PL185293B1 - Izolowany polipeptyd, izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, sposób otrzymywania polipeptydu, cząsteczka antysensowna, środek farmaceutyczny, komórka gospodarza oraz wektor - Google Patents
Izolowany polipeptyd, izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, sposób otrzymywania polipeptydu, cząsteczka antysensowna, środek farmaceutyczny, komórka gospodarza oraz wektorInfo
- Publication number
- PL185293B1 PL185293B1 PL96322067A PL32206796A PL185293B1 PL 185293 B1 PL185293 B1 PL 185293B1 PL 96322067 A PL96322067 A PL 96322067A PL 32206796 A PL32206796 A PL 32206796A PL 185293 B1 PL185293 B1 PL 185293B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- acid sequence
- molecule
- vegf
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Izolowany polipeptyd posiadający przynajmniej jedną spośród następujących cech:
(i) zdolność do indukowania proliferacji komórek nabłonka naczyniowego;
(ii) zdolność do oddziaływania z rodziną receptoróworaz
(iii) zdolność do indukowania migracji komórek, przeżywalności komórek i/lub wzrostu
wewnątrzkomórkowych poziomów alkalicznej fosfatazy;
przy czym polipeptyd zawiera:
a. sekwencję aminokwasowąkodowanąprzez sekwencję nukleotydowąprzedstawioną
na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydowązdolnądo hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do
niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji w obecności 0,1-1 x SSC/0,7%
wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin, lub
b. sekwencję aminokwasową przedstawionąna SEQ ID nr 4 lub sekwencję aminokwasową
posiadającą wobec niej przynajmniej 70% podobieństwo;
lub pochodna takiego polipeptydu, wykazująca przynajmniej jedną z cech (i) - (iii).
Description
Przedmiotem wynalazku jest izolowany polipeptyd posiadający przynajmniej jedną spośród następujących cech:
(i) zdolność do indukowania proliferacji komórek nabłonka naczyniowego;
(ii) zdolność do oddziaływania z rodziną receptorów flt-l/flk-1,, oraz (iii) zdolność do indukowania migracji komórek, przeżywalności komórek i/lub wzrostu wewnątrzkomórkowych poziomów alkalicznej fosfatazy;
przy czym polipeptyd zawiera:
a) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji wo becności 0,1-1 x SSC/0, 1% wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin, lub
b) sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4 lub sekwencję aminokwasową posiadającą wobec niej przynajmniej 70% podobieństwo; lub pochodna takiego polipeptydu, wykazująca przynajmniej jedną z cech (i) - (iii).
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową 13 przedstawioną na SEQ ID nr 5.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 7.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 9.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 6.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 8.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 10.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku jest pochodzenia ludzkiego.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku posiada przynajmniej jedną spośród następujących cech: zdolność indukowania proliferacji astrogleju, zdolność do wspomagania neuronowej żywotności i/lub proliferacji u ssaków.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku jest dojrzałą formą polipeptydu z odtrawioną sekwencją liderową. Przedmiotem wynalazku jest także izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego posiadająca sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub
185 293 sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacjj wo becności 0,1-1 x SSC/0, 1% wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 5.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 7.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 9.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4 lub sekwencję aminokwasową posiadającą wobec niej przynajmniej 70% podobieństwo.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 6.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 8.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 10.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd posiadający przynajmniej jedną spośród następujących cech:
(i) zdolność do indukowania proliferacji komórek nabłonka naczyniowego;
(ii) zdolność do oddziaływania z rodziną receptorów flt-1/flk-1, oraz (iii) zdolność do indukowania migracji komórek, przeżywalności komórek i/lub wzrostu wewnątrzkomórkowych poziomów alkalicznej fosfatazy;
lub pochodną takiego polipeptydu, wykazującą przynajmniej jedną z cech (i) - (iii).
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd dodatkowo posiadający zdolność indukowania proliferacji astrogleju.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd dodatkowo posiadający zdolność do wspomagania neuronowej żywotności i/lub proliferacji u ssaków. .
