CN102669057B - 一种调控动物内源基因表达的遗传修饰方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种调控动物内源基因表达的遗传修饰方法。本发明通过基因重组技术将四环素响应元件定点插入到动物拟调控的内源基因的合适位置；通过转基因方法将调控基因转入动物基因组内，获得转基因动物，在诱导物四环素或其类似物的作用下实现对内源基因的可逆的表达调控。该方法建立的小鼠内源基因诱导表达调控模型可广泛应用于基因功能研究，疾病动物模型的建立等领域。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体的，涉及一种可诱导的调控内源基因表达的模型，及建立该模型的方法，以及该模型的用途。
背景技术
后基因组时代面临的一个主要挑战就是阐明新发现的成千上万基因的功能。对这些基因功能研究的阐明直接关系到对发育和疾病等相关过程的研究和理解。当前对基因功能研究的一个有效途径是：在细胞水平上，通过上调(过表达)或者下调(RNAi或者突变失活)该基因的表达，来研究其对细胞功能的影响；在整体动物水平上，往往通过建立转基因的动物上调该基因的表达，或者通过建立突变和基因剔除动物品系失活该基因的功能，来研究其在整体水平上的生理功能病理作用。而在建立转基因和基因剔除动物的过程中，目的基因的功能性失活往往是整个生命周期性的。这种生命周期性的失活经常带来以下问题：1)基因失活导致胚胎致死或者产后致死，导致无法对其在生长发育后期的功能进行评估；2)无法判断目的基因失活的表型是在观察时基因失活的一个结果还是因为该基因在成长发育早期失活造成的一个后果；3)该基因长期失活造成的功能缺失为其他基因功能所代偿，掩盖了该基因功能的表现。为了解决这些问题，人们开发了一系列条件性敲除和表达系统，如：Cre-LoxP介导的组织特异性敲除、四环素调控的转录激活系统和可诱导的RNAi系统。Cre-LoxP系统虽然解决了基因敲除的组织特异性问题但其引发的功能缺失是不可逆的；四环素调控的转录激活系统无法下调目的基因的内源性表达，仅适用于过表达；近年来发展的可诱导RNAi系统虽然具有时空可调控性但RNAi本身的专一性及细胞毒性问题给研究带来一定的不确定性，同时其在高等动物如小鼠等整体水平上的应用常常在效率上大大低于细胞的水平，目前原因尚不清楚。由此可见，这些系统均不能完全解决所出现的问题。
因此，对于基因功能的研究迫切需要开发一种新的具有时空特异性，可以可逆的上调或者下调内源基因表达的系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调控动物内源基因表达的遗传修饰方法。
本发明的另一目的在于提供一种模式动物，所述模式动物中目的内源基因是可诱导调控表达的。
在本发明的第一方面，提供一种制备模式动物的方法，所述模式动物中目的内源基因是可诱导调控表达的，所述方法包括：
(1)建立转基因动物1(内源基因响应动物)：该动物1基因组中，目的内源基因的转录起始位点附近插入了四环素响应元件(TRE)；
(2)建立转基因动物2(调控动物)：该动物2基因组中，包括转录抑制因子或转录激活因子的编码基因，所述的转录抑制因子或转录激活因子可与四环素响应元件结合，且所述结合受四环素或其类似物(如强力霉素)调控；
(3)将转基因动物1和转基因动物2进行交配，选出基因组中既包括四环素响应元件、又包括转录抑制因子或转录激活因子的编码基因的动物，作为模式动物。
在另一优选例中，所述的四环素响应元件具有SEQ ID NO：1所示的核酸序列。
在另一优选例中，所述的四环素响应元件插入在所述的目的内源基因的转录起始位点上游或下游4000bp范围内(较佳地为3000bp范围内)。
在另一优选例中，通过同源重组或随机插入的方式将四环素响应元件插入基因组中。
在另一优选例中，所述的转录抑制因子选自：tTR-KRAB或RtTR-KRAB；或所述的转录激活因子选自：tTA或rtTA。
在另一优选例中，所述的转录抑制因子tTR-KRAB具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的转录抑制因子RtTR-KRAB
在另一优选例中，所述的转录激活因子tTA具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的转录激活因子rtTA具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，步骤(1)、(2)或(3)中，还分别包括，对获得的动物进行交配建系，获得子代动物。
在另一优选例中，所述的动物是转录抑制因子或转录激活因子的编码基因、四环素响应元件纯合的动物。
