JPH10510718A - 血管内皮増殖因子−ｂ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 血管内皮細胞の有糸分裂と増殖を促進する性質を有するＰＤＧＦファミリーの成長因子からのＶＥＧＦ−Ｂポリペプチドと、これらポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、それらを含有する医薬組成物と、それらと反応する抗体。前記ＶＥＧＦ−Ｂポリペプチドは、血管新生を刺激することと、更に、診断における使用とに於いて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 血管内皮増殖因子−Ｂ発明の背景 血管新生、すなわち、既存の血管からの新しい毛細血管の増殖は、組織の正常 な成長と発達に必要な基本的プロセスである。それは、血管の樹枝状分岐（ｖａ ｓｃｕｌａｒ ｔｒｅｅ）の発達と分化、および、胚形成、身体の成長、組織お よび器官の修復と再生、黄体と子宮内膜の周期的成長、および、神経システムの 発達と分化を含む多様な基本的生理学的プロセスにとっての必須条件である。女 性の生殖システムに於いて、血管新生は、濾胞においてはその発達中に起こり、 黄体においては排卵の後に起こり、胎盤においては妊娠状態を確立し維持するた めに起こる。血管新生は、更に、たとえば、傷や骨折の治癒等の体の修復プロセ スの一部としても起こる。又、血管新生は、腫瘍成長の因子でもある。というの は、腫瘍は成長するためには、連続的に新しい毛細血管の成長を刺激しなければ ならないからである。 毛細血管は、内皮細胞と、周細胞（ルジェー細胞）とから成る。これら二つの 細胞タイプは、管、分岐、および全毛細血管ネットワークを形成するためのすべ ての遺伝情報を有している。特定の血管新生分子がこのプロセスを開始させるこ とができる。血管新生の生理学的重要性に鑑みて、血管新生を刺激することがで きる因子の単離、キャラクタリゼーション、及び精製に多大な努力がささげられ てきた。血管新生を刺激する多数のポリペプチドが精製され、その分子的、生化 学的、および生物学的特性についてのキャラクタライズが行われてきた。このよ うな血管新生の調節因子の概観のために、クラーグスブルン（Ｋｌａｇｓｂｒｕ ｎ）他，”Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ“，Ａｎｎ ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１７−３９（１９９１）とフォークマン （Ｆｏｌｋｍａｎ）他，”Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，“Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．，２６７：１０９３１−９３４（１９９２）とを参照。最近の結果は、血管 システムの確立と維持に於いて、いくつかの内皮 のレセプタ−チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を関連付けている。 血管内皮細胞に対する分裂促進因子として特異性の高い一つのそのような増殖 因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と命名されている。フェッラーラ（Ｆｅ ｒｒａｒａ）他，“Ｔｈｅ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒ ｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，” Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２１１−２１８（１９９１） ；コノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ），“Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉ ｔｙ Ｆａｃｔｏｒ： Ａ Ｕｎｉｑｕｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｂｌｏ ｏｄ Ｖｅｓｓｅｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．，４７：２１９−２２３（１９９１）を参照。ＶＥＧＦは、ウシ下垂体濾 胞細胞を含む多数の細胞ラインによって調整された培地中に検出された強力に血 管に作用するたん白質である。ＶＥＧＦは、二つの２４ｋＤサブユニットから成 る、グリコシル化された陽イオン性の４６−４８ｋＤダイマーである。それは、 スルフヒドリル還元剤によって不活性化され、酸性ｐＨと加熱とに対する抵抗性 を有し、固定化されたヘパリンに結合する。ＶＥＧＦは皮内注射後に血管からの 液体の漏洩を増加させるため、時として、血管透過性亢進因子（ＶＰＦ）と称さ れる。それは、又、ｖａｓｃｕｌｏｔｒｏｐｉｎという名でも呼ばれる。 これまで４つの異なった分子種のＶＥＧＦが検出されている。１６５アミノ酸 種は、約４６ｋＤの分子量を有し、正常な細胞と組織に見られる主要な分子形態 である。より数が少なく、位置１１６と１５９との間で４４個のアミノ酸が欠失 した短い形態（ＶＥＧＦ₁₂₁）と、位置１１６に２４個の高塩基性残基の挿入を 有する長い形態（ＶＥＧＦ₁₈₉）と、ＶＥＧＦ₁₈₉に見られる前記２４アミノ酸挿 入を含む、４１個のアミノ酸の挿入を有するもう一つのより長い形態（ＶＥＧＦ₂₀₆ ）も、知られている。ＶＥＧＦ₁₂₁とＶＥＧＦ₁₆₅とは、可溶性のたん白質で ある。ＶＥＧＦ₁₈₉とＶＥＧＦ₂₀₆とは、大半が、細胞結合型である。ＶＥＧＦの 全てのアイソフォームは、生物学的に活性である。例えば、皮内に投与 された時、これらの種はそれぞれ、エバンスブルーの血管外遊出を誘発させるこ とができる。 前記種々のＶＥＧＦ種は、同じ遺伝子によってコードされ、メッセンジャーＲ ＮＡの選択的スプライシングから生じる。この結論は、ヒトゲノムＤＮＡのサザ ンブロット分析によって支持されており、これは、ＶＥＧＦ₁₆₅のためのプロー ブを使用しても、あるいは、ＶＥＧＦ₂₀₆における挿入を有するプローブを使用 しても、いずれの場合にも、制限パターンが同じであることを示している。推定 ｍＲＮＡスプライシングの領域に於けるゲノム・クローンの分析も、選択的スプ ライシングと矛盾なく一致するイントロン／エキソン構造を示している。 ＶＥＧＦの様々なアイソフォームは、細胞放出、区画化、バイオアベイラビリ ティを調節し、更に、恐らくは、それら増殖因子のシグナリング特性を調整する であろう異なった化学特性を有している。 ＶＥＧＦ遺伝子のヌクレオチド配列の分析は、ＶＥＧＦが血小板由来増殖因子 （ＰＤＧＦ）ファミリーのメンバーであることを示している。ＶＥＧＦとＰ１Ｇ Ｆとは、二つの内皮のＲＴＫ、ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦレセプター１，ＶＥＧＦＲ １）とｆｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦレセプター２，ＶＥＧＦＲ２）とに対する リガンドである。ＶＥＧＦのアミノ酸配列は、ＰＤＧＦのＡおよびＢ鎖の配列に 対する約２０％の相同性と、更に、両方の成熟ＰＤＧＦ鎖に見られる８つのシス テイン残基の完全な保存とを示している。ＶＥＧＦ₁₆₅、ＶＥＧＦ₁₈₉およびＶＥ ＧＦ₂₀₆は、又、カルボキシ末端領域内に於いて８つのさらなるシステイン残基 をも有している。ＶＥＧＦのアミノ−末端配列の前には、典型的なシグナル配列 に対応する２６個のアミノ酸がある。成熟たん白質は、介在するプロシーケンス なしに、シグナル配列の切断の後、直接的に生成される。Ａｓｎ⁷⁴に於ける潜在 的グリコシル化部位の存在は、ＶＥＧＦが糖たん白質であるという他の証拠と一 致しているが、前記ポリペプチドは、グリコシル化種と非グリコシル化種との両 方の形態で存在することが報告されている。 他のサイトカインと同様に、ＶＥＧＦは、それが見られる特定の生物学 的環境(biological context)に依り、様々な作用を有することができる。ＶＥＧ Ｆとその高親和性レセプターであるｆｌｔ−１とＫＤＲ／ｆｌｋ−１とが、血管 システムの形成と維持、更に、生理的および病的血管新生とに必要である。ＶＥ ＧＦは、強力な内皮細胞分裂促進因子であり、正常な胚の発達、傷の治癒、およ び組織の再生と再編成中に於いて内皮細胞増殖を促進することに依って、イン・ ヴィヴォでの血管新生の誘発に直接寄与する。ＶＥＧＦは、又、固形腫瘍の成長 と転移、虚血−誘発網膜症等の病的プロセスにも関係している。ＶＥＧＦの最も 顕著な特徴はその特異性である。それは、毛細血管およびヒト臍帯血管内皮細胞 に対して、１ｎｇ／ｍｌでイン・ヴィトロで分裂促進性であるが、副腎皮質細胞 、角膜又は水晶体上皮細胞、血管平滑筋細胞、角膜内皮細胞、顆粒膜細胞、ケラ チン生成細胞、ＢＨＫ−２１繊維芽細胞、３Ｔ３細胞、ラット胚繊維芽細胞、ヒ ト胎盤繊維芽細胞、およびヒト肉腫細胞に対してはそうではない。従って、ＶＥ ＧＦの標的細胞特異性は、血管内皮細胞に限定される。ＶＥＧＦは、血管新生に つながる全ての一連の事象を引き起こすことができ、イン・ヴィヴォで角膜に於 ける、又、治癒骨移植片モデルに於ける血管新生を刺激する。それは、小さな血 管と大きな血管の両方から単離された内皮細胞の増殖を刺激することができる。 ＶＥＧＦｍＲＮＡの発現は、卵巣の黄体、又は発達中の脳に於ける毛細血管の生 理的増殖に時間的又空間的に、関連している。ＶＥＧＦ発現は、低酸素症によっ て引き起こされるので、内皮細胞増殖と血管新生とは、特に虚血部位に於いて刺 激されるようである。ＶＥＧＦは、又、単球に対する強力な誘引物質でもある。 更に、ＶＥＧＦは、内皮細胞に於いて、プラスミノーゲンアクチベーターと、プ ラスミノーゲンアクチベータインヒビターを誘導する。 ＶＥＧＦ等の腫瘍細胞放出血管新生分子とＶＥＧＦに対するモノクローナル抗 体とは、横紋筋肉腫等のある種の腫瘍の成長を阻害することが示されている。キ ム（Ｋｉｍ）他，“Ｉｎｈｉｂｉｔｏｎ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔ ｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｎｇｉｏｇｅ ｎｅｓｉｓ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ，”Ｎａｔ ｕｒｅ，３６２：８４１−８４４（１９９３）参照。これは、ＶＥＧＦの作用を 阻止することが、腫瘍一般の治療、特に、高度に血管が発達した、勢いのある腫 瘍の治療に於いて、潜在的な治療上の重要性を有するものであることを示唆して いる。発明の要旨 本発明の課題は、内皮細胞の増殖を促進する特性を有する新規な増殖因子を提 供することにある。 本発明の別の課題は、内皮細胞の増殖を促進する新規な増殖因子をコードする 単離ＤＮＡ配列を提供することにある。 本発明の更に別の課題は、診断および／又は治療用途に於いて有用な新規な製 品を提供することにある。 これらおよびその他の課題は、本発明に依って、下記の特徴的なアミノ酸配列 （配列認識番号１６） Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ− Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ を示し、内皮細胞又は中胚葉細胞の増殖を促進する特性を有するたん白質をコー ドする単離ＤＮＡを提供することによって達成され、そのＤＮＡは、図１および ２のＤＮＡ（配列認識番号１）と、図３のＤＮＡ（配列認識番号４）と、図５の ＤＮＡ（配列認識番号６）と、図７のＤＮＡ（配列認識番号８）と、図１０のＤ ＮＡ（配列認識番号１０）と、図１２のＤＮＡ（配列認識番号１２）と、図１４ のＤＮＡ（配列認識番号１４）と、それらＤＮＡ配列の少なくとも一つとストリ ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとから成るグループから選択さ れる。 本発明の別の態様に依れば、前記諸課題は、又、下記の特徴的なアミノ酸配列 （配列認識番号１６） Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ− Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ を示し、内皮細胞又は中胚葉細胞の増殖を促進する特性を有するたん白質を提供 することによって達成され、たん白質は、図１のアミノ酸配列（配列認識番号２ ）と、図２のアミノ酸配列（配列認識番号３）と、図４のアミノ酸配列（配列認 識番号５）と、図６のアミノ酸配列（配列認識番号７）と、図８のアミノ酸配列 （配列認識番号９）と、図１１のアミノ酸配列（配列認識番号１１）と、図１３ のアミノ酸配列（配列認識番号１３）と、図１５のアミノ酸配列（配列認識番号 １５）とから成るグループから選択されるアミノ酸配列に実質的に対応するアミ ノ酸配列を含む。 本発明の更に別の態様に於いて、前記諸課題は、そのようなたん白質を含有す る医薬調合物を提供すること、および、そのようなたん白質と反応する、もしく は、そのようなたん白質を認識する抗体を提供することによって達成される。 以後、血管内皮増殖因子Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｂと称する本発明の新規な増殖因子 は、ＶＥＧＦと、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）とに対して高い構造的類似性を有す る。前記ＶＥＧＦ−Ｂの全ての形態は、前記特徴的アミノ酸配列（配列認識番号 １６） Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ− Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ を有し（ここで、Ｘａａは、可変残基を示す）、これは、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦフ ァミリの増殖因子の特徴である。この特徴的なアミノ酸配列は、図４，６，８， １１，１３および１５に於いて、アミノ酸７０から８２に見られる。 本発明の臨床上の使用は、診断用としての使用、傷の治癒に於ける血管新生の 促進、そして血管新生の阻害を含む。癌の生体組織検査標本に於けるＶＥＧＦ− Ｂの定量化は、将来の転移のリスクのインジケーターとして有用であろう。慢性 的創傷に対するＶＥＧＦ−Ｂ調合物の局所的適用によって、血管新生と創傷の治 癒を促進することができる。ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦと類似の方法で使用する ことができる。 本発明の更に別の態様に依れば、前記諸課題は、典型的にはテスト・キ ットの形態をとる診断／予知手段を提供することによって達成される。たとえば 、本発明の一具体例に於いて、本発明の新規な増殖因子に対する抗体と、前記抗 体と本発明の新規増殖因子との間の結合を検出、より好ましくは評価するための 手段と、を有する診断／予知テスト・キットが提供される。本発明の前記診断／ 予知手段の一好適具体例に於いて、増殖因子−抗体相互作用が、抗体と増殖因子 との間の結合後に於いて、基質に結合した標識の量を測定することによって確証 されるようにするために、抗体又は新規増殖因子のいずれかが標識化され、そし て、抗体又は増殖因子のいずれかが、基質結合されている。本発明の特に好適な 具体例に於いて、診断／予知手段は、従来式ＥＬＩＳＡキットとして提供するこ とができる。 更に別の具体例に於いて、前記診断／予知手段は、テスト個体のＶＥＧＦ−Ｂ 遺伝子のゲノム配列構造を確定するためにＰＣＲ手段を含むことができ、そして 、そのテスト個体の配列構造をなんらかの異常を検出するために本出願に開示す る配列構造と比較することができる。この際、ＶＥＧＦ−Ｂ発現に於けるなんら かの異常が所定の病状に関連しているかどうかを確立することを予想している。 本発明の更に別の態様は、ＶＥＧＦ−Ｂを認識し、適当に標識化された抗体に 関する。 本発明の更に別の態様は、ＶＥＧＦ−Ｂたん白質又はそれに対する抗体のいず れかを含有する医薬組成物の提供に関する。ＶＥＧＦ−Ｂたん白質を含有する組 成物には、オプションとして、更に、ＶＥＧＦ又はヘパリン、あるいはこれらの 両方を含ませることができる。 本発明の更に別の態様に依れば、血管新生の欠如又は減少によって特徴付けら れる状態を治療するための、ＶＥＧＦ−Ｂたん白質とヘパリンとを含有する薬剤 の製品が提供される。 更に別の態様に於いて、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｂたん白質を含むたん白質ダイ マー、特に、ジスルフィド結合ダイマーに関する。本発明のたん白質ダイマーは 、ＶＥＧＦ−Ｂたん白質のホモダイマーと、ＶＥＧＦ−ＢとＶＥＧＦとのヘテロ ダイマーとの両方を含む。 本発明の更に別の態様に依れば、細胞からのＶＥＧＦおよび／又はＶＥＧＦ− Ｂの放出を容易にするための方法であって、前述した増殖因子の一方又は両方を 発現する細胞をヘパリンに対して露出させる工程を有する方法が提供される。 本発明の更に別の態様は、内皮細胞の増殖を促進する本発明の新規な増殖因子 をコードする、ここに開示されるＤＮＡ配列の少なくとも一部に対して相補的な アンチ・センスヌクレオチド配列を有するベクターの提供に関する。本発明の更 に別の態様に依れば、アンチ・センス配列を有するそのようなベクターは、ＶＥ ＧＦ−Ｂ発現を阻害するか、あるいは少なくともそれを弱めるために使用するこ とができる。ＶＥＧＦ−Ｂ発現を阻害するためのこのタイプのベクターの使用は 、ＶＥＧＦ−Ｂ発現が、腫瘍が、血管新生の準備ためにＶＥＧＦ−Ｂを産生する 場合等の疾患に関連している場合に、好適である。このような腫瘍細胞を、アン チ・センスヌクレオチド配列を有するベクターでトランスフォーメーションする ことによって、血管新生が抑制、又は、遅延され、腫瘍の成長も阻害又は遅延さ れるであろう。図面の簡単な説明 図１は、ＶＥＧＦ−Ｂの（部分的）ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（配 列認識番号１）と、ｃＤＮＡの第１リーディングフレームによってコードされる たん白質セグメントのアミノ酸配列（配列認識番号２）とを示している。 図２は、ＶＥＧＦ−Ｂの（部分的）ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（配 列認識番号１）と、ｃＤＮＡの第２リーディングフレームによってコードされる たん白質セグメントのアミノ酸配列（配列認識番号３）とを反復している。 図３は、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の全長ｃＤＮＡクローンのコード領域のヌク レオチド配列（配列認識番号４）を示している。 図４は、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のアミノ酸配列（配列認識番号５）を 示している。 図５は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₇₄のｃＤＮＡクローンのコード領域のヌクレオチド配 列（配列認識番号６）を示している。 図６は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₇₄のアミノ酸配列（配列認識番号７）を示している。 図７は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₁₂のｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（配列認識 番号８）を示している。 図８は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₁₂のアミノ酸配列（配列認識番号９）を示している。 図９は、ｍＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇，ｍＶＥＧＦ₁₆₄，ｈＰｌＧＦ，ｍＰＤＧＦ Ａお よびｍＰＤＧＦ Ｂのアミノ酸配列の比較を示している。 