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku lub kodowany przez nią polipeptyd jest pochodzenia ludzkiego.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania polipeptydu posiadającego przynajmniej jedną spośród następujących cech:
(i) zdolność do indukowania proliferacji komórek nabłonka naczyniowego;
(ii) zdolność do oddziaływania z rodziną receptorów flt-1/flk-1, oraz (iii) zdolność do indukowania migracji komórek, przeżywalności komórek i/lub wzrostu wewnątrzkomórkowych poziomów alkalicznej fosfatazy, charakteryzujący się tym, że obejmuje ekspresjonowanie cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd zawierający:
a) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybi^r^y^^/z^cci wo becności 0,1-1 x SSC/0,1% wag./wag. SdS w 60°C przez 1-3 godzin, lub
b) sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4 lub sekwencję aminokwasową. posiadającą wobec niej przynajmniej 70% podobieństwo;
lub pochodna takiego polipeptydu w odpowiednim gospodarzu hodowanym w warunkach odpowiednich dla syntezy polipeptydu.
185 293
Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 7 i SEQ ID nr 9, albo sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SEQ ID nr 8, SEQ ID nr 10, przy czym korzystnie izolowany polipeptyd jest pochodzenia ludzkiego.
Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka antysensowna hybrydyzująca z cząsteczką kwasu nukleinowego posiadającą sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną lub z cząsteczką kwasu nukleinowego posiadającą sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzaaji wo becności 0,1-1 x SSC/0,1% 30 wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin.
Korzystnie cząsteczka antysensowna według wynalazku charakteryzuje się tym, że hybrydyzuje z cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 7, SEQ ID nr 9, albo cząsteczką kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SEQ ID nr 8, SEQ ID nr 10 lub sekwencji aminokwasowej posiadającej przynajmniej 70% podobieństwo do SEQ ID nr 4.
Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny do wywoływania proliferacji astrogleju u ssaka i/lub zwiększania przetrwania i/lub proliferacji neuronów ssaków zawierający czynnik aktywny oraz jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych nośników i/lub rozcieńczalników, charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera izolowany polipeptyd posiadający przynajmniej jedną spośród następujących cech:
(i) zdolność do indukowania proliferacji komórek nabłonka naczyniowego;
(ii) zdolność do oddziaływania z rodziną receptorów flt-l/flk-1, oraz (iii) zdolność do indukowania migracji komórek, przeżywalności komórek i/lub wzrostu wewnątrzkomórkowych poziomów alkalicznej fosfatazy;
przy czym polipeptyd zawiera:
a) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji wo becności 0,1-1 x SSC/0,1% wag./wag. SDS w 60176C przez 1-3 godzin, lub
b) sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4 lub sekwencję aminokwasową posiadającą wobec niej przynajmniej 70% podobieństwo;
lub pochodna takiego polipeptydu, wykazująca przynajmniej jedną z cech (i) - (iii).
Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że izolowany polipeptyd zawiera sekwencję aminokwaso wą kodowaną przez sekwencję nukleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SeQ ID nr 5, sEq ID nr 7 i SEQ ID nr 9, albo sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SEQ ID nr 8, SEQ ID nr 10, przy czym izolowany polipeptyd jest korzystnie pochodzenia ludzkiego lub dojrzałą formą polipeptydu z odtrawioną sekwencją liderową.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza, która zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego posiadającą sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji wo becności 0,1-1 x SSC/0,1% wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin.
Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 7, SEQ ID nr 9 albo koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SeQ ID nr 8, SEQ ID nr 10 lub sekwencji aminokwasowej posiadającej przynajmniej 70% podobieństwo do SEQ ID nr 4.
185 293
Przedmiotem wynalazku jest także wektor, który zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego cząsteczkę kwasu nukleinowego posiadającą sekwencję przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję ncklaótydówa zdolną do hybrydyzówania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji wo eeicnc^ści 0,1-1 x SSC/0, 1% wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin.
Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nckleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 7, SEQ ID nr 9 albo koduje polipeptyd zawierający sekwencję amikokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SEq ID nr 8, SEQ ID nr 10 lub sekwencji amikokwasoweO posiadającej przynajmniej 70% podobieństwo do SEQ ID nr 4.
