２１
μｇのｍＲＮＡを回収した。 （３） 以下のようにして第一鎖ｃＤＮＡ合成を行った。 （ａ） ＰＣＲ機を４℃に保温している間に、以下の成分を順に添加して
第一鎖反応混合液を準備した。 ４１μｌ ＤＥＰＣ処理ｄｄＨ2０ ４μｌ １０ｍＭ各ｄＮＴＰ ８μｌ ０．１Ｍ ＤＴＴ １６μｌ ５ｘＭＭＬＶ第一鎖バッファー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ） ５μｌ （１０ｐｍｏｌ／μｌ） コンセンサスポリアデニル化部位プラ
イマー ＧＤ．Ｒ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）＊ １μｌ ＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ） ３μｌ （１．２５μｇ／μｌ） ｍＲＮＡ ＊注釈：GD.R1, 5' TTTTTTTTTTTTCGTCAGCGGCCGCATCNNNNTTTATT 3'(SEQ ID NO:10
) は、ｍＲＮＡの第一鎖ｃＤＮＡ合成用（遺伝子発見「 Ｇｅｎｅ Ｄｉｓｃｏ
ｖｅｒｙ」）プライマーである。このプライマーはポリアデニル化シグナルＡＡ
ＴＡＡＡおよび下流のポリＡ領域にアニールするように設計してある。このプラ
イマーにより、第一鎖にＮｏｔＩ切断部位が導入される。 サンプル調製後、以下のようにインキュベーションした。 （ｂ） ７０℃、１分 （ｃ） ４２℃、保温
【０２２７】 次にそれぞれのサンプルに２μｌの４００ Ｕ／μｌ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐ
ｔII（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ； Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を添加し、最終全
量を８２μｌとした。約３分後、サンプルを以下のようにインキュベーションし
た。 （ｄ） ３７℃、３０分 （ｅ） ９４℃、２分 （ｆ） ４℃、５分 続いてそれぞれのサンプルに２μｌの２０ Ｕ／μｌ ＲＮａｃｅ−ＩＴ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、サンプルを３７℃で１０分間インキュベーショ
ンした。
【０２２８】 （４） 第一鎖合成に続き、ＰＣＲ ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を
用いて以下のようにｃＤＮＡを精製した。 （ａ） １．７ｍｌのシリコン処理したエッペンドルフチューブに８０μ
ｌの第一鎖反応液を移し、４００μｌのＰＢを添加した。 （ｂ） サンプルをＰＣＲ ｃｌｅａｎｕｐカラムに移し、１４，０００
Ｒｐｍで２分間、遠心分離した。 （ｃ） カラムを分解して流出液をデカントし、ペレットに７５０μｌの
ＰＥを添加して、チューブを１４，０００Ｒｐｍで２分間遠心分離した。 （ｄ） カラムを分解して流出液をデカントし、チューブを１４，０００
Ｒｐｍで２分間遠心分離して樹脂を乾燥させた。 （ｅ） ５０μｌのＥＢを用いて、１４，０００Ｒｐｍで２分間遠心分離
することにより、カラムから新しくシリコン処理したエッペンドルフチューブに
溶出した。
【０２２９】 （５） 次に以下のようにして第二鎖ｃＤＮＡを合成した。 （ａ） 以下の成分を順に添加して、第二鎖反応混合液を室温で準備した
。 ｄｄＨ2Ｏ ５５μｌ １０ ｘ ＰＣＲバッファー １０μｌ ５０ ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５μｌ １０ ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２μｌ ２５ ｐｍｏｌ／μｌ ＲＩＧ．７５１−Ｂｉｏ＊ ４μｌ ２５ ｐｍｏｌ／μｌＧＤ．Ｒ２＊＊ ４μｌ 第一鎖産物 ２０μｌ ＊注釈：ＲＩＧ．Ｆ７５１−Ｂｉｏ， ５' Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＡＧＡＴＣＡＣ
ＴＡＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＣＧＧ ３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）は、
ｐＲＩＧベクターから発現される転写物のキャップ部位にアニールする。 ＊＊注釈：GD.R2, 5' TTTTCGTCAGCGGCCGCATC 3'(SEQ ID NO:12)は、ＧＤ．Ｒ１
プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）を用いて作製したｃＤＮＡをＰＣＲ増
幅するのに用いるプライマーである。ＧＤ．Ｒ２はＧＤ．Ｒ１のサブ配列であり
、ポリＡシグナル配列に先行する縮重塩基まで一致する。 （ｂ） 第二鎖合成の開始： ９４℃、１分 １μｌのＴａｑ（５ Ｕ／μｌ， Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を添加； １μｌのＶｅｎｔ ＤＮＡ ｐｏｌ（０．１ Ｕ／μｌ， Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加 （ｃ） ６３℃で２分間インキュベーション （ｄ） ７２℃で３分間インキュベーション （ｅ） （ｂ）のステップを４回繰り返す （ｆ） ７２℃で６分間インキュベーション （ｇ） ４℃でインキュベーション（保温） （ｈ） 終了
【０２３０】 （６） ＳＴＥで３回洗浄することにより、２００μｌの１ｍｇ／ｍｌストレプ
トアビジン常磁性粒子（ＳＡ−ＰＭＰ）を調製した。 （７） 第二鎖反応の産物をＳＡ−ＰＭＰに直接添加し、室温で３０分間インキ
ュベーションした。 （８） 結合後、マグネットでＳＡ−ＰＭＰを捕集し、上清を除去した。 （９） ５００μｌのＳＴＥでビーズを３回洗浄した。 （１０） ビーズを５０μｌのＳＴＥに再懸濁し、マグネットを用いてチューブ
の底に捕集した。次に、ピペットでＳＴＥ上清を注意深く除去した。 （１１） ５０μｌのｄｄＨ2０でビーズを再懸濁し、１００℃のウォーターバ
スに２分間入れてＰＭＰから精製ｃＤＮＡを遊離させた。 （１２） マグネットにＰＭＰを捕集し、ｃＤＮＡを含む上清を注意深く除去し
、精製ｃＤＮＡを回収した。 （１３） 精製産物をきれいなチューブに移し、１４，０００Ｒｐｍで２分間遠