在另一优选例中，所述的动物是有性繁殖的动物；如选自：虫、果蝇线、鱼、大鼠、小鼠、猴。
在另一优选例中，所述的四环素的类似物是：强力霉素。
在本发明的另一方面，提供一种诱导调控模式动物中目的内源基因表达的方法，所述方法包括：
(a)提供模式动物，所述模式动物通过所述的方法获得；
(b)给予(a)的模式动物四环素或其类似物，从而调控模式动物中目的内源基因的表达。
在另一优选例中，(a)所述的模式动物中，包括转录抑制因子RtTR-KRAB的编码基因；(b)中，给予(a)的模式动物四环素或其类似物，模式动物中目的内源基因的表达受到抑制；不(或撤销)给予(a)的模式动物四环素或其类似物，目的内源基因正常表达；或者
(a)所述的模式动物中，包括转录抑制因子tTR-KRAB的编码基因；(b)中，不(或撤销)给予(a)的模式动物四环素或其类似物，模式动物中目的内源基因的表达受到抑制；给予(a)的模式动物四环素或其类似物，目的内源基因的表达抑制被解除；或者
(a)所述的模式动物中，包括转录激活因子tTA的编码基因；(b)中，给予(a)的模式动物四环素或其类似物，模式动物中目的内源基因的正常表达；不(或撤销)给予(a)的模式动物四环素或其类似物，目的内源基因超表达；或者
(a)所述的模式动物中，包括转录激活因子rtTA的编码基因；(b)中，给予(a)的模式动物四环素或其类似物，激活模式动物中目的内源基因的超表达；不(或撤销)给予(a)的模式动物四环素或其类似物，目的内源基因正常表达。
在本发明的另一方面，提供一种模式动物在基因功能研究中的用途，所述的模式动物通过所述的方法获得。
在本发明的另一方面，提供一种细胞(非生殖细胞或胚胎干细胞)，其来源于一种模式动物，所述的模式动物通过所述的方法获得。
在本发明的另一方面，提供所述的体细胞在基因功能研究中的用途。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了四环素调控的转录激活系统示意图。
图2显示了本发明受CAG启动子驱动的广泛表达的tTR-KRAB和RtTR-KRAB质粒结构图。
图3显示了本发明CAG启动子驱动的tTR-KRAB和RtTR-KRAB转基因小鼠基因型二次鉴定结果图。其中，
上图：泳道1-22为tTR-KRAB转基因founder鼠PCR产物，泳道23为野生型小鼠PCR产物，泳道24为PCR模板为纯水对照物的PCR产物，泳道25为DNAmarker；
下图：泳道1-19为tTR-KRAB转基因founder鼠PCR产物，泳道20为野生型小鼠PCR产物，泳道21为PCR模板为纯水对照物的PCR产物，泳道22为DNAmarker。
图4显示了本发明用于制备Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠的质粒结构图。
图5显示了Nmyc-TRE-EGFP-Knockin质粒ES细胞转染同源重组阳性ES细胞PCR鉴定示意图。其中，
图A为左臂鉴定示意图，图中左边泳道为DNA marker，1-5所示为阳性ES细胞PCR产物结果，6为阴性ES细胞PCR产物结果；
图B为右臂鉴定示意图，1-5所示为阳性ES细胞PCR产物结果，6，7为阴性ES细胞PCR产物结果，右边泳道为DNA marker。
图6显示了在无强力霉素情况下tTR-KRAB对Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠Nmyc启动子的表达调控效果。其中，
图A为Realtime PCR检测结果图；
图B为Western检测结果图；
图C为荧光显微镜检测结果图。
图7显示了在添加强力霉素情况下tTR-KRAB对Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠Nmyc启动子的表达调控效果。其中，
图A为Realtime PCR检测结果图；
图B为Western检测结果图；
图C为荧光显微镜检测结果图。
图8显示了有无强力霉素条件下，RtTR-KRAB对Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠Nmyc启动子的表达调控效果。其中，
图A为在无强力霉素情况下，Realtime PCR检测结果图；
图B为在有强力霉素情况下，Realtime PCR检测结果图；
图C为无强力霉素情况下，荧光显微镜检测结果图。
图9显示了Cre酶作用前后Nmyc基因的结构。
图10显示了有无强力霉素(dox)条件下，tTR-KRAB对Nmyc-TRE-Knockin小鼠内源Nmyc基因的表达调控效果。
具体实施方式