Wynalazek zostanie dokładniej przedstawiony przy pomocy poniższych figur i przykładów, które nie ograniczającego zakresu, na rysunkach:
Figura 1. Sekwencja kukleotydowa [SEQ ID nr 1] i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasów [SEQ ID nr 2] VEGF165.
Figura 2. Sekwencja nUklaotydowa [SEQ ID nr 3] i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasów [SEQ ID nr 4] SOM175.
Figura 3. Wyniki przeszukiwania sekwencji białka SOM175 z wykorzystaniem BLAST.
Figura 4. Dopasowanie cDNA VEGF i cDNA SOM175 z wykorzystaniem BESTFIT.
Figura 5. Wielokrotne dopasowywanie VEGF,65 z SOM175 i jego wariantami składanymi na poziomie kckleotydó>w.
Figura 6. Wielokrotne dopasowywanie VEGF)65 z SOM175 i jego wariantami składanymi na poziomie aminokwasów.
Figura 7. Przedstawienie SOM175 i jego wariantów składanych w postaci diagramów.
Figura 8(a). Przedstawienie struktury gekomowaO ludzkiego gekómowagó SOM175 w postaci diagramu, pokazujące mapę agzók/iktron.
Figura 8(b). Przedstawienie struktury genomowej ludzkiego ganomowego SOM175 w postaci diagramu, pokazujące granice agzonu/iktroku.
Figura 9. Sekwencje kukleotydówa i przewidywane sekwencje peptydowe pochodzące z cDNA klonu mVRF. Numerację nukleotydów podano z lewej strony, poczynając od A kodonu inicjacyjnego. Numerację aminokwasów podano z prawej strony poczynając od pierwszej reszty przewidywanego dojrzałego białka po usunięciu przypuszczalnego peptydu sygnałowego. Przemiennie składany obszar jest podwójnie podkreślony, a uzyskana sekwencja peptydowa z każdego mRNA została włączona. Potencjalny sygnał poliadanylowania zaznaczono pogrubionymi literami. Kodony startu i stopu mVRFj67 i mYRF^ są podkreślone, a polimorficzke powtórka w 3' UTR jest zaznaczona kropkowanym prostokątem. Pozycje granic iktrok/egzon zaznaczono strzałkami.
Figura 10. Dopasowanie izoform ludzkiej i mysiej białka VRF. A: mVRFj67 i hYRF^. B: mVRF]86 i hVRF]g6, od punktu, w którym sekwencje zaczynają różnić się od odpowiednich izoform o 167 aminokwasach. Identyczność aminokwasów zaznaczono kreskami pionowymi, a aminokwasy zachowane dwukropkiem. Strzałka zaznacza przewidywane miejsce odszczepienia peptydu sygnałowego od ludzkiego i mysiego VRF.
Figura 11. Dopasowanie sekwencji peptydowych mVRF167 i mVEGFlgg (Breier i inni, 1992) z wykorzystaniem BESTFIT. Strzałka zaznacza miejsce odszczapiania peptydu sygnałowego w mVEGF. Identyczne aminokwasy są zaznaczone pionowymi kreskami, a zachowawcze podstawienia dwukropkami. Zastosowane numerowanie aminokwasów opisano w legendzie do fig. 9.
Figura 12. Porównanie struktur genu VRF (przedstawiono generyczny gen VRF, gdyż organizacja iktrok/agzon w mysim i ludzkim homologu jest prawie identyczna) z innymi członami rodziny ludzkich genów VEGF/PIGF/PDGF. Egzony zaznaczono ramkami. Obszary kodujące białko i obszary nie ulegające translacji przedstawiono odpowiednio jako części wypełnione i puste.
185 293
Zakreskowany obszar w VRF oznacza dodatkową sekwencję 3' UTR powstałą w wyniku przemiennego składania izoformy VRF186. Pokazano potencjalne produkty przemiennego składania każdego genu.
Figura 13. Autoradiogram błotu northern pełnego mRNA z różnych tkanek (zaznaczonych) dorosłych myszy hybrydyzowanych z cDNA klonu mVRF. Główny transkrypt o 11 kb wykryto we wszystkich próbkach.