図１０は、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のクローンのヌクレオチド配列（配列認識番 号１０）を示している。 図１１は、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のアミノ酸配列（配列認識番号１１）を示し ている。 図１２は、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のヌクレオチド配列（配列認識番号１２） を示している。 図１３は、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のアミノ酸配列（配列認識番号１３）を示 している。 図１４は、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のヌクレオチド配列（配列認識番号１４）を 示している。 図１５は、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のアミノ酸配列（配列認識番号１５）を示し ている。 図１６は、マウスおよびヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇およびＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆アイソフ ォームのアミノ酸配列（配列認識番号５，１１，１３＆１５）比較を示している 。 図１７は、ＶＥＧＦ−Ｂのマウスおよびヒトの遺伝子の概略構造を示している 。 図１８は、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆アイソフォーム の親水性分析を示している。 図１９は、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーの増殖因子の系統発生分析を示して いる。 図２０は、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とウシの毛細血管内皮（ＢＣ Ｅ）細胞の、ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦによる、［³Ｈ］チミジン 取り込みの誘導を示すグラフである。 図２１は、いくつかのマウスとヒトの組織に於けるＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆転写産物 の発現のノザンブロット分析である。 図２２は、トランジェントにマウスＶＥＧＦ−Ｂ ｃＤＮＡをトランスフェク ションしたＣｏｓ−１細胞からの細胞培養培地および洗浄剤可溶化細胞溶解物の 免疫沈降法とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示している。 図２３Ａは、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とヒトＶＥＧＦ₁₆₅とを別々に発現するト ランスフェクションＣｏｓ−１細胞からの細胞培養培地の免疫沈降法とＳＤＳ− ＰＡＧＥ分析の結果を示している。 図２３Ｂは、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とヒトＶＥＧＦ₁₆₅とを同時に発現するＣ ｏｓ−１細胞の細胞培養培地（Ｍ）と洗浄剤可溶化細胞溶解物（Ｌ）の免疫沈降 法とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示している。 図２３Ｃは、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とヒトＶＥＧＦとを別々に又は、組み合 わせて発現するＣｏｓ−１細胞及び、模擬(mock)トランスフェクションコントロ ール細胞からの細胞培養培地の免疫沈降法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を 示している。 図２４は、ＶＥＧＦ−Ｂプロモーター−レポータークローンの導出の略図、そ して、 図２５は、１．５５ｋｂヒトＶＥＧＦ−Ｂプロモーターフラグメントのヌクレ オチド配列（配列認識番号１７）を示している。好適実施例の詳細説明 従って、本発明は、ＶＥＧＦの血管新生およびその他の特性を共有するが、組 織においてはＶＥＧＦと異な分布と発現を示す、以後ＶＥＧＦ−Ｂ 増殖因子と称する新規な血管新生内皮増殖因子に関する。 ＶＥＧＦ−Ｂ増殖因子は、血小板由来増殖因子のファミリのメンバーであり、 血管新生内皮細胞および／又は中胚葉細胞の有糸分裂と増殖とを促進する増殖因 子である。それらは、図１および２（配列認識番号１）、図３（配列認識番号４ ）、図５（配列認識番号６）、図７（配列認識番号８）、図１０（配列認識番号 １０）、図１２（配列認識番号１２）、又は図１４（配列認識番号１４）に示す ＤＮＡ配列のいずれか一つに対応、又は、それとストリンジェントな条件下に於 いてハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列の発現によって産生される。本発明の範囲 には、上記ＤＮＡ配列のいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダ イズするＤＮＡ配列によってコードされるすべての血管新生たん白質が含まれる と意図される。適当なハイブリダイゼーション条件には、たとえば、５０％ホル ムアミド、５ｘＳＳＰＥ緩衝液、５ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳそして、 １００μｇ／ｍｌの鮭精子ＤＮＡで４２℃で一晩、その後、５５℃で２ｘＳＳＣ 中で２ｘ３０分間の洗浄、という条件が含まれる。 本発明は、又、上記ＤＮＡ配列のいずれか一つと対応、又は、それとストリン ジェントな条件下でハイブリダイズする単離および／又は精製ＤＮＡにも関する 。 別の態様に於いて、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｂ増殖因子の抗体、特に、モノクロ ーナル抗体に関する。 ＶＥＧＦ−Ｂたん白質は、たん白質チロシンキナーゼ増殖因子レセプターと相 互作用するものであると考えられている。このようなレセプターの詳細は当該技 術に於いて公知である。［たとえば、ウィルクス，エイ，エフ（Ｗｉｌｋｓ，Ａ ．Ｆ．），“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｃ ａｎｃｅｒ，”Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０：４３−７３（１９９３ ）参照］。 様々な成体マウス組織が、ＶＥＧＦ−Ｂに対応する転写産物の発現につ いて、ノザンブロッティングによってテストされた。ｍＲＮＡのサイズは、１． ３−１．４ｋｂであった。マウスの多組織ノザンブロット（ＭＴＮ，Ｃｌｏｎｔ ｅｃｈ）を、上述したｐＰＣ６７酵母発現ベクター由来の≒０．９ｋｂ Ｓａｌ Ｉ／ＮｏｔＩフラグメントでプローブした。前記プローブは、ランダムプライミ ングを使用して、³²Ｐ−ｄＣＴＰによって標識化した（比活性１０⁸−１０⁹ｃｐ ｍ／μｇＤＮＡ）。前記ブロットを、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ緩衝液 、２％ＳＤＳ、１０ｘデンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌの鮭精子ＤＮＡ、そし て１ｘ１０⁶ｃｐｍの前記標識化プローブ／ｍｌを使用して、４２℃で一晩ハイ ブリダイゼーションした。前記ブロットを、０．０５％ＳＤＳを含有する２ｘＳ ＳＣ中で、室温で２ｘ３０分間、その後、０．１％ＳＤＳを含有する０．１ｘＳ ＳＣ中で、５２℃で２ｘ２０分間洗浄した。前記ブロットを、その後、強化スク リーンを使用して３日間、−７０℃で露出した。コダック社製ＸＡＲフィルムを 使用した。前記フィルムの視覚検査よって測定した相対発現レベルを以下の表に リストする。 Ｃｌｏｎｔｅｃｈからのヒトの多組織ノザンブロット（ＭＮＴ）を、マウスの 部分的ｃＤＮＡを用いて、プローブして、様々なヒト組織に於ける相対ＶＥＧＦ −Ｂ発現レベルを測定した。転写産物のサイズは、１．３−１．４ｋｂであった 。条件は、上述したマウスのノザンブロットに使用したものと同じであった。ヒ トのノザンブロットの相対的ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物レベルを、次の表２にリスト する。比較の目的のために、表２は、文献からの様々な哺乳類システムに於ける ＶＥＧＦの相対的発現レベルデータもリストしている。 表１と表２の比較から、ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物のマウスとヒトの組織発現レベ ルは、比較的類似しており、最高の発現レベルが、心臓と骨格筋とに見られるこ とが理解される。脳と腎臓組織においては、かなりの相違が見られる。又、そこ から最も一般的なヒトの腫瘍のいくつかが発生する、前立腺、膵臓および腸等の 、筋細胞と上皮細胞との両方を大きな比率で含有する組織は、比較的高いレベル でＶＥＧＦ−Ｂを発現することも銘記されるべきである。 ヒトの組織に於けるＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｂの相対的発現レベルの比較は、い くつかの顕著な相違を示している。ＶＥＧＦは、ヒトの心臓組織によってはやや 弱く発現されるが、ＶＥＧＦ−Ｂは、同組織によって非常に強く発現される。他 方、ＶＥＧＦはヒトの肺組織によって強く発現されるが、ＶＥＧＦ−Ｂはヒトの 肺組織によって弱く発現されるだけである。同様に、ヒトの肝臓組織は、ＶＥＧ Ｆを中レベルで発現するが、ＶＥＧＦ−Ｂは非常に弱く発現されるだけである。 これらのデータは、その全体的類似にも拘わらず、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｂの作 用が、完全に同一ではないことを証明している。 ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物の発現を、マウスとヒトの組織に於いて、ノザンブロッ ティングによって更に分析し、ＶＥＧＦ転写産物の発現と比較した。マウスとヒ トの多組織ノザン（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、³²Ｐ−標識化マ ウスＶＥＧＦ−Ｂプローブ（クローンｐｃｉｆ２の≒０．９ｋｂ ＳａｌＩ／Ｎ ｏｔＩインサート）でハイブリタイズさせた。ＶＥＧＦ発現は³²Ｐ標識化ＶＥＧ Ｆ₁₆₅ｃＤＮＡをプローブとして用いて分析した。ハイブリダイゼーションを、 ５０％脱イオン化ホルムアミド、５ｘＳＳＣ ｐＨ７．０，１％ＳＤＳ，５ｘデ ンハルト溶液、および１００μｇ／ｍｌの変性鮭精子ＤＮＡ中で、４２℃で行っ た。フィルターを、０．５％ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣ中で、５２℃で２ｘ３０分 間洗浄し、補力スクリーンを使用して、−７０℃で２−５日間、コダック社製Ｘ ＡＲフィルムに露出した。ＣＢＡマウスからの成体マウス組織と、ＣＢＡとＮＭ ＲＩマウスとの交配から得た胚のインサイチュハイブリダイゼーショ ン分析を、過去に於いてコルホーネン（Ｋｏｒｈｏｎｅｎ）他，Ｂｌｏｏｄ，８ ０ ，２５４８−５５（１９９２）によって記載されているものと実質的に同様に 行った。ＲＮＡプローブ（３８３ｂｐアンチセンスプローブと、１６９ｂｐセン スプローブ）を、ｐｃｉｆ２ｃＤＮＡクローンから得た４４０ｂｐ Ｓａｌ Ｉ ／Ｓａｃ Ｉフラグメントを含む線状化プラスミドから作成した。放射性標識化 ＲＮＡを、Ｔ７およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼと、［³⁵Ｓ］ＵＴＰ（Ａｍｅｒ ｓｈａｍ Ｉｎｃ．）を使用して合成した。プローブのアルカリ加水分解は省略 した。ヘマトキシリンを対比染色に使用した。センスストランドと、ＲＮＡｓｅ Ａ−処理済みセクションによるコントロールハイブリダイゼーションでは、バッ クグランド以上のシグナルは検出されなかった。 マウス組織に於いては、１．４ｋｂ ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物の最も多量の発現 が、心臓、脳、骨格筋および腎臓において検出された。主要な３．７ｋｂのＶＥ ＧＦ転写産物が、心臓、脳、肺、骨格筋、および腎臓において発現された。ヒト の組織に於いては、１．４ｋｂ ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物と、主要な３．７と４． ５ｋｂのＶＥＧＦ転写産物との最も多量の発現が、心臓、骨格筋、膵臓、および 前立腺において検出された。従って、明白な量的相違が存在するものの、ＶＥＧ Ｆ−ＢとＶＥＧＦとは、多くのヒトとマウスの組織において同時発現されるよう である。 ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物の発現を、更に、成体マウス心臓および骨格筋からのセ クションと、初期（Ｅ１０）マウス胚からのセクションに於けるインサイチュハ イブリダイゼーションによって調べた。成体心臓に於いて、ＶＥＧＦ−Ｂ転写産 物は、心筋ににおいて顕著に発現されるのに対して、動脈平滑筋においてはなん ら特異的なシグナルは検出されない。成体横紋筋では、ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物は 、いくつかの筋原繊維によって発現されるが、それ以外で前記転写産物が欠如し ているようである。Ｅ１０マウス胚では、ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物は、主として成 長中の心臓に於いて検出される。成体マウス心臓の心筋は、顕著なシグナルを有 する。横紋筋に於いては、ＶＥＧＦ−Ｂ発現は、筋原繊維の部分集団において見 られる。 Ｅ１０マウス胚の成長中の心臓に於いても、強いシグナルが得られた。他の胚組 織は、より低いレベル、もしくは検出不能なレベルのＶＥＧＦ−Ｂ転写産物を発 現した。総括すると、これらのテストは、ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物が主として筋肉 組織に於いて発現されることを示している。ＶＥＧＦ−Ｂは、特に、心臓と骨格 筋とに於いて豊富であり、これらの組織とその他の組織とに於いてＶＥＧＦと同 時発現する。トランスフェクション細胞に於いては、ＶＥＧＦ−Ｂは、細胞表面 に結合したジスルフィド結合ホモダイマーを形成し、ＶＥＧＦと同時発現される 時には、ＶＥＧＦとヘテロダイマーを形成する。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆アイソフォー ム特異的プローブを使用したいくつかのマウスとヒトの組織に於けるＶＥＧＦ− Ｂ₁₈₆転写産物の発現のノザンブロット分析を図２１に示す。 ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子の染色体位置を、サザンブロッティングと、体細胞雑種の ポリメラーゼ連鎖反応による分析と、中期染色体の蛍光インサイチュハイブリダ イゼーション（ＦＩＳＨ）とによって評価した。前記ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子は、染 色体１１ｑ１３上の、サイクリンＤ１遺伝子の近傍に見つかった。興味深いこと に、サイクリンＤ１遺伝子は、多数のヒトの癌腫において増幅されるが、ＶＥＧ Ｆ−Ｂ遺伝子は、増幅されたサイクリンＤ１を含有するいくつかの乳がん細胞ラ インに於いては増幅されなかった。しかしながら、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子に於ける 突然変異は、血管の奇形および／又は心血管疾病に関連しているかもしれない。 特に銘記のない限り、下記の例では、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，（ｅ ｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９ ２）に記載されている標準的分子生物学技術および手順を使用した。例１： 二つのリーディングフレームを有する部分的ｃＤＮＡクローン マウスＶＥＧＦ−Ｂをコードする部分的ｃＤＮＡクローンを次のようにして同 定した。１４．５日齢のマウス胚から単離されたポリＡ＋ｍＲＮＡ から得られたｃＤＮＡライブラリー（Ｅ１４．５）［シェヴレイ，ピー(Ｃｈｅ ｖｒａｙ Ｐ．)およびネイサンズ，ディ（Ｎａｔｈａｎｓ Ｄ．），“Ｐｒｏ ｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｙｅａｓｔ： Ｉ ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ ｏ ｆＪｕｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５７８９ −９３（１９９２）］から、ジュリス，ジェィ（Ｇｙｕｒｉｓ Ｊ．），ゴレミ ス，イー（Ｇｏｌｅｍｉｓ Ｅ．），チェルトコフ，エイチ（Ｃｈｅｒｔｋｏｖ Ｈ．）およびブレント，アール（Ｂｒｅｎｔ Ｒ．），“Ｃｄｉ１，ａ Ｈｕ ｍａｎ Ｇｌ ａｎｄ Ｓ Ｐｈａｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔａ ｓｅ Ｔｈａｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｃｄｋ２，“Ｃｅｌｌ，７ ５：７９１−８０３（１９９３）に記載されている酵母ツーハリブリッド相互作 用トラップ・スクリーニング技術を使用して、細胞質レチノイン酸−結合たん白 質タイプ１（ＣＲＡＢＰ−Ｉ）と相互作用する可能性のある細胞質たん白質をス クリーニングした。このスクリーニング技術は、結合ドメインを有し、転写的に 不活性であることが知られている融合たん白質（“ｂａｉｔ”）と、基礎転写を 示さず、かつ、前記ｂａｉｔによって結合されるレポーター遺伝子と、キメラと して発現されるたん白質をコードし、そのアミノ末端が、活性化ドメインと、他 の有用な部分を有する発現ライブラリー（ｔｈｅ“ｐｒｅｙ”）、とを含む。ス クリーニングされたライブラリーは、Ｄｒ．Ｐｉｅｒｒｅ Ｃｈｅｖｒａｙ ｏ ｆ ｔｈｅ Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｃｈｏｏ ｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７２５ Ｎｏｒｔｈ Ｗｏｌｆｅ Ｓｔ．，Ｂａ ｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ ２１２０５から入手した酵母発現ベクターｐＰＣ６７中 の１４．５日歯令マウス胚プラスミドライブラリーであった。一つの陽性のｃＤ ＮＡクローン（ｐｃｉｆ−２）がスクリーニングから回収された。その陽性クロ ーンを、周知の、従来技術を使用してシークエン シングしたところ、ＶＥＧＦと、ＰＤＧＦファミリーの増殖因子の他のメンバー とに対して相同性の高いたん白質をコードすることが分かった。前記プラスミド ｐＰＣ６７中の≒０．９ｋｂＳａｌＩ／ＮｏｔＩインサートを、ｐＢｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔにクローニングし、Ｔ７，Ｔ３ベクタープライマーを内部プライマーと 共に使用して、完全にシークエンシングした。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ ａから市販されている。前記ｃＤＮＡインサートは、８８６塩基対長で、異なる リーディングフレームにおいて、２つのポリペプチドをコードし、それらはそれ ぞれＶＥＧＦのＮ−末端とＣ−末端とに相向性があることがわかった。この新規 な増殖因子を、以後、ＶＥＧＦ−Ｂと称する。前記クローンは、部分的であり、 アミノ末端領域と、全シグナル配列とにおいていくつかのアミノ酸が欠如してい る。 