ES2206558T3 - Nuevo factor de crecimiento y secuencia genetica que lo codifica. - Google Patents
Nuevo factor de crecimiento y secuencia genetica que lo codifica.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA EN GENERAL DE UNA MOLECULA AISLADA QUE POSEE UNAS PROPIEDADES PARECIDAS AL FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL, Y DE UNA SECUENCIA GENETICA QUE LA CODIFICA. LA MOLECULA RESULTARA UTIL EN EL DESARROLLO DE UNA SERIE DE PRODUCTOS TERAPEUTICOS Y DE DIAGNOSTICO UTILES EN EL TRATAMIENTO, PROFILAXIS Y/O DIAGNOSTICO DE TRASTORNOS QUE REQUIEREN UNA PERMEABILIDAD DE LA VASCULATURA Y/O VASCULAR AUMENTADA O DISMINUIDA. LA MOLECULA DE LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN ES UN EFECTOR UTIL DE NEURONAS PRINCIPALES Y NERVIOSAS Y ES CAPAZ DE INDUCIR LA PROLIFERACION ASTROGLIAL.
Description
Nuevo factor de crecimiento y secuencia genética
que lo codifica.
La presente invención se refiere en general a una
molécula aislada con propiedades similares a las de un factor de
crecimiento endotelial vascular y a la secuencia genética que lo
codifica. La molécula será de utilidad para el desarrollo de una
variedad de terapias y diagnósticos útiles para el tratamiento,
profilaxis y/o diagnóstico de enfermedades que necesitan una
vascularización incrementada o disminuida y/o permeabilidad
vascular. La molécula de la presente invención también es un efecto
útil de las neuronas primarias y centrales y tiene la capacidad
para inducir la proliferación astroglial.
Los detalles bibliográficos de las publicaciones
a las que se refiere el autor de la presente solicitud se recogen
al final de la descripción. Los Números de Identidad de las
Secuencias (SEC ID n^{os}) de las secuencias de nucleótidos y
aminoácidos a los que se refiere la solicitud se definen a
continuación de la bibliografía.
A lo largo de la presente solicitud, a menos que
de otra forma lo requiera el contexto, la palabra
"comprender", o las variaciones tales como "comprende" o
"comprendiendo", se entiende que implican la inclusión de un
elemento mencionado o entero o un grupo de elementos o enteros,
pero no la exclusión de cualquier otro elemento o entero o grupo
de elementos o enteros.
El factor de crecimiento vascular endotelial
(referido en lo sucesivo en la presente solicitud "VEGF"),
también conocido como factor de permeabilidad vasoactivo, es una
glicoproteína homodimérica covalentemente enlazada que activa al
tejido endotelial específicamente (Senger et al., 1993). Se
ha atribuido una multiplicidad de funciones al VEGF tales como su
implicación e la angiogénesis normal incluyendo la formación del
corpus luteum (Yang et al., 1993) y el desarrollo de
la placenta (Sharkey et al., 1993), la regulación de la
permeabilidad vascular (Senger et al., 1993), la
angiogénesis inflamatoria (Sunderkotter et al., 1994) y el
autotransplante (Dissen et al., 1994) y enfermedades humanas
tales como la promoción de la angiogénesis tumoral (Folkman &
Shing, 1992), la artritis reumatoide (Kock et al., 1994) y
la retinopatía relacionada con la diabetes (Folkman & Shing,
1992).
El VEGF es, por consiguiente, una molécula
importante que la convierte en una diana potencialmente valiosa en
la investigación de agentes terapéuticos, profilácticos y
diagnósticos basados en el VEGF o sus actividades. También es
necesaria la identificación de moléculas homólogas o relacionadas
para la utilización como alternativas al VEGF o a la vez que el
VEGF.
En el trabajo que condujo a la presente
invención, los inventores buscaron el gen I de susceptibilidad a la
neoplasia endocrina múltiple (MENI). Sorprendentemente, los
inventores descubrieron que una secuencia genética excluida como
candidata para el gen MENI fue sin embargo un nuevo factor de
crecimiento con cierta similitud a VEGF. Además, el factor de
crecimiento de la presente invención es una molécula efectora para
las neuronas primarias y centrales.
En consecuencia, un aspecto de la presente
invención proporciona un polipéptido aislado que exhibe por lo
menos una de las siguientes propiedades:
- (i)
- capacidad para inducir la proliferación de las células endoteliales vasculares;
- (ii)
- capacidad para interactuar con la familia de receptores flt-1/flk-1; y/o
- (iii)
- capacidad para inducir la migración celular, la supervivencia celular y/o el incremento de los niveles intracelulares de fosfatasa alcalina;
en la que dicho péptido comprende:
- (a)
- una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos tal como se da a conocer en SEC ID NO:3 o la secuencia de nucleótidos que híbrida sobre la longitud total de SEC ID NO:3 o su forma complementaria bajo condiciones de elevada estringencia de 0,1-1 x SSC/0,1% peso/peso SDS a 60ºC durante 1 a 3 horas; o
- (b)
- una secuencia de aminoácidos tal como se da a conocer en SEC ID NO:4 o una forma truncada de dicho polipéptido que muestre por lo menos una de las propiedades (i)-(iii).
"Biológicamente aislada" significa que la
molécula ha sufrido por lo menos una etapa de purificación a partir
de una fuente biológica. Preferiblemente, la molécula también es
biológicamente pura lo que significa que una composición
comprendiendo por lo menos aproximadamente 20%, más preferiblemente
por lo menos aproximadamente 40%, todavía más preferiblemente por
lo menos aproximadamente 65%, incluso todavía más preferiblemente
por lo menos aproximadamente 80-90% o más de la
molécula determinada en peso, actividad u otras formas
convenientes, relativas a otros compuestos en la composición. Más
preferiblemente, la molécula es secuenciablemente pura.
Otro aspecto preferido de la presente invención
proporciona la molécula en forma recombinante.
La presente invención también contempla clones
genómicos o clones genómicos parciales codificantes de una
molécula proteica de la presente invención.
La secuencia de aminoácidos dada a conocer en SEC
ID NO:2 corresponde al VEGF humano (referida en la presente
invención como "VEGF_{165}"). En consecuencia, la molécula
de la presente invención es similar a VEGF o es homóloga a VEGF pero
comprende una secuencia de aminoácidos que es similar pero no
idéntica a la secuencia de aminoácidos de VEGF. Aunque la presente
invención está ejemplificada utilizando una molécula human similar
a VEGF, ello se hace bajo el entendimiento de que presente
invención contempla las moléculas homólogas y secuencias
codificantes de los mamíferos tales como el ganado (p.ej. ovejas,
cerdos, caballos y bacas) animales de compañía (p.ej. perros y
gatos) y animales de laboratorio para ensayos (p.ej. ratones,
ratas, conejos y cobayas) así como no mamíferos tales como los
pájaros (p.ej. las aves de corral), los peces y reptiles. En una
forma de realización muy preferida, la molécula similar al VEGF es
de origen humano y está codificada por un gen situado en el
cromosoma 11q13. La presente invención se extiende, por
consiguiente, a la secuencia genómica o parte de esta codificante de
la molécula sujeto similar a VEGF.
Preferiblemente, el porcentaje de similitud es
por lo menos del 30%, más preferiblemente por lo menos
aproximadamente del 40%, todavía más preferiblemente por lo menos
del 50%, todavía aún más preferiblemente por lo menos del
60-70%, todavía aún más preferiblemente de por lo
menos del 80-95% a toda o parte de la secuencia de
aminoácidos dada a conocer en SEC ID NO:2.
En un aspecto, la molécula similar a VEGF de la
presente invención comprende una secuencia de aminoácidos tal como
se da a conocer en SEC ID NO:4 o es una parte, fragmento, derivado o
análogo de esta. La referencia en la presente solicitud a los
derivados también incluye variantes de ensamblaje. En consecuencia,
la presente invención se extiende a los variantes de ensamblaje de
SOM175. Los ejemplos de variantes de ensamblaje contemplados en la
presente invención incluyen pero no quedan limitados a los
variantes con secuencia de aminoácidos esencialmente tal como se da
a conocer en por lo menos una de las SEC ID NO:8 y/o SEC ID NO:10 o
mutantes o derivados o más variantes de ensamblaje de estos.
En consecuencia, todavía otro aspecto de la
presente invención contempla un fragmento de péptido
correspondiente a una parte de la secuencia de aminoácidos dada a
conocer en SEC ID NO:4 o los variantes de ensamblaje de esta tales
como se da a conocer en SEC ID NO:8 o SEC ID NO:10 o un equivalente
químico de la misma. La molécula biológicamente aislada o molécula
recombinante de la presente invención puede estar glicosilada
naturalmente o puede comprender un patrón de glicosilación alterado
dependiendo de las células de las que se ha aislado o en que se
sintetiza. Por ejemplo, si se produce por medios recombinantes en
organismos procarióticos, la molécula no estará glicosilada. La
molécula puede ser de la longitud total, la forma natural o puede
estar truncada o derivatizada de otra forma.