Figura 14. Zdjęcia autoradiografii (A-C) i mikrografie z ciemnymi polami (D-E) ilustrujące układ mVRF i mRNA u myszy, w przypadku embriona myszy E14 (A) dodatnie sygnały są widoczne na rozwijającym się sercem (Ha) i korą mózgową (Cx). Niski sygnał tła jest również widoczny nad innymi tkankami w tej sekcji, w przypadku embriona myszy E17 (B) serce (Ha) jest wyraźnie widoczne z uwagi na silny sygnał hybrydyzacji. Równie silny sygnał występuje nad brunatną tkanką tłuszczową (Fa) z tyłu oraz wokół klatki piersiowej. Umiarkowany sygnał hybrydyzacji występuje nad rdzeniem kręgowym (SC) i językiem (T). Sygnał tła jest osłabiony w porównaniu z embrionem E14. w przypadku młodych dorosłych myszy (C-D) dodatnie sygnały są widoczne nad sercem (Ha) i tkanką tłuszczową (Fa) wokół klatki piersiowej, podczas gdy np. w przypadku płuc (Lu) znaczenie nie wystąpiło. Sygnał hybrydyzacji nad sercem jest równomiernie rozmieszczony nad całą lewą komorą, w tym nad mięśniami brodawkowymi (D). w przypadku serca E17 hybrydyzowanego z nadmiarem zimnej sondy nie występują dodatnie sygnały (D). Słupki skali: 0,5 mm (A), 1,2 mm (B), 1 mm (C), 0,3 mm (D), 0,1 mm (E) .
Figura 15. Mikrografie z ciemnymi (A i C) oraz jasnymi polami (B i D) przedstawiające ekspresję mRNA mVFR w mysiej tkance tłuszczowej (A-B) i rdzeniu kręgowym (C-D). Silny sygnał hybrydyzacji jest widoczny nad tłuszczem (A), co potwierdza silne znaczenie w sekcjach barwionych czernią sudańską (B). Słaby sygnał występuje także w mięśniu szkieletowym (M na A-B). w rdzeniu kręgowym dorosłej myszy (C) sondy mVRF uwidoczniają neuronalny układ barwienia nad istotą szara. Przeciwbarwienie toluidyną wykazało, że neurony ruchowe w rogu brzusznym, neurony wstawkowe w głębokiej części rogu grzbietowego oraz wokół kanału centralnego (nie pokazano) były silnie dodatnie w stosunku do mRNA mVRF. Słupki skali: 0,1 mm (A), 0,1 mm (B), 0,25 mm (C), 0,015 mm (D).
Figura 16. Wpływ VEGF na czuciowe neurony 8-dniowego embriona kurczaka (E8), określany jako % przetrwania, % przerostu neurytów i średnią długość neurytu (pm).
Figura 17. Wpływ VEGF i SOM175 na glej pisklęcia. Zbadano glej z ośrodkowego układu nerwowego (CNS), glej obwodowy i oligodęndrocyty CNS.