図１は、このＶＥＧＦ−Ｂの部分的ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（配 列認識番号１）と、その第１リーディングフレームにおいてコードされるアミノ 酸配列（配列認識番号２）とを示している。図１のＤＮＡ配列は、前記酵母発現 ベクターｐＰＣ６７中のクローン（ｐｃｉｆ−２）を従来式にシークエンシング することによって得た。そのクローンは、８８６の塩基対を有し、マウスＶＥＧ Ｆ−Ｂの一部をコードしてした。 前記単離ｃＤＮＡ配列は、ＶＥＧＦ−Ｂを含有する、たとえばマウス又はヒト の、哺乳類ゲノムＤＮＡ、とハイブリダイズするであろう。コード配列の他に、 ゲノムＤＮＡは、単数又は複数の特定の組織に於いてＶＥＧＦ−Ｂの発現を引き 起こし、誘導する単数又は複数のプロモーター配列を有するであろう。従って、 ＶＥＧＦ−Ｂのコード配列は、ある種の筋繊維に対して特異的な筋肉−特異的プ ロモーターエレメントにつながっているかもしれない。 前記ヌクレオチド配列は、二つの異なるリーディングフレームに於いて、二つ の異なるアミノ酸配列に翻訳される。コード配列内の塩基対３０９−３１１にお いて一つの停止コドン（ＴＧＡ）が存在する。従って、 ＶＥＧＦ−Ｂには、複数のスプライシング・バリアントがある。クローニングさ れたｃＤＮＡ配列の５‘末端は、ＶＥＧＦ，ＰｌＧＦおよびＰＤＧＦ Ａおよび ＢのＮ−末端ドメインに対してかなりの相同性を有する１０２アミノ酸長のたん 白質をコードする。特に、多数のシステイン残基が、このグループのたん白質中 おいてに完全に保存されている。前記ヌクレオチド配列（配列認識番号１）の他 に、図１は、更に、この第１たん白質の推定アミノ酸配列（配列認識番号２）を 示している。 異なったリーディングフレームで前記ｃＤＮＡのＣ−末端（塩基対３０８−４ ７５）が翻訳されると、ＶＥＧＦ₁₆₅，ＶＥＧＦ₁₈₉，ＶＥＧＦ₂₀₆のＣ−末端部 分に対して相同性の高いたん白質が生成される。図２も、図１のヌクレオチド配 列（配列認識番号１）を示しているが、ここでは、第２リーディングフレームに コードされ、５４アミノ酸長である第２のたん白質の推定アミノ酸配列（配列認 識番号３）が示されている。従って、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子は、一次転写産物の選 択的スプライシングを使用して、異なったたん白質をコードするようである。前 記第２ペプチドをコードする前記クローンの最後の部分は、ＶＥＧＦ−Ｂの他の スプライシング・バリアントに於いて機能的たん白質として発現されるかもしれ ない。 上述したたん白質は、約５ないし１０個のアミノ酸からなる付加的なＮ−末端 配列と、更に、約２１ないし２８個のアミノ酸のリーダー配列と結合して存在す るかもしれない。従って、そのように結合されたアミノ酸配列は、内皮細胞の増 殖を促進する特性を示し、そのように結合されたペプチド配列をコードするＤＮ Ａ配列は、図１および２のＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリ ダイズし、そのようなアミノ酸配列と、それらをコードするＤＮＡとが、本発明 の範囲に含まれると明らかに理解される。例２ ： マウスＶＥＧＦ−Ｂの全長ｃＤＮＡのクローニング 前述の例１で同定されたＣＤＮＡクローンの約０．９ｋｂのＳａｌＩ／ ＮｏｔＩｃＤＮＡインサートをプローブとして使用して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．，ｏｆ Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手した成体 マウス心臓ラムダＺＡＰ−ＩＩｃＤＮＡライブラリーを、標準式技術を使用して スクリーニングした。前記ライブラリーを、指示に従って、滴定し、プレーティ ングして、フィルターを作成した。５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ，５ｘデ ンハルト溶液、１％ＳＤＳおよび１００ｕｇの鮭精子ＤＮＡ／ｍｌ中での４２℃ でのプレハイブリダイゼーションの後、前記フィルターを、同じ温度で、かつ、 変性放射性標識化プローブを含有する同じ溶液中で１０⁶ｃｐｍ／ｍｌのハイブ リダイゼーション溶液を使用して、ハイブリダイゼーションした。前記プローブ は、ランダムプライミングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して標識化した。 １６時間後、前記フィルターを、０．５％ＳＤＳ含有の２ｘＳＳＣ中で、２ｘ３ ０分間、５２℃で洗浄した。前記フィルターを、−７０℃で一晩、補力スクリー ンを使用して露出した。プレート上のすべてのプラークが陽性になるまで、陽性 クローンを２回再スクリーニングした。いくつかの陽性クローンからのインサー トを、供給業者によって指示されているように、イン・ヴィヴォエキサイション によって、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋にサブクローニングした 。 いくつかのクローンを、制限酵素分析によってマッピングしたところ、Ｓｐｅ Ｉ／ＢａｍＨＩの制限フラグメントの長さによって特徴付けられる二つの異なる グループに分類されることが分かった。これらのグループの第１のものは、それ ぞれが、２４０ｂｐ ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを有する、前記制 限マッピングされたクローンの内の三つを有していた。もう一つののグループは 、３４０ｂｐ ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを有するクローンであった。 このフラグメントの分析は、例５に記載する。 ２４０ｂｐ ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを示した三つのクローン を、完全、又は部分的にシークエンシング（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０，Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、そして、これらのクローンの特 徴を次のように要約する。 ヌクレオチド配列分析は、前記ｃＤＮＡクローンの内の二つは、長さに於いて 異なり、一方が突然変異を有していたものの、実質的に同じであることを示した 。前記クローンの内の一方は、全長であり、最初の２１個のアミノ酸が切断可能 なシグナル配列である１８８のアミノ酸残基をコードするオープンリーディング フレームを含有していた。これら実質的に同一の二つのクローンの内の他方は、 開始コドンのＧの位置が末端となっていた。別のクローンの配列分析により、前 記Ｇの前の配列は、ＡＣＣＡＴであると推定できた。これらのクローンの両方は 、図３に示す同じコード領域ヌクレオチド配列（配列認識番号４）を有している ことが分かった。図面に於いて、前記単離クローンには存在していなかった開始 コドン（ＴＡＧ）の最初のチミンとアデニンとは省略されている。これら二つの ｃＤＮＡクローンの両方のコード領域のオープンリーディングフレームの推定ア ミノ酸配列が図４に示されている（配列認識番号５）。この配列によってコード されたん白質を、以後ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇と称する。ここに使用されるたん白質名 のそれぞれに於いて、その下付き数字は、シグナル配列を除いた成熟たん白質に 於けるアミノ酸の数を示す。 予想されたように、これらの二つのクローンによってコードされるアミノ酸配 列と、例１のｃＤＮＡクローンから推定された部分的アミノ酸配列との比較は、 顕著な類似性を示した。しかし、それぞれがＶＥＧＦの異なった部分に対する相 同性を有するアミノ酸配列をコードする、例１のクローンにおける二つのオープ ンリーディングフレームは、両方共に、例２に依る上述の二つのクローンのそれ ぞれにおける同じリーディングフレーム中に存在している。例１のクローンのフ レームシフトは、二つの追加アデニン単位の挿入によって引き起こされ、その結 果、例１のクローンのＣ−末端部分はフレーム外にずれることになる。この理由 は、現在ではわからないが、クローニングにおけるアーティファクトに依るもの であるかもしれない。 前述の３つのクレーンのうち第３のクローンのコード領域は、２１ｂｐの挿入 を有することを除いて、前の二つのクローンのそれらと同一のヌクレオチド配列 を有していた。図５は、この第３クローンのヌクレオチド配列（配列認識番号６ ）を示している。確認を容易にするために、前記２１の追加塩基は、図中に於い て下線を引かれている。この挿入によって、成熟たん白質中に於いて７つの追加 のアミノ酸残基が生じる。従って、このより長いｃＤＮＡによってコードされる たん白質を、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₇₄と称する。図５のｃＤＮＡによってコードされる たん白質のアミノ酸配列が、図６に示されている（配列認識番号７）。この図に 於いても、確認を容易にするために、前記７つの追加アミノ酸には下線が引かれ ている。これらの追加アミノ酸は、スプライス部位に於いて前記配列中に挿入さ れており、マウスゲノムＤＮＡクローンのシークエンシングは、これら追加アミ ノ酸が、実際に選択的スプライシングの結果であることを示している。更に、Ｐ ＤＧＦのレセプター結合部位位置に関して今日知られていることに基づくと、前 記挿入は、恐らくレセプター結合部位の一部であるたん白質中の位置において起 こる。従って、前記挿入は、恐らく、レセプター結合に影響を与え、アンタゴニ ストおよび／又は異なるレセプター特異性に対する影響に於いて、機能的重要性 を持つものであるかもしれない。例３： ハイブリッドｃＤＮＡクローン 既に指摘したように、例１のこの元のｃＤＮＡクローンは、全長ではなく、ア ーティファクトを含んでいるものである可能性がある。しかし、もしもＶＥＧＦ −Ｂ₁₆₇および／又はＶＥＧＦ−Ｂ₁₇₄をコードする前述のクローンの末端５‘ヌ クレオチド配列を追加すると、例１のこのオープンリーディングフレームは、１ ３３個のアミノ酸のたん白質をコードし、１１２アミノ酸長で、従って、ＶＥＧ Ｆ−Ｂ₁₁₂と称される成熟たん白質を生成することになる。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₁₂をコ ードするこのハイブリッドｃＤＮＡ配列（配列認識番号８）が、図７に示され、 対応するたん白質のアミノ酸配列（配列認識番号９）が図８に示されている。 図９は、マウス血管内皮増殖因子Ｂの１６７アミノ酸バリアント（ｍＶＥＧＦ −Ｂ₁₆₇）と、マウス血管内皮増殖因子（ｍＶＥＧＦ₁₆₄）と、ヒト胎盤増殖因子 （ｈＰｌＧＦ）と、マウス血小板由来増殖因子Ａ（ｍＰＤＧＦ Ａ）と、マウス 血小板由来増殖因子Ｂ（ｍＰＤＧＦ Ｂ）とを比較する目的の、複数のアミノ酸 配列のアラインメントを示している。マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇と同一のアミノ酸 残基は、箱内に示されている。これら配列の相同関係は、明らかであり、図は、 ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子に属する増殖因子の保存された構造を 示し、ＶＥＧＦ−Ｂが、このグループの他の増殖因子の構造的ホモローグである ことをはっきりと示している。これらアミノ酸配列の対比較は、マウスＶＥＧＦ −Ｂが、マウスＶＥＧＦ₁₆₄に対して約４３％同一であり、ヒトＰｌＧＦに対し て約３０％同一であり、更に、マウスＰＤＧＦ ＡおよびＢに対して約２０％同 一であることを示している。保存されたシステイン残基が特に注目に値する。前 記５つの増殖因子のＮ−末端ドメイン（すなわち、ＰＤＧＦ様ドメイン）に於け る最初の８つのシステイン残基がこのファミリーのすべてのメンバーによって共 有されていることが理解され、従って、分子内および分子間ジスルフィド結合に 関係しているこれら８つのシステイン残基が、これらの増殖因子間に於いて不変 であることが明らかである。更に、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とＶＥＧＦ₁₆₄のＣ− 末端ドメインは、又、８つのさらなる保存システイン残基といくらかの領域にわ たるアミノ酸塩基性に対して重要な類似性をも示している。例４： ヒトＶＥＧＦ−Ｂ ｃＤＮＡのクローニング λｇｔｌｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のヒト繊維肉腫ｃＤＮＡライブラリーＨＴ １０８０の１０⁶λ−クローンを、標準式手順に従って、前記マウスＶＥＧＦ− Ｂクローンｐｃｉｆ２の：≒０．９ｋｂインサートを用いてスクリーニングした 。いくつかの陽性クローンの中の、一つの、Ｈ．１と命名したものをより詳しく 分析し、そのヌクレオチド配列を決定した。そのヌクレオチド配列は、ヒトＶＥ ＧＦ−Ｂの２０７アミノ酸アイソフォーム がコードされていることを示した。このアイソフォームの分析は、例６に於いて 後述する。前記Ｈ．１配列に基づき、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇アイソフォームに 対応する推定ヒトｃＤＮＡの全コード領域を増幅する二つのオリゴヌクレオチド をデザインした。 ５‘−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＣＣ−３’（正方向） （配列認識番号１８） ５‘−ＧＣＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＡＧ−３’（逆方向） （配列認識番号１９） これらのオリゴヌクレオチドを利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に よって、オリゴ−ｄＴプライムドヒト赤白血病細胞（ＨＥＬ）ＲＮＡからのヒト ＶＥＧＦ−Ｂの全コード領域を増幅した。この増幅産物を、ＴＡクローニングキ ット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のｐＣＲ−ＩＩ−ベクターにクローニングし、標 準式技術を使用してシークエンシングした。ヒトＶＥＧＦ−ＢｃＤＮＡクローン のヌクレオチド配列を図１０に示し（配列認識番号１０）、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ_{16 7} の推定アミノ酸配列を、図１１に示す（配列認識番号１１）。 例２の全長マウスｃＤＮＡクローンと、例４の全長ヒトｃＤＮＡクローンとは 、それぞれ、Ｎ−末端疎水性推定シグナル配列を含有する１８８個のアミノ酸の ポリペプチドをコードする。ＶＥＧＦとの類推に依り、シグナルペプチダーゼ切 断部位は、Ａｌａ２１とＰｒｏ２２との間に位置するものと考えられる。シグナ ルペプチダーゼの推定切断部位を、図１６に於いて矢印によって示す。従って、 これら二つのクローンのプロセッシングされたＶＥＧＦ−Ｂポリペプチドは、そ れぞれ１６７個のアミノ酸を有している。例５ 例２に於いて単離された３４０ｂｐ ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメン トを示したクローンを分析したところ、その大部分は、２４０ｂｐ ＳｐｅＩ／ ＢａｍＨＩフラグメントを示した例２の最初の二つのクローンと同一であること が分かった。その相違は、配列のＣ−末端部分に於いて挿入が存在することに依 るものである。 この３４０ｂｐ ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントは、２０７個の アミノ酸を含むマウスＶＥＧＦ−Ｂの別のアイソフォームをコードする。このた ん白質をコードするＤＮＡのコード領域（配列認識番号１２）が図１２に示され 、それが翻訳れたアミノ酸配列（配列認識番号１３）は、図１３に示されている 。２１アミノ酸のリーダー配列の切断後、成熟たん白質は、１８６個のアミノ酸 を有し、これをｍＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆と称する。このアイソフォームは、明らかに 、図１７を参照して後述するように、選択的ＤＮＡスプライシングの結果、生じ るものである。例６： 例４に記載したようにして単離された前記Ｈ．１クローンは、ヒトＶＥＧＦ− Ｂの２０７アミノ酸のアイソフォームをコードすることが分かった。このたん白 質をコードするＤＮＡのコード領域（配列認識番号１４）が図１４に示され、そ れが翻訳されたアミノ酸配列（配列認識番号１５）が、図１５に示されている。 ここでも、ｈＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆と命名する、このアイソフォームは、選択的スプ ライシングの産生物であるようである。 例５のｍＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆と、例６のｈＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆との両方が、ＶＥＧＦ −Ｂ₁₆₇のコード配列のヌクレオチド４１４と４１５との間に１０１の塩基対の 挿入部を有している。この挿入部の後、これらｃＤＮＡクローンのヌクレオチド 配列は、対応するＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の配列と同一であった。その１０１塩基対挿 入部の位置は、ＶＥＧＦ中のエキソン５−エキソン６接続部に対応している。こ の挿入によって、フレームシフトが生じ、これによって、二つのＶＥＧＦ−Ｂア イソフォームのＣ−末端ドメインは、互いに全く異なったものになっている。 二つの主要なＶＥＧＦ−Ｂアイソフォーム、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇と ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とに対応する、配列認識番号１１と１５とに於けるアミノ酸１ １６から始まるＣ−末端アミノ酸配列の相違は、これら二つのアイソフォームの 互い異なる生化学的特徴によって反映されている。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のＣ−末端 ドメインは、強塩基性（正味のチャージ＋１３）であり、ヘパリンに結合する。 ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のＣ−末端ドメインは、弱塩基性（正味のチャージ＋５）であ り、そのＣ−末端に疎水性アミノ酸残基が長い領域にわたって存在している。Ｖ ＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の疎水性末端が、膜貫通ドメインとして振る舞う可能性は低い、 というのは、このＶＥＧＦ−Ｂのバリアントは、細胞から分泌されるからである 。従って、Ｎ−末端ドメインが同一であるにもかかわらず、これらの二つの主要 なＶＥＧＦ−Ｂのアイソフォームは、互いに非常に異なる生化学的特徴を有して いる。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆には高塩基性ヘパリン−結合ドメインがないことにより 、前記たん白質は、細胞から自由に分泌されることが可能となる。しかしながら 、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の分泌は、非常に低速であり、トランスフェクション細胞を 使用したパルス・チェイス実験では、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーは、１時間 以内では培地中に見つからなかった。これに対して、ＶＥＧＦホモダイマーとＶ ＥＧＦ−Ｂ₁₈₆・ＶＥＧＦダイマーとは、３０分以内に培地中に出現した。 図１６は、マウスおよびヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇およびＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のアミノ 酸配列（配列認識番号５，１１，１３および１５）のアラインメントを１文字コ ードで示している。