针对目前基因功能研究中的基因表达调控系统的缺陷，本发明人经广泛的研究以及反复的试验，首次提出了一种对动物体内内源基因进行可诱导的可逆调控表达的方法，通过基因重组技术将四环素响应元件(TRE)定点插入到动物拟调控的内源基因的合适位置；通过转基因方法将调控基因转入动物基因组内，获得转基因动物，在诱导物四环素或其类似物的作用下实现对内源基因的可逆的表达调控。该方法建立的小鼠内源基因诱导表达调控模型可广泛应用于基因功能研究，疾病动物模型的建立等领域。
术语
如本文所用，所述的“动物”没有特别的限制，只要其是适合于采用本发明的方法进行转基因操作并能够产生子代(后代)，且是有性繁殖的动物。例如，所述的动物包括但不限于：虫、果蝇线、鱼、大鼠、小鼠、猴。作为一种可选的方式，所述的动物是哺乳动物，更特别的是非人哺乳动物。例如，所述的非人哺乳动物选自：小鼠、大鼠、兔、狗、猴。所述的非人哺乳动物在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等方面和人类接近。优选的，所述的非人哺乳动物是鼠；更优选的是小鼠。作为本发明的优选方式，以小鼠作为模式生物，和人类相比，它无论在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等都和人类非常接近，因此可良好地应用于人类疾病发病机制、药物药理学研究等方面。
如本文所用，除非另外说明，“/”表示“或”。
如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。
如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
如本文所用，“内源的”基因或蛋白是指天然地或内在地包含在动物体基因组中的基因或蛋白。
如本文所用，“目的基因”是指欲(拟)调控的基因，也即由本发明的方法调控表达的基因。本发明中，“目的基因”可以是基因组中任何感兴趣的、需要了解其功能的基因。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
原理
本发明的调控内源基因表达的原理为：转录抑制因子可通过结合到近启动子区域的TRE位点上，引起内源基因启动子区域甲基化和去乙酰化，引发转录抑制；转录激活因子同样可以结合TRE位点，达到激活目标基因的过表达。而这些转录调控因子与TRE的结合都受四环素及其类似物调控，因此可以通过四环素及其类似物的有无调控转录调控因子与TRE位点的结合，进而实现可逆地调控内源基因的表达。
四环素调控的转录激活系统
四环素诱导的转录激活系统包括Tet-off和Tet-on两个系统(图1)。Tet-off系统由调节质粒和反应质粒组成。调节质粒包含一个杂合的四环素调控的转录活化因子(tetracycline_controlled transactivator，tTA)，它是由大肠杆菌Tnl0四环素抗性操纵子中调节基因表达的阻遏蛋白(tet repressor protein，TetR)与单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白羧基末端的一段转录激活区融合而成(序列例如SEQ ID NO：4)，VP16转录激活区可招募RNA聚合酶II起始转录。
tTA序列受人巨细胞病毒IE启动子(Phcmv)调控。反应质粒中含有目的基因，并受四环素反应元件(tet-responsive element，TRE)的操纵。TRE包含有操纵基因(tet operator，TetO)的42个碱基的7次正向重复序列，它的下游为人巨细胞病毒的最低限度启动子(minimal CMV promoter，P minCMV)，minimal Phcmv将PhCMV中增强子区去掉后余下的启动子序列，当没有tTA结合到tetOs的时候minimal P hcmv处于转录失活状态，如图1B所示，当没有四环素或其衍生物的时候，tTA结合到tetOs上，起始P minCMV的转录，目的基因表达；当存在四环素或其衍生物的时候，四环素或其衍生物与tTA结合，不能结合到P minCMV上，转录终止，目的基因不表达。Tet-on系统与Tet-off系统类似，也是由调控质粒和反应质粒组成，只是将Tet-on系统中的调控质粒的tTA经氨基酸突变成为rtTA(reverse tetracycline(Tet)-controlledtransactivator，SEQ ID NO：5)，rtTA具有与tTA相反的药理学性质，如图1A所示，在没有四环素或其衍生物的时候，不能结合特异的DNA靶序列(TetO)，不能引发转录，而在加入四环素或其衍生物强力霉素(doxycycline，Dox)后，才能与tetO结合，引发下游基因的转录表达。