Figura 18. Wpływ różnych białek SOM175 na mysie komórki astroglejowe. 3 H (sygnały/minutę)
1. FGF-2 (10 ng/ml) - dodatnia próba kontrolna
2. SOM^C6* 1 ng/ml
3. SOMAX6 10 ng/ml
4. SOMAX6 100 ng/ml
5. SOMAX6 1000 ng/ml
6. SOMAX6 1000 ng/ml, bez heparyny
7. SOMX6** 1 ng/ml
8. SOMX6 10 ng/ml
9. SOMX6 100 ng/ml
10. SOMX6 1000 ng/ml
11. SOMX6 1000 ng/ml, bez heparyny * Doyyczy SOM17P z nieobecnym egzonem 6 ** Dotyczy SOM175
185 293
Figura 19. Wpływ różnych białek SOM175 na mysie komórki oligodendroglejowe. 3H (sygnały/minutę)
1. FGF-2 (10 ng/ml) - dodatnia próba kontrolna
2. SOMAX6* 1 ng/ml
3. SOMAX6 10 ng/ml
4. SOMAX6 100 ng/ml
5. SOMAX6 1000 ng/ml
6. SOMA 1000 ng/ml, bez heparyny
7. SOMX6** 1 ng/ml
8. SOMX6 10 ng/ml
9. SOMX6 100 ng/ml
10. SOMX6 1000 ng/ml
11. SOMX6 1000 ng/ml, bez heparyny * Dotyczy SOM175 z nieobecnym egzonem 6 ** Dotyczy SOM175
Figura 20. Wpływ różnych białek SOM175 na mysie neurony przedmózgowia. % przeżycia
1. FGF-2 (10 ng/ml) - dodatnia próba kontrolna
2. SOMAX6* 1 ng/ml
3. SOMAX6 10 ng/ml
4. SOMAX6 100 ng/ml
5. SOMAX6 1000 ng/ml
6. SOMAX6 1000 ng/ml, bez heparyny
7. SOMX6** 1 ng/ml
8. SOMX6 10 ng/ml
9. SOMX6 100 ng/ml
10. SOMX6 1000 ng/ml
11. SOMX6 1000 ng/ml, bez heparyny * Dotyczy SOM175 z nieobecnym egzonem 6 ** Dotyczy SOM175
Tabela 1
Zestawienie numerów identyfikacji sekwencji
| SEQ ID nr 1 | Sekwencja nukleotydów VEGF165 |
| SEQ ID nr 2 | Sekwencja aminokwasów VEGFi65 |
| SEQ ID nr 3 | Sekwencja nukleotydów SOM175 (cząsteczkiVEGF- podobne |
| SEQ ID nr 4 | Sekwencja aminokwasów SOM175 |
| SEQ ID nr 5 | Sekwencja nukleotydów SOM175 z z nieobecnym egzonem 6 |
| SEQ ID nr 6 | Sekwencja aminokwasów SOM175 z nieobecnym egzonem 6 |
| SEQ ID nr 7 | Sekwencja nukleotydów SOM175 z nieobecnym egzonem 6 i egzonem 7 |
| SEQ ID nr 8 | Sekwencja aminokwasów SOM175 z nieobecnym egzonem 6 i egzonem 7 |
| SEQ ID nr 9 | Sekwencja nukleotydów SOM175 z nieobecnym egzonem 4 |
| SEQ ID nr 10 | Sekwencja aminokwasów SOM175 z nieobecnym egzonem 4 |
| SEQ ID nr 11 | Oligonukleotyd |
| SEQ ID nr 12 | Oligonukleotyd |
| SEQ ID nr 13 | Oligonukleotyd |
| SEQ ID nr 14 | Oligonukleotyd |
185 293
Przykład 1. Ludzkie klony cDNA
Oryginalne cDNA SOM175 wydzielono przez selekcjonowanie ludzkiej płodowej biblioteki mózgowej (/.zapli, Stratagene) kosmidem D11S750 (Larsson i inni, 1992). Plazmid wycięto „in v/vo” uzyskując pojedynczy cDNA o 1,1 KB. Trzy niezależne klony cDNA SOM175 wydzielono również z ludzkiej płodowej biblioteki śledziony (Stratagene, Unizap) stosując wyżej wspomniany insert SOM175 jako sondę. Otrzymano 3 klony: SOM175-4A, -5A i - 6A. SOM 175-4Ajest przemiennie złożonym klonem z nieobecnym egzonem 4 (SOM175-e4). Selekcjonowanie biblioteki wykonano przeprowadzając hybrydyzację w warunkach zalecanych przez producenta biblioteki (Stratagene) i przypadkowo znaczony insert SOM175.
Wydzielono także dwa częściowe ludzkie cDNA SOM175 z biblioteki A2058 linii ludzkich komórek czerniaka λ GT11 (Clontech). Selekcjonowanie biblioteki przeprowadzono stosując warunki hybrydyzacji opisane przez Churcha i Gilberta (1994). w każdym przypadku sondę wytwarzano przez przypadkowe znaczenie produktu PCR pochodzącego z SOM175 (18f-700r).