同一の残基は、箱内に示され、これに対して、マウスおよび ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇およびＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆アイソフォーム間で異なるアミノ酸 残基は、箱の外側に示されている。マウスおよびヒトＶＥＧＦ−Ｂは、約８８％ のアミノ酸配列同一性を示し、特にそのＣ−末端領域に於いて、高塩基性である 。マウスとヒトのＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のＣ−末端ドメインは、アミノ酸レベルに於 いて約８５％同一である。マウスとヒトのＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のＣ−末端ドメイン はアミノ酸レベルにおいて約８４％同一である。両方のポリペプチドは、Ｎ−結 合グリコシレート化のコンセンサス配列（Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ）を欠如している。矢 印 は、Ａｌａ²¹とＰｒｏ²²との間のシグナルペプチダーゼのための推定切断サイト を示している。シグナル配列を除くと、マウスとヒトのＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇アミノ 酸配列は、高度に相同であり、１６７の残基において２０の置換があるにすぎな い。これらの置換部は、Ｎ−末端、アミノ酸６０と１４５との周囲の二つの領域 、に集中している。両方のＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇たん白質のすべてのシステイン残基 は不変であるが、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のＣ−末端の８つのシステイン残基は、ＶＥ ＧＦ−Ｂ₁₈₆アイソフォームに於いては保存されていない。マウスおよびヒト配 列は、残基６６と１２９との間の領域に於いて、一つの進化的に保存された置換 （Ｑ１０５Ｒ）を除いて同一であることが注目される。これは、レセプター結合 部位がたん白質のこの部分に見られるため（ＰＤＧＦ構造と比較して）、重要で ある。このことから、マウスとヒトのＶＥＧＦ−Ｂが、レセプターレベルで交差 反応結合を示し、従って、同一又は類似の生物学的活性を示す可能性がある、と 結論される。例７： マウスとヒトのＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のエキソンイントロン構造 ヒトＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子の構造を、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして使 用したＰＣＲ反応から得た、クローン化ＰＣＲフラグメントの制限マッピングと ヌクレオチド配列分析とによって調べた。この際、ゲノムλクローンから同定さ れた、第１エキソンとイントロンについては除いた。マウス遺伝子の構造を、異 なる組み合わせのプライマーを使用して増幅されたクローン化ＰＣＲフラグメン トの制限マッピングとヌクレオチド配列分析とによって調べた。これらのＰＣＲ 増幅に於けるテンプレートとして、全長マウスＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子を含有する単 離ゲノムλクローンを使用した。 手順 前記マウスＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のいくつかのλクローンを、供給業者（Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）による指示に従って、１２９／Ｓｗ λＦＩＸゲノ ムライブラリーから単離した。ＶＥＧＦ−Ｂの、前述 のｐｃｉｆ２ｃＤＮＡの≒０．９ｋｂ ＳａｌＩ／ＮｏｔＩインサート（配列認 識番号１）を、プローブとして使用した。いくつかの陽性クローンからのλＤＮ Ａを、プレート溶解物から単離した。前記陽性λ−クローンの一つ（クローン１ ０）を、ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）にサブクローニングした。この同じクローンからの 単離ＤＮＡも、ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用し（１００ｎｇのλＤＮＡ ／反応）、マウスＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のコード領域を、異なった組み合わせのプ ライマーを使用して増幅した。これらのプライマーのヌクレオチド配列は、マウ スＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とマウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とをコードするｃＤＮＡクローンか ら得た。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／反応）を使用した。生成され たＰＣＲフラグメントを、ＴＡ−クローニングベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔ ｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）に直接にクローニングした。マウスＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子 のエキソンイントロン構造を、サブクローニングされたＢａｍＨＩゲノムフラグ メントと、クローニングされたＰＣＲ生成物とのヌクレオチド配列分析によって 確定した。 ヒトゲノムλ−クローンを、 ＥＭＢＬ−３ ＳＰ６／Ｔ７（Ｃｌｏｎｔｅｃ ｈ）中のヒトのゲノムライブラリーの１ｘ１０⁶クローンをスクリーニングする ことによって単離した。その際、プローブとしてヒトＶＥＧＦ−ＢｃＤＮＡの５ ‘配列にわたる９０ｂｐのＰＣＲ−フラグメントを使用し、高度にストリンジェ ントな条件を用いた。洗浄条件は、１ｘＳＳＣ、室温で３０分間での１回の洗浄 と、１ｘＳＳＣ、６５℃で３０分間の２回の洗浄、であった。前記ＰＣＲのプラ イマーは、 ５‘−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＣＣ−３’（正方向） （配列認識番号１８）と、 ５‘−ＧＧＧＣＡＴＣＡＧＧＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧ−３’（逆方向） （配列認識番号１９）とであった。 陽性λ−クローンを、Ｓａｃ ＩフラグメントとしてｐＧＥＭ ３Ｚベクター （Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングしたところ、遺伝子の５‘−領域を坦持 していることが分かった。ヒトＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子の残りの部分を、ゲノムＤＮ Ａをテンプレートとして使用したＰＣＲによって増幅した。ヒトｃＤＮＡ配列か ら得た異なった組み合わせのプライマーを使用した。Ｄｙｎａｚｙｍｅ ＤＮＡ ポリメラーゼ（２．５Ｕ／反応、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用した。増幅された ＰＣＲフラグメントを、ＴＡ−クローニングベクターｐＣＲ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔ ｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）に直接にクローニングした。マウスとヒトのＶＥＧＦ− Ｂ遺伝子の短いイントロンのエキソン−イントロン境界と、長さとを、ベクター 特異的プライマー又は、ｃＤＮＡ配列から得た適当なプラィマーを使用したヌク レオチド配列分析によって判定した。長いイントロンの長さは、アガロース・ゲ ル電気泳動によって分析した時の増幅ＰＣＲフラグメントの長さに基づいて計算 した。 結果 その結果は、マウスとヒトのＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のコード化部分は、ＤＮＡの 約４ｋｂに渡っており、両方の遺伝子が長さが１９ｂｐ（Ｅ７）から２３６ｂｐ （Ｅ６）の範囲である７つのコードエキソンに分割されることを示した。図１７ は、マウスとヒトのＶＥＧＦ−Ｂの遺伝子の構造の略図である。塩基対としての エキソンのサイズは、箱内に示され、イントロンのサイズは、箱の間に示されて いる。イントロンは、一定縮尺では示されていない。マウスとヒトのＶＥＧＦ− Ｂ遺伝子の非翻訳化隣接領域の構造は、確定されず、グレーのボックスで示され ている。両方の遺伝子のエキソン−イントロン接続部を、次の表３に示す。 前述したように、エキソン６は、遺伝子が異なる２つのＶＥＧＦ−Ｂアイソフ ォームの転写産物を生成することを可能にする選択的スプライス受容部位を有し ている。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇は、エキソン１−５、エキソン６の最後の部分、そし てエキソン７（ＴＧＡ）を用いてなる。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆は、エキソン１ないし ５、エキソン６の最初の部分を用いてなり、エキソン６の最後の部分中（ＴＡＧ ）において終止している。エキソン６の最初の部分の挿入が、フレームシフトを 導入し、エキソン６の最後の部分に於いて終止コドンを生成するため、エキソン ７は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆に於いて翻訳されない。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の終止コドン（ ＴＡＧ）の位置は、エキソン６Ｂにおいて示され、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の終止コド ン（ＴＧＡ）の位置は、エキソン７において示されている。 両方の遺伝子に於けるイントロンは、１６１ｂｐから約２．６ｋｂの範囲であ る。各エキソンの長さと、二つの遺伝子に於けるスプライス接続部の位置とは、 同一であった。そして、すべてのスプライス供与、及び受容部位は、規範的なＧ Ｔ／ＡＧ則に従っている、パジェット（Ｐａｄｇｅｔｔ）他，Ａｎｎｕａｌ Ｒ ｅｖ． ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５：１１１９−５０（１９８６） 。マウスとヒトの遺伝子の間の唯一の特筆すべき相違は、イントロン１，４およ び６の長さであり、それらはマウスの遺伝子に於いてのほうが長いということで ある。すべてのエキソンイントロン境界が、ＶＥＧＦ−ＢとＶＥＧＦとの間で保 存されていることが分かったが、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子に於けるイントロンは、一 般的に、ＶＥＧＦ遺伝子に於けるよりも小さかった。 ＶＥＧＦ−Ｂのエキソン５の後の３００ｂｐ−イントロンは、ＶＥＧＦにおけ る対応のものとは異なっている。ＶＥＧＦにおけるものは、長さが３ｋｂであり 、ＶＥＧＦ₁₈₉とＶＥＧＦ₂₀₆との転写産物に見られる選択的スプライシングされ たエキソンを有し、それは多数の塩基性アミノ酸残基をコードする。このＶＥＧ Ｆ−Ｂにおけるイントロンをより詳しく調べたが、ＶＥＧＦの第６番目のエキソ ンに対応するエキソンは見つからなかった。その代わり、このイントロンの３‘ 末端とそれに続くエキソンとは、 ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆をコードするｃＤＮＡクローンの対応する配列と同一であるこ とが分かった。これは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のｍＲＮＡが、ｍＲＮＡスプライシン グ中における、選択的スプライス受容部位の使用によって形成され、その結果、 これらのｍＲＮＡ中に１０１ｂｐイントロン配列の挿入が起こるという事実によ って説明可能である。 図１８は、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の比較親水性分析を示し ている。これらのプロファイルは、９つの残基の枠を使用するキール（Ｋｙｌｅ ）およびドゥーリトル（Ｄｏｌｉｔｔｌｅ）に従って作成された。予想されるよ うに、親水性／疎水性のパターンは、アミノ酸１からアミノ酸１１５まで本質的 に同一である。アミノ酸１１５の後に於いて、親水性／疎水性パターンは、エキ ソン６の最初の部分によって引き起こされるフレームシフトに依り、変化する。 従って、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とは、類似と非類似の両方の活性を 示すものと予期される。 図１９は、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーの増殖因子の５つのメンバーのアミ ノ酸配列の系統発生的関係を示す系統樹である。置換又は代替の数は、図の左側 から右側にかけて減少している。ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦと血小板由来増殖因 子（ＰＤＧＦ）グループの間に位置していることが分かる。 図９および１６の複数のアミノ酸配列アラインメントと、図１９の系統発生分 析は、ＰＡＭ２５０ディスタンステーブルを使用して、ヘリン（Ｈｅｉｎ），Ｍ ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８３，ｐｐ．６２６− ４５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９ ０）に従って行った。例８： 抗体の産生 ａ．マウスＶＥＧＦ−Ｂに対する抗血清 マウスＶＥＧＦ−Ｂに対する抗血清を、ラビットを、プロセッシングされたＶ ＥＧＦ−ＢのＮ−末端領域を有し、かぎ穴式吸着 （ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニンと結合させた１８−ｍｅｒ オ リゴペプチドで免疫化することによって産生させた。前記ペプチドがキャリアた ん白質に結合できるようにするため、ＳＰＤＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて 、システイン残基をＮ−末端およびＣ−末端アミノ酸残基として導入した。前記 オリゴペプチドの配列は、Ｃ−Ｐ−Ｖ−Ｓ−Ｑ−Ｆ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｈ−Ｑ− Ｋ−Ｋ−Ｖ−Ｖ−Ｐ−Ｃ（配列認識番号２１）であった。 各ラビットには、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄｓ Ａｄｊｖａｎｔ中で懸 濁させたペプチド結合体の３００μｇの皮下注射を行った。Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔ ｅ Ｆｒｅｕｎｄｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ中で懸濁させた同量の抗原を用いて、皮 下追加抗原刺激（ｂｏｏｓｔｅｒ）注射を与えた。第２回目の追加抗原刺激注射 後に血清が得られた。 ｂ．ヒトＶＥＧＦ−Ｂに対する抗血清 ヒトＶＥＧＦ−Ｂに対する抗ペプチド抗血清を、ラビットを、下記のＮ−末端 領域アミノ酸残基配列（配列認識番号２２）を有する派生（ｂｒａｎｃｈｅｄ） ２３−ｍｅｒオリゴペプチドで免疫化することによって産生させた。 Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｄ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｈ−Ｑ−Ｒ−Ｋ−Ｖ−Ｖ−Ｓ−Ｗ−Ｉ−Ｄ−Ｖ− Ｙ−Ｔ−Ｒ−Ａ−Ｔ。 前記派生２３−ｍｅｒオリゴペプチドは、タム（Ｔａｍ），“Ｓｙｎｔｈｅｔ ｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ： ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｕ ｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５，ｐａｇｅｓ５４０９ −４１３（１９８８）に従って合成した。第１回目の免疫化に於 いて、ラビットに、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ中で 懸濁された５００μｇの前記派生ペプチドを皮下注射した。引き続いての追加抗 原刺激に於いては、Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ 中で懸濁された２００μｇの前記抗原を注射した。第２回目と第３回目の追加抗 原刺激の後、従来技術によって抗血清を採集した。例９： ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の生化学的特徴、ホモダイマー化およびＶＥＧＦとの ヘテロダイマー化 ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の生化学的特徴を、トランスフェクションされたヒト胚 腎臓２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中において調べた 。ヒトＶＥＧＦ−Ｂ１６７とヒトＶＥＧＦ１６５とをコードするｃＤＮＡインサ ート［ケック（Ｋｅｃｋ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４６，ｐａｇｅｓ１ ３０９−３１２（１９８９）参照］を、個々に、ｐＲＥＰ７発現ベクター（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）にクローニングした。ヒト胚腎臓２９３ＥＢＮＡ 細胞（エプスタイン・バーウィルス核抗原−１を発現する）を、燐酸カルシウム 沈殿法を使用して、それぞれの発現プラスミドによるトランジェントなトランス フェクションによってトランスフェクションし、これらの細胞を、４８時間イン キュベートした。コントロールとして、細胞を、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇ｃＤＮＡを反 対方向で含有する発現ベクターによってもトランスフェクションした。細胞の単 層を、メチオニン非含有およびシステイン非含有培地中で、３０分間インキュベ ートし、その後、同じ培地中で、２時間、１００μＣｉ／ｍｌ［³⁵Ｓ］メチオニ ンおよび［³⁵Ｓ］システイン（Ｐｒｏｍｉｘ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｃ．）で 標識化した。標識化培地を、血清を含まない通常の培地と置き換え、標識化され たたん白質を、６時間チェイスした。指示されている場合、チェイス中にはヘパ リンが含まれていた（１００μｇ／ｍｌ）。前記チェイス時間後に、培地を採集 し、細胞を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．５％デ オキシコール酸ナトリウム， ０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０，０．１％ ＳＤＳおよび０．１Ｕ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ中で溶解した。 ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇ＤＮＡを含有するプラスミドでトランス フェクションされた細胞中で発現された。