转录抑制因子tTR-KRAB/RtTR-KRAB
转录抑制因子tTR-KRAB为一融合蛋白，它是由大肠杆菌Tnl0四环素抗性操纵子中调节基因表达的阻遏蛋白(tet repressor protein，TetR)与Kox1蛋白的KRAB结构域融合而成；而RtTR-KRAB是由RtTR蛋白(TetR蛋白氨基酸突变体)与KRAB结构域融合而成。tTR/RtTR结构域可以与四环素响应位点(TRE)特异性结合，但两者具有相反的药理学特性，tTR在没有四环素或其衍生物的情况下可以结合到TRE位点上，有四环素或其衍生物的情况下不能与TRE位点结合；而RtTR则是在有四环素或其衍生物的情况下可以结合到TRE位点上，没有四环素或其衍生物的情况下不能与TRE位点结合。KRAB结构域可以招募甲基化酶和去乙酰化酶，导致结合位点旁边3kb区域内DNA区域甲基化去乙酰化，抑制转录的发生。关于tTR-KRAB或RtTR-KRAB的描述还可参考文献：ULRICH.DEUSCHLE，et.al.Tetracycline-Reversible Silencing ofEukaryotic Promoters.MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，Apr.1995，p.1907-1914和Jolanta Szulc，et.al.A versatile tool for conditional geneexpression and knockdown.NATURE METHODS VOL.3 NO.2 FEBRUARY2006 109。
因此，可以通过四环素或其衍生物(如强力霉素)的有无，调控tTR-KRAB/RtTR-KRAB与TRE位点的结合，从而可逆地下调内源基因的表达。当将tTA/rtTA代替tTR-KRAB/RtTR-KRAB，上述模型可以演变为对内源基因上调表达的方式。
作为本发明的优选方式，所述的转录抑制因子tTR-KRAB具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列；所述的转录抑制因子RtTR-KRAB具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
转基因
在本发明中，四环素响应元件(TRE)的插入可通过同源重组或随机插入等方法进行。在本领域中，通过同源重组或者随机插入在基因组中插入DNA片段的技术是已知的，这些常规技术都可用于本发明。
在本发明中，实现转录抑制因子tTR-KRAB/RtTR-KRAB对目的基因的表达调控可以将目的基因组中含TRE位点的动物和预先制备好的tTR-KRAB/RtTR-KRAB转基因动物交配获得，也可以通过对含TRE位点动物受精卵或机体注射表达tTR-KRAB/RtTR-KRAB的病毒或者质粒载体实现，这些常规方法都可用于本发明。
在本发明的一具体实例中，通过将TRE位点及EGFP基因定点插入到Nmyc基因第一个内元中建立了一个Nmyc基因的响应小鼠(命名为Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠)，在该小鼠中EGFP的表达受Nmyc内源启动子的驱动，因此可通过EGFP表达来反映Nmyc基因启动子的表达活性，将该Nmyc-TRE-EGFP-Knockin响应小鼠与tTR-KRAB转基因小鼠交配，检测表明在其后代胚胎中的EGFP和tTR-KRAB双阳性胚胎中，EGFP的表达受到tTR-KRAB的严格调控：在无强力霉素的情况下，双阳性胚胎中EGFP的表达约为单EGFP阳性小鼠的1/300，即双阳性小鼠中Nmyc启动子的活性为正常水平的1/300，Nmyc启动子受到了tTR-KRAB的显著抑制；而在强力霉素的诱导下，双阳性胚胎中EGFP的表达与EGFP单阳性小鼠的表达，无显著性差别，Nmyc基因启动子处于全开放状态。
在本发明的另一具体实例中，将该Nmyc-TRE-EGFP-Knockin响应小鼠与RtTR-KRAB转基因小鼠交配，检测表明在其后代胚胎中的EGFP和RtTR-KRAB双阳性胚胎中，EGFP的表达受到RtTR-KRAB的严格调控：在有强力霉素的情况下，双阳性胚胎中EGFP的表达约为单EGFP阳性小鼠的1/500，即双阳性小鼠中Nmyc启动子的活性为正常水平的1/500，Nmyc启动子受到了RtTR-KRAB的显著抑制；而在无强力霉素的情况下，双阳性胚胎中EGFP的表达与EGFP单阳性小鼠的表达，无显著性差别，Nmyc基因启动子处于全开放状态。
细胞