心分離して残りのＰＭＰをすべて除去した。
【０２３１】 （１４） 次に、以下のようにＰＣＲ反応を行い、ＲＩＧ活性化ｃＤＮＡを特異
的に増幅した。 （ａ） 以下の成分を順に添加して、ＰＣＲ反応混合液を室温で準備した
。 Ｈ2Ｏ ５９μｌ １０ ｘ ＰＣＲバッファー １０μｌ ５０ ｍＭ ＭｇＣｌ２ ５μｌ １０ ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２μｌ ２５ ｐｍｏｌ／μｌ ＲＩＧ．Ｆ７８１＊ ２μｌ ２５ ｐｍｏｌ／μｌ ＧＤ．Ｒ２ ２μｌ 第二鎖産物 ２０μｌ ＊注釈：ＲＩＧ．Ｆ７８１， ５' ＡＣＴＣＡＴＡＧＧＣＣＡＴＡＧＡＧＧＣ
ＣＴＡＴＣＡＣＡＧＴＴＡＡＡＴＴＧＣＴＡＡＣＧＣＡＧ ３'（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１３）は、ＧＤ．Ｆ１， ＧＤ．Ｆ３， ＧＤ．Ｆ５−Ｂｉｏ， およ
びＲＩＧ．Ｆ７５１−Ｂｉｏの下流にアニールし、ｃＤＮＡの５'クローニング
用にＳｆｉＩ切断部位を付加する。このプライマーは、ＲＩＧ エキソン１特異
的第二鎖ｃＤＮＡのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ増幅に用いる。 （ｂ） サーマルサイクラーの開始： ９４℃、３分 １μｌのＴａｑ（５ Ｕ／μｌ， Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を添加； １μｌのＶｅｎｔ ＤＮＡ ｐｏｌ（０．１ Ｕ／μｌ， Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加 次に（ｃ）〜（ｅ）のステップを１０サイクル繰り返し、ＰＣＲを行った。 （ｃ） ９４℃、３０秒 （ｄ） ６０℃、４０秒 （ｅ） ７２℃、３分 続いて次のステップを行い、ＰＣＲを完了した。 （ｆ） ９４℃、３０秒 （ｇ） ６０℃、４０秒 （ｈ） ７２℃、３分 （ｉ） ７２℃ ＋ 各サイクル２０秒として１０サイクル分 （ｊ） ７２℃、５分 （ｋ） ４℃、保温
【０２３２】 （１５） ５０μｌのＥＢでライブラリー物質を溶出した後、１０μｌのＮＥＢ
バッファー２，４０μｌのｄＨ2Ｏ，および２μｌのＳｆｉＩを加えて５０℃で
１時間インキュベーションし、ｆｏｒｗａｒｄプライマー（ＲＩＧ．Ｆ７８１；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）でコードされるＳｆｉＩ切断部位でｃＤＮＡの５
’末を切断した。 （１６） ＳｆｉＩ切断後、５μｌの１ Ｍ ＮａＣｌと２μｌのＮｏｔＩをそ
れぞれのサンプルに加えて３７℃で１時間インキュベーションし、第一鎖プライ
マー（ＧＤ．Ｒ１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）でコードされるＮｏｔＩ切断
部位でｃＤＮＡの３’末を切断した。 （１７） 続いて切断したＤＮＡを１％低融点アガロースゲルで分画した。１．
２ ｋｂ〜８ ｋｂの範囲にあるｃＤＮＡをゲルから切り出した。 （１８） ＱｉａｅｘII Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用
いて切り出したアガロースゲルからｃＤＮＡを回収した。４００単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、全量１０μｌの１ｘＴ４リガーゼバッファー（
ＮＥＢ）中で、２μｌのｃＤＮＡ（約３０ｍｇ）を７μｌ（３５ｎｇ）のｐＢＳ
−ＨＳＰ（ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで直鎖状化）にライゲーションした。
【０２３３】 （１９） ステップ（１８）のライゲーション反応混合液０．５μｌをＥ．ｃｏ
ｌｉ ＤＨ１０Ｂに形質転換した。 （２０） １０３コロニー／０．５μｌライゲーションＤＮＡを回収した。 （２１） 以下のように、１２．５μｌ容量のＰＣＲでプライマーＭ１３Ｆ２０
およびＪＨ１８２（ＲＩＧエキソン１特異的）を用いて、これらのコロニーをエ
キソンについてスクリーニングした。 （ａ） 適当数の９６ウェルプレートに１００μｌのＬＢ（選択抗生物質
を含む）を分注した。 （ｂ） 単一コロニーを拾って９６ウェルプレートの個々のウェルに播種
し、プレートを３７℃のインキュベーターに振盪せずに２〜３時間置いた。 （ｃ） 以下のように、ＰＣＲ反応「マスターミックス」を氷上で調製し
た。
【０２３４】
【表２】
【０２３５】 （ｄ） ＰＣＲ反応プレートのそれぞれのウェルに１０μｌのマスターミ
ックスを分注した。 （ｅ） １００μｌのＥ．ｃｏｌｉ培養液から２．５μｌを、ＰＣＲ反応
プレートの対応するウェルに移した。 （ｆ） 典型的なＰＣＲサイクル条件でＰＣＲを行った。 （ｉ） ９４℃／２分（細菌の溶解とプラスミドの変性） （ｉｉ） ９２℃変性で１５分間；６０℃プライマーアニーリング
を２０秒；７２℃プライマー伸張を４０秒を３０サイクル （ｉｉｉ） ７２℃の最終伸張を５分 （ｉｖ） ４℃で保温 （ｇ） 次にＰＣＲ反応液にブロモフェノールブルーを添加した；サンプ
ルを混合し、遠心分離した後、全反応混合液をアガロースゲルにのせた。
【０２３６】 （２３） ２００クローンをスクリーニングしたうち、７８％がベクターのエキ
ソンに関して陽性であった。これらのうち９６クローンをミニプレップ用に培養
し、Ｑｉａｇｅｎ ９６−ｗｅｌｌ ｔｕｒｂｏ−ｐｒｅｐを用いてＱｉａｇｅ
ｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９７年４月）にしたがい精製し
た。 （２４） ＮＥＢバッファー３中、全量２２μｌで２μｌのＤＮＡをＮｏｔＩ，
ＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ，ＸｂａＩ，ＨｉｎｄIII，ＥｃｏＲＩで同時に切断し
、１％アガロースゲルで電気泳動することにより多くの重複クローンを除去した
。
【０２３７】 （結果） このプロトコールにより、２つの異なるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グした。１つめのライブラリー（ＴＭＴ＃１）では、単離した活性化遺伝子８つ
をシークエンシングした。これら８つの遺伝子のうち、４つの遺伝子は周知の内
在性膜タンパク質をコードし、６つは新規遺伝子であった。２つめのライブラリ