Todavía otro aspecto de la presente invención se
dirige a una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula
similar al VEGF descrita en la presente solicitud. Más
particularmente, la presente invención proporciona una molécula de
ácido nucleico aislada comprendiendo la secuencia de nucleótidos
dada a conocer en SEC ID NO:3 o una secuencia de nucleótidos que se
híbrida sobre toda la longitud de la secuencia de aminoácidos dada
a conocer en SEC ID NO:3 o su forma complementaria bajo condiciones
de elevada estringencia de 0,1-1 x SSC/0,1%
peso/peso SDS a 60ºC durante 1-3 horas.
Para definir el nivel de estringencia, se puede
hacer convenientemente referencia a Sambrook et al., (1989)
paginas 9,47-9,51 que en la presente solicitud se
incorpora por referencia donde las etapas de lavado dadas a conocer
se consideran de elevada estringencia. En la presente solicitud se
define como baja estringencia como 4-6 x
SSC/0,1/0,5% p/v SDS a 37-45ºC durante
2-3 horas. Dependiendo del origen y de la
concentración de ácido nucleico implicado en la hibridación, se
pueden emplear condiciones alternativas de estringencia, tales como
condiciones de estringencia intermedia que en la presente solicitud
se consideran ser 1-4 x SSC/0,25/0,5% p/v SDS a
\geq45ºC durante 2-3 horas o condiciones de
estringencia elevada consideradas en la presente solicitud ser
0,1-1 x SSC/0,1% P/v SDS a 60ºC durante
1-3 horas.
La presente invención se dirige además al
homólogo murino de VEGF (aquí referido como "SOM175"). El
SOM175 tiene aproximadamente un 85% de identidad y conserva un 92%
de los residuos de aminoácido sobre toda la región codificante en
comparación con el VEGF humano. El SOM175 está codificado por una
molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de
nucleótidos sustancialmente como se da a conocer en la Figura
9.
La molécula similar a VEGF de la presente
invención será útil para el desarrollo de una multiplicidad de
aplicaciones terapéuticas y/o diagnósticas sola o en combinación
con otras moléculas tales como VEGF. La presente invención se
extiende, por consiguiente, a composiciones farmacéuticas
comprendiendo la molécula similar a VEGF o partes, fragmentos,
derivados, homólogos o análogos de la misma junto con uno o más
vehículos farmacéuticamente aceptables y/o diluyentes. Además, la
presente invención se extiende a ribozimas y moléculas antisentido
basadas en SEC ID NO:3 así como a anticuerpos neutralizantes de la
molécula similar a VEGF. Dichas moléculas pueden ser de utilidad,
reduciendo los efectos de, por ejemplo, la sobreexpresión de genes
similares al VEGF que inducen la angiogénesis o a la
vascularización de los tumores.
\newpage
La presente invención también contempla
anticuerpos a la molécula similar a VEGF de la presente invención
o a sondas de ácido nucleico para un gen codificante de la molécula
similar a VEGF de la presente invención que son útiles como agentes
diagnósticos.
Según un aspecto más de la presente invención, se
proporciona un anticuerpo neutralizante aislado contra un
polipéptido de la invención.
En otro aspecto de la presente invención se
proporciona una composición comprendiendo un polipéptido de la
invención y uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente
aceptables.
En otro aspecto de la presente invención se
proporciona un huésped consistente en una molécula de ácido
nucleico según la presente invención.
En todavía otro aspecto de la presente invención
se proporciona un vector comprendiendo una molécula de ácido
nucleico según la presente invención.
En otro aspecto más de la presente invención se
proporciona la utilización de un polipéptido que exhibe por lo
menos una de las siguientes propiedades:
- (i)
- capacidad para inducir la proliferación de las células endoteliales vasculares
- (ii)
- capacidad para interacturar con la familia de receptores flt-1/flk-1; y/o
- (iii)
- capacidad para inducir la migración celular, la supervivencia celular y/o incrementar los niveles intracelulares de fosfatasa alcalina;
en la que dicho péptido comprende:
- (a)
- una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos dada a conocer en SEC ID NO:1, 3, 5, 7 ó 9 o en una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse a SEC ID NO:1, 3, 5, 7 ó 9 o a su forma complementaria bajo condiciones de elevada estringencia de 0,1-1 x SSC/0,1% peso/peso SDS a 60ºC durante 1-3 horas; o
- (b)
- una secuencia de aminoácidos tal como se da a conocer en SEC ID NO:2, 4, 6, 8 ó 10 o una secuencia de aminoácidos con por lo menos una similitud a esta del 70%, o una forma truncada de dicho polipéptido,
para la preparación de un medicamento para
inducir la proliferación de astroglial en un mamífero.
Preferentemente, la molécula proteica
recombinante comprende la secuencia de aminoácidos dada a conocer
en SEC ID NO:4 o SEC ID NO:6.
La presente invención se describe además por
referencia a las siguientes Figuras y/o Ejemplos no
limintantes.
Figura 1 Secuencia de nucleótidos [SEC ID NO:1]
y correspondiente secuencia de aminoácidos [SEC ID NO:2] del
VEGF_{165}.
Figura 2 Secuencia de nucleótidos [SEC ID NO:3]
y correspondiente secuencia de aminoácidos [SEC ID NO:4] de
SOM175.
Figura 3 Resultados de la búsqueda BLAST con la
secuencia de la proteína SOM175
Figura 4 Alineamiento BESTFIT del cADN de VEGF
y el cADN de SOMI175.
Figura 5 Alineamiento múltiple de VEGF_{165}
con SOM175 y sus variantes de ensamblaje a nivel de nucleótido.
Figura 6 Alineamiento múltiple de VEGF_{165}
con SOM175 y sus variantes de ensamblaje a nivel de aminoácidos.
Figura 7 Representación diagramática de SOM175
y sus variantes de ensamblaje.
Figura 8(a) Diagrama representativo de
la estructura genómica del SOM175 humano mostrando el mapa de
exones/intrones.
Figura 8(b) Diagrama representando la
estructura genómica de SOM175 humano mostrando los bordes entre
exones/intrones.
Figura 9 Secuencia de nucleótidos y la predicha
de péptidos derivada los clones de cADN de mSOM175. La numeración
de nucleótidos se da a la izquierda, empezando por la A del codon de
iniciación. Los aminoácidos se numeran a la derecha, empezando por
el primer residuo de la proteína madura predicha después de haberse
eliminado el péptido señal putativo. La región de ensamblaje
alternativo está doblemente subrayada y se incluye la secuencia de
péptidos resultante de cada mARN. Una señal potencial de
poliadenilación se ha indicado en negritas. Los codones de inicio y
terminación de mSON175_{167} y mSOM175_{186} están subrayados
y una repetición AC polimórfica en el 3'UTR se indica mediante una
recuadro de puntos. La posición de los bordes intron/exon se indica
por puntas flechas.
Figura 10 Alineamientos BESTFIT de proteínas
isoformas de VRF humanas y murinas, A: mSOM175_{167} y
hSOM175_{167}, B: mSOM175_{186} y hSOM175_{186} desde el punto en que las secuencias divergen de los respectivos isoformos de 167 aminoácidos. Las identidades de aminoácidos están marcadas por barras verticales y los aminoácidos conservados por dos puntos. Una flecha marca el lugar de corte del péptido señal predicho en el SOM175 humano y murino.
hSOM175_{167}, B: mSOM175_{186} y hSOM175_{186} desde el punto en que las secuencias divergen de los respectivos isoformos de 167 aminoácidos. Las identidades de aminoácidos están marcadas por barras verticales y los aminoácidos conservados por dos puntos. Una flecha marca el lugar de corte del péptido señal predicho en el SOM175 humano y murino.
Figura 11 Alineamiento BESTFIT de la secuencia
de péptidos de mSOM175_{167} y mVEGF_{188} (Breier et
al., 1992). La flecha marca el lugar de corte del péptido
señal del mVEGF. Los aminoácidos idénticos están indicados por
barras verticales y las sustituciones conservativas por dos puntos.
La numeración de los aminoácidos se describe en la leyenda de la
Figura 9.
Figura 12 Comparación de la estructura génica
entre SOM175 (se muestra un gen SOM175 genérico ya que la
organización de intrones/exones de los homólogos humanos y murinos
es casi idéntica) y otros miembros de la familia de genes
VEGF/PIGF/PDGF. Los exones se representan por cajas. Las regiones
codificantes de proteína y las regiones no traducidas se indican con
regiones abiertas y rellenas, respectivamente. La regione rayada en
SOM175 indica la secuencia 3'UTR adicional formada por el
ensamblaje alternativo del isoformo SOM175_{186}. Se muestran los
productos potenciales del ensamblaje alternativo de cada gen.
Figura 13 Autoradiograma de una transferencia
Northern de ARN total de múltiples tejidos de ratón adulto (como se
indica) hibridado con un clon de cADN de mVRF. En todas las
muestras se detectó un transcripto principal de 1,3 kb.