此外，本发明还提供了一种来源于所述模式动物的细胞，所述的细胞的基因组中既包括四环素响应元件、又包括转录抑制因子或转录激活因子的编码基因。较佳地，所述的细胞为非胚胎干细胞或生殖细胞。优选地，所述的细胞为体细胞。
本发明的主要优点在于：
1)所调控的基因可以为动物内源基因；
2)对目的基因的调控具有可诱导性；
3)对目的基因的开关具有可逆性；
4)该方法建立的动物模型，遗传稳定，表型稳定。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
CAG启动子驱动的tTR-KRAB和RtTR-KRAB转基因质粒构建
pcDNA3-CAG promoter-tTR-KRAB表达质粒构建流程为：
1)pcDNA3.1(-)-Hygromycin(购自Invitrogen公司)质粒BglII和NheI双酶切去除原有的CMV promoter后补平、连接，经XbaI和BamHI双酶切后作为载体以备连入CAG promoter；
2)PLVCT-tTR-KRAB或PLVCT-RtTR-KRAB质粒(购自addgene公司)SpeI和BamHI双酶切得到CAG promoter片段；
3)将1)中的载体片段与2)中的CAG promoter连接得到pcDNA3.1(-)-Hygromycin-CAG promoter载体，将该载体用BamHI和KpnI双切后，与PCR(以PLVCT-tTR-KRAB或PLVCT-RtTR-KRAB质粒为模板)获得的经BamHI和KpnI酶切后的tTR-KRAB或RtTR-KRAB(也称为tTR-KRAB/RtTR-KRAB)片段连接，得到pcDNA3-CAGpromoter-tTR-KRAB/RtTR-KRAB，简称CAG启动子驱动的tTR-KRAB和RtTR-KRAB质粒，结构如图2所示。
实施例2
CAG启动子驱动的tTR-KRAB和RtTR-KRAB转基因小鼠制备
将pcDNA3-CAG promoter-tTR-KRAB/RtTR-KRAB质粒用BciVI和EcoRI酶切后，割胶回收含CAG promoter-tTR-KRAB-polyA和含CAGpromoter-RtTR-KRAB-polyA片段，通过受精卵细胞雄原核DNA显微注射获得转基因Founder鼠(制备Founder鼠参见Gordon K，Ruddle FH.1986.Genetransfer into mouse embryos.Dev Biol(NY1985)4：1-36.Kupriyanov S，Zeh K，Baribault H.1998.Double pronuclei injection of DNA into zygotes increasesyields of transgenic mouse lines.Transgenic Res 7：223-226)。
CAG promoter-tTR-KRAB-polyA片段显微注射共出生101只小鼠，经两次PCR鉴定得到20只转基因阳性小鼠；CAG promoter-RtTR-KRAB-polyA片段显微注射所生后代中，经两次PCR鉴定得到19只转基因阳性小鼠。PCR鉴定结果如图3所示。
实施例3
Nmyc-TRE-EGFP-Knockin打靶载体构建
利用ET-Clone技术通过两步同源臂套取，获得目的打靶载体。步骤如下：首先从Nmyc BAC(购自英国Gene Service公司)上通过PCR获得长度为200-400bp间的4个同源小臂a、b、c和d(其分别位于打靶载体5’臂的5’端、3’臂的3’端、5’臂的3’端和3’臂的5’端)。采用的引物如表1。
表1
然后将a和b按正确方向连入pBR322-MK(参见Pentao Liu，Nancy A.Jenkins and Neal G.Copeland.A Highly Efficient Recombineering-BasedMethod for Generating Conditional Knockout Mutations.Genome Res.2003 13：476-484)的SalI和SpeI；SpeI和BamHI位点之间，a与b连接处SpeI线性化后，两者从Nmyc BAC上套取14.78kb DNA片段，获得载体PBR322-a-b，此为第一步套取；同时将c、d小臂以及TRE、LoxP、Nmyc Intron、EGFP、polyA元件按正确顺序连入PL451载体。