ー（ＴＭＴ＃２）では、単離した活性化遺伝子１１個をシークエンシングした。
これら１１個の遺伝子のうち、１つの遺伝子は周知の内在性膜タンパク質をコー
ドし、１つの遺伝子は内在性膜タンパク質に相同な部分的にシークエンシングさ
れた遺伝子をコードし、９つは新規遺伝子であった。単離した遺伝子がキャラク
タライズされた既知遺伝子に相当する場合はすべて、その遺伝子は内在性膜タン
パク質であった。
【０２３８】 それぞれのライブラリーから単離した遺伝子の典型的で顕著なアラインメント
（ＧｅｎＢａｎｋから得た）を以下に示す。
【０２３９】ＴＭＴ＃１の顕著なアラインメント： 179761|gb|M76559|Human neuronal DHP-sensitive voltage-dependent, calcium channel alpha-2b subunit mRNA complete CDs. Length = 3600 >gi|3183974|emb|Y10183|HSMEMD H.sapiens mRNA for MEMD protein Length = 4235ＴＭＴ＃２の顕著なアラインメント： >gi|476590|gb|U06715|HSU06715 Human cytochrome B561, HCYTO B561, mRNA, partial CDs. Length = 2463 >gi|2184843|gb|AA459959|AA459959 zx66c01.s1 Soares total fetus Nb2HF8 9w Homo sapiens cDNA clone 796414 3' similar to gb:J03171 INTERFERON-ALPHA RECEPTOR PRECURSOR (HUMAN); Length = 431
【０２４０】 理解を確実にする目的で本発明を説明と例によりある程度詳細に十分に記述し
たが、本発明あるいはその特異的実施態様の範囲に影響を及ぼすことなく、広範
で同等の条件、組成、および他のパラメータ範囲内で本発明を修飾あるいは変更
して同様のことが実施実施可能であること、そうした修飾あるいは変更が添付の
クレーム内に包含されることは、当業者には明らかであろう。
【０２４１】 この明細書で述べた刊行物、特許、および特許出願はすべて本発明に関連する
当業者の熟練レベルを示しており、これらは、各刊行物、特許、あるいは特許出
願が明示的に個々にあるいは個別に引用して本明細書の一部をなすものとされる
ように、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０２４２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本明細書に記載した遺伝子活性化事象の概略図。活性化構築物を細胞にトラン
スフェクトし、宿主細胞染色体のＤＮＡ破壊位置に組込ませる。破壊が目的の遺
伝子の上流で生じ（例えば、Ｅｐｏ）、適当な活性化構築物が破壊位置に取込ま
れ、よって、その調節配列が目的の遺伝子に機能的に結合するようになる場合、
遺伝子の活性化が生じる。転写およびスプライシングにより、活性化構築物由来
および内在性遺伝子由来のエキソン配列を含むキメラＲＮＡ分子が産生される。
続く翻訳により、目的のタンパク質が産生される。組換え細胞を単離した後、遺
伝子発現はさらに遺伝子増幅により増強することができる。
【図２】 翻訳されていない活性化構築物の概略図。矢印は、プロモーター配列を示す。
エキソン配列は、白抜きのボックスで示され、スプライスドナー配列はＳ／Ｄに
より示される。下記の明細書に対応する構築物番号は左に示される。選択および
増幅マーカーは示していない。
【図３】 翻訳された活性化構築物の概略図。矢印はプロモーター配列を示す。エキソン
配列は、白抜きのボックスで示され、スプライスドナー配列はＳ／Ｄにより示さ
れる。翻訳された、シグナルペプチド、エピトープタグ、およびプロテアーゼ開
裂配列は、構築物の下の説明に示す。下記の明細書に対応する構築物番号は左に
示される。選択および増幅マーカーは示していない。
【図４】 内在性遺伝子を活性化できる活性化構築物の概略図。
【図５Ａ−５Ｄ】 ｐＲＩＧ８Ｒ１−ＣＤ２のヌクレオチド配列（配列番号７）。
【図６Ａ−６Ｃ】 ｐＲＩＧ８Ｒ２−ＣＤ２のヌクレオチド配列（配列番号８）。
【図７Ａ−７Ｃ】 ｐＲＩＧ８Ｒ３−ＣＤ２のヌクレオチド配列（配列番号９）。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/00 5/00 Ｂ Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA80 CA20 DA03 EA04 FA02 FA06 FA08 FA10 FA18 GA11 GA14 GA18 GA30 HA09 4B064 AG01 CA10 CA19 CC01 CC24 DA01 DA11 DA13 4B065 AA01X AA57X AA58X AA72X AA88X AA90X AA93X AA95Y AB01 AC20 BA03 BA25 BA30 CA24 CA43 CA44 CA46 CA53 CA60 4C084 AA13 NA05 NA10 NA11

Claims (95)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配
    列と、１つまたは複数の増幅可能なマーカーとから実質的になるベクター構築物
    。
  2. 【請求項２】 分泌シグナル配列、不対スプライスドナー部位、および翻訳
    開始コドンに機能的に連結された転写調節配列から実質的になるベクター構築物
    。
  3. 【請求項３】 エピトープ標識、不対スプライスドナー部位、および翻訳開
    始コドンに機能的に連結された転写調節配列から実質的になるベクター構築物。
  4. 【請求項４】 分泌シグナル配列と、エピトープ標識と、不対スプライスド
    ナー部位、および翻訳開始コドンに機能的に連結された転写調節配列を含むベク
    ター構築物。
  5. 【請求項５】 分泌シグナル配列、エピトープ標識、配列特異的プロテアー
    ゼ部位、不対スプライスドナー部位、および翻訳開始コドンに機能的に連結され
    た転写調節配列を含むベクター構築物。
  6. 【請求項６】 前記構築物は、ポリシストロン性メッセージを産生するため