Mysie klony cDNA
Ludzki SOM175 zastosowano także do selekcjonowania biblioteki cDNA z całego mózgu nowo narodzonych myszy (Unizap, Stratagene). Wydzielono 4 niechimeryczne klony: M175-A, B, C i D. Wszystkie klony stanowiły częściowe cDNA, a M175-C zawierał szereg intronów. 3 spośród tych cDNA nie zawierały egzonu 6.
Inny klon oznaczony jako Ml poddano pełnemu sekwencjonowaniu stwierdzając, że zawiera on pełną otwartą ramkę odczytu oraz część 5'utr i cały 3'utr.
Przykład 2. Analiza sekwencji DNA
Pełną sekwencję cDNA klonu (SOM175) złożono i pokazano na fig. 2 wraz z odpowiednią sekwencją aminokwasów. Sekwencję tą przeszukiwano w celu znalezienia otwartych ramek odczytu z wykorzystaniem programu MAP (GCG, University of Wisconsin). Zaobserwowano pojedynczą otwartą ramkę odczytu o 672 bp (fig. 2). Okazało się, że zawiera ona niewielkie 5'-nietranslowane sekwencje (2 bp). Okazało się, że obszar 3'-nietranslowany jest kompletny, gdyż zawiera on sygnał poliadenylowania i ogon poli-A.
Poszukiwania homologii w bazie danych przeprowadzono z wykorzystaniem algorytmu BLAST (wykonane w NCBI, USA). Analiza potwierdziła homologię z szeregiem ludzkich form VEGF (patrz fig. 3). Stopień homologii pomiędzy SOM175 i ludzkim VEGF165 ustalono z wykorzystaniem programu BESTFIT (CGC, University of Wisconsin, patrz fig. 4 i 5). Oszacowano, że homologia nukleotydów wynosi 69,7%, a homologię białka oceniono jako 33,3% identyczności i 52,5% zachowania przy wykorzystaniu analizy BESTFIT. Analiza BLAst sekwencji nukleotydowych potwierdziła prawie pełne dopasowanie z ludzką eksprymowaną sekwencją tag EST06302 (Adams i inni, 1993).
Wyniki te wskazują, że SOM175 koduje czynnik wzrostu strukturalnie podobny do VEGF. Obydwa geny zawierają kodony startu i stopu w podobnych pozycjach oraz wykazują dyskretne bloki homologii. Zachowanych zostało wszystkie 8 cystein oraz szereg innych reszt VEGF, które, jak się uważa, odgrywają rolę w dimeryzacji. Do reszt tych należy cysteina-47, prolina-70, cysteina-72, walina-74, arginina-77, cysteina-78, glicyna-80, cysteina-81, cysteina-82, cysteina-89, prolina-91, cysteina-122 i cysteina-124, co pokazano na fig. 6. w związku z zachowaniem struktury w VEGF i produktach genowych SOM175 możliwe jest również, że wykazują one podobne działanie. Zakłada się, że SOM175 koduje cząsteczkę VEGF-podobną, która dzieli pewne właściwości z VEGF, ale również wykazuje swoiste unikatowe właściwości. Sekwencję nukleotydową i odpowiadającą jej sekwencję aminokwasów VEGF165 pokazano na fig. 1.
Przykład 3. Procent podobieństwa i różnicy pomiędzy rodziną VEGF165 i rodziną SOM175 (białka) zanalizowano z wykorzystaniem metody Clustala, oprogramowanie MegAlign, DNSTAR, Wisconsin. Wyniki przedstawiono w tabelach 2.1 i 2.2. Wariantowo składane formy SOM175 skrócono do SOM715-e6, w którym wycięto całość egzon 6; SOM715-e6 i 7,
185 293 w których wycięto całość egzonów 6 i 7; oraz SOM175-e4, w którym wycięto całość egzonu 4. Złożoną formę SOM175 pokazano na fig. 7. Mapy ganomewa SOM175 z zaznaczonymi granicami int-on/egzon przedstawiono na fig. 8a i 8b.