详细过程如下：c臂PCR产物经KpnI和XhoI酶切后连入PL451载体(参见Pentao Liu，Nancy A.Jenkins and Neal G.Copeland.A Highly Efficient Recombineering-Based Method for GeneratingConditional Knockout Mutations.Genome Res.2003 13：476-484)，得到PL451-c；d臂PCR产物经BamHI和NotI酶切后连入载体PL451-c；TRE序列PCR扩增自载体PLVCT-tTR-KRAB，PCR产物经XhoI和SalI酶切后连入载体PL451-c-d；LoxP序列为直接DNA合成，PL451-c-TRE-d经SalI和ClaI酶切后连入LoxP；Nmyc Intron序列PCR扩增自Nmyc BAC，经ClaI和HindIII酶切后连入PL451-c-TRE-LoxP-d；EGFP-polyA片段PCR扩增自载体pIRES2-EGFP(购自clontech)，PCR产物经HindIII和EcoRI酶切后连入PL451-c-TRE-LoxP-Intron-d。所采用的引物及合成的序列如表2。
表2
将载体PL451-c-TRE-LoxP-Intron-EGFP-polyA-d中的c-TRE-LoxP-Intron-EGFP-polyA-FRT-PGK-NEO-BGHpA-FRT-LoxP-d片段(其中FRT-PGK-NEO-BGHpA-FRT-LoxP来自载体PL451)，经NotI和KpnI酶切后通过重组靶向插入到载体PR322-a-b的c和d臂中，完成第二次套取。所得载体5’臂长为10.4kb，3’臂长为4.39kb，因5’臂过长，不利于鉴定，将构建好的载体KpnI酶切，去除5’端7.7kb。最终获得的Nmyc-TRE-EGFP-Knockin打靶载体，5’臂长度为2.73kb，3’臂长度为：4.39kb。最终Nmyc-TRE-EGFP-Knockin打靶载体结构如图4所示。
实施例4
Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠获得
Nmyc-TRE-EGFP-Knockin打靶载体经NotI酶切线性化后，ES细胞(购自Chemicon公司)打靶，经G418和GANC双筛后，挑取了96个克隆，抽基因组鉴定。鉴定采用PCR方法，分两步进行：5’臂鉴定引物一端在臂外侧的基因组上，一端位于Nmyc第一个内元上，采用该对引物PCR，阳性杂合子克隆应该拉出3528bp和3144bp两条带，阴性克隆应该只拉出3144bp一条带；将左臂鉴定阳性的克隆，进行右臂鉴定，引物一端在右臂外侧的基因组上，另一端在Neo基因上，如为阳性克隆，应该拉出6383bp条带，阴性克隆应拉不出条带。经鉴定，从96个克隆中获得了11个阳性克隆，阳性率为11.5％。鉴定结果如图7所示，5’同源臂鉴定引物拉出两条目的条带(图5A)，3’同源臂也拉出目的大小条带(图5B)，所拉出的PCR产物经两端测序证明正确后，阳性ES细胞复苏，送囊胚注射。
阳性ES细胞注射入囊胚后，囊胚移入假孕母鼠(品种为B6/CBA(购自上海斯莱克实验动物中心)杂交一代)，从后代中选择毛色嵌合度高于50％的雄性小鼠与C57/BL6J小鼠(购自上海斯莱克实验动物中心)交配，其子代中的灰色小鼠即来源于生殖系统嵌合的阳性ES细胞。Nmyc-TRE-EGFP-Knockin阳性ES细胞共注射165个囊胚，移植了11个受体，共有2个受体怀孕，产下11只小鼠，将嵌合率超过50％的雄性小鼠与C57BL/6J小鼠交配，从后代中获得了Nmyc-TRE-EGFP-Knockin杂合子小鼠。
实施例5
tTR-KRAB对Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠Nmyc启动子调控效果检测
将实施例4中获得的Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠与实施例2中获得的tTR-KRAB转基因小鼠交配，雌鼠见栓后，一组正常饲养，一组在饮水中加入2mg/ml的强力霉素，10.5天后(见栓时记为0.5d)取胚胎，胚胎在荧光显微镜下检测胚胎荧光表达，胚胎羊膜抽提基因组用于PCR鉴定基因型，部分胚胎抽提蛋白，部分胚胎抽提RNA，反转录后用于Realtime检测目的基因EGFP表达量。
Realtime检测结果表明在其后代胚胎中的Nmyc-TRE-EGFP-Knockin和tTR-KRAB双阳性胚胎中，EGFP的表达受到tTR-KRAB的严格调控：在无强力霉素的情况下，双阳性胚胎中EGFP的表达约为单EGFP阳性小鼠的1/300，即双阳性小鼠中Nmyc启动子的活性为正常水平的1/300(如图6A所示)，Nmyc启动子受到了tTR-KRAB的显著抑制；而在2mg/ml强力霉素的诱导下，双阳性胚胎中EGFP的表达与EGFP单阳性小鼠的表达，无显著性差别，说明在诱导条件下，Nmyc基因启动子处于全开放状态(如图7A所示)。