    の内部のリボソーム進入部位をさらに含む、請求項２から５のいずれか１項に記
    載のベクター構築物。
  7. 【請求項７】 前記構築物は１つまたは複数の増幅可能なマーカーをさらに
    含む、請求項２から５のいずれか１項に記載のベクター構築物。
  8. 【請求項８】 前記構築物は１つまたは複数の増幅可能なマーカーをさらに
    含む、請求項６に記載のベクター構築物。
  9. 【請求項９】 前記転写調節配列はプロモーターである、請求項１から５の
    いずれか１項に記載のベクター構築物。
  10. 【請求項１０】 前記プロモーターはウイルスプロモーターである、請求項
    ９に記載のベクター構築物。
  11. 【請求項１１】 前記ウイルスプロモーターはサイトメガロウイルス前初期
    プロモーターである、請求項１０に記載のベクター構築物。
  12. 【請求項１２】 前記プロモーターは非ウイルスプロモーターである、請求
    項９に記載のベクター構築物。
  13. 【請求項１３】 前記プロモーターは誘導性プロモーターである、請求項９
    に記載のベクター構築物。
  14. 【請求項１４】 前記転写調節配列はエンハンサーである、請求項１から５
    のいずれか１項に記載のベクター構築物。
  15. 【請求項１５】 前記エンハンサーはウイルスエンハンサーである、請求項
    １４に記載のベクター構築物。
  16. 【請求項１６】 前記ウイルスエンハンサーはサイトメガロウイルス前初期
    エンハンサーである、請求項１５に記載のベクター構築物。
  17. 【請求項１７】 前記エンハンサーは非ウイルスエンハンサーである、請求
    項１４に記載のベクター構築物。
  18. 【請求項１８】 請求項１から５のいずれか１項に記載のベクター構築物を
    含む細胞。
  19. 【請求項１９】 前記ベクター構築物は細胞ゲノムに組み込まれている、請
    求項１８に記載の細胞。
  20. 【請求項２０】 内因性遺伝子が、前記ベクター構築物での前記転写調節配
    列による前記遺伝子のアップレギュレーション(ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に
    よって前記細胞において過剰発現される、請求項１９に記載の細胞。
  21. 【請求項２１】 前記細胞は単離された細胞である、請求項１８に記載の細
    胞。
  22. 【請求項２２】 組換え細胞を作製するための方法であって、請求項１から
    ５のいずれか１項に記載の構築物を細胞に導入することを含む方法。
  23. 【請求項２３】 内因性遺伝子を細胞において過剰発現させるための方法で
    あって、 （ａ）請求項１から５のいずれか１項に記載の構築物を細胞に導入することと、 （ｂ）前記構築物を非相同組換えにより前記細胞のゲノムに組み込ませることと
    、 （ｃ）前記内因性遺伝子を前記細胞において過剰発現させることと、 を含む方法。
  24. 【請求項２４】 前記過剰発現はインビトロで行われる、請求項２３に記載
    の方法。
  25. 【請求項２５】 前記過剰発現はインビボで行われる、請求項２３に記載の
    方法。
  26. 【請求項２６】 内在性細胞遺伝子の単離された発現産物を製造するための
    方法であって、 （ａ）請求項２３に記載の方法に従って内因性遺伝子を細胞において過剰発現さ
    せること（ここで、前記内因性遺伝子の発現産物は前記細胞によって産生される
    ）と、 （ｂ）前記細胞から前記発現産物を単離することと、 を含む方法。
  27. 【請求項２７】 請求項１から５のいずれか１項に記載の構築物で形質転換
    された細胞集団を含む細胞ライブラリーであって、前記構築物は、非相同組換え
    により前記細胞のゲノムに組み込まれている細胞ライブラリー。
  28. 【請求項２８】 過剰発現された遺伝子産物を細胞ライブラリーから得る方
    法であって、請求項２７に記載のライブラリーを前記遺伝子産物についてスクリ
    ーニングすることと、前記遺伝子産物を過剰発現する細胞を前記ライブラリーか
    ら選択することと、前記の選択細胞から前記遺伝子産物を得ることとを含む方法
    。
  29. 【請求項２９】 内在性細胞遺伝子の単離された発現産物を製造するための
    方法であって、 （ａ）転写調節配列を含むベクターを細胞に導入することと、 （ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記細胞のゲノムに組み込ませること
    と、 （ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内
    因性遺伝子を前記細胞において過剰発現させることと、 （ｄ）前記内因性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングすること
    と、 （ｅ）前記細胞による前記内因性遺伝子の発現産物の製造に好ましい条件のもと
    で前記細胞を培養することと、 （ｆ）前記発現産物を単離することと、 を含む方法。
  30. 【請求項３０】 内在性細胞遺伝子の発現産物を製造するための方法であっ
    て、 （ａ）非レトロウイルスの転写調節配列を含むベクターを細胞に導入することと
    、 （ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記細胞のゲノムに組み込ませること
    と、 （ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内
    因性遺伝子を前記細胞において過剰発現させることと、 （ｄ）前記内因性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングすること
    とと、 （ｅ）前記細胞による前記内因性遺伝子の発現産物の製造に好ましい条件のもと
    で前記細胞を培養することと、 を含む方法。
  31. 【請求項３１】 内在性細胞遺伝子の発現産物を製造するための方法であっ
    て、 （ａ）分泌シグナル配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクターを細
    胞に導入することと、 （ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記細胞のゲノムに組み込ませること