Figura 14 Autoradiografia en película
(A-C) y microfotografías de campo oscuro
(D-E) ilustrando el patrón de expresión de mVRF y
mARN en el ratón. En el embrión de ratón E14 (A) se encuentran
señales positivas sobre el corazón en desarrollo (Ha) y la corteza
cerebral (Cx). También hay una baja señal de fondo sobre otros
tejidos de la sección. En el embrión E17 (B) y en el corazón (Ha)
se ve claramente debido a una fuerte señal de hibridación. Una señal
igualmente fuerte se haya presente sobre el tejido adiposo marrón
(Fa) en la espalda y alrededor de la caja torácica. Se encuentra
una señal de hibridación moderada sobre la espina dorsal (SC) y la
lengua (T). La señal de fondo es reducida en comparación con el
embrión E14. En el ratón adulto joven (C-D), se
encuentran señales positivas sobre el corazón (Ha) y en el tejido
adiposo (Fa) alrededor de la caja torácica, mientras que, por
ejemplo, los pulmones (Lu) no están marcados. La señal de
hibridación sobre el corazón está uniformemente distribuida sobre
todo el ventrículo izquierdo, incluyendo el músculo papilar (D). En
el corazón E17 hibridado con un exceso de sonda fría, no se
encuentra ninguna señal positiva (E). Barra de escala = 0,5 mm (A),
1,2 mm (B), 1 mm (C), 0,3 mm (D), 0,1 mm (E).
Figura 15 Microfotografías de campo oscuro (A y
C) y campo claro (B y D) mostrando la expresión de mARN de mSOM175
en el tejido adiposo de ratón (A-B) y la espina
dorsal (C-D). Se encuentra presente una fuerte
señal de hibridación sobre la grasa (A), tal como muestra el fuerte
marcaje con negro de Sudan en las secciones teñidas en negro (B).
También se encuentra presente una débil señal en el músculo
esquelético (M en A-B). En la espina dorsal adulta
(C) la sonda mSOM175 dio un patrón de tinción neuronal sobre la
materia gris. Contratinción con tolueno mostrando que las
motoneuronas en el cuerno ventral (D), las interneuronas en la parte
profunda del cuerno dorsal y alrededor del canal centran (no
mostrado) fueron mayormente positivas para el mARN de mSOM175.
Barra de escala = 0,1 mm (A), 0,1 mm (B), 0,25 mm (C), 0,015 mm
(D).
Figura 16 Efectos del VEGF sobre las neuronas
sensoriales del embrión de pollo de 8 días (E8) tal como
determinado por el % de supervivencia, % de alargamiento de las
neuritas y longitud media de las neuritas (\mum).
Figura 17 Efecto de VEGF y SOM175 sobre la glia
de pollo. Se ensayó glia de CNS, glia periférica y
oligodendrocitos del CNS.
Figura 18 Efecto de múltiples proteínas SOM175
sobre las células de astroglia de ratón. \blacksquare ^{3}H
(cpm)
| 1. | FGF-2 (10 ng/ml) control positivo |
| 2. | SOM_{\Delta}X6* 1 ng/ml |
| 3. | SOM_{\Delta}X6 10 ng/ml |
| 4. | SOM_{\Delta}X6 100 ng/ml |
| 5. | SOM_{\Delta}X6 1000 ng/ml |
| 6. | SOM_{\Delta}X6 1000 ng/ml, sin heparina |
| 7. | SOMX6** 1 ng/ml |
| 8. | SOMX6 10 ng/ml |
| 9. | SOMX6 100 ng/ml |
| 10. | SOMX6 1000 ng/ml |
| 11. | SOMX6 1000 ng/ml, sin heparina |
| *Se refiere al SOM175 sin exon 6; | |
| **Se refiere a SOM175 |
Figura 19 Efecto de múltiples proteínas SOM175
sobre las células oligodendrogliales de ratón \blacksquare
^{3}H (cpm).
| 1. | FGF-2 (10 ng/ml) control positivo |
| 2. | SOM_{\Delta}X6* 1 ng/ml |
| 3. | SOM_{\Delta}X6 10 ng/ml |
| 4. | SOM_{\Delta}X6 100 ng/ml |
| 5. | SOM_{\Delta}X6 1000 ng/ml |
| 6. | SOM_{\Delta}X6 1000 ng/ml, sin heparina |
| 7. | SOMX6** 1 ng/ml |
| 8. | SOMX6 10 ng/ml |
| 9. | SOMX6 100 ng/ml |
| 10. | SOMX6 1000 ng/ml |
| 11. | SOMX6 1000 ng/ml, sin heparina |
| *Se refiere a SOM175 sin exon 6; | |
| ** Se refiere a SOM175 |
Figura 20 Efecto de múltiples proteínas SOM175
sobre las neuronas de cerebro frontal de ratón \blacksquare % de
supervivencia.
| 1. | FGF-2 (10 ng/ml) control positivo |
| 2. | SOM_{\Delta}X6* 1 ng/ml |
| 3. | SOM_{\Delta}X6 10 ng/ml |
| 4. | SOM_{\Delta}X6 100 ng/ml |
| 5. | SOM_{\Delta}X6 1000 ng/ml |
| 6. | SOM_{\Delta}X6 1000 ng/ml, sin heparina |
| 7. | SOMX6** 1 ng/ml |
| 8. | SOMX6 10 ng/ml |
| 9. | SOMX6 100 ng/ml |
| 10. | SOMX6 1000 ng/ml |
| 11. | SOMX6 1000 ng/ml, sin heparin. |
| *Se refiere a SOM175 sin exón 6; | |
| **Se refiere a SOM175. |
| SEC ID NO:1 | Secuencia de nucleótidos de VEGF_{165} |
| SEC ID NO:2 | Secuencia de aminoácidos de VEGF_{165} |
| SEC ID NO:3 | Secuencia de nucleótidos de SOM175 (molécula similar a VEGF) |
| SEC ID NO:4 | Secuencia de aminoácidos de SOM175 |
| SEC ID NO:5 | Secuencia de nucleótidos de SOM175 sin exón 6 |
| SEC ID NO:6 | Secuencia de aminoácidos de SOM175 sin exón 6 |
| SEC ID NO:7 | Secuencia de nucleótidos de SOM175 sin exones 6 y 7 |
| SEC ID NO:8 | Secuencia de aminoácidos de SOM175 sin exones 6 y 7 |
| SEC ID NO:9 | Secuencia de nucleótidos de SOM175 sin exón 4 |
| SEC ID NO:10 | Secuencia de aminoácidos de SOM175 sin exón 4 |
| SEC ID NO:11 | Oligonucleótido |
| SEC ID NO:12 | Oligonucleótido |
| SEC ID NO:13 | Oligonucleótido |
| SEC ID NO:14 | Oligonucleótido |
Se aisló cADN de SOM175 original cribando un
genoteca de cerebro fetal humano (\lambdazapII, Stratagene) con el
cósmido D11S750 (Larsson et al., 1992). Se escindió el
plásmido in vivo y se obtuvo un único cADN de 1,1 kb.
También se aislaron tres clones de cADN de SOM175 independientes a
partir de una genoteca de bazo humano fetal (Stratagene, Unizap)
utilizando como sonda el inserto de SOM175 anteriormente mencionado.
Se obtuvieron tres clones: SOM175-4A, -5A y -6A.
SOM175-5A es un clon con ensamblaje alternativo sin
el exón 4 (SOM175-e4). El cribado de la genoteca se
realizó utilizando las condiciones de hibridación recomendadas por
el fabricante de la genoteca (Stratagene) y el inserto de SOM175
primado aleatoriamente.
También se aislaron dos cADNs parciales de SOM175
a partir de una genoteca en \lambdaGT11 de una línea celular
(A2058) de melanoma humano (Clontech) Los cribados de la genoteca
se realizaron utilizando condiciones de hibridación descritas por
Church y Gilbert, (1984). En cada uno de los casos, la sonda se
generó por primado aleatorio de un producto de PCR derivado de
SOM175 (18f-700r).
También se utilizó SOM175 humano para cribar una
genoteca de cerebro total de ratón recién nacido (Unizap,
Stratagene). Se aislaron cuatro clones no quiméricos:
M175-A, B, C, D. todos los clones fueron cADNs
parciales y M175-C contuvo varios intrones. Tres
de los cADNs no contuvieron el exón 6.
Otro clon referido como M1 se secuenció por
completo y se encontró que contenía el marco de lectura abierto
completo además de parte del 5'utr y el 3'utr total.
Se compiló la secuencia completa del cADNA del
clón (SOM175) y se muestra en la Figura 2 con su correspondiente
secuencia de aminoácidos. Dicha secuencia se cribó para determinar
los marcos de lectura abiertos utilizando el programa MAP (GCG,
University of Wisconsin). Se observó un único marco de lectura
abierto de 672 bp (ver Figura 2). Parece haber poca secuencia 5'
no traducida (2bp). La región 3' no traducida parece estar
completa ya que incluye una señal de
poli-adenilación y una cola de
poli-A.
Las búsquedas de homología en bases de datos se
realizaron utilizando el algoritmo BLAST (corriendo en NCBI, USA).
Dicho análisis reveló homología con múltiples formas de VEGF de
mamífero (ver Figura 3). La cantidad de homología entre SOM175 y el
VEGF_{165} humano se determinón utilizando el programa BESTFIT
(GCG, University of Wisconsin; ver Figuras 4 y 5). La homología en
nucleótidos se estimó en 69,7% y la homología de la proteína se
estimó en por lo menos el 33,3% de identidad y 52,5% de conservación
utilizando análisis por BESTFIT. El análisis por BLAST de la
secuencia de nucleótidos reveló una coincidencia casi completa con
una etiqueta de secuencia humana expresada EST06302 (Adams et
al., 1993).