EGFP荧光显微镜检测表明：在无强力霉素的情况下，双阳性胚胎中检测不到EGFP荧光，而Nmyc-TRE-EGFP-Knockin单阳性小鼠则可以检测到明显的EGFP荧光(如图6C所示)，说明Nmyc启动子受到了tTR-KRAB的显著抑制；在2mg/ml强力霉素的诱导下，荧光显微镜检测表明在双阳性胚胎和Nmyc-TRE-EGFP-Knockin单阳性小鼠中均可检测到明显的EGFP荧光表达(如图7C所示)，两者无显著性差别，说明在添加强力霉素的情况下，Nmyc基因启动子处于全开放状态。
Western印迹分析表明：在无强力霉素的情况下，双阳性胚胎中针对EGFP的抗体检测不到EGFP蛋白的表达，而Nmyc-TRE-EGFP-Knockin单阳性小鼠则可以检测到EGFP蛋白，说明Nmyc启动子受到了tTR-KRAB的显著抑制(如图6B所示)；在2mg/ml强力霉素的诱导下，在双阳性胚胎和Nmyc-TRE-EGFP-Knockin单阳性小鼠中EGFP的抗体均可检测到明显的EGFP条带(如图7B所示)，两者无显著性差别，说明在添加强力霉素的情况下，Nmyc基因启动子处于全开放状态。
实施例6
RtTR-KRAB对Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠Nmyc启动子调控效果检测
将实施例4中获得的Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠与实施例2中获得的RtTR-KRAB转基因小鼠交配，雌鼠见栓后，一组正常饲养，一组在饮水中加入4mg/ml的强力霉素，10.5天后(见栓时记为0.5d)取胚胎，胚胎在荧光显微镜下检测胚胎荧光表达，胚胎羊膜抽提基因组用于PCR鉴定基因型，胚胎抽提RNA，反转录后用于Realtime检测目的基因EGFP表达量。
Realtime检测结果表明在其后代胚胎中的Nmyc-TRE-EGFP-Knockin和RtTR-KRAB双阳性胚胎中，EGFP的表达受到RtTR-KRAB的严格调控：在有强力霉素的情况下，双阳性胚胎中EGFP的表达约为单EGFP阳性小鼠的1/500，即双阳性小鼠中Nmyc启动子的活性为正常水平的1/500(如图8B所示)，Nmyc启动子受到了RtTR-KRAB的显著抑制；而在无强力霉素的情况下，双阳性胚胎中EGFP的表达与EGFP单阳性小鼠的表达，无显著性差别(如图8A所示)，Nmyc基因启动子处于全开放状态。
EGFP荧光显微镜检测表明：在无强力霉素的情况下，荧光显微镜检测表明在双阳性胚胎和Nmyc-TRE-EGFP-Knockin单阳性小鼠中均可检测到明显的EGFP荧光表达(如图8C所示)，两者无显著性差别，说明在没有强力霉素的情况下，Nmyc基因启动子处于全开放状态。
实施例7
Nmyc-TRE-Knockin小鼠的获得
将实施例4中获得的Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠与EIIa-Cre转基因小鼠(购自国家遗传工程小鼠资源库)交配，利用EIIa-Cre小鼠表达的Cre酶将Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠中两个LoxP位点间的序列剪切掉，剪切后大的Nmyc基因结构较剪切前的基因结构，第一个内元中仅插入了一个TRE位点和一个LoxP位点，剪切前后的小鼠Nmyc基因结构如图9所示。经PCR鉴定，在Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠与EIIa-Cre转基因小鼠子代中获得了LoxP位点间序列切除的小鼠，本发明人称之为：Nmyc-TRE-Knockin小鼠，为TRE位点插入的杂合子小鼠，缩写为NmycTRE(+/-)。
实施例8
tTR-KRAB对小鼠Nmyc内源基因调控效果检测
将Nmyc-TRE-Knockin杂合子小鼠自交配获得Nmyc-TRE-Knockin纯合子小鼠，缩写为NmycTRE(+/+)。同时将Nmyc-TRE-Knockin杂合子小鼠与实施例2中获得的tTR-KRAB转基因小鼠交配，获得Nmyc-TRE-Knockin杂合同时tTR-KRAB阳性的小鼠，缩写为：NmycTRE(+/-)/tTR。将NmycTRE(+/-)小鼠与NmycTRE(+/+)小鼠交配，以获得Nmyc-TRE-Knockin纯合子同时tTR-KRAB阳性的小鼠，缩写为：NmycTRE(+/+)/tTR小鼠。雌鼠见栓后，一组雌鼠正常饲养，一组雌鼠在饮水中加入2mg/ml的强力霉素，10.5天后(见栓时记为0.5d)取胚胎，胚胎羊膜抽提基因组用于PCR鉴定基因型，胚胎用于抽提RNA，RNA反转录后用于Realtime检测内源基因Nmyc表达量。