    と、 （ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内
    因性遺伝子を前記細胞において過剰発現させることと、 （ｄ）前記内因性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングすること
    と、 （ｅ）前記細胞による前記内因性遺伝子の発現産物の製造に好ましい条件のもと
    で前記細胞を培養することと、 を含む方法。
  32. 【請求項３２】 内在性細胞遺伝子の発現産物を製造するための方法であっ
    て、 （ａ）分泌シグナル配列に機能的に連結された非レトロウイルスの転写調節配列
    を含むベクターを細胞に導入することと、 （ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記細胞のゲノムに組み込ませること
    と、 （ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内
    因性遺伝子を前記細胞において過剰発現させることと、 （ｄ）前記内因性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングすること
    と、 （ｅ）前記細胞による前記内因性遺伝子の発現産物の製造に好ましい条件のもと
    で前記細胞を培養することと、 を含む方法。
  33. 【請求項３３】 内在性細胞遺伝子の発現産物を製造するための方法であっ
    て、 （ａ）不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベク
    ターを細胞に導入することと、 （ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記細胞のゲノムに組み込ませること
    と、 （ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内
    因性遺伝子を前記細胞において過剰発現させることと、 （ｄ）前記内因性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングすること
    と、 （ｅ）前記細胞による前記内因性遺伝子の発現産物の製造に好ましい条件のもと
    で前記細胞を培養することと、 を含む方法。
  34. 【請求項３４】 前記発現産物を単離することをさらに含む、請求項３０か
    ら３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 内因性遺伝子をインビボの細胞で過剰発現させるための方
    法であって、 （ａ）転写調節配列を含むベクターを細胞に導入することと、 （ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記細胞のゲノムに組み込ませること
    と、 （ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内
    因性遺伝子を前記細胞において過剰発現させることと、 （ｄ）前記内因性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングすること
    と、 （ｅ）前記の単離およびクローニングされた細胞をインビボの前記細胞による前
    記内因性遺伝子の過剰発現に好ましい条件のもとで動物に導入することと、 を含む方法。
  36. 【請求項３６】 内因性細胞遺伝子の発現産物をインビボで製造するための
    方法であって、 （ａ）不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベク
    ターを細胞に導入することと、 （ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記細胞のゲノムに組み込ませること
    と、 （ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内
    因性遺伝子を前記細胞において過剰発現させることと、 （ｄ）前記内因性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングすること
    と、 （ｅ）前記の単離およびクローニングされた細胞をインビボでの前記細胞による
    前記内因性遺伝子の過剰発現に好ましい条件のもとで動物に導入することと、 を含む方法。
  37. 【請求項３７】 内在性細胞遺伝子の発現産物を製造するための方法であっ
    て、 （ａ）転写調節配列および１つまたは複数の増幅可能なマーカーを含むベクター
    を細胞に導入することと、 （ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記細胞のゲノムに組み込ませること
    と、 （ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内
    因性遺伝子を前記細胞において過剰発現させることと、 （ｄ）前記内因性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングすること
    と、 （ｅ）前記ベクターおよび前記内因性遺伝子が前記細胞で増幅される条件のもと
    で前記細胞を培養することと、 （ｆ）前記細胞による前記内因性遺伝子の発現産物の製造に好ましい条件のもと
    で前記細胞を培養することと、 を含む方法。
  38. 【請求項３８】 前記発現産物を単離することをさらに含む、請求項３７に
    記載の方法。
  39. 【請求項３９】 内因性遺伝子をインビボの細胞で過剰発現させるための方
    法であって、 （ａ）転写調節配列および１つまたは複数の増幅可能なマーカーを含むベクター
    を細胞に導入することと、 （ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記細胞のゲノムに組み込ませること
    と、 （ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内