ヘパリンで処理された、あるいは、処 理されていない細胞からの培地上清のアリコットと、洗浄剤可溶化細胞溶解物を 、例８に記載したようにして得たＶＥＧＦ−Ｂに対する特異的抗ペプチド抗血清 で免疫沈降させ、特に指示されている場合を除き、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅによって分析した。そのデータは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇ホモダイマーとＶＥＧＦ −Ｂ₁₆₇−ＶＥＧＦ₁₆₅ヘテロダイマーとがヘパリンによって細胞から放出される ことを示している。ヘパリン処理（１−１００μｇ／ｍｌ）又は１．２Ｍ Ｎａ Ｃｌによって、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇が細胞から放出され、上清中に見つかった。細 胞がヘパリンによって処理されなかった場合には、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇は、細胞結 合状態にとどまり、培養培地中には放出されなかった。同じ条件下で、ＶＥＧＦ₁₈₆ ホモダイマーは、細胞から分泌され、ヘパリン処理無しで培養上清中に見つ かる。 還元条件下に於いて、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇は、２１ｋＤａの分子量（Ｍｒ） として移動する。非還元条件下での培養上清の分析は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇が、分 子量４２ｋＤａ種として移動し、ダイマー構造を示すことを示した。これらの結 果は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇が、恐らくは細胞外ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの イオン性相互作用によって、細胞表面に結合したジスルフィド結合ダイマーを形 成することを示唆している。細胞表面への結合は、ＶＥＧＦのより長いスプライ スバリアントに於いて観察されるように、Ｃ−末端塩基性ドメインによって仲介 される可能性がある。 ＶＥＧＦがＰｌＧＦとヘテロダイマーを形成することが示されたので、ＶＥＧ Ｆ₁₆₅も、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とヘテロダイマーを形成できるか否かをテストするこ とにした。この目的のために、２９３ＥＢＮＡ細胞を、ヒトＶＥＧＦ₁₆₅とヒト ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇との両方をコードする発現ベクタ ーで、コトランスフェクションしたところ、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇は、ＶＥＧＦ₁₆₅と 組み合わされて発現された。代謝標識化したたん白質を、ヘパリンの存在下でチ ェイスし、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇又はＶＥＧＦ₁₆₅のいずれかに対する抗血清で免疫沈 降法を行った。ヒトＶＥＧＦに対する抗血清は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの ものであった。非還元条件下に於いて、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇・ＶＥＧＦ₁₆₅ヘテロダ イマーは、分子量４２−４６ｋＤａ種として移動した。その結果は、ＶＥＧＦ− Ｂは、ＶＥＧＦとジスルフィド結合ヘテロダイマーを形成することが出来、これ は、ヘパリンの不在下では細胞結合状態にとどまる、ということを示している。 ＶＥＧＦ₁₆₅のホモダイマーは、培地中に効率的に分泌されるので、ＶＥＧＦ− Ｂが、前記ヘテロダイマーの分泌を決定するようである。 ＶＥＧＦ−Ｂは、正常には、続いておこる輸送の為にソース細胞の小胞体中に 於いて合成される。組換えＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦ−Ｂたん白質をコードする ＤＮＡ配列を、適当な操作可能にリンクされたプロモーターと、コントロール配 列とともに、周知のプラスミドｐＢＲ３２２やその誘導体のような適当なベクタ ーに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉやＣｏｓ細胞等の適当な宿主細胞を、その結果得られ る当該技術に於いて周知のベクター又は他のシステムによってトランスフォーメ ーション又はトランスフェクションし、その結果得られるトランスフォーマット 又はトランスフェクタントをＶＥＧＦ−Ｂ発現についてスクリーニングし、次に 、ＶＥＧＦ−Ｂの発現に関して陽性の細胞ライン又はバクテリア細胞ストックを 培養することによって生産することができる。トランスフェクション又はトラン スフォーメーションされるべき細胞のタイプに応じて、真核ベクター又は原核ベ クターのいずれかがを使用される。組換えＶＥＧＦ−Ｂの生産のための特に好適 なシステムは、組換えたん白質の産出量が極めて優れていることが証明されてい るバキュロウィルス−昆虫細胞システムである。例１０： バキュロウィルスシステムを使用したＶＥＧＦ−Ｂ発現 １ それ自身のシグナルペプチドを有するＶＥＧＦ−Ｂ ａ）クローニングとトランスフェクション 完全ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇遺伝子を、市販されているプラスミドｐＣＲＩＩ（ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）に挿入した。その結果得られるプラスミド ｐＣＲII−ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇からのＨｉｎｄIII−ＸｂａＩフラグメントと３‘− ５’−接続部の両方をシークエンシングした。前記フラグメントはＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇ の全オープンリーディングフレームをコードしており、次にｐＦＡＳＴＢＡ Ｃｌにクローニングされた。Ｂａｃｍｉｄ−ＤＮＡを、“Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ （商標名）Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ”（ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）のための製造業者の指示に従 って作成し、Ｓｆ９００ＩＩ−ａｄａｐｔｅｄ Ｓｆ９細胞（Ｄｒ．Ｃｈｒｉｓ ｔｉａｎ Ｏｋｅｒ−Ｂｌｏｍから得た）にリポフェクションした。Ｓｆ９細胞 は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｌｏｎ Ｃ ｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｍ Ｄ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７１１）からのものである。トランスフェクションさ れた細胞を、次に、２５ｃｍ²の培養皿中で標準ＴＭＮ−ＦＨ培地上で培養した 。 ｂ）たん白質発現のアッセイ トランスフェクションの約７２時間後に、前記細胞を溶解し、１ｍｌの培養上 清と細胞溶解物とを、例９に記載した免疫沈降法とウェスタンブロッティングと で、発現されたＶＥＧＦ−Ｂについてアッセイした。４つの個別にトランスフェ クションされた細胞培養物の内の三つからの溶解物が、ウェスタンブロッティン グでのシグナルの強度が異なるものの、ＶＥＧＦ−Ｂについて陽性であることが 分かった。各ケースの発現されたＶＥＧＦ−Ｂポリペプチドは、例９の哺乳類細 胞に於いて発現されたたん白質にサイズに於いて、対応していることが分かった 。 ウェスタンブロッティングに於いて最も強いシグナルを提示した細胞からのウ ィルスストックを、細胞を感染させて培地から新たなウィルスを収 集することによって２ラウンド増幅した。その結果得られた上清を分析した。非 感染細胞も、ネガティブコントロールとして分析した。経時分析は、感染後４８ 時間と７２時間の間に収集された細胞が、最も多量のＶＥＧＦ−Ｂを含有してい ることを示した。感染の９６時間後、ウィルスによって誘発された細胞溶解の結 果として、ＶＥＧＦ−Ｂは、免疫沈降法とウェスタンブロッティングとによって 培養上清中でも検出することができた。組換えＶＥＧＦ−Ｂは、２０％と４０％ の間（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄によって溶解物から沈殿させることができた。 １０．２ メリチンシグナルペプチドを有するＶＥＧＦ−Ｂ （ｐＶＴＢａｃ） ａ）クローニングおよびトランスフェクション ヌクレオチド位置６８−１４１からのボリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）フラグ メントを使用して、例１０．１のプラスミドｐＣＲII−ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇中のシ グナル切断部位の直後にＢａｍＨＩ制限部位を導入した。この修飾ｐＣＲII−Ｖ ＥＧＦ−Ｂ₁₆₇コンストラクトからのＢａｍＨＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ開 裂ｐＶＴＢａｃにクローニングした［テッシール（Ｔｅｓｓｉｅｒ）他，“Ｅｎ ｈａｎｃｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｏ ｆ ａ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｈｏｎ ｅｙｂｅｅ ｍｅｌｌｉｔｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ”，Ｇｅｎｅ， Ｖｏｌ．９８，ｐａｇｅ１７７（１９９１）］。３‘−と５’−接続部の両方を 、シークエンシングした。Ｓｆ９細胞を、ヒトＶＧＥＦ−Ｂ₁₆₇遺伝子を含む前 述したｐＶＴＢａｃベクターと、線状化したバキュロウィルスＤＮＡ（Ｉｎｓｅ ｃｔｉｎ（商標名），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）とでコトランスフェ クションした。これらトランスフェクション細胞を、次に、ＴＭＮ−ＦＨ培地中 で培養した。 ｂ）たん白質発現のアッセイ トランスフェクションの４８時間後、上清を採集し、これを、免疫沈降法によ って一次スクリーニングした。４つの陽性のプラークが単離された。 １０．３ マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆をコードするｃＤＮＡインサート（マウスＶＥＧＦ− Ｂ₁₈₆ｃＤＮＡ（配列認識番号１２）クローン由来のＥｃｏＲＩ切断ｃＤＮＡフ ラグメント）を、ｐＦＡＳＴＢＡＣｌにクローニングした。マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇ （配列認識番号４）由来のＥｃｏＲＩ切断ｃＤＮＡフラグメントもｐＦＡＳ ＴＢＡＣｌにクローニングした。その結果得られたプラスミドを、前述の１０． １に記載されたようにしてバクテリアにトランスフォーメーションし、組換えプ ラスミドを単離し、Ｓｆ９およびＳｆ２１細胞にルポフェックションした。組換 えバキュロウィルスを含む上清を、Ｓｆ２１細胞に複数ラウンド再感染させるこ とによって増幅した。前記バキュロウィルスストックの最終タイターを、プラー ク滴定によって測定したところ、１ミリリットルのストック上清に対して、４ｘ １０⁸ないし２ｘ１０⁹の範囲のバキュロウイルス粒子が見出された。例１１： 組換えＶＥＧＦ−Ｂの大量生産 Ｓｆ２１細胞［ヴォーン（Ｖａｕｇｈｎ）他，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，１３：２１ ３−１７（１９７７）参照］に、１細胞当たり１０のウィルス粒子の複数の感染 によって、例１０のバキュロウィルスストックを感染させた。これらの感染Ｓｆ ２１細胞を、無血清培地（Ｓｆ９００ＩＩ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）１ｍｌ当たり ２ｘ１０⁶の細胞の密度で接種し、９６時間ローラーフラスコ内で増殖させた。 次に、培養培地と細胞とを回収した。細胞溶解物と培地とのアリコットを、ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥによって分析した。全たん白質パターンを、ゲルをＣｏｏｍａｓｓ ｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅで染色することによって可視化し、発現さ れたＶＥＧＦ−Ｂアイソフォームの存在を、例８に記載したように、ヒトおよび マウスＶＥＧＦ−Ｂに対する特異的抗ペプチド抗体を使用したイム ノブロソティングによって可視化した。分析に依れば、ヒトとマウスとの両方の ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇ポリペプチドは２１．５ｋＤａの予想されたサイズであった。 両方のたん白質は前記感染細胞中で細胞内に保持され、培地中には放出されてい なかった。これに対して、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆は、ダイマー形態として培地 中に容易に分泌された。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーは、５２−５４ｋＤａ種 として移動し、これは、昆虫細胞産生たん白質が、トランスフェクションＣｏｓ −１細胞から分泌されたＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆にみられるものと同じ共有結合修飾を 受けなかったことを示唆した。例１２： ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆を発現するＣｏｓ−１細胞のトランスフェクション と分析 マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とヒトＶＥＧＦ₁₆₅をコードするｃＤＮＡインサートを 、ｐＳＧ５発現ベクター［グリーン（Ｇｒｅｅｎ）他，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ ｄ Ｒｅｓ．，１６：３６９（１９８８）］にクローニングした。Ｃｏｓ−１細 胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭグルタミン、および適当な抗生物質を含む最 小必須培地（ＭＥＭ）中に維持した。トランスフェクションのために、前記細胞 を、９０ｍｍペトリ皿に再びプレーティングした。燐酸カルシウム沈殿法を使用 して、別々又は組み合わせて、前記発現ベクターでこれらの細胞をトランスフェ クションさせ、３６−４８時間インキュベートした。細胞の単層を、メチオニン とシステインとを含まない培地中で、３０分間インキュベートし、次に、１００ μＣｉ／ｍｌの［³⁵Ｓ］−メチオニンおよび［³⁵Ｓ］−システインを含む同じ培 地中で２時間インキュベートした（Ｐｒｏｍｉｘ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｃ. ）。 パルスチェイス実験のために、前記細胞を、３０分間標識化し、通常の培地で ２回洗浄し、次に、胎児ウシ血清を含まないＭＥＭ培地中で６時間までインキュ ベートした。チェイス時間後に培地を回収し、細胞を、５０ｍＭ ＮａＣｌ，０ ．５％デオキシコール酸塩、０．５％ｎｏｎｉｄｅｔＰ−４０および０．１％Ｓ ＤＳを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５中で可溶化した。培地と細胞溶解物のアリコットに対 して、例８ａからのマウスＶＥＧＦ−Ｂに対する特異的抗血清と、Ｒ＆Ｄ Ｓｙ ｓｔｅｍｓから市販されているヒトＶＥＧＦ特異的抗血清とを使用した免疫沈降 法を行った。沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。例１３： トランスフェクションＣｏｓ−１細胞に発現されたＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ の生化学的特性 マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の生化学的特性を、適当な発現ベクターで例１２に記 載したようにトランジェントにトランスフェクションしたＣｏｓ−１細胞で調べ た。これら細胞を、代謝標識化し、これらの標識化細胞からのたん白質を、ＶＥ ＧＦ−Ｂに対する抗ペプチド抗体を使用して免疫沈降させた。沈降物を、還元条 件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。細胞培養培地（Ｍ）と洗浄剤可溶化細胞溶解 物（Ｌ）との両方を、分析した。その結果を図２２に示す。細胞結合型ＶＥＧＦ −Ｂ₁₈₆が、還元条件下で分子量約２４，０００のポリペプチドとして移動した ことが判る。これに対して、トランスフェクション細胞の培地中に存在するＶＥ ＧＦ−Ｂ₁₈₆は、分子量３２，０００種として移動し、これは、たん白質が、そ の細胞内輸送および分泌中に於いて共有結合的に修飾されたことを示唆している 。対応する分子は、コントロールとして使用した擬似（ｍｏｃｋ）トランスフェ クションＣｏｓ−１細胞からの細胞溶解物や培地には検出されなかった。 非還元条件下での培地の免疫沈降法とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、分子量約６０ ，０００種を示し、これは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆がジスルフィド結合ホモダイマー を形成したことを示唆した。標識化中に１００ｕｇ／ｍｌのヘパリンを含有させ ても、トランスフェクション細胞からのＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーの分泌又 は放出には影響がなかった。例１４： ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーの生合成 ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーの生合成を、パルスチェイス実験によって調べ た。トランスフェクションＣｏｓ−１細胞を、３０分間代謝標識化し、次に、４ 時間までチェイスした。洗浄剤可溶化細胞溶解物と培地との免疫沈降法とＳＤＳ −ＰＡＧＥ分析とは、細胞結合型の分子量約２４，０００種がチェイス時間全体 を通じて溶解物中に容易に検出されることを示した。この分子種の強度の減少は 、培地中に存在する分子量３２，０００たん白質の増加と関連していた。分子量 ３２，０００種は、１時間のチェイス後に培地中に現れた。４時間のチェイス時 間後に、最高レベルの分泌ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆が得られた。細胞溶解物中には、中 間体は検出されなかったが、分泌された分子量３２，０００たん白質は、わずか に不均一であるようであった。前記修飾の性質は現在まだ未知であるが、Ｎ−結 合グリコシル化は、この修飾のためのコンセンサス部位が不在であるため除外す ることができる。例１５： ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆によるヘテロダイマーの形成 上述したように、ＶＥＧＦ−ＢとＶＥＧＦとは、多くの組織に於いて同時発現 され、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇・ＶＥＧＦ₁₆₅ヘテロダイマーは、トランスフェクション 細胞内で同時発現された時に容易に形成される。