Tabela 2.1
A. Procent podobieństwa nukleotydów pomiędzy złożonymi wariantami SOM175 i ludzkim VEGF]65
| vegf165 | SOM175 | SOM175-e6 | SOM175-e&7 | SOM175-e4 | |
| VEGF,65 | * * * | 34,9 | 39,7 | 41,4 | 37,0 |
| SOM175 | * * * | 98,9 | 95,6 | 99,2 | |
| SOM175-e6 | 98,8 | 84,0 | |||
| SOM175-e6 & 7 | * * * | 80,3 | |||
| SOM175-e4 | *** |
B. Procent różnic w kuklaetydanh pomiędzy złożonymi wariantami SOM175 i ludzkim VEGFI65
| VEGF,65 | SOM175 | SOM175-e6 | SOM175-e&7 | SOM175-e4 | |
| VEGF,65 | * * * | 46,7 | 41,6 | 41,7 | 41,8 |
| SOM175 | * * * | 0,2 | 0,2 | 0,0 | |
| SOM175-e6 | *** | 0,0 | 0,2 | ||
| SOM175-e6 & 7 | * ** | 0,3 | |||
| SOM175-e4 | * * * |
Tabela 2.2
A. Procent identyczności aminokwasów pomiędzy złożonymi wariantami SOM175 i ludzkim VEGF165
| VEGF,65 | SOM175 | SOM175-e6 | SOM175-e&7 | SOM175-e4 | |
| VEGF„5 | * * * | 31,4 | 42,3 | 33,5 | 40,6 |
| SOM175 | * * * | 74,7 | 73,7 | 99,1 | |
| SOM675-e6 | *** | 76,8 | 99,1 | ||
| SOM175-e6 & 7 | * * * | 99,1 | |||
| SOM175-e4 | * * * |
B. Procent różnic w aminokwasach pomiędzy złożonymi wariantami SOM175 i ludzkim VEGFI65
| VEGF,65 | SOM175 | SOM175-e6 | SOM175-e&7 | SOM175-e4 | |
| VEGFj65 | * * * | 65,7 | 55,4 | 54,6 | 57,4 |
| SOM175 | * * * | 19,9 | 4,2 | 0,0 | |
| SOM175-e6 | *** | 0,0 | 0,0 | ||
| SOM175-e6 & 7 | * * * | 0,0 | |||
| SOM175-e4 | * * * |
Przykład 4. Testy biologiczne do wyznaczania działania SOM175
Testy przeprowadzono w celu ocenienia, czy SOM175 wykazuje podobną aktywność jak VEGF w odniesieniu do działania komórek nabłonkowych, ang^e^zy i gojenia się ran. Inne testy przeprowadzono w oparciu o wyniki badań rozkładu wiązania receptorów.
185 293
Test działania komórek nabłonkowych
Proliferacja komórek nabłonkowych. Testy wzrostu komórek nabłonkowych opisali Ferrara i Henzel (1989) oraz Gospodarowicz i inni (1989).
Test przepuszczalności naczyń. Test ten, w którym wykorzystuje się test Milesa na świnkach morskich, przeprowadzono w sposób, który opisali Miles i Miles (1952).
Test adhezji komórek. Zanalizowano wpływ SOM175 na adhezję polimorf do komórek nabłonkowych.
Chemitaksja. Wykonano ją stosując standardową komorę Boydena do testu chemotaksji.
Test aktywatora plazminogenu. w komórkach nabłonkowych oznaczono aktywator plazminogenu oraz wytwarzanie inhibitora aktywatora plazminogenu po dodaniu SOM175 (Pepper i inni (1991)).
Test migracji komórek nabłonkowych. Zdolność SOM175 do pobudzania migracji komórek nabłonkowych i tworzenia cew zbadano w sposób opisany przez Montesano i innych (1986).
Test angiogenezy
Wywoływanie przez SOM175 reakcji angiogenicznej w błonie kosmówki omoczniowej pisklęcia zbadano w sposób, który opisali Leung i inni (1989).