Dichos datos indican que SOM175 codifica un
factor de crecimiento que tiene estructura similar a la de VEGF.
Ambos genes muestran condons de inicio y terminación en posiciones
similares y comparten bloques de homología similares. Las 8
cisteinas así como también una multiplicidad de otros residuos de
VEGF que se cree están implicados en la dimerización están
conservados. Dichos residuos son Cisteina-47,
Prolina-70, Cisteina-72,
Valina-74,
\hbox{Arginina-77,}
Cisteina-78, Glicina-80,
Cisteina-81, Cisteina-82,
Cisteina-89, Prolina-91,
Cisteina-122 y Cisteina-124 y se
muestran en la Figura 6. Dada la conservación estructural entre
los productos de los genes VEGF y SOM175 también es posible que
compartan similaridades funcionales. Se propone que SOM175 codifica
un molécula similar a VEGF que comparte algunas propiedades con
VEGF pero tiene propiedades únicas propias. La secuencia de
nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos de
VEGF_{165} se muestran en la Figura 1.
El porcentaje de similitud y la divergencia entre
la familia VEGF_{165} y la familia SOM175 (proteína) se
analizaron utilizando el procedimiento Clustal, MegAlign Software,
DNASTAR, Wisconsin. Los resultados se muestran en las Tablas 2.1 y
2.2. Las formas alternativas de ensamblaje de SOM175 se abrevian a
SOM715-e6 en la que todo el exón 6 está
deleccionado; SOM715-e6 y 7 en los que todo el exón
6 y 7 están deleccionados; y SOM175-e4 en la que
todo el exón 4 está deleccionado. La formas ensambladas de SOM175
se muestra en la Figura 7. Los mapas genómicos de SOM175 mostrando
los bordes entre exones/intrones se muestran en las Figuras 8a y
8b.
| A Porcentaje de similitud en nucleótidos entre los variantes de ensamblaje de SOM175 y el VEGF_{165} humano | |||||
| VEGF_{165} | SOM175 | SOM175-e6 | SOM175-e6 \textamp 7 | SOM175-e4 | |
| VEGF_{165} | *** | 34,9 | 39,7 | 41,4 | 37,0 |
| SOM175 | *** | 98,9 | 95,1 | 99,2 | |
| SOM175-e6 | *** | 98,8 | 84,0 | ||
| SOM175-e6 \textamp 7 | *** | 80,3 | |||
| SOM175-e4 | *** |
| B Porcentaje de divergencia en nucleótidos entre los variantes de ensamblaje de SOM175 y VEGF_{165} humano | |||||
| VEGF_{165} | SOM175 | SOM175-e6 | SOM175-e6 \textamp 7 | SOM175-e4 | |
| VEGF_{165} | *** | 41,7 | 41,6 | 41,7 | 41,8 |
| SOM175 | *** | 0,2 | 0,2 | 0,0 | |
| SOM175-e6 | *** | 0,0 | 0,2 | ||
| SOM175-e6 \textamp 7 | *** | 0,3 | |||
| SOM175-e4 | *** |
| A Porcentaje de identidad de aminoácidos entre los variantes de ensamblaje de SOM175 y el VEGF_{165} humano | |||||
| VEGF_{165} | SOM175 | SOM175-e6 | SOM175-e6 \textamp 7 | SOM175-e4 | |
| VEGF_{165} | *** | 31,4 | 42,3 | 33,5 | 40,6 |
| SOM175 | *** | 74,7 | 73,7 | 99,1 | |
| SOM175-e6 | *** | 76,8 | 99,1 | ||
| SOM175-e6 \textamp 7 | *** | 99,1 | |||
| SOM175-e4 | *** |
| B Porcentaje de divergencia en aminoácidos entre los variantes de ensamblaje de SOM175 y VEGF_{165} | |||||
| VEGF_{165} | SOM175 | SOM175-e6 | SOM175-e6 \textamp 7 | SOM175-e4 | |
| VEGF_{165} | *** | 65,7 | 55,4 | 54,6 | 57,4 |
| SOM175 | *** | 19,9 | 4,2 | 0,0 | |
| SOM175-e6 | *** | 0,0 | 0,0 | ||
| SOM175-e6 \textamp 7 | *** | 0,0 | |||
| SOM175-e4 | *** |
Se realizan ensayos para evaluar si SOM175 tiene
actividades similares a las de VEGF en las funciones de células
endoteliales, angiogénesis y cicatrización. Se realizaron otros
ensayos basados en los resultados de los estudios de distribución y
enlace a receptores.
Proliferación de células endoteliales.
Ensayos de crecimiento de células endoteliales tal como describen
Ferrara & Henzel (1989) y Gospodarowicz et al (1989).
Ensayo de permeabilidad vascular. Tales
ensayos, que utilizan el ensayo de Miles en cobayas se realizarán
tal como describen Miles & Miles (1952).
Ensayos de adhesión celular. Se analiza
la influencia de SOM175 sobre la adhesión de los polimorfos a las
células endoteliales.
Quimiotáxia. Se realiza utilizando el
ensayo de quimiotaxis en cámara de Boyden estándar.
Ensayo de activador del plasminógeno. Se
ensayan las células endoteliales para la producción de activador
del plasminógeno e inhibidor del activador del plasminógeno con la
adición de SOM175 (Pepper et al., (1991)).
Ensayo de migración de las células
endoteliales. La capacidad de SOM175 para estimular la
migración de las células endoteliales y para formar tubos se ensaya
tal como describen Montesano et al., (1986).
Se evalúa la inducción de una respuesta
angiogénica por SOM175 en la membrana corioalantoidea de pollo tal
como se describe en Leung et al (1989).
Las posibles acciones neurotrópicas de SOM175 se
valoran utilizando los siguientes ensayos:
Las células PC12 (una línea celular de
feocromocitoma) responden a NGF y otros factores neurotróficos
desarrollando características de las neuronas simpáticas,
incluyendo la inducción de genes tempranos y tardíos y la extensión
de neuritas. Se exponen dichas células a SOM175 y se siguen sus
respuestas (Drinkwater et al., (1991); y Drinkwater et
al., (1993)).
Se exponen cultivos primarios de las siguientes
neuronas de PNS a SOM175 y se sigue cualquier respuesta:
- -
- neuronas sensoriales de la cresta neural y el ganglio de la raíz dorsal
- -
- neuronas simpáticas de la cadena de ganglios simpáticos
- -
- neuronas sensoriales derivadas de placode del ganglio nudoso
- -
- motoneuronas de la espina dorsal
Los ensayos se describen en Suter et al
(1992) y en Marinou et al., (1992).
\newpage
Cuando se observa una respuesta in vitro
se realizan ensayos in vivo de propiedades tales como
captura y transporte retrógrado tal como describen Hendry et
al., (1992).
Cuando se observan efectos neurotróficos de
SOM175, se analiza su posible papel en la regeneración de neuronas
sensoriales axotomizadas, neuronas simpáticas y motoneuronas por el
procedimiento de Otto et al., (1989); Yip et al.,
(1984) y Hendry et al., (1976).
Se analiza la capacidad de SOM175 para
promocionar la supervivencia de las neuronas del sistema nervioso
central tal como describen Hagg et al., (1992); Williams
et al., (1986); Hefti (1986) y Kromer (1987).
Se ensayo la capacidad de SOM175 para apoyar la
cicatrización de las heridas en el modelo disponible clínicamente
más relevante, tal como se describe en Schilling et al.
(1959) y utilizado por Hunt et al., (1967).
Se dispone de una multiplicidad de ensayos in
vitro e in vivo sobre poblaciones específicas de células
del sistema hematopoyético y se subraya a continuación:
Se han desarrollado una multiplicidad de nuevos
ensayos in vitro en células progenitoras murinas utilizando
FACS en células purificadas:
Dichas células son capaces de repoblar la médula
ósea de ratones irradiados letalmente, y tienen el fenotipo
Lin^{-}, Rh^{hi}, Ly-6A/E^{+},
c-kit^{+}. Dicha sustancia se ensaya sobre estas
células sola, o por co-incubación con una
multiplicidad de factores, seguido de la medición de la
proliferación celular por incorporación de ^{3}H timidina.
Estas son células que tienen relativamente poca
capacidad para repoblar la médula ósea pero pueden generar D13
CFU-S. Tales células tienen el fenotipo Lin^{-},
Rh^{hi}, Ly-6A/E^{+},
c-kit^{+}. Se incuba la sustancia a ensayar con
dichas células durante un período de tiempo, se inyectan en
recipientes letalmente irradiados y se cuenta el número de colonias
D13 en el bazo.
Estas son células que responden in vitro
a factores de crecimiento únicos, y tienen el fenotipo Lin^{-},
Rh^{hi}, Ly-6A/E^{+},
c-kit^{+}. Este ensayo mostrará si SOM175 puede
actuar directamente sobre los progenitores de las células
hematopoyéticas. La sustancia a ensayar se incuba con tales
células en cultivo de agar y se cuenta el número de colonias
después de 7 a 14 días.