Realtime检测结果表明NmycTRE(+/+)/tTR基因型胚胎较NmycTRE(+/+)基因型胚胎中的Nmyc基因，其表达受到tTR-KRAB的严格调控：在无强力霉素的情况下，NmycTRE(+/+)/tTR胚胎中Nmyc的表达约为NmycTRE(+/+)的1/1000，如图10所示，Nmyc的表达受到了tTR-KRAB的显著抑制。而在2mg/ml强力霉素的诱导下，NmycTRE(+/+)/tTR胚胎中Nmyc的表达与NmycTRE(+/+)胚胎的表达，无显著性差别，说明在诱导条件下，Nmyc基因启动子处于全开放状态，如图10所示。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种制备模式动物的方法，所述模式动物中目的内源基因是可诱导调控表达的，所述方法包括：
(1)建立转基因动物1：该动物1基因组中，目的内源基因的转录起始位点附近插入了四环素响应元件；
(2)建立转基因动物2：该动物2基因组中，包括转录抑制因子或转录激活因子的编码基因，所述的转录抑制因子或转录激活因子与四环素响应元件结合，且所述结合受四环素或强力霉素调控；
(3)将转基因动物1和转基因动物2进行交配，选出基因组中既包括四环素响应元件、又包括转录抑制因子或转录激活因子的编码基因的动物，作为模式动物；
其中，所述的转录抑制因子选自：tTR-KRAB或RtTR-KRAB；所述的转录激活因子选自：tTA或rtTA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的四环素响应元件插入在所述的目的内源基因的转录起始位点上游或下游4000bp范围内。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述的转录抑制因子tTR-KRAB具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
所述的转录抑制因子RtTR-KRAB具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
所述的转录激活因子tTA具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
所述的转录激活因子rtTA具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)、(2)或(3)中，还分别包括，对获得的动物进行交配建系，获得子代动物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的四环素响应元件的序列如SEQ ID NO:1所示。
6.一种诱导调控模式动物中目的内源基因表达的方法，所述方法包括：
(a)提供模式动物，所述模式动物通过权利要求1所述的方法获得；
(b)给予(a)的模式动物四环素或强力霉素，从而调控模式动物中目的内源基因的表达。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，
(a)所述的模式动物中，包括转录抑制因子RtTR-KRAB的编码基因；(b)中，给予(a)的模式动物四环素或强力霉素，模式动物中目的内源基因的表达受到抑制；不给予(a)的模式动物四环素或强力霉素，目的内源基因正常表达；或者
(a)所述的模式动物中，包括转录抑制因子tTR-KRAB的编码基因；(b)中，不给予(a)的模式动物四环素或强力霉素，模式动物中目的内源基因的表达受到抑制；给予(a)的模式动物四环素或强力霉素，目的内源基因的表达抑制被解除；或者
(a)所述的模式动物中，包括转录激活因子tTA的编码基因；(b)中，给予(a)的模式动物四环素或强力霉素，模式动物中目的内源基因的正常表达；不给予(a)的模式动物四环素或强力霉素，目的内源基因超表达；或者
(a)所述的模式动物中，包括转录激活因子rtTA的编码基因；(b)中，给予(a)的模式动物四环素或强力霉素，激活模式动物中目的内源基因的超表达；不给予(a)的模式动物四环素或强力霉素，目的内源基因正常表达。
8.一种模式动物在基因功能研究中的用途，所述的模式动物通过权利要求1所述的方法获得。
9.一种体细胞，其来源于一种模式动物，所述的模式动物通过权利要求1所述的方法获得。
10.权利要求9所述的体细胞在基因功能研究中的用途。
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