    因性遺伝子を前記細胞において過剰発現させることと、 （ｄ）前記内因性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングすること
    と、 （ｅ）前記の単離およびクローニングされた細胞をインビボの前記細胞による前
    記内因性遺伝子の過剰発現に好ましい条件のもとで動物に導入することと、 を含む方法。
  40. 【請求項４０】 前記転写調節配列はプロモーターである、請求項２６、２
    ８から３３、３５から３７または３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記プロモーターはウイルスプロモーターである、請求項
    ４０に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記ウイルスプロモーターはサイトメガロウイルス前初期
    プロモーターである、請求項４１に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記プロモーターは非ウイルスプロモーターである、請求
    項４０に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記プロモーターは誘導性である、請求項４０に記載の方
    法。
  45. 【請求項４５】 前記転写調節配列はエンハンサーである、請求項２６、２
    ８から３３、３５から３７または３９のいずれか１項に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記エンハンサーはウイルスエンハンサーである、請求項
    ４５に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記ウイルスエンハンサーはサイトメガロウイルス前初期
    エンハンサーである、請求項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記エンハンサーは非ウイルスエンハンサーである、請求
    項４５に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記ベクターの組み込みの前またはその組み込みと同時に
    、前記細胞のゲノムＤＮＡに二本鎖の破壊を導入することをさらに含む、請求項
    ２６、２８から３３、３５から３７または３９のいずれか１項に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 請求項２６、２８から３３、３５から３７または３９のい
    ずれか１項に記載の方法によって作製される細胞。
  51. 【請求項５１】 前記ベクターは線状である、請求項２９から３３、３５か
    ら３７または３９のいずれか１項に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 内因性遺伝子を細胞において過剰発現させるための方法で
    あって、 （ａ）転写調節配列を含むベクターを細胞に導入することと、 （ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記細胞のゲノムに組み込ませること
    と、 （ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内
    因性遺伝子を前記細胞において過剰発現させることと、 （ｄ）前記内因性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングすること
    とと、 （ｅ）無血清培地で前記細胞を培養することと、 を含む方法。
  53. 【請求項５３】 内在性細胞遺伝子の発現産物を製造するための方法であっ
    て、 （ａ）転写調節配列を含むベクターを細胞に導入することと、 （ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記細胞のゲノムに組み込ませること
    と、 （ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内
    因性遺伝子を前記細胞において過剰発現させることと、 （ｄ）前記内因性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングすること
    と、 （ｅ）前記細胞による前記内因性遺伝子の発現産物の製造に好ましい条件のもと
    で前記細胞を培養することと、 （ｆ）１０4細胞／ｍｌで１０リットルに等しい細胞量から前記発現産物を単離
    することと、 を含む方法。
  54. 【請求項５４】 遺伝子の発現を活性化させるための方法であって、 （ａ）調節配列および不対スプライスドナー部位を含有し、かつ標的化配列を有
    さないベクターを細胞のゲノムに導入することと、 （ｂ）遺伝子の発現について前記細胞をスクリーニングすることと、 を含む方法。
  55. 【請求項５５】 活性化されたタンパク質を産生する細胞を単離することを
    さらに含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 遺伝子の発現を活性化させるための方法であって、 （ａ）調節配列および不対スプライスドナー部位を含有するベクターを非相同組
    換えにより細胞に組み込むことと、 （ｂ）遺伝子（ただし、この遺伝子およびこの遺伝子の上流領域は前記ベクター
    との相同性を有さない）を発現する非相同組換え細胞をスクリーニングすること
    と、 を含む方法。
  57. 【請求項５７】 表現型が知られている遺伝子の細胞での発現を、前記遺伝
    子の何らかの配列情報を使用することなく、ｉｎ ｓｉｔｕで高めるための方法
    であって、 （ａ）調節配列および不対スプライスドナー配列を含むベクターを構築する工程
    と、 （ｂ）複数コピーの前記ベクターを複数の細胞に送達する工程と、 （ｃ）挿入されたベクターと前記細胞のゲノムとの間での非相同組換え事象を可
    能にする条件のもとで前記細胞を培養する工程と、 （ｄ）前記表現型に関するアッセイにより前記組換え細胞をスクリーニングして
    、前記遺伝子の発現が高められた細胞を同定する工程と、 を含む方法。
  58. 【請求項５８】 前記表現型は特定のタンパク質の産生であり、かつ前記ア
    ッセイは前記タンパク質の増大した産生に関する試験により行われる、請求項５