Las células de músculo liso juegan un papel
crucial en el desarrollo o la iniciación de la aterosclerosis,
necesitando un cambio en su fenotipo del estado contráctil al
sintético. Los macrófagos, las células endoteliales, los limfocitos
T y las plaquetas todas ellas juegan un papel en el desarrollo de
la placa aterosclerótica influenciando el crecimiento y la
modulación fenotípica de las células musculares lisas. Se utiliza
un ensayo in vitro que mide la velocidad proliferativa y la
modulación fenotípica de las células de músculo liso en un ambiente
multicelular para valorar los efectos de SOM175 sobre las células
musculares lisas. El sistema utiliza un cámara de Rose modificada
en la que se siembran diferentes tipos celulares en cubre objetos
opuestos.
Se ensaya la capacidad de SOM175 para regular la
proliferación de osteoblastos tal como describen Lowe et
al., (1991). Cualquier efecto sobre la reabsorción de hueso se
ensayan tal como describen Lowe et al., (1991). Los efectos
sobre la migración de los osteoblastos y sobre los cambios en las
moléculas intracelulares (p.ej. la acumulación de cAMP, los niveles
de fosfatasa alcalina) se analizan tal como describen Midy et
al (1994).
Los efectos de SOM175 sobre la proliferación de
los mioblastos y el desarrollo de miotúbulos se puede determinar
tal como describen Ewton et al., (1980) y Gospodarowicz
et al., (1976).
Los clones de SOM175 (mSOM175) se seleccionaron
de una genoteca de cADN de cerebro total de ratón recién nacido en
lambda Zap (Stratagene). Se identificaron fagos primarios de
filtros de elevada densidad (5 x 10^{4} pfu/placa) por
hibridación con una sonda 682bp marcada con ^{32}P generada por
PCR de un cADN de hVRF (pSOM175) tal como se describió
anteriormente. La hibridación y los lavados a elevada estringencia
de las membranas de nylon
\hbox{(Hybond-N)} se realizaron a 65ºC
bajo las condiciones descritas por Church y Gilbert (1984). Las
placas positivas se recogieron, se purificaron y se escindieron
in vivo para producir colonias bacterianas conteniendo clones
de cADN en pBluescript SK-.
Los clones genómicos se aislaron a partir de una
genoteca de ratón cepa SV/129 clonada en el vector lambda
\hbox{Fix II} (Stratagene). Los filtros de elevada
densidad (5 x 10^{4} pfu/filtro) se cribaron con una sonda de 563
bp marcada con ^{32}P generada por amplificación por PCR de la
región 233-798 del cADN de mSOM175 (ver Figura 9).
Los clones positivos se extrajeron y se re-cribaron
con filtros conteniendo 400 a 800 pfu. Se prepararon preparaciones
de fago a gran escala utilizando el equipo de lamba de QIAGEN o por
purificación con ZnCl_{2} (Santos, 1991).
Los cADNs se secuenciaron en ambas cadenas
utilizando una multiplicidad de cebadores con base en el vector y
externos usando el equipo de secuenciación por colorante terminador
de Applied Biosystems Incorporated (ABI) según las instrucciones del
fabricante. Las secuencias se analizaron en un secuenciador de ADN
automático Modelo 373A de ABI. Los alineamientos de homología de
péptidos se realizaron utilizando el programa BESTFIT (GCG,
Wisconsin).
La identificación de los bordes de los exones y
regiones flanqueanes se realizó utilizando PCR con ADN genómico de
ratón o clones en lambda de mSOM175 como moldes. Los cebadores
utilizados en la PCR para identificar los intrones se derivaron de
la secuencia de hSOM175 y se para tener en cuenta las potenciales
disparidades entre las secuencias de humano y ratón se hizo la
hibridación a una temperatura entre 5 y 10ºC por debajo de la
T_{m} estimada. Se midió el tamaño de todos los productos de PCR
por electroforesis en geles de agarosa y purificación del gel
utilizando columnas QIAquick spin, (Qiagen) y los bordes entre
intrones/exones se secuenciaron directamente del producto. Además,
algunas de las uniones de ensamblaje se secuenciaron de fragmentos
genómicos de mSOM175 subclonados. Los bordes entre intrones/exones
se identificaron por comparación de las secuencias de cADN y ADN
genómicas.
El ARN celular total se preparó a partir de un
panel de tejido fresco de ratón adulto normal (cerebro, riñón,
hígado, músculo) utilizando el procedimiento de Chomczynski y
Sacchi (1987). 20 \mug de ARN total se fraccionó por
electroforesis, se transfirió a una membrana de nylon (Hybond N,
Amersham) y se híbrido bajo condiciones estándar (Church &
Gilbert, 1984). Los filtros se lavaron a 65ºC en 0,1 X SSC (20 x
SSC es 3M NaCl/0,3M citrato trisódico), 0,1% SDS y se expusieron a
película de rayos X con una pantalla intensificadora a -70ºC
durante 1 a 3 días.
Los homólogos murino de SOM175 se aislaron por
cribado de genotecas de cADN murino con un clon cADN de hSOM175.
Se recuperaron cinco clones con tamaños oscilando entre 0,8 y 1,5
kb y se secuenciaron. Las secuencias de cADN se compilaron para
producir una secuencia de cADN tamaño completo de 1041 bp cubriendo
todo el marco abierto de lectura (621 bp o 564 bp dependiendo de la
forma de ensamblaje, ver más adelante) y 3'UTR (379 bp), así como
163 bp de 5'UTR (Figura 9).
Los codons de inicio predichos coincidieron con
la posición del codon de inicio en hSOM175. Se localizó otro ATG
fuera de marco en la posición -47 y se observaron dos codons de
terminación corriente arriba (posiciones -9 y -33, respectivamente)
en el marco con el codon de inicio putativo.
El péptido señal N-terminal
predicho de hSOM175 parece estar presente en mSOM175 con identidad
del 81% (17/21 aminoácidos). Se espera que ocurra el corte del
péptido dentro de mSOM175 después del residuo 21 (Figura 10).
Dichos datos sugieren que el mSOM175 se secrete y por consiguiente
concebiblemente funcione como un factor de crecimiento.
Tal como con hSOM175, se detectaron dos marcos
de lectura abiertos (ORFs) en los cADNs aislados por el cribaje de
genotecas. Se encontraron cuatro o cinco clones que estaban
ensamblados alternativamente y no tenían un fragmento de 101 bp
homólogo al exón 6 de hSOM175. Las secuencias de péptidos
predichas para los dos isoformos de mSOM175 se determinaron y se
alinearon con los correspondientes isoformos humanos (Figura
10).
El mensaje codificante de mSOM175_{186}
contiene un ORF de 621 bp con secuencias codificantes terminando en
la posición +622, hacia el final del exón 7 (Figura 9). El menor
de los mensajes codificando mSOM175_{167} de hecho termina
corriente abajo de la posición +622 del TAG debido a un cambio en
el marco resultante de la excisión de los 101 bp del exón 6 y la
introducción de un codon de terminación (TGA) en la posición +666,
cerca del comienzo del exón 8 (Figura 9).
La proteína mSOM175_{186} tiene una fuerte
homología con las porciones amino y central de VEGF mientras que el
la terminación carboxilo es completamente divergente y es rica en
alanina. mSOM175_{167} posee dichas similaridades y también
mantiene la homología con mVEGF a través del
C-final (Figura11). La homología general de
mSOM175_{167} con hSOM175_{167} fue de 85% identidad y 92%
similitud, respectivamente (Figura 10). Asimismo, la homología
entre mSOM175_{167} y mVEGF (Breir et al., 1992) fue del
49% identidad y 71% sustituciones conservativas de aminoácidos,
respectivamente (Figura 11).
Una señal de poliadenilación canónica para los
vertebrados (AATAAA) (Birnstiel et al., 1986) no se encontró
presente en el cADN de mSOM175, sin embargo, la secuencia muy
parecida GATAAA se encuentra en una posición similar tanto en el
cADN de SOM175 de ratón como el de humano (Figura 9). Por el
contrario hSOM175, mSOM175 se encontró que contiene una repetición
del dinucleótido AC en el extremo 3' del 3'UTR (posiciones de
nucleotídos 998 a 1011, Figura 9). Se observó el polimorfismo de
esta región repetida entre algunos de los cADNs de mSOM175, con el
número de dinucleótidos oscilando entre 7 y 11.
Los bordes entre exo/intron (Tabla 3) se mapearon
utilizando cebadores que flanquean las secuencias homólogas a los
correspondientes bordes de hSOM175. los intrones I, III, IV y VI
de mSOM175 (Tabla 3, Figura 12) fueron más pequeños que las
secuencias intermedias de hSOM175. La secuencia genómica completa
se compiló a partir del 5'UTR de mSOM175 a través del intron VI, la
mayor región intermedia (2,2 kb), por secuenciación de intrones
amplificados y porciones genómicas clonadas de mSOM175. Solo hubo
una diferencia mayor en la estructura genómica entre mSOM175 y
hSOM175 y esta fue el borde entre el exón 7/intrón VI de mSOM175
estaba localizada 10 bp más allá corriente abajo en relación con la
secuencia del cADN, en consecuencia el exón 7 en mSOM175 es 10 bp
más largo que la del correspondiente exón en hSOM175.