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆もＶＥＧＦ₁₆₅ とヘテロダイマーを形成することができるか否かを調べるために、Ｃｏｓ−１細 胞を、適当な発現ベクターとを用いて、単独又は組み合わせて、上述したように して、トランスフェクションした。これらトランスフェクション細胞からの培地 中に存在する代謝標識化たん白質について、ＶＥＧＦ−ＢとＶＥＧＦとに対する 抗血清を使用した免疫沈降法を行った。図２３Ａは、それぞれＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ とＶＥＧＦとを別々に発現するトランジェントにトランスフェクションされたＣ ｏｓ−１細胞の細胞培養培地からの免疫沈降物の還元条件下に於けるＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ分析の結果を示している。前記抗血清が、検出可能な交叉反応性無く、Ｖ ＥＧＦ−ＢとＶＥＧＦとに対してそれぞれ特異的であることが判る。 Ｃｏｓ−１細胞を、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とＶＥＧＦ₁₆₅のための発現ベクターでコ トランスフェクションした。その結果得られたＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とＶＥＧＦ₁₆₅と を同時発現する細胞からの細胞培養培地（Ｍ）と洗浄剤可溶化溶解物（Ｌ）とに ついて、還元条件下で免疫沈降法とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とを行った。その結果 を図２３Ｂに示す。このテストは、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とヒトＶＥＧＦ₁₆₅が 細胞内及び分泌型ヘテロダイマーを形成することを示した。 マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とヒトＶＥＧＦ₁₆₅を別々に又は組み合わせて、発現す る細胞からの培養培地に対して、ＶＥＧＦ−ＢとＶＥＧＦに対する抗体を使用し た免疫沈降法と、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とを行った。コントロ ールとして、模擬トランスフェクション細胞からの細胞培養培地を、分析した。 その結果を図２３Ｃに示す。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆が、分泌ジスルフィド結合ホモダ イマーを形成し、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とＶＥＧＦ₁₆₅とが、分泌ジルスフィド結合ヘ テロダイマーを形成することが分かった。 ＶＥＧＦとのヘテロダイマー形成がＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の分泌と放出とに影響を 与えたか否かを調べるために、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とＶＥＧＦ₁₆₅との発現ベクター でトランジェントにトランスフェクションされたＣｏｓ−１細胞を使用して、パ ルスチェイス実験を行った。３０分間の標識化時間後、細胞結合型ジスルフィド 結合ヘテロダイマーを回収することができ、分泌されたヘテロダイマーが、３０ 分間のチェイス時間後に既に培地から回収された。分泌されたヘテロダイマーは 、標識化後の２時間までの間に培地中に蓄積した。４時間のチェイス時点で、恐 らくは複合体の分解に依る、培地中のヘテロダイマーの量の減少があった。いく らかのＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆・ＶＥＧＦヘテロダイマーが、チェイス時間を通じて細 胞結合状態のままであった。これらの結果は、ＶＥＧＦとのヘテロダイマー形成 が、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーの分泌と比較して、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の分泌を 促進するものであることを示唆した。更に、３０分間の標識化時間後に於いて既 にヘテロダイマーが存在していたことは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホ モダイマーのゆっくりとした放出が、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆がダイマー化する能力の 欠陥に依るものではないことを示唆した。例１６： 分泌されたＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーの精製 分泌されたＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーを、次のようにして、バキュロウィ ルス感染Ｓｆ２１細胞の無血清培養培地から単離した。 ａ．最初の分離 培養培地中の主要なコンタミナントたん白質は、バキュロウィルス感染細胞に よって分泌される酸性たん白質である、バキュロウィルスたん白質ｇｐ６４／６ ７である。このたん白質を除去するために、培養培地を、限外濾過で２０倍に濃 縮し、次に、２０ｍＭのＮａＣＬを含有する２０ｍＭの燐酸緩衝液ｐＨ６．５中 で平衡化させたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを通過させた。次に、溶出し たたん白質を、同じ緩衝液中で平衡化させたＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）イオン交換カラムを通過させた。このカラムを、未結合のたん白 質を除去するために、燐酸緩衝液で洗浄し、結合したたん白質を、溶出緩衝液の ＮａＣｌ濃度を段階的に増加させることによって溶出させた。主要なｇｐ６４／ ６７バキュロウィルスコードたん白質は、それらの条件下に於いて前記イオン交 換カラムに結合しなかったのに対して、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーは、９０ ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出した。溶出フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によ って判断すると、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーは、この手順によって５−１５ ％の純度になっていた。 ｂ．均質状態への精製 前記ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーを、ＦＬＰＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）に結合させたＭｏｎｏＳカラムで均質状態にまで精製した。結合したたん白 質を、２０ｍＭの燐酸緩衝液ｐＨ６．５中でのＮａＣｌのリニアグラジェントで 溶出した。例１７： 前記二つのＶＥＧＦ−Ｂスプライスアイソフォームが、異なった組織分布を示 すか否かと、さらに別のアイソフォームが存在するか否かとを調べるために、マ ウスの脳、心臓、肝臓および腎臓、そしてヒトの胚心臓と骨格筋とから抽出され た全ＲＮＡを使用して、ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。その転写産物を、マウスと ヒトＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のエキソン４ないし７と、エキソン３ないし７とをそれ ぞれカバーする４対の特異的プライマーを使用したＰＣＲによって分析した。 手順 マウスおよびヒト組織からの全ＲＮＡを、チャーグウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ）他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４−９９（１９７９）によって 開示されている標準式手順を使用して、単離した。反応当たり２ないし５μｇの 全ＲＮＡを、トリｍｙｅｌｏｓｔｏｓｉｓウィルス逆転写酵素（２０Ｕ／反応） を使用したファーストストランドｃＤＮＡ合成用に使用した。反応は、オリゴー （ｄＴ）₁₈を用いて始めた。これらの反応のアリコットを、Ｔａｑ ＤＮＡポリ メラーゼ（２．５Ｕ／反応）を使用したＰＣＲ反応におけるテンプレートとして 使用した。マウスｃＤＮＡを増幅するために、二対のプライマーを使用した。こ れらの対は、エキソン４に位置する共通の５‘−プライマー、 ５‘−ＣＡＣＡＧＣＣＡＡＴＧＴＧＡＡＴＧＣＡ（正方向） （配列認識番号２３） を、それぞれエキソン６Ｂと７とに位置する二つの異なった３’−プライマー、 ５‘−ＧＣＴＣＴＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡ（逆 方向）（配列認識番号２４）、 ５’−ＡＣＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＣＧＧＣＴＴＣＣＧ（逆方向） （配列認識番号２５）（この最後のプライマーは、Ｂｇｌ ＩＩ部位と、５‘末 端に４つの追加の塩基を有する） とを組み合わせることによって得た。アガロースゲル電気泳動による分析後、増 幅されたバンドを、ナイロンフィルター（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ）に トランスファーし、続いてエキソン６Ａと６Ｂとに対して特異的なオリゴヌクレ オチドプローブでハイブリダイゼーションした。前記オリゴヌクレオチドプロー ブは、５’−ＣＴＣＴＧＴＴＣＣＧＧＧＣＴＧＧＧＡＣＴＣＴＡ（エキソン６Ａ ）（配列認識番号２６）と、５‘−ＴＣＡＧＧＧＣＧＴＴＧＡＣＧＧＣＧＣＴＧ ＧＧＴＧＣＡＡ（エキソン６Ｂ）（配列認識番号２７）とであった。このオリゴ ヌクレオチドプローブを、高特異性活性となるようなターミナルトランスフェラ ーゼを使用して［³²Ｐ］ｄＣＴＰで標識化した。毎ｍｌの溶液当たり１ｘ１０⁶ ｃｐｍの標識化プローブを使用して、５ｘデンハルト溶液と、０．５％ＳＤＳと 、１００μｇ／ｍｌの鮭精子ＤＮＡとを含有する、６ｘＳＳＣ中で、３７℃でハ イブリダイゼーションを行った。フィルターを、２ｘ１５分間、０．５％ＳＤＳ を含有する６ｘＳＳＣ中で、同じ温度で洗浄し、フィルムに露出した。 ヒトｃＤＮＡの増幅に使用する二対のプライマーは、二つの異なった５‘−プ ライマー、すなわち、エキソン３に位置する ５’−ＣＣＴＧＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＴ（正方向） （配列認識番号２８） と、エキソン４に位置する ５‘−ＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣ（正方向） （配列認識番号２９） とを用いてエキソン７に位置する、共通の３’−プライマー、 ５‘−ＧＣＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＡＧ（逆方向） （配列認識番号１９） と組み合わせたものである。増幅産生物のアリコットを、アガロースゲル電気泳 動によって分析した。前記アリコットを、ＴＡ−クローニングベクターｐＣＲ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中に直接にクローニングし、生成され たプラスミドを、ヌクレオチドシークエンシングによ って分析した。ＧＡＰＤＨの増幅はコントロールとして用いた。 結果 増幅されたＰＣＲ産生物のアガロースゲル電気泳動に依る分析は、それぞれ２ １５と３１６ｂｐの二つの主要なバンドを示した。これらのサイズは、ＶＥＧＦ −Ｂ₁₆₇とＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とに対応する二つのｍＲＮＡと一致する。これら二つ のバンドは、同じ強度であり、これは、前記二つのアイソフォームが、調べたす べてのマウスおよびヒト組織中に於いて大体同じレベルで発現されたことを示唆 するものであった。 マウス組織からの増幅産生物の正体を確かめるために、ＰＣＲ−増幅ＤＮＡを 、フィルターにトランスファーし、それぞれエキソン６Ａと６Ｂとに対する特異 的オリゴヌクレオチドプローブでプローブした。オートラジオグラムは、エキソ ン６−特異的プローブは前記３１６ｂｐバンドとハイブリダイズするのに対して 、エキソン６Ｂ特異的プローブは前記２１５ｂｐと３１６ｂｐとの両方の増幅バ ンドとハイブリダイズすることを示した。これらの結果は、二つのＶＥＧＦ−Ｂ のアイソフォームを作り出すためのエキソン６における受容部位の選択的利用と 一致するものであり、従って、すべての増幅産物がＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とＶＥＧＦ −Ｂ₁₈₆アイソフォームの配列から予想されたものと一致した。 ヒト胚心臓および筋から単離された全ＲＮＡのＰＣＲ分析の産生物のアガロー スゲル電気泳動によって３２９ｂｐと４３０ｂｐの二つの主要な増幅バンドが可 視化された。 総合すると、これらのデータは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とが組織 に於ける二つの主要なＶＥＧＦ−Ｂのアイソフォームであることを示している。 ＰＣＲの産生物のパターンと、プライマーの位置とは、もしもＶＥＧＦ−Ｂのよ り長いスプライスアイソフォームが存在するとすれば、そのような転写産物は、 ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の場合よりも、わずかに５‘側に位置するスプライス受容部位 を使用するものであることを示している。更に、ヘパリン結合ドメイン、すなわ ち、ＶＥＧＦ−Ｂのエキソン６に対応する配列を欠如した、ＶＥＧＦ₁₂₁に対応 するＰＣＲ産物は、検 出されなかった。しかしながら、エキソン５をエキソン７にスプライシングする ことによって、ＶＥＧＦ₁₂₁に対応するＶＥＧＦ−Ｂのアイソフォームをコード する転写産物が作り出されるかもしれず、このＶＥＧＦ−Ｂの推定アイソフォー ムは、この例に於いて分析されたもの以外の組織に於いて発現されるかもしれな い。例１８： 細胞増殖の刺激 ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇が内皮細胞増殖を刺激する能力を、ヒト臍帯血管内皮細胞（ ＨＵＶＥＣ）と、ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞への［³Ｈ］チミジン導入の 分析を通じて確認した。 ２９３ＥＢＮＡ細胞に、１μｇ／ｍｌヘパリンの存在下で、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇ 、ＶＥＧＦ₁₆₅にのための発現ベクター、又はエンプティベクター（模擬）を上 述した要領でトランスフェクションした。これらの細胞から調整された培地を、 それぞれの培地中で希釈し、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と、ウシ毛細 血管内皮（ＢＣＥ）細胞とに投与し、［³Ｈ］チミジンの取り込みを測定した。 ポジティブコントロールとして、組換えｂＦＧＦを、ＢＣＥ細胞に添加した。 詳述すると、ヒトＶＥＧＦ−ＢとヒトＶＥＧＦ₁₆₅とを含有する調整された培 地を、ヘパリン（１μｇ／ｍｌ）の存在下で、適当な発現ベクター又は、エンプ ティーベクター（模擬）でトランスフェクションされた２９３ＥＢＮＡ細胞から 、トランスフェクションの４８時間後に収集した。第２パッセージ（ｓｅｃｏｎ ｎｄ ｐａｓｓａｇｅ）ＨＵＶＥＣを、１０％ウシ胎児血清を添加したＭ−１９ ９培地中で、９６−ウェルプレート（４ｘ１０³細胞／ウェル）にプレーティン グし、２４時間インキュベートした。調整された培地を、増殖培地によって希釈 し、細胞を４８時間刺激した。１０μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒ ｓｈａｍ Ｉｎｃ．）を含有する新たな調整された培地を前記細胞に添加し、刺 激を更に４８時間継続した。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、取 り込まれた放射能を、液体シンチレーション計数によって測定した。ＢＣＥ細胞 を、２４−ウェルプレートに接種し、１０％胎児ウシ血清を添加した最小必須培 地（ＭＥＭ）中で集密するまで増殖させた。細胞を、３％の胎児ウシ血清を添加 したＭＥＭ中で７２時間飢餓させ、その後、無血清培地に希釈した調整された培 地を、前記細胞に添加し、これらの細胞を２４時間刺激した。［³Ｈ］チミジン は、刺激期間の最後の４時間にわたって含ませた（１μＣｉ／ｍｌ）。ｂＦＧＦ による刺激を、６ｎｇ／ｍｌの組換えｂＦＧＦ（Ｓｙｎｅｒｇｅｎ Ｉｎｃ．） を使用して、上述したように行った。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＮａＯＨで溶解 し、取り込まれた放射能を、液体シンチレーション計数によって測定した。 図２０は、前記模擬トランスフェクション細胞から調整された培地によって誘 発された基礎活性との比較に於ける、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と、 ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞におけるＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇に依る［³Ｈ］チミジ ン取り込みの誘発の倍率を示す棒グラフである。比較の目的のために、ＶＥＧＦ₁₆₅ とｂＦＧＦとに依る誘発も示されている。棒は並列したサンプルの平均±標 準偏差を示している。いくつかの他の独立した実験に於いても類似の結果が得ら れた。これらのテスト結果は、ＶＥＧＦ−ＢがＨＵＶＥＣとＢＣＥとの両方の細 胞に於いて［³Ｈ］チミジン取り込み明らかにを誘発し、イン・ヴィトロでの内 皮細胞の増殖を刺激したことを示しており、これによって、ＶＥＧＦ−Ｂが内皮 増殖因子であることが示される。例１９： ヒトＶＥＧＦ−ＢプロモーターＤＮＡクローンと活性の同定 バクテリオファージλＥＭＢＬ中のヒトゲノムＤＮＡライブラリーを、ＶＥＧ Ｆ−Ｂ第１および第２エキソンからの配列を含む５‘ＰＣＲフラグメントをプロ ーブとして使用して、スクリーニングした。二つの陽性クローンが得られ、これ らの内の一つを、Ｓａｃ ＩフラグメントとしてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩ Ｉプラスミドにサブクローニングした。１．４ｋｂのフラグメントが得られ、こ れは、ｃＤＮＡ中に存在する ＮｃｏＩ部位（ＡＴＧ翻訳開始部位の１００ｂｐ以内の上流側に位置する）から 上流側に約０．４ｋｂの配列を含んでいた。 更に、他方のλクローンからの約６ｋｂのＸｈｏＩフラグメントを、ｐＧＥＭ ＥＸプラスミドにサブクローニングした。このサブクローンは、ＮｃｏＩ部位か ら上流側に約１．５ｋｂの配列を有していた。ＳａｃＩ／ＮｃｏＩフラグメント とＥｃｏＲＩ（ポリリンカー）−ＮｃｏＩフラグメントを、それぞれの転写方向 で、ｐＧＬ３ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。 これらのサブクローンのＤＮＡと、ＳＶ４０プロモーターを有するｐＧＬ３コン トロールベクターからのＤＮＡを、燐酸カルシウム沈殿法を使用して、ＨｅＬａ 細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後、トランスフ ェクション細胞の溶解物から、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果は、４ ００ｐｂ ＳａｃＩ／ＮｃｏＩフラグメントがｐＧＬ３コントロールベクターの 活性の約３０％に等しいプロモーター活性を有しているのに対して、１．５ｋｂ フラグメントはバックグランド活性を与えるに過ぎないことを示した。