    ７に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 表現型が知られている遺伝子の細胞での発現を、前記遺伝
    子の何らかの配列情報を使用することなく、ｉｎ ｓｉｔｕで高めるための方法
    であって、 （ａ）調節配列および不対スプライスドナー配列を含むベクターを構築する工程
    と、 （ｂ）複数コピーの前記ベクターを複数の細胞に送達する工程と、 （ｃ）挿入されたベクターと前記細胞のゲノムとの間での非相同組換え事象の可
    能性を増大させる条件のもとで前記細胞を培養する工程と、 （ｄ）前記表現型に関するアッセイにより前記組換え細胞をスクリーニングして
    、前記遺伝子の発現が高められた細胞を同定する工程と、 を含む方法。
  60. 【請求項６０】 表現型が知られている遺伝子の細胞での発現を、前記遺伝
    子の何らかの配列情報を使用することなく、ｉｎ ｓｉｔｕで活性化させるため
    の方法であって、 （ａ）調節配列および不対スプライスドナー配列を含むベクターを構築する工程
    と、 （ｂ）前記ベクターを少なくとも１００，０００個の細胞に非相同組換えにより
    組み込む工程と、 （ｃ）前記表現型に関するアッセイにより前記組換え細胞をスクリーニングして
    、前記遺伝子の発現が活性化された細胞を同定する工程と、 を含む方法。
  61. 【請求項６１】 不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節
    配列を含む挿入された遺伝子構築物をゲノムに含む単離された細胞であって、前
    記遺伝子構築物は、遺伝子内または遺伝子の上流領域に挿入され、かつ前記遺伝
    子の発現を活性化し、そして前記遺伝子および前記遺伝子の上流領域は前記遺伝
    子構築物に対するヌクレオチド配列相同性を有さない細胞。
  62. 【請求項６２】 前記の組み込まれた遺伝子構築物は、１つまたは複数の増
    幅可能なマーカーをさらに含有する、請求項６１に記載の細胞。
  63. 【請求項６３】 不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節
    配列を含む挿入された遺伝子構築物をゲノムに含む単離された細胞であって、前
    記遺伝子構築物は、前記遺伝子または前記遺伝子の上流領域に対するヌクレオチ
    ド配列相同性を有さない細胞。
  64. 【請求項６４】 遺伝子の発現を活性化させるための方法であって、 （ａ）転写調節配列および不対スプライスドナー配列を含むベクターを構築する
    ことと、 （ｂ）前記ベクターを細胞に導入することと、 （ｃ）前記の挿入されたベクターと前記細胞のゲノムとの間の非相同組換え事象
    を可能にする条件のもとで前記細胞を培養することと、 （ｄ）遺伝子（ただし、この遺伝子およびこの遺伝子の上流領域は前記ベクター
    に対するヌクレオチド配列相同性を有さない）の発現に関するアッセイにより前
    記組換え細胞をスクリーニングすることと、 を含む方法。
  65. 【請求項６５】 不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節
    配列を含む挿入された遺伝子構築物をゲノムに含む単離された細胞であって、前
    記遺伝子構築物は、非相同組換えにより遺伝子内または遺伝子の上流領域に挿入
    され、そして前記遺伝子の発現を活性化させる細胞。
  66. 【請求項６６】 遺伝子の発現を高めるための方法であって、 （ａ）エンハンサー配列および１つまたは複数の増幅可能なマーカーを含有し、
    そして標的化配列を有さないベクターを細胞のゲノムに導入することと、 （ｂ）前記細胞を遺伝子の発現についてスクリーニングすることと、 を含む方法。
  67. 【請求項６７】 活性化されたタンパク質を産生する前記細胞を単離するこ
    とをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 遺伝子の発現を高めるための方法であって、 （ａ）エンハンサー配列を含有するベクターを非相同組換えにより細胞に組み込
    むことと、 （ｂ）遺伝子（ただし、この遺伝子ならびに前記エンハンサーが活性であるこの
    遺伝子の上流領域および下流領域は、前記ベクターに対する相同性を有さない）
    を発現する非相同組換え細胞に関してスクリーニングすることと、 を含む方法。
  69. 【請求項６９】 表現型が知られている遺伝子の細胞での発現を、前記遺伝
    子の何らかの配列情報を使用することなく、ｉｎ ｓｉｔｕで高めるための方法
    であって、 （ａ）エンハンサーを含むベクターを構築する工程と、 （ｂ）複数コピーの前記ベクターを複数の細胞に送達する工程と、 （ｃ）前記ベクターと前記細胞のゲノムとの間の非相同組換え事象を可能にする
    条件のもとで前記細胞を培養する工程と、 （ｄ）前記表現型に関するアッセイにより前記組換え細胞をスクリーニングして
    、前記遺伝子の発現が高められた細胞を同定する工程と、 を含む方法。
  70. 【請求項７０】 前記表現型は特定のタンパク質の産生であり、そして前記
    アッセイは前記タンパク質の増大した産生に関する試験により行われる、請求膏
    ６９に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 表現型が知られている遺伝子の細胞での発現を、前記遺伝
    子の何らかの配列情報を使用することなく、ｉｎ ｓｉｔｕで高めるための方法
    であって、 （ａ）エンハンサーを含むベクターを構築する工程と、 （ｂ）複数コピーの前記ベクターを複数の細胞に送達する工程と、 （ｃ）前記ベクターと前記細胞のゲノムとの間の非相同組換え事象の可能性を増
    大させる条件のもとで前記細胞を培養する工程と、 （ｄ）前記表現型に関するアッセイにより前記組換え細胞をスクリーニングして
    、前記遺伝子の発現が高められた細胞を同定する工程と、 を含む方法。
  72. 【請求項７２】 遺伝子の細胞での発現を、前記遺伝子の何らかの配列情報
    を使用することなく、ｉｎ ｓｉｔｕで高めるための方法であって、 （ａ）エンハンサーを含むベクターを構築する工程と、 （ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより少なくとも１００，０００個の細胞に