Los exones 6 y 7 son contiguos en mSOM175, tal
como se ha encontrado que ocurre en el homólogo humano. La fuerte
homología de secuencia entre el exón 6 de mSOM175 y hSOM175 (Figura
10) sugiere que dicha secuencia no es una secuencia intrónica
retenida sino que más bien codifica una parte funcional de los
isoformos de SOM175_{186}.
La estructura general intron/exon está conservada
entre varios miembros de la familia de genes VEGF (VEGF, PIGF,
hSOM175) y por consiguiente no es sorprendente que la organización
genómica general del gen mSOM175 sea muy similar a la de dichos
genes (Figura 12).
Previos estudios de mapeo comparativo han
mostrado que la región que rodea el locus de la enfermedad de
neoplasia endocrina múltiple tipo 1 en el cromosoma 11q13 es
sinténica con el segmento próximo de cromosoma 19 de ratón (Rochelle
et al., 1992). Ya que los inventores han mapeado el gen
hSOM175 hasta 1 kb del locus MENI (ver más arriba) es muy probable
que el gen SOM175 murino se localice en el mapa cerca del centrómero
del cromosoma 19.
El análisis Northern del ARN de tejido de ratón
adulto (músculo, corazón, pulmón e hígado) mostró que la expresión
parece ubicua y tiene lugar principalmente como una banda principal
de aproximadamente 1,3 kb de tamaño (Figura 14). Ello es algo
diferente al patrón observado para el hSOM175 en el que se han
identificado dos bandas principales de 2,0 y 5,5 kb en todos los
tejidos examinados. El mensaje murino de 1,3 kb presumiblemente
corresponde al más corto de los transcriptos humanos y las
variaciones de tamaño del mismo son lo más probablemente debidas a
diferencias en la longitud de los diferentes 5'UTRs.
Ratones hembra preñadas temporizadas (n = 4) y
jóvenes adultos (n = 2) (C57 cepa consanguínea, ALAB, Suecia) se
sacrificaron con dióxido de carbono y se cosecharon y se congelaron
los tejidos relevantes en una cuña. Se mantuvieron los tejidos a
-70ºC hasta su uso posterior. Se utilizaron dos edades de gestación
en este estudio; día 8 embriónico (E8), 14 y E17.
La hibridación in situ se realizó tal como
se describió previamente (Dagerlind et al., 1992). En breve,
se cortaron secciones (14 \mum) en un criostato (Micron,
Alemania); se descongelaron en un porta objetos
Probe-On (Fisher Scientific, USA) y se guardaron en
una cajas negras selladas a -70ºC hasta ser utilizadas. Las
secuencias sintéticas de oligonucleótido 42mero complementarias al
mARN codificantes de mSOM175 fueron:
Para determinar las dos formas de ensamblaje
alternativas el oligonucleótido
fueron utilizadas. Las sondas se marcaron en el
extremo 3'con
alfadeoxiadenosina-alfa[tio]trifosfato.
[^{35}S] (NEN, USA) utilizando deoxinucleotidil transferasa
terminal (IBI, USA) a una actividad específica de
7-10 x 10^{8} cpm/\mug y se híbrido a secciones
sin pretratamiento durante 16-18h a 42ºC. La mezcla
de hibridación contuvo: 50% v/v formamida, 4 x SSC (1 x SSC = 0,15
M NaCl y 0,015 M citrato sódico), solución 1 x de Denhardt (0,02%
cada uno de polivinil-pirrolidona, BSA y Ficoll), 1%
v/v sarcosilo (N-laurilsarcosina; Sigma), 0,02 M
tampón fosfato (pH 7,0), 10% p/v sulfato de dextrano (Pharmacia,
Suecia), 250 \mug/ml de tARN de levadura (Sigma), 500 \mug/ml
ADN de esperma de salmón desnaturalizado por calor y cizallado
(Sigma) y 200 mM ditiotreitol (DTT, LKB, Suecia). En las secciones
control, se comprobó la especificidad de las sondas añadiendo un
exceso de 20 veces de una sonda sin marcar a la mezcla de
hibridación. Además, se hibridaron las secciones adyacentes con
una sonda no relacionada con el presente estudio lo que dio un
patrón de expresión diferente. A continuación de la hibridación
las secciones se lavaron varias veces con 1 x SSC a 55ºC, se
deshidrataron en etanol y se sumergieron en emulsión NTB2 (Kodak,
USA). Una vez transcurridas 3-5 semanas las
secciones se revelaron en revelador D-19 (Kodak,
USA) y se cubrieron con un cubreobjetos. En algunos casos, las
secciones se colocaron en oposición a una película autoradiográfica
(película de autoradiografía Beta-max Amersham Ltd,
UK) antes de sumergirlas en la
emulsión.
Las cuatro sondas diferentes dieron patrones de
hibridación idénticos en todos los tejidos examinados.
La expresión de SOM175 de ratón se detectó ya en
los embriones E8, en los que se grabó una señal positiva sobre
estructuras que probablemente corresponden al tubo neural. En las
secciones sagitales de los embriones de ratón E14 la señal de
hibridación más fuerte se encontró sobre el corazón y sobre el
sistema nervioso, especialmente la corteza cerebral (Figura 14A).
En todos los otros tejidos se encontró un nivel bajo de expresión.
En un estado gestacional posterior, E17,se encontró una elevada
señal de mARN de mSOM175 confinada sobre el corazón y el tejido
graso marrón en la espalda y alrededor del cuello (Figura 14B). Se
encontraron señales de hibridación claramente positivas en la parte
gris de la espina dorsal y en la lengua (Figura 14B). la expresión
en la corteza cerebral estuvo claramente reducida en comparación
con la del día 14. La débil señal de expresión de fondo encontrada
en el embrión E14 en, por ejemplo, el músculo, había decrecido a
esta edad de gestación. En los ratones maduros jóvenes se encontró
una fuerte señal de hibridación al mARN de mSOM175 solamente sobre
el corazón y en la grasa marrón (Figura 14C). La señal sobre el
corazón estuvo completamente uniformemente distribuida sobre toda la
pared ventricular, incluyendo el músculo papilar (Figura 14D). En
las secciones de tejido cardíaco hibridadas con un exceso de sonda
sin marcar, no se grabó una señal específica sobre la señal de
fondo (Figura 14E).
Aparte del corazón, la señal de mARN de mSOM175
se encontró sobre ciertos tejidos del exterior de la caja torácica
que se parecen morfológicamente a la grasa marrón. Ello se
verificó por contratinción con negro de Sudán, que muestra una
fuerte tinción en las mismas zonas (Figuras 15A y 15B). En las
secciones transversales de la espina dorsal de los ratones adultos,
las sondas de mVRF dieron un patrón de tinción neuronal sobre la
materia gris (Figura 15C). La contratinción con tolueno (Figura
15D) mostró que las motoneuronas en el cuerno central (Figura 15C
y 15D), las interneuronas (Figura 15C) en la zona profunda del
cuerno dorsal y alrededor del canal central fueron en gran parte
positivas para el mARN de mSOM175.
Se determinaron los efectos de las proteínas VEGF
y SOM175 sobre las neuronas sensoriales embrionarias de pollo de
día 8 utilizando el procedimiento de Nurcombe et al.,
(1992). El ensayo neuronal se leyó a las 48 horas utilizando 2000
células por pocillo de ensayo. Los resultados se obtuvieron
utilizando cuentas de ^{3}H-timidina. El
porcentaje de supervivencia de neuronas, extensión de neuritas y
longitud media de neuritas en \mum se determinó utilizando NGF
como control positivo y múltiples concentraciones de VEGF, VEGF en
presencia de heparina y VEGF en presencia de heparina y 5 \muM
5'-fluorouracilo (5FU). El 5FU mata las células
glia.
Los resultados se muestran en la Figura 16. Los
resultados muestran que el VEGF es efectivo promocionando la
supervivencia neuronal pero que ello necesita la presencia de
células glia. La Figura 17 muestra los resultados de los efectos
del VEGF y SOM175 sobre tres tipos de glia de pollo. Las glia
ensayadas fueron glias del CNS, glia periférica y oligodendrocitos
del CNS. Se utilizó heparina a 10 \mug/ml en todos los cultivos
y se leyó el ensayo a las 24 horas. Los resultados se midieron en
cuentas de ^{3}H-timidina utilizando 2000 células
por pocillo.
Los resultados muestran que para las neuronas
centrales y periféricas de pollo, la astroglia fue marcadamente
estimulada a proliferar por SOM175 en presencia de heparina pero
que los oligodendrocitos de pollo mostraron un incremento
insignificante en velocidad de división.
Los resultados en el Ejemplo 7 muestran que los
isoformos de VEGF tuvieron un efecto sobre las neuronas primarias y
centrales de pollo a través de la acción de las células de
astroglia. Se repitieron resultados similares con células de
ratón.