より強い 、あるいはより活性度の高いプロモーター、たとえば、ＣＭＶプロモーターや延 長因子１−アルファプロモーター、を使用すれば、恐らく、ヒトの細胞および組 織に於いてより高い活性が得られるであろう。クローニングされたフラグメント の構造を図２４に示す。 前記ＮｃｏＩ部位の上流側の１．５ｋｂフラグメントをシークエンシングした 。その結果得られた配列（配列認識番号１７）を図２５に示す。得られた配列は 、ヌクレオチド１６６−１８７間の２つの８−塩基対部分（図中箱内）から成る 推定サイレンサーエレメント［ワイスマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ）およびシンガー （Ｓｉｎｇｅｒ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ ｏｇｙ，１１：４２２８−２３４（１９９１）］を明らかにした。このサイレン サーが、１．５ｋｂフラグメントの活性の相対的欠如の原因であるのかもしれな い。例２０： ＲＴ−ＰＣＲに依る、メラノーマ、正常皮膚および筋肉中のＶＥＧＦ −ＢｍＲＮＡの分析 正常な皮膚とメラノーマ組織とを、ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒ ａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ Ｕｎ ｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌにかかっている患者から 得た。４つの転移性メラノーマ標本を、外科切除後に新規な状態で得て、すぐに 、Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｅｋ（Ｍｉｌｅｓ）中に埋め込み、液体窒素中で凍結した。 正常皮膚のサンプルは、乳がんの外科手術および皮膚斑点の摘出を受けているボ ランティア患者から得た。すべての標本は、その診断を確認するために病理学者 によって検査された。 全ＲＮＡを、グアニジウム・イソチオアネート法［チョムジンスキー（Ｃｈｏ ｍｃｚｙｎｓｋｉ）他，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（ １９８７）］によって単離した。ｃＤＮＡを、０．２μｇのランダム・ヘキサデ オキシヌクレオチド・プライマーと、５ユニットのマウス逆転写酵素と、テンプ レートとしての５μｇの全ＲＮＡと、ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して合成した。３７℃での１時間のインキュベー ション後、その反応混合物を、−７０℃で保存した。ＰＣＲ増幅のためのネガテ ィブコントロールサンプルを、類似の方法で作成したが、但しここでは逆転写酵 素は添加しなかった。β−アクチンも、それが構成的に高レベルで発現され、そ の発現は、様々な細胞に於いて大きな違いを示さないので、内部標準としてテス トした。 ＰＣＲ増幅のために、次に示すようにプライマー配列を、ＶＥＧＦ−Ｂおよび β−アクチン遺伝子から選択した。 ＶＥＧＦ−Ｂセンス：５‘−ＧＣＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＡＧ−３’ （配列認識番号１９）、 ＶＥＧＦ−Ｂアンチセンス：５‘−ＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＡＧＣ Ｃ−３’（配列認識番号２９）、 β−アクチン センス：５‘−ＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴ−３ ’（配列認識番号３０）、 β−アクチン アンチセンス：５‘−ＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＧＴＡＧＴＴＴＣＧ ＴＧ−３’（配列認識番号３１） ［β−アクチン配列は、ウング（Ｎｇ）他，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５： ２７２０−７３２（１９８５）からのヌクレオチド２１０５−２１２５と２４１ １−２４３２からなる］。前記ｃＤＮＡ反応産物からの４μｌのアリコットを、 ５分間、９４℃で加熱し、ＰＣＲＩ増幅のためのテンプレートとして使用した。 ＰＣＲは、２０ｐｍｏｌのプライマーと、１０ｘＰＣＲ緩衝液と、１μｌの２０ ｍＭ ｄＮＴＰと、２．５ＵのＴａｑ ポリメラーゼと用いて行った。最終容積 を、ＤＥＰＣ処理水によって、１００μｌに調節した。９５℃で１分間の変性と 、６２℃で４５秒間のアニーリングと、７２℃で５０秒間のポリマー化とを、Ｖ ＥＧＦ−Ｂに対しては合計３５サイクル、そしてβ−アクチンに対しては合計２ ５サイクル行った。各５サイクル後に、１５μｌのアリコットを分析のために採 取した。 ５μｌの前記ＰＣＲ反応混合物の電気泳動を、エチジウムブロマイドを含む２ ％アガロースゲル中で行った。サイズマーカーＤＮＡフラグメントの長さは、２ ４から７２６塩基対の範囲であった（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ,ＷＩ,Ｕ ＳＡからの ΦＸ１７４ ＤＮＡ／Ｈｉｎｆ Ｉマーカー）。従って、テストさ れたサンプルは、４つの転移性メラノーマ、筋肉、正常皮膚、ネガティブコント ロール（逆転写酵素無し）そして前記ΦＸ１７４ ＤＮＡ／Ｈｉｎｆ Ｉサイズ ・マーカー、を含んでいた。ＶＥＧＦ−Ｂ（ＰＣＲ産物の長さ：３２３および２ ３４ｂｐ）と、β−アクチンとに対するＲＴ−ＰＣＲ分析の結果は、ＶＥＧＦ− Ｂが、調べられたすべてのメラノーマに於いて、筋肉組織に於ける発現とほぼ同 様のレベルで、高レベルで発現されることを示している。他方、正常皮膚は、非 常にわずかなＶＥＧＦ−Ｂ ＲＮＡしか有していない。ノザン・ブロッティング およびハイブリダイゼーション分析からも類似の結論を導くことがで きる。 上記結果は、ＶＥＧＦ−Ｂが、血管新生、特に筋肉の血管新生に於いて役割を 有する、内皮細胞に対する新規な増殖因子であることを示している。虚血心臓又 は四肢の側枝動脈増殖は、タケシタ（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ）他，Ａｍ．Ｊ．Ｐａ ｔｈｏｌ．，１４７：１６４９−６０（１９９５）に記載された技術を利用して ＶＥＧＦ−Ｂ巨丸剤（ｂｏｌｕｓ）を動脈投与することによって促進させること ができる。ＶＥＧＦ−Ｂの細胞結合は、血管新生と内皮細胞増殖の調節にいくつ かの関係を持っているかもしれない。発育中の胚と、収縮性組織とに於いて、細 胞結合型ＶＥＧＦ−Ｂは、血管樹枝状組織の確立と維持との間に於ける過剰増殖 内皮細胞に対する空間的指示（ｓｐａｔｉａｌ ｃｕｅｓ）を提供するのかもし れない。それは、又、その細胞結合を通じて、成人血管に於ける損傷を受けた内 皮の再生を支持することができるかもしれない。動脈損傷の再内皮化は、アサハ ラ（Ａｓａｈａｒａ）他，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９１（１１）：２７９３− ８０２（１９９５）によって記載された技術を使用してＶＥＧＦ−Ｂを直接的に 適用することによって促進させることができるであろう。ＶＥＧＦ−Ｂが、ヘテ ロダイマーの形成によってＶＥＧＦの分泌を調整することができる能力は、ＶＥ ＧＦシグナリングに於いてＶＥＧＦ−Ｂが間接的な役割を果たし、これによって 、ポトジェンス（Ｐｏｔｇｅｎｓ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（５ ２）：３２８７９−８５（１９９４）に記載されているように、レセプター結合 および／又は活性化を調節すること、を示唆している。これらの増殖因子の複数 のヘテロダイマー複合体の形成は、内皮細胞のための多様な調節シグナルのため の基礎を提供することができるかもしれない。 ＶＥＧＦ−Ｂは、イン・ヴィトロで、内皮細胞の集団に対する増殖因子として 使用可能である。ＶＥＧＦ−Ｂは、望ましい血管新生、すなわち、新たな血管お よび毛細血管の形成を促進するために使用可能である。タケシタ（Ｔａｋｅｓｈ ｉｔａ）他，前述、参照。たとえば、妊娠を開始および／又は維持するための補 助剤として、黄体や、子宮内膜の発達を促進す るのに有用であろう。又、その内皮細胞に対する作用に依り、骨の修復にも有用 であろう。ＶＥＧＦ−Ｂの投与は、又、胚形成、更に、体の成長と血管の発達と 分化とを支持するのにも有用であろう。傷に対してＶＥＧＦ−Ｂを局所的に適用 することは、傷の治癒を促進するのに有用であろうし、ＶＥＧＦ−Ｂを経口投与 することは、胃および／又は十二指腸潰瘍の治癒を促進するのに有用であろう。 ＶＥＧＦ−Ｂの、ヘテロダイマーの形成によってＶＥＧＦの分泌を調節する能力 は、ＶＥＧＦアゴニストが有用であるような疾病に於いて、ＶＥＧＦ−Ｂの治療 的な役割を提供する可能性がある。前述のポトジェンス（Ｐｏｔｇｅｎｓ）他， 参照。 ＶＥＧＦ−Ｂは、中胚葉細胞に対して、直接的、又は、血液供給に於ける改善 を通じて、増殖効果を提供することができる。 ＶＥＧＦ−Ｂは、メラノーマ等の腫瘍に於いて過剰に発現されることが判って いる。従って、ＶＥＧＦ−Ｂの発現のアッセイは、腫瘍の診断に於ける手段とし て使用することができ、たとえば、モノクローナル抗体を使用した、ＶＥＧＦ− Ｂ発現の抑制は、腫瘍の成長を遅延させるために有用であろう。 ＶＥＧＦ−Ｂの腫瘍アッセイは、転移リスクのインジケーターとして有用であ ろう。たとえば、新血管新生と増殖とを定量化するための、タカハシ（Ｔａｋａ ｈａｓｈｉ）他，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：３９６４−６８（１９９５） によって記載されている手順に類似するＶＥＧＦ−Ｂ抗体の使用は、大腸癌から の転移リスクのインジケータとして使用できるであろう。組織化学による体液又 は腫瘍自体におけるＶＥＧＦ−Ｂのアッセイは腫瘍予知因子として有用であろう 。コンドウ（Ｋｏｎｄｏ）他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉ ｃａ Ａｃｔａ，１２２１（２）：２１１−１４（１９９４）によって記載され ている手法に類似のＥＬＩＳＡは、腫瘍スクリーニングとしてＶＥＧＦ−Ｂアッ プレギュレーションを検出するのに有用であろう。ブーコック（Ｂｏｏｃｏｃｋ ）他，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８７：５０６−１６（１９９ ５）によって記 載されている技術を使用した、ＶＥＧＦ−Ｂ発現の固相酵素免疫検定法は、卵巣 がんの診断指標として有用であろう。ウェインデル（Ｗｅｉｎｄｅｌ）他，Ｎｅ ｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，３５：４３９−４８（１９９４）によって記載されてい るＶＥＧＦアッセイに類似のＶＥＧＦ−Ｂ発現のアッセイは、脳腫瘍における悪 性腫瘍のインジケーターとして有用であろう。 更に、腫瘍の成長には、血管新生が必要であることから、ＶＥＧＦ−Ｂの投与 は、抗腫瘍形成剤をテストするために、実験動物に於いて腫瘍の成長を促進する のにも有用であろう。ＶＥＧＦ−Ｂは、又、腫瘍の低酸素症領域の微小血管質を 増加させ、それらを放射線、放射線増感剤等に対してより敏感にさせるのに有用 であろう。 ＶＥＧＦ−Ｂの血管新生作用は、虚血状態を治療するのに有用であろう。ボー タース（Ｂａｕｔｅｒｓ）他，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈ ｙｓｉｏｌｏｇｙ，２６７（４ Ｐｔ２）：Ｈ１２６３−７／（１９９４）に記 載されている技術によって、ＶＥＧＦ−Ｂの動脈内巨丸剤（ｂｏｌｕｓ）を投与 することは、下肢虚血の治療と、四肢に於ける潅流を増加させるのに有用であろ う。メスリ（Ｍｅｓｒｉ）他，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７ ６：１６１−６７（１９９５）によって記載されている手順を使用して、組織虚 血（たとえば、心筋虚血）を治療するために、ＶＥＧＦ−Ｂを発現するウィルス を形質導入した繊維芽細胞を注射した組織中で、血管新生反応を作り出すことが できるであろう。ＶＥＧＦ−Ｂ又はアゴニストは、たとえば、心筋梗塞、虚血四 肢、深静脈血栓症、および／又は分娩後の血管障害等の、動脈および／又は静脈 閉塞に於ける側枝循環の発達を刺激するために利用できるであろう。前出のタケ シタ（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ）他を参照。 ＶＥＧＦ−Ｂ／ＶＥＧＦ−Ｂレセプターシステムは、新しい薬品としての、開 発のために、アゴニスト／アンタゴニストとして小さな分子を検出するためのア ッセイシステムとして使用可能である。検出可能な小分子の具体例としては、こ れらに限定されるものではないが、有機化学薬品、ペプチド、およびＲＮＡ分子 がある。 薬剤的有効量のＶＥＧＦ−Ｂたん白質を、水、ミネラルオイル、ポリエチレン グリコール、スターチ、タルカム、ラクトース、増粘剤（ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ） 、安定剤、懸濁剤、等の単数又は複数の適当なキャリア又はアジュバントと混合 することによって、医薬組成物を作ることができる。このような組成物は、溶液 、懸濁液、錠剤、カプセル、クリーム、膏薬、軟膏、その他の従来形状の形態と することができる。 例７に示したように、ＶＥＧＦ−Ｂたん白質は、抗体を生産するのにも使用す ることができる。一般に、従来式抗体生産技術を使用して、ＶＥＧＦ−Ｂ抗体を 生産することができる。たとえば、特異的モノクローナル抗体を、組換えＤＮＡ 発現によって得られた融合たん白質の免疫化を通じて生産することができる。 標識化モノクローナル抗体は、特に、体内での異常なレベルのＶＥＧＦ−Ｂに 関連する状態をスクリーニングするのに有用であろう。たとえば、ファヴァ（Ｆ ａｖａ）他，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉ ｎｅ，１８０：３４１−４６（１９９４）によって記載されている手法に類似の 免疫蛍光測定技術による滑液および／又は関節組織のＶＥＧＦ−Ｂのアッセイは 、慢性関節リウマチの診断インジケーターとして有用であろう。アイロ（Ａｉｅ ｌｌｏ）他，ｉｎ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉ ｃｉｎｅ，３３１（２２）：１４８０−８７（１９９４）によって記載されてい る技術を使用した眼液（ｏｃｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）におけるＶＥＧＦ−Ｂの 放射線免疫検定法は、糖尿病性網膜症、虹彩又は網膜血管閉塞の新血管新生の診 断インジケーターとして有用であろう。血液、尿、又はその他の体液中のＶＥＧ Ｆ−Ｂレベルのイムノアッセイは、腫瘍マーカーとしても有用であろう。前出の コンドウ（Ｋｏｎｄｏ）他，参照。ＶＥＧＦ−Ｂに対するこれらのモノクローナ ル抗体は、又、体内での高いレベルのＶＥＧＦ−Ｂに関連する血管新生の阻害に おいて有用であり、たとえば、哺乳類に於ける急速に増殖する血管新生依存性腫 瘍においては、この血管新生阻害によって、そのような腫瘍の成長を遅延させる ことがで きるであろう。キム（Ｋｉｍ）他，ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ，３６２（６２４３）： ８４１−４４（１９９３）によって記載されているものに類似の技術を使用した 、ＶＥＧＦ−Ｂに対して特異的なモノクローナル抗体による治療は、イン・ヴィ ヴォでの腫瘍の成長を阻害又は抑制するために有用であろう。アサノ（Ａｓａｎ ｏ）他，ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５：５２９６−５３０１（ １９９５）に記載されているような手順を使用した、ＶＥＧＦ−Ｂに対するモノ クローナル抗体の静脈および／又は皮下注射は、新血管新生と、固形腫瘍の一次 および転移成長とを阻害するのに有用であろう。ヒトの治療のためには、そのよ うなモノクローナル抗体のｃｈｉａｓｅｒｉｚａｔｉｏｎ又はｈｕｍａｎｉｚａ ｔｉｏｎが好ましい。治療は、例えば１０ないし５００μｇ０、好ましくは、５ ０−１００μｇのモノクローナル抗体を、週二回、腹膜内注射することによって 行うことができる。 抗体等のＶＥＧＦ−Ｂアンタゴニストは、又、糖尿病性網膜症、乾癬関節症お よび／又は血管腫等の血管腫瘍における新しい血管を阻害するのにも有用であろ う。アイロ（Ａｉｅｌｌｏ）他，前出、参照。 以上の記載および例は、単に本発明を説明するために記載されたものであって 、限定することを意図したものではない。当業者に於いては、本発明の精神およ び内容を具体化している開示した実施例の改変がありうるであろうから、本発明 は、付随のクレームとその均等物の範囲内に於けるすべてを含むものであると理 解されるべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年９月１６日 【補正内容】請求の範囲： １． 特徴的なアミノ酸配列 Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ− Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ （配列認識番号１６） を有し、内皮細胞又は中胚葉細胞の増殖を促進する特性を有するたん白質をコー ドする単離核酸であって、 前記核酸は、図１および２のＤＮＡ（配列認識番号１）と、図３のＤＮＡ（配列 認識番号４）と、図５のＤＮＡ（配列認識番号６）と、図７のＤＮＡ（配列認識 番号８）と、図１０のＤＮＡ（配列認識番号１０）と、図１２のＤＮＡ（配列認 識番号１２）と、図１４のＤＮＡ（配列認識番号１４）と、前記ＤＮＡ配列の少 なくとも一つとストリンジェントな条件下でハイブリダズする核酸とから成るグ ループから選択される単離核酸。 ２． 前記核酸はｃＤＮＡである請求項１の核酸。 ３． 図１および２のＤＮＡ（配列認識番号１）に対応するｃＤＮＡを有する請 求項１の核酸。 ４． 核酸配列が哺乳類ＤＮＡである請求項１の核酸。 ５． 前記核酸はマウスＤＮＡである請求項４の核酸。 ６． 前記核酸はヒトＤＮＡである請求項４の核酸。 ７． 前記核酸は血管内皮細胞の増殖を促進するたん白質をコードする請求項１ の核酸。 ８． 図３のＤＮＡ（配列認識番号４）に対応するｃＤＮＡを有する請求 項１の核酸。 ９． 図５のＤＮＡ（配列認識番号６）に対応するｃＤＮＡを有する請求項１の 核酸。 １０．図７のＤＮＡ（配列認識番号８）に対応するｃＤＮＡを有する請求項１の 核酸。 １１．図１０のＤＮＡ（配列認識番号１０）に対応するｃＤＮＡを有する請求項 １の核酸。 １２．図１２のＤＮＡ（配列認識番号１２）に対応するｃＤＮＡを有する請求項 １の核酸。 １３．図１４のＤＮＡ（配列認識番号１４）に対応するｃＤＮＡを有する請求項 １の核酸。 １４．プロモーター配列と操作可能にリンクされた請求項１の核酸を有するベク ター。 １５．前記ベクターは真核ベクターである請求項１４のベクター。 １６．前記ベクターは原核ベクターである請求項１４のベクター。 １７．前記ベクターはプラスミドである請求項１４のベクター。 １８．特徴的な配列 Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ− Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（配列認識番号１６） を示し、内皮細胞又は中胚葉細胞の増殖を促進する特性を有する単離たん白質で あって、前記たん白質は、図１のアミノ酸配列（配列認識番号２）と、図２のア ミノ酸配列（配列認識番号３）と、図４のアミノ酸配列（配列認識番号５）と、 図６のアミノ酸配列（配列認識番号７）と、図８のアミノ酸配列（配列認識番号 ９）と、図１１のアミノ酸配列（配列認識番号１１）と、図１３のアミノ酸配列 （配列認識番号１３）と、図１５のアミノ酸配列（配列認識番号１５）とから成 るグループから選択されるアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を有す る単離たん白質。 １９．前記たん白質は、図１のアミノ酸配列（配列認識番号２）に対応するアミ ノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２０．