    組み込む工程と、 （ｃ）前記表現型に関するアッセイにより前記組換え細胞をスクリーニングして
    、前記遺伝子の発現が高められた細胞を同定する工程と、 を含む方法。
  73. 【請求項７３】 挿入された人工の遺伝子構築物をゲノムに含む精製された
    細胞であって、前記遺伝子構築物は、遺伝子の発現を高めるために細胞株におい
    て効果的なエンハンサーを含み、そして遺伝子内または前記エンハンサーが効果
    的である遺伝子の上流領域もしくは下流領域に挿入され、前記遺伝子および前記
    領域は前記遺伝子構築物における任意の配列に対する相同性を有さない細胞。
  74. 【請求項７４】 前記の組み込まれた遺伝子構築物は１つまたは複数の増幅
    可能なマーカーをさらに含有する、請求項７３に記載の細胞。
  75. 【請求項７５】 挿入された人工の遺伝子構築物をゲノムに含む精製された
    細胞であって、前記遺伝子構築物は、遺伝子の発現を高めるために細胞株におい
    て効果的なエンハンサーを含み、そして前記遺伝子における任意の配列に対する
    相同性、または前記エンハンサーが効果的である前記遺伝子の上流配列もしくは
    下流領域に対する相同性を有さない細胞。
  76. 【請求項７６】 遺伝子発現を高めるための方法であって、 （ａ）エンハンサーを含むベクターを構築することと、 （ｂ）前記ベクターを細胞に導入することと、 （ｃ）前記挿入ベクターと前記細胞のゲノムとの間の非相同組換えを可能にする
    条件のもとで前記細胞を培養することと、 （ｄ）遺伝子（ただし、この遺伝子ならびに前記エンハンサーが効果的であるこ
    の遺伝子の上流領域および下流領域は、前記ベクターに対する相同性を有さない
    ）の発現に関するアッセイにより前記細胞をスクリーニングすることと、 を含む方法。
  77. 【請求項７７】 挿入された遺伝子構築物をゲノムに含む単離された細胞で
    あって、前記遺伝子構築物は、内因性遺伝子の前記細胞での発現を活性化するた
    めに細胞株において効果的なエンハンサーを含み、そして非相同組換えによって
    遺伝子内または遺伝子の上流領域もしくは下流領域に挿入されている細胞。
  78. 【請求項７８】 前記ベクター構築物は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５
    つの増幅可能なマーカーを含む、請求項７に記載のベクター構築物。
  79. 【請求項７９】 前記ベクター構築物は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５
    つの増幅可能なマーカーを含む、請求項８に記載のベクター構築物。
  80. 【請求項８０】 前記ベクター構築物は１つの増幅可能なマーカーを含む、
    請求項７８または請求項７９に記載のベクター構築物。
  81. 【請求項８１】 前記ベクター構築物は２つの増幅可能なマーカーを含む、
    請求項７８または請求項７９に記載のベクター構築物。
  82. 【請求項８２】 前記ベクター構築物は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５
    つの増幅可能なマーカーを含む、請求項３７、３９または６６のいずれか１項に
    記載のベクター構築物。
  83. 【請求項８３】 前記ベクター構築物は１つの増幅可能なマーカーを含む、
    請求項８２に記載の方法。
  84. 【請求項８４】 前記ベクター構築物は２つの増幅可能なマーカーを含む、
    請求項８２に記載の方法。
  85. 【請求項８５】 前記の組み込まれた遺伝子構築物は、１つ、２つ、３つ、
    ４つまたは５つの増幅可能なマーカーを含む、請求項６２または請求項７４に記
    載の細胞。
  86. 【請求項８６】 前記の組み込まれた遺伝子構築物は１つの増幅可能なマー
    カーを含む、請求項８５に記載の細胞。
  87. 【請求項８７】 前記の組み込まれた遺伝子構築物は２つの増幅可能なマー
    カーを含む、請求項８５に記載の細胞。
  88. 【請求項８８】 前記内因性遺伝子は膜貫通タンパク質をコードする、請求
    項２６、２８から３３、３５から３７、３９、５２または５３のいずれか１項に
    記載の方法。
  89. 【請求項８９】 前記内因性遺伝子は細胞膜貫通タンパク質をコードする、
    請求項２３に記載の方法。
  90. 【請求項９０】 前記遺伝子は細胞膜貫通タンパク質をコードする、請求項
    ５４、５６、５７、５９、６０、６４、６６、６８、６９、７１、７２または７
    ６のいずれか１項に記載の方法。
  91. 【請求項９１】 前記細胞を動物に導入する前に、前記細胞の単離およびク
    ローニングを行うことをさらに含む、請求項３５、３６または３９のいずれか１
    項に記載の方法。
  92. 【請求項９２】 前記動物は哺乳動物である、請求項３５、３６または３９
    のいずれか１項に記載の方法。
  93. 【請求項９３】 前記哺乳動物はヒトである、請求項９２に記載の方法。
  94. 【請求項９４】 細胞の内在性膜タンパク質をコードする内因性遺伝子を同
    定するための方法であって、 （ａ）転写調節配列を含むベクターを細胞に導入することと、 （ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記細胞のゲノムに組み込ませること
    と、 （ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内
    因性遺伝子を前記細胞において過剰発現させることと、 （ｄ）前記内因性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングすること
    と、 （ｅ）前記の活性化された遺伝子を特徴付けして、細胞の内在性膜タンパク質を
    コードする遺伝子としてその実体を明らかにすることと、 を含む方法。
  95. 【請求項９５】 前記の活性化された遺伝子は、前記の特徴づけが行われる
    前に前記細胞から単離される、請求項９４に記載の方法。
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