Las células neuronales y de glia para todos los
experimentos in vitro se prepararon y cultivaron según los
procedimientos descritos en "Methods in Neurosciences (Vol. 2):
Cell Culture" Ed. P.M. Conn, Academic Press, San Diego, 1990,
pp33-46 para células de astroglia,
pp56-74 para células de oligodendrocito y
pp87-102 para neuronas centrales.
Se sembraron las células en placas de cultivo de
24 pocillos (Nunc) recubiertas con
poli-L-ornitina (0,1 mg/ml, 1 h) a
una densidad de 2.000 células/pocillo. A las 48 horas en cultivo,
se contaron las neuronas en los pocillos bajo luz de fase invertida
utilizando procedimientos bien establecidos (Maruta et al.,
1993) y las células glia se ensayaron por incorporación de
[^{3}H]timidina para seguir la velocidad de división como
más adelante. La heparina (10 \mug/ml, fracción de bajo peso
molecular, Sigma Chemical Corporation) estuvo presente en todo
momento en el medio de cultivo excepto donde se indique. Los
cultivos neuronales fueron suplementados con 5 mM
5-fluoro-2-deoxiuridina
(Sigma) para suprimir el crecimiento de fondo de glia.
Se pulsaron las células durante 14
horas con ^{3}H-timidina (actividad específica
103 \muCi/\mug) de una concentración madre de 0,1 mCi/ml en
medio estándar, dando un volumen de incubación final de 20
\mul/pocillo. El contenido de los pocillos se cosechó y se
absorbió en un papel de nitrocelulosa (Tiertek, Flow). Las células
adherentes resultantes se extrajeron con tripsina/verseno (CSL
Limited, Victoria, Australia) durante 5 minutos. Dicho
procedimiento se realizó dos veces. Los discos de nitrocelulosa se
lavaron en un cosechador Titertek (Flow) estándar, utilizando
primero agua y a continuación metanol. Los discos de nitrocelulosa
se secaron, se añadió fluido de centelleo (conteniendo 5% v/v
Triton-X) y se contaron los discos en un contador de
centelleo.
La mayor actividad se detectó con preparaciones
de SOM175 sin el exón 6 (SOM_{\Delta}X6) en cultivos de células
de astroglia de ratón, en los que hubo un estímulo de proliferación
significativo cuando se administró junto con heparina (Figura 16).
Se dio poco estímulo de la proliferación de células de
oligodendroglia (Figura 17) y muy poca potenciación discernible de
la respuesta de supervivencia de neuronas de cerebro frontal
aisladas (Figura 18). La desviación estándar para cada punto en
todos los gráficos fue inferior al 8%.
\newpage
La viabilidad de las neuronas se puede mantener
promocionando la proliferación de las células de glia. Además,
SOM_{\Delta}X6 es un buen inductor de la proliferación de
astroglia y se puede expresar junto con la formación de las
prolongaciones terminales de astroglia en las células endoteliales
del sistema nervioso central.
| 5'UTR* ........ | Exon 1 | \hskip-0.2cm >223bp | CCCAGgtacgtgcgt | Intron I | 495 bp |
| ttccccacagGCCCC | Exon 2 | 43 bp | GAAAGgtaataatag | Intron II | 288 bp |
| ctgcccacagTGGTG | Exon 3 | 197 bp | TGCAGgtaccagggc | Intron III | 196 bp |
| ctgagcacagATCCT | Exon 4 | 74 bp | TGCAGgtgccagccc | Intron IV | 182 bp |
| ctcttttcagACCTA | Exon 5 | 36 bp | GACAGattcttggtg | Intron V | 191 bp |
| ctcctcctagGGTTG | Exon 6 | 101 bp | (no intron) | ||
| CCCACTCCAGCCCA | Exon 7 | 135 bp | TGTAGgtaaggagtc | Intron VI | aprox 2200 bp |
| cactccccagGTGCC | Exon 8 | 394 bp | AGAGATGGAGACACT | ||
| Las letras mayúsculas y minúsculas indican las secuencias exónicas e intrónicas respectivamente. | |||||
| * Indica que el extremo 5'del exón 1 no ha sido determinado todavía. |
Adams MD, Soares MB,
Kerlavage AR, Fields C, Venter JC,
(1993) Nature Genet, 4, 373-380.
Birnstiel ML, Busslinger M and
Strub K (1985) Cell
41,349-359.
Breier G, Albrecht U,
Sterrer S and Risau W (1992) Development
114: 521-532.
Chomczynski p and Sacchi N
(1987) Analyt. Biochem.
162:156-159.
Church G and Gilbert W
(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
18:1991-1995.
Dagerlind A, Friberg K, Bean
AJ and Hokfelt T (1992) Histochemistry 98:
39-49.
Dissen GA, Lara HE,
Fabrenbach WH, Costa ME, Ojeda SR,
(1994) Endocrinology 134:
1146-1154.
Drinkwater CC, Barker PA,
Suter U and Shooter EM (1993) J. Biol.
Chem., 268: 23202-23207.
Drinkwater CC, Suter U,
Angst C and Shooter EM (1991) Proc. Roy.
Soc. Lond. (Series B), 246: 307-313.
Ewton DZ & Florini JR
(1980) Endocrinology, 106:577-583.
Ferrara N & Henzel WJ
(1989) Biochem. Biophys. Res.
Commun.161:851-858.
Folkman J & Shing Y
(1992) J.Biol.Chem.,
267:10931-10934.
Gospodarowicz D, Abraham JA &
Schilling J (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA
86:7311-7315.
Gospodarowicz D, Weseman J,
Morgan JS & Lindstrom J (1976) J.Cell
Biol., 70:395-405.
Hagg T, Quon D, Higaki J
& Varon S (1992) Neuron,
8:145-158.
Hefti S (1986) J. Neurosci.,
6:2155-2162.
Hendry IA & Campbell J
(1976) J. Neurocytol., 5:351-360.
Hendry IA, Murphy M, Hilton
DJ, Nicola NA & Bartlett PF (1992) J.
Neurosci. 12:3427-3434.
Hunt et al., (1967) Am.
J. Surgery, 114:302-307.
Koch AE, Harlow LA, Haines
GK, Amento EP, Unemoti EN, Wong WL,
Pope RM, Ferrara N, (1994) J. Immunol.
152:4149-4156.
Kromer AF (1987) Science,
235:214-216.
\newpage
Larsson C, Weber G, Kwanta
E, Lewis C, Janson M, Jones C, Glaser
T, Evans G, Nordenskjold M, (1992) Hum.
Genet. 89:187-193.
Ozus Leung DW, Cachianes G,
Kuang W-J, Goeddel DV &
Ferrara N (1989) Science
246:1306-1309.
Lowe C, Cornish J, Callon K,
Martin TJ & Reid IR (1991) J.Bone
Mineral Res., 6:1277-1283.
Lowe C, Cornish J, Martin TJ
& Reid IR (1991) Calcif. Tissue Int.,
49:394-397.
Martinou JC, Martinou I &
Kato AC (1992) Neuron,
8:737-744.
Maruta et al (1993)
Growth Factors 8:119-134.
Midy V and Plouet J (1994)
Biochem. Biophys. Res. Commun.
199:380-386.
Miles AA & Miles EM
(1952) J. Physiol. (Lond)
118:228-257.
Montesano R, Vassalli JD,
Baird A, Guillemin R & Orci, L
(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
83:7297-7301.
Nurcombe et al. (1992)
Development 116:1175-1183.
Otto D., Frotscher M &
Unsicker K (1989) J. Neurosci. Res.,
22:83-91.
Pepper MS, Ferrara N, Orci
L, Montesano R. (1991) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 181:902-906.
Rochell JM, Watson ML, Oakey
RJ & Seldin MF (1992) Genomics
14:26-31.
Roth S & Weston J (1967)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 58:974-980.
Sambrook J, Fritsch EF,
Maniatis T, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual 2^{nd} Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.Y.
Santos MA (1991) Nucleic Acids
Res. 19:5442.
Schilling et al., (1959)
Surgery, 46:702-710.
Senger DR, Van De Water L,
Brown LF, Nagy JA, Yeo KT, Yeo TK,
Berse B, Jackman RW, Dvorak AM, Dvorak
HF (1993) Cancer Netastasis Rev. 12:
303-324.
Sharkey AM,
Chamock-Jones DS, Boocock CA,
Brown KD, Smith SK, (1993) J. Reprod.
Fertil. 99:609-615.
Sunderkotter C, Steinbrink K,
Goebeler M, Bhardway R, Sorg E, (1993)
J. Leukocyt. Biol. 55:410-422.
Suter U, Angst C, Tien
C-L, Drinkwater CC, Linsay RM and
Shooter EM (1992) J.Neurosci.,
12:306-318.
Tischer E, Mitchell R,
Hartman T, Silva M, Gospodarowicz D,
Fiddes JC, & Abraham J (1991) J. Biol.
Chem. 266:11947-11954.
Williams LR, Varon S,
Peterson GM, Wictorin K, Fischer W,
Bjorklund A & Gage FH (1986) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83:9231-9235.
Yan Z, Weich HA, Bernart W,
Breckwoldt M, Neulen J, (1993) J. Clin.
Endocrinol. Metab. 77:1723-1725.