前記たん白質は、図２のアミノ酸配列（配列認識番号３）に対応するアミ ノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２１．前記たん白質は、図４のアミノ酸配列（配列認識番号５）に対応するアミ ノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２２．前記たん白質は、図６のアミノ酸配列（配列認識番号７）に対応するアミ ノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２３．前記たん白質は、図８のアミノ酸配列（配列認識番号９）に対応するアミ ノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２４．前記たん白質は、図１１のアミノ酸配列（配列認識番号１１）に対応する アミノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２５．前記たん白質は、図１３のアミノ酸配列（配列認識番号１３）に対応する アミノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２６．前記たん白質は、図１５のアミノ酸配列（配列認識番号１５）に対応する アミノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２７．前記たん白質は哺乳類たん白質である請求項１８の単離たん白質。 ２８．前記たん白質はマウスたん白質である請求項２７の単離たん白質。 ２９．前記たん白質はヒトたん白質である請求項２７の単離たん白質。 ３０．前記たん白質は血管内皮細胞の増殖を促進する請求項１８の単離たん白質 。 ３１．図１および２のＤＮＡ（配列認識番号１）と、図３のＤＮＡ（配列認識番 号４）と、図５のＤＮＡ（配列認識番号６）と、図７のＤＮＡ（配列認識番号８ ）と、図１０のＤＮＡ（配列認識番号１０）と、図１２のＤＮＡ（配列認識番号 １２）と、図１４のＤＮＡ（配列認識番号１４）と、前記ＤＮＡ配列の少なくと も一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとから成るグル ープから選択されるＤＮＡの発現によって作り出される単離たん白質。 ３２．内皮細胞又は中胚葉細胞の増殖を促進するのに有効な量の請求項１８のた ん白質と、少なくとも一つの従来式製薬用キャリア又は希釈剤とを有する医薬組 成物。 ３３．請求項１８のたん白質と反応する抗体。 ３４．前記抗体はモノクローナル抗体である請求項３３の抗体。 ３５．請求項１４のベクターによってトランスフォーメーション又はトランスフ ェクションされて、内皮細胞又は中胚葉細胞の増殖を促進する特徴を有するたん 白質を発現する宿主細胞。 ３６．前記宿主細胞は真核細胞である請求項３５のトランスフェクションされた 宿主細胞。 ３７．前記宿主細胞はＣＯＳ細胞である請求項３５のトランスフェクションされ た宿主細胞。 ３８．前記宿主細胞は原核細胞である請求項３５のトランスフェクションされた 宿主細胞。 ３９．前記宿主細胞は２９３ＥＢＮＡ細胞である請求項３５のトランスフェクシ ョンされた宿主細胞。 ４０．前記宿主細胞は昆虫細胞である請求項３５のトランスフェクションされた 宿主細胞。 ４１．サンプル中のＶＥＧＦ−Ｂの量を検出するために、ＶＥＧＦ−Ｂと反応す る請求項３３の抗体を有する、テストサンプル中のＶＥＧＦ−Ｂを定量的に検出 するための診断手段。 ４２．前記抗体は標識化抗体である請求項４１の診断手段。 ４３．テストＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子と請求項１の核酸配列との配列比較を容易にす るために、ポリメラーゼ連鎖反応によってテストＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子を増幅する ために、請求項１の核酸配列に対して相補的な少なくとも一対のプライマーを有 する、テストサンプル中のＶＥＧＦ−Ｂを検出するた めの診断手段。 ４４．有効ＶＥＧＦ−Ｂ結合量の請求項３３の抗体と、少なくとも一つの薬学的 に許容可能なキャリア又はアジュバントと、を有する医薬組成物。 ４５．内皮細胞又は中胚葉細胞の増殖を促進するのに有効な量の請求項１８のた ん白質と、ＶＥＧＦとを有する医薬組成物。 ４６．更に、細胞増殖促進量の前記たん白質が、細胞と結合しない状態で存在す ることを確実にするのに有効な量のヘパリンを有する請求項４５の医薬組成物。 ４７．更に、細胞増殖促進量の前記たん白質が、細胞と結合しない状態で存在す ることを確実にするのに有効な量のヘパリンを有する請求項３２の医薬組成物。 ４８．血管新生の刺激に有効な量の請求項１８のたん白質と、ヘパリンとを有す る医薬組成物。 ４９．請求項１８のたん白質を有する単離たん白質ダイマー。 ５０．前記たん白質ダイマーは前記たん白質のホモダイマーである請求項４９の 単離たん白質ダイマー。 ５１．前記たん白質ダイマーは前記たん白質とＶＥＧＦとのヘテロダイマーであ る請求項４９の単離たん白質ダイマー。 ５２．前記たん白質ダイマーはジスルフィド−結合ダイマーである請求項４９の 単離たん白質ダイマー。 ５３．請求項１８のたん白質と、ＶＥＧＦから成るグループから選択される少な くとも一つのたん白質を、その少なくとも１つのたん白質を発現する細胞から放 出させるのを促進する方法であって、前記細胞をヘパリンに対して露出する工程 を有する方法。 ５４．請求項１の核酸配列の少なくとも一部に対して相補的なアンチセンスヌク レオチド配列を有するベクター。 ５５．ＶＥＧＦ−Ｂを発現する細胞からのＶＥＧＦ−Ｂの発現を遅延させる方法 であって、前記細胞に請求項５４のベクターをトランスフェクションする工程を 有する方法。 ５６．前記細胞は腫瘍細胞である請求項５５の方法。 ５７．図２５の配列（配列認識番号１７）に対応するヌクレオチド配列、又は、 前記核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を有する単 離核酸。 ５８．ＶＥＧＦ−Ｂたん白質を発現するべく、適当なプロモーターに操作可能に リンクされた、請求項１の核酸配列を有するベクターでトランスフォーメーショ ン又はトランスフェクションされた宿主細胞。 ５９．前記ＶＥＧＦ−Ｂたん白質は、図１のアミノ酸配列（配列認識番号２）と 、図２のアミノ酸配列（配列認識番号３）と、図４のアミノ酸配列（配列認識番 号５）と、図６のアミノ酸配列（配列認識番号７）と、図８のアミノ酸配列（配 列認識番号９）と、図１１のアミノ酸配列（配列認識番号１１）と、図１３のア ミノ酸配列（配列認識番号１３）と、図１５のアミノ酸配列（配列認識番号１５ ）とから成るグループから選択されるア ミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列からなる請求項５８の宿主細胞。 ６０．請求項１の核酸配列に対して相補的な少なくとも一対のプライマーを有す るテストサンプル中のＶＥＧＦ−Ｂを検出するための診断手段。 ６１．請求項１８のたん白質とＶＥＧＦから成るグループから選択される少なく とも１つのたん白質を、前記少なくとも一つのたん白質を発現する細胞から得る ための方法であって、前記細胞をヘパリンに対して露出して、前記少なくとも１ つのたん白質の放出を誘発させる工程と、放出されたたん白質を収集する工程、 とを有する方法。 ６２．請求項１のヌクレオチド配列を、適当なプロモーターと操作可能にリンク された関係で、ベクターに導入する工程を有するＶＥＧＦ−Ｂたん白質の発現に 適したベクターを作る方法。 ６３．前記単離核酸分子は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ ｐＨ７．０又は ５ｘＳＳＰＥ緩衝液、１％ないし２％のＳＤＳ、５ないし１０ｘデンハルト溶液 、そして、１００μｇ／ｍｌの鮭精子ＤＮＡ中に於いて、４２℃で、マウスＶＥ ＧＦ−Ｂをコードする核酸分子とハイブリダイズするヒトＶＥＧＦ−Ｂ分子をコ ードする単離核酸分子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/02 33/566 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ０８／５６９，０６３ (32)優先日 1995年12月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，Ｆ Ｉ，ＪＰ，ＮＯ，ＮＺ (72)発明者 オロフソン，ビルギッタ スウェーデン国 エス−117 26 ストッ クホルム クリング ホルンスガタン 106 ３ ティアール (72)発明者 アリターロ，カリ フィンランド国 エフアイエヌ−02100 エスポー ニーリキンティエ ４ エイ (72)発明者 パジュソラ，カトリ フィンランド国 エフアイエヌ−00900 ヘルシンキ カステホルマンティエ ４ エイ ８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 特徴的なアミノ酸配列 Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ− Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（配列認識番号１６） を有し、内皮細胞又は中胚葉細胞の増殖を促進する特性を有するたん白質をコー ドする単離核酸であって、 前記核酸は、図１および２のＤＮＡ（配列認識番号１）と、図３のＤＮＡ（配列 認識番号４）と、図５のＤＮＡ（配列認識番号６）と、図７のＤＮＡ（配列認識 番号８）と、図１０のＤＮＡ（配列認識番号１０）と、図１２のＤＮＡ（配列認 識番号１２）と、図１４のＤＮＡ（配列認識番号１４）と、前記ＤＮＡ配列の少 なくとも一つとストリンジェントな条件下でハイブリダズする核酸とから成るグ ループから選択される単離核酸。 ２． 前記核酸はｃＤＮＡである請求項１の核酸。 ３． 図１および２のＤＮＡ（配列認識番号１）に対応するｃＤＮＡを有する請 求項１の核酸。 ４． 核酸配列が哺乳類ＤＮＡである請求項１の核酸。 ５． 前記核酸はマウスＤＮＡである請求項４の核酸。 ６． 前記核酸はヒトＤＮＡである請求項４の核酸。 ７． 前記核酸は血管内皮細胞の増殖を促進するたん白質をコードする請求項１ の核酸。 ８． 図３のＤＮＡ（配列認識番号４）に対応するｃＤＮＡを有する請求 項１の核酸。 ９． 図５のＤＮＡ（配列認識番号６）に対応するｃＤＮＡを有する請求項１の 核酸。 １０．図７のＤＮＡ（配列認識番号８）に対応するｃＤＮＡを有する請求項１の 核酸。 １１．図１０のＤＮＡ（配列認識番号１０）に対応するｃＤＮＡを有する請求項 １の核酸。 １２．図１２のＤＮＡ（配列認識番号１２）に対応するｃＤＮＡを有する請求項 １の核酸。 １３．図１４のＤＮＡ（配列認識番号１４）に対応するｃＤＮＡを有する請求項 １の核酸。 １４．プロモーター配列と操作可能にリンクされた請求項１の核酸を有するベク ター。 １５．前記ベクターは真核ベクターである請求項１４のベクター。 １６．前記ベクターは原核ベクターである請求項１４のベクター。 １７．前記ベクターはプラスミドである請求項１４のベクター。 １８．特徴的な配列 Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ− Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（配列認識番号１６） を示し、内皮細胞又は中胚葉細胞の増殖を促進する特性を有する単離たん白質で あって、前記たん白質は、図１のアミノ酸配列（配列認識番号２）と、図２のア ミノ酸配列（配列認識番号３）と、図４のアミノ酸配列（配列認識番号５）と、 図６のアミノ酸配列（配列認識番号７）と、図８のアミノ酸配列（配列認識番号 ９）と、図１１のアミノ酸配列（配列認識番号１１）と、図１３のアミノ酸配列 （配列認識番号１３）と、図１５のアミノ酸配列（配列認識番号１５）とから成 るグループから選択されるアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を有す る単離たん白質。 １９．前記たん白質は、図１のアミノ酸配列（配列認識番号２）に対応するアミ ノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２０．前記たん白質は、図２のアミノ酸配列（配列認識番号３）に対応するアミ ノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２１．前記たん白質は、図４のアミノ酸配列（配列認識番号５）に対応するアミ ノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２２．前記たん白質は、図６のアミノ酸配列（配列認識番号７）に対応するアミ ノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２３．前記たん白質は、図８のアミノ酸配列（配列認識番号９）に対応するアミ ノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２４．前記たん白質は、図１１のアミノ酸配列（配列認識番号１１）に対応する アミノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２５．前記たん白質は、図１３のアミノ酸配列（配列認識番号１３）に対応する アミノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２６．前記たん白質は、図１５のアミノ酸配列（配列認識番号１５）に対応する アミノ酸配列を有する請求項１８の単離たん白質。 ２７．前記たん白質は哺乳類たん白質である請求項１８の単離たん白質。 ２８．前記たん白質はマウスたん白質である請求項２７の単離たん白質。 ２９．前記たん白質はヒトたん白質である請求項２７の単離たん白質。 ３０．前記たん白質は血管内皮細胞の増殖を促進する請求項１８の単離たん白質 。 ３１．図１および２のＤＮＡ（配列認識番号１）と、図３のＤＮＡ（配列認識番 号４）と、図５のＤＮＡ（配列認識番号６）と、図７のＤＮＡ（配列認識番号８ ）と、図１０のＤＮＡ（配列認識番号１０）と、図１２のＤＮＡ（配列認識番号 １２）と、図１４のＤＮＡ（配列認識番号１４）と、前記ＤＮＡ配列の少なくと も一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとから成るグル ープから選択されるＤＮＡの発現によって作り出される単離たん白質。 ３２．内皮細胞又は中胚葉細胞の増殖を促進するのに有効な量の請求項１８のた ん白質と、少なくとも一つの従来式製薬用キャリア又は希釈剤とを有する医薬組 成物。 ３３．請求項１８のたん白質と反応する抗体。 ３４．前記抗体はモノクローナル抗体である請求項３３の抗体。 ３５．請求項１４のベクターによってトランスフォーメーション又はトランスフ ェクションされて、内皮細胞又は中胚葉細胞の増殖を促進する特徴を有するたん 白質を発現する宿主細胞。 ３６．前記宿主細胞は真核細胞である請求項３５のトランスフェクションされた 宿主細胞。 ３７．前記宿主細胞はＣＯＳ細胞である請求項３５のトランスフェクションされ た宿主細胞。 ３８．前記宿主細胞は原核細胞である請求項３５のトランスフェクションされた 宿主細胞。 ３９．前記宿主細胞は２９３ＥＢＮＡ細胞である請求項３５のトランスフェクシ ョンされた宿主細胞。 ４０．前記宿主細胞は昆虫細胞である請求項３５のトランスフェクションされた 宿主細胞。 ４１．サンプル中のＶＥＧＦ−Ｂの量を検出するために、ＶＥＧＦ−Ｂと反応す る請求項３３の抗体を有する、テストサンプル中のＶＥＧＦ−Ｂを定量的に検出 するための診断手段。 ４２．前記抗体は標識化抗体である請求項４１の診断手段。 ４３．テストＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子と請求項１の核酸配列との配列比較を容易にす るために、ポリメラーゼ連鎖反応によってテストＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子を増幅する ために、請求項１の核酸配列に対して相補的な少なくとも一対のプライマーを有 する、テストサンプル中のＶＥＧＦ−Ｂを検出するた めの診断手段。 ４４．有効ＶＥＧＦ−Ｂ結合量の請求項３３の抗体と、少なくとも一つの薬学的 に許容可能なキャリア又はアジュバントと、を有する医薬組成物。 ４５．内皮細胞又は中胚葉細胞の増殖を促進するのに有効な量の請求項１８のた ん白質と、ＶＥＧＦとを有する医薬組成物。 ４６．更に、細胞増殖促進量の前記たん白質が、細胞と結合しない状態で存在す ることを確実にするのに有効な量のヘパリンを有する請求項４５の医薬組成物。 ４７．更に、細胞増殖促進量の前記たん白質が、細胞と結合しない状態で存在す ることを確実にするのに有効な量のヘパリンを有する請求項３２の医薬組成物。 ４８．血管新生の刺激に有効な量の請求項１８のたん白質と、ヘパリンとを有す る医薬組成物。 ４９．請求項１８のたん白質を有する単離たん白質ダイマー。 ５０．前記たん白質ダイマーは前記たん白質のホモダイマーである請求項４９の 単離たん白質ダイマー。 ５１．前記たん白質ダイマーは前記たん白質とＶＥＧＦとのヘテロダイマーであ る請求項４９の単離たん白質ダイマー。 ５２．前記たん白質ダイマーはジスルフィド−結合ダイマーである請求項４９の 単離たん白質ダイマー。 ５３．請求項１８のたん白質と、 ＶＥＧＦから成るグループから選択される少 なくとも一つのたん白質を、その少なくとも１つのたん白質を発現する細胞から 放出させるのを促進する方法であって、前記細胞をヘパリンに対して露出する工 程を有する方法。 ５４．請求項１の核酸配列の少なくとも一部に対して相補的なアンチセンスヌク レオチド配列を有するベクター。 ５５．ＶＥＧＦ−Ｂを発現する細胞からのＶＥＧＦ−Ｂの発現を遅延させる方法 であって、前記細胞に請求項５４のベクターをトランスフェクションする工程を 有する方法。 ５６．前記細胞は腫瘍細胞である請求項５５の方法。 ５７．図２５の配列（配列認識番号１７）に対応するヌクレオチド配列、又は、 前記核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を有する単 離核酸。 ５８．ＶＥＧＦ−Ｂたん白質を発現するべく、適当なプロモーターに操作可能に リンクされた、請求項１の核酸配列を有するベクターでトランスフォーメーショ ン又はトランスフェクションされた宿主細胞。 ５９．前記ＶＥＧＦ−Ｂたん白質は、図１のアミノ酸配列（配列認識番号２）と 、図２のアミノ酸配列（配列認識番号３）と、図４のアミノ酸配列（配列認識番 号５）と、図６のアミノ酸配列（配列認識番号７）と、図８のアミノ酸配列（配 列認識番号９）と、図１１のアミノ酸配列（配列認識番号１１）と、図１３のア ミノ酸配列（配列認識番号１３）と、図１５のアミノ酸配列（配列認識番号１５ ）とから成るグループから選択されるア ミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列からなる請求項５８の宿主細胞。 ６０．請求項１の核酸配列に対して相補的な少なくとも一対のプライマーを有す るテストサンプル中のＶＥＧＦ−Ｂを検出するための診断手段。 ６１．請求項１８のたん白質とＶＥＧＦから成るグループから選択される少なく とも１つのたん白質を、前記少なくとも一つのたん白質を発現する細胞から得る ための方法であって、前記細胞をヘパリンに対して露出して、前記少なくとも１ つのたん白質の放出を誘発させる工程と、放出されたたん白質を収集する工程、 とを有する方法。 ６２．請求項１のヌクレオチド配列を、適当なプロモーターと操作可能にリンク された関係で、ベクターに導入する工程を有するＶＥＧＦ−Ｂたん白質の発現に 適したベクターを作る方法。 ６３．前記単離核酸分子は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ ｐＨ７．０又は ５ｘＳＳＰＥ緩衝液、１％ないし２％のＳＤＳ、５ないし１０ｘデンハルト溶液 、そして、１００μｇ／ｍｌの鮭精子ＤＮＡ中に於いて、４２℃で、マウスＶＥ ＧＦ−Ｂをコードする核酸分子とハイブリダイズするヒトＶＥＧＦ−Ｂ分子をコ ードする単離核酸分子。