Yip NK, Rich KM, Lampe PA
& Johnson EM Jr (1984) J. Neurosci.,
4:2986-2992.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\hskip0.4cm(otros países distintos de los US) AMRAD OPERATIONS PTY.LTD
\hskip0.4cm(solamente US) Hayward, N and Weber, G
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: UN FACTOR DE CRECIMIENTO NUEVO Y UNA SECUENCIA GENETICA CODIFICANTE DEL MISMO.
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS:14
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- REMITENTE: DAVIES COLLISON CAVE
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1 LITTLE COLLINS STREET
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: MELBURNE
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: VICTORIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAIS: AUSTRALIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL: 3000
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco de 31/2
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: Patentin release nº 1.0, Versión nº 1.25
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD: PCT INTERNACIONAL
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 22-FEB-1996
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD: AU PN1457
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 02-MAR-1995
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD: AU PN6647
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 20-NOV-1995
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD: AU PN7274
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 22-DIC-1995
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- ABOGADO/INFORMACIÓN DEL AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: HUGHES DR. E JOHN L
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- REFERENCIA/NUMERO DE CERTIFICADO: EJH/EK
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACION DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELEFONO: +61 3 9254 2777
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: +61 3 9254 2770
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 649 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 17.....589
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 191 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEC ID NO:3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1094 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACION: 3.....624
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 207 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 993 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3.....566
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:5:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 188 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:6:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 858 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3.....431
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:7:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 143 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:8:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 910 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3.....305
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:9:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 101 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:10:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: oligonucleotido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCACCACCT CCCTGGGCTG GCATGTGGCA CGTGCATAAA CG
\hfill42
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: oligonucleótido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAGTTGTTTGA CCACATTGCC CATGAGTTCC ATGCTCAGAG GC
\hfill42
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: oligonucleótido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGATCCTGGGG CTGGAGTGGG ATGGATGATG TCAGCTGG
\hfill38
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: oligonucleótido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCGGGCAGAG GATCCTGGGG CTGTCTGGCC TCACAGCACT
\hfill40
Claims (19)
1. Polipéptido aislado que exhibe por lo menos
una de las siguientes propiedades:
- (i)
- capacidad para inducir la proliferación de las células endoteliales vasculares;
- (ii)
- capacidad para interacturar con la familia de receptores flt-1/flk-1; y/o
- (iii)
- capacidad para inducir la migración celular, la supervivencia celular y/o incrementar los niveles intracelulares de fosfatasa alcalina;
en el que dicho polipéptido comprende:
- (a)
- una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos tal como se da a conocer en SEC ID NO:3 o una secuencia de nucleótidos que se híbrida sobre toda la longitud de la SEC ID NO:3 o su forma complementaria bajo condiciones de estringencia elevadas de 0,1 a 1 x SSC/0,1% peso/peso SDS a 60ºC durante 1 a 3 horas; o
- (b)
- una secuencia de aminoácidos tal como se da a conocer en SEC ID NO:4 o una forma truncada de dicho polipéptido que exhibe por lo menos una de las siguientes propiedades (i) a (iii).
2. Polipéptido aislado según la reivindicación
1, que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la
secuencia de nucleótidos dada a conocer en SEC ID NO:3, SEC ID NO:7
ó SEC ID NO:9.
3. Polipéptido aislado según la reivindicación
1, que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se da a
conocer en SEC ID NO:4, SEC ID NO:8 o SEC ID NO:10.
4. Polipéptido aislado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polipéptido es de origen
humano.
5. Polipéptido aislado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polipéptido tiene la
capacidad de inducir la proliferación astroglial.
6. Molécula de un ácido nucleico aislado que
codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores.
7. Molécula de un ácido nucleico aislado según
la reivindicación 6, que comprende la secuencia de nucleótidos dada
a conocer en la SEC ID NO:3, SEC ID NO:7 o SEC ID NO:9.
8. Anticuerpo neutralizante aislado contra el
polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 6 ó 7.
9. Anticuerpo neutralizante aislado contra el
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
10. Procedimiento para la preparación de un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,
comprendiendo dicho procedimiento expresar una moléculas de ácido
nucleico codificante de un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 en un huésped adecuado que ha crecido bajo
condiciones efectivas para la síntesis de dicho polipéptido.
11. Molécula antisentido que se hibridiza sobre
toda la longitud de una molécula de ácido nucleico según las
reivindicaciones 6 ó 7 o su complemento.
12. Composición que comprende un polipéptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y uno o más
vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
13. Utilización de un polipéptido que exhibe por
lo menos una de las siguientes propiedades:
(i) capacidad para inducir la proliferación de
las células endoteliales vasculares;
(ii) capacidad para interactuar con la familia de
receptores flt-1/flk-1;
y/o
(iii) capacidad para inducir la migración
celular, la supervivencia celular y/o los niveles intracelulares
de fosfatasa alcalina;
en la que dicho polipéptido comprende:
\newpage
- (a)
- una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos dada a conocer por la SEC ID NO:1, 3, 5, 7 ó 9 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse a la SEC ID NO:1, 3, 5, 7 ó 9 o sus formas complementarias bajo condiciones de elevada estringencia de 0,1-1 x SSC/0,1% peso/peso SDS a 60ºC durante un periodo de 1 a 3 horas; o
- (b)
- una secuencia de aminoácidos tal como se da a conocer en SEC ID NO:2, 4, 6, 8 ó 10 o una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos un 70% de similitud respecto a esta, o a una forma truncada de dicho polipéptido,
para la preparación de un medicamento para
inducir la proliferación astroglial en un mamífero.
14. Utilización según la reivindicación 13, en la
que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos
codificada por la secuencia de nucleótidos dada a conocer en la SEC
ID NO:3, SEC ID NO:7 o SEC ID NO:9.
15. Utilización según la reivindicación 13, en la
que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos tal como
se da a conocer en la SEC ID NO:4, SEC ID NO:8 o SEC ID NO:10.
16. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, en la que dicho polipéptido o la
secuencia de nucleótidos que la codifican son de origen humano.
17. Utilización de una molécula de ácido nucleico
que codifica un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 16, para la preparación de un medicamento
para inducir la proliferación astroglial en un mamífero.
18. Célula huésped que comprende una molécula de
ácido nucleico según las reivindicaciones 6 ó 7.
19. Vector que comprende una molécula de ácido
nucleico según las reivindicaciones 6 ó 7.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5928939A (en) * | 1995-03-01 | 1999-07-27 | Ludwig Institute For Cancer Research | Vascular endothelial growth factor-b and dna coding therefor |
| EP0873348A4 (en) * | 1995-06-06 | 2000-11-08 | Human Genome Sciences Inc | GROWTH FACTOR 3 OF THE HUMAN VASCULAR ENDOTHELIUM |
| PT848755E (pt) | 1995-09-08 | 2003-12-31 | Genentech Inc | Proteina relacionada com o vegf |
| ATE459715T1 (de) | 1995-09-29 | 2010-03-15 | Univ Siena | Regulierte gene und ihre verwendungen |
| WO1997017442A1 (en) | 1995-11-08 | 1997-05-15 | Immunex Corporation | Flk-1 binding protein |
| US6994989B1 (en) | 1995-11-08 | 2006-02-07 | Immunex Corp. | FLK-1 binding proteins |
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| EP0977854A2 (en) * | 1997-04-25 | 2000-02-09 | Collateral Therapeutics | Truncated vegf-related proteins |
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| EP2151454B1 (en) | 1998-11-10 | 2012-05-02 | Ludwig Institute For Cancer Research | Truncated platelet-derived growth factor D, DNA coding therefor, and uses thereof |
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| ES2312223T3 (es) | 1998-12-07 | 2009-02-16 | Zymogenetics, Inc. | Zvegf3 homologo de factor de crecimiento. |
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| AUPQ568100A0 (en) * | 2000-02-16 | 2000-03-09 | Amrad Operations Pty. Limited | A method for producing recombinant molecules |
| AU2884102A (en) | 2000-12-07 | 2002-06-18 | Sangamo Biosciences Inc | Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins |
| US7067317B2 (en) | 2000-12-07 | 2006-06-27 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins |
| US7981863B2 (en) * | 2001-09-19 | 2011-07-19 | Neuronova Ab | Treatment of Parkinson's disease with PDGF |
| WO2006094106A2 (en) | 2005-02-28 | 2006-09-08 | Sangamo Biosciences, Inc. | Anti-angiogenic methods and compositions |
| CN100448892C (zh) * | 2006-08-02 | 2009-01-07 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 抗肿瘤血管内皮生长因子受体vegf－r2抗原及其编码基因与应用 |
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| US5219739A (en) * | 1989-07-27 | 1993-06-15 | Scios Nova Inc. | DNA sequences encoding bVEGF120 and hVEGF121 and methods for the production of bovine and human vascular endothelial cell growth factors, bVEGF120 and hVEGF121 |
| US5338671A (en) * | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| ES2249762T3 (es) * | 1994-03-08 | 2006-04-01 | Human Genome Sciences, Inc. | Factor de crecimiento del endotelio vascular 2. |
| US5607918A (en) * | 1995-03-01 | 1997-03-04 | Ludwig Institute For Cancer Research | Vascular endothelial growth factor-B and DNA coding therefor |
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