Ewentualne działanie neurotroficzne SOM175 oceniono z wykorzystaniem następujących testów:
Ocena przerostu neurytów i indukcji genu (komórki C12)
Komórki P12 (linia komórek barwiaka chromochłonnego) reagują na NGF i inne czynniki neurotroficzne rozwijając charakterystyczne współczulne neurony obejmujące indukcję wczesnych i późnych genów oraz wydłużanie neurytów. Komórki wystawiono na działanie SOM175, po czym śledzono ich reakcję (Drinkwater i inni (1991) oraz Drinkwater i inni (1993)).
Hodowane neurony z obwodowego układu nerwowego (PNS)
Pierwotne hodowle następujących neuronów PNS wystawiono na działanie SOM175, po czym prowadzono monitoring w celu wykrycia ewentualnych reakcji:
- neurony czuciowe ze zwojów nerwowych grzebienia i korzenia tylnego
- neurony współczulne z współczulnych zwojów łańcuchowych
- pochodzące z plakody neurony czuciowe ze zwoju dolnego nerwu błędnego
- neurony ruchowe z rdzenia kręgowego.
Testy te opisali Suter i inni (1992) oraz Marinou i inni (1992).
Gdy obserwuje się reakcję in vitro, przeprowadza się testy in vivo w celu określenia w/aściwości takich jak wychwyt i transport wsteczny, w sposób opisany przez Hendry'ego i innych (1992).
Regeneracja nerwu (PNS)
Gdy obserwuje się działanie neutrotroficzne SOM175, jego ewentualną rolę w regeneracji aksonotmezowanych neuronów czuciowych, neuronów współczulnych i neuronów ruchowych analizuje się metodami, które opisali Otto i inni (1989), Yip i inni (1984) oraz Hendry i inni (1976).
Działanie SOM175 na neurony CNS
Zdolność SOM175 do podtrzymywania przeżycia neuronów ośrodkowego układu nerwowego analizuje się sposobami, które opisali Hagg i inni (1992), Williams i inni (1986), Hefti (1986) oraz Kromer (1987).
Gojenie się ran
Zdolność SOM175 do podtrzymywania gojenia się ran bada się na dostępnych modelach o największej wiarygodności klinicznej, jako to opisali Schilling i inni (1959), a zastosowali Hunt i inni (1967).
Układ hemopoetyczny
Dostępne są różne testy in vitro i in vivo na określonych populacjach układu hemopoetycznego, które wymieniono poniżej:
185 293
Test na komórkach macierzystych układu krwiotwórczego
Test na myszach. Opracowano szereg testów in vitro dla mysich komórek macierzystych układu krwiotwórczego z wykorzystaniem komórek oczyszczonych metodą FACS:
(a) Repopulacja mysich komórek macierzystych układu krwiotwórczego
Są to komórki zdolne do repopulacji w szpiku kostnym myszy napromieniowanych śmiertelną dawką, wykazujące fenotyp Lin', Rhhl, Ly-6A/E+, c-kit+. Ocenia się działanie na te komórki samej badanej substancji lub prowadzi się inkubację z wieloma czynnikami, po czym mierzy się proliferację komórek na podstawie wbudowywania 3H tymidyny.
(b) Komórki macierzyste układu krwiotwórczego późnego stadium
Są to komórki wykazujące stosunkowo niewielką zdolność do repopulacji w szpiku kostnym, które jednak mogą wytwarzać D13 CFU-S. Są to komórki o fenotypie Lin', Rhhl, Ly6A/E + c-kit+. Badaną substancję inkubuje się z tymi komórkami przez pewien okres, po czym wstrzykuje się biorcom napromieniowanym śmiertelną dawką i określa się liczbę kolonii Dl 3 śledziony.
(c) Komórki wzbogacone w przodka bezpośredniego
Są to komórki, które reagują in vitro na pojedyncze czynniki wzrostu, o fenotypie Lin-, Rh111, Ly-6A/E+, c-kit+. Test ten wykazuje, czy SOM175 może oddziaływać bezpośrednio na hemopoetyczne komórki rodzicielskie. Badaną substancję inkubuje się z komórkami w agarze, a po 7-14 dniach określa się liczbę kolonii.
Miażdżyca tętnic. Komórki mięśni gładkich odgrywają kluczową rolę w rozwoju lub zapoczątkowaniu miażdżycy tętnic, co wymaga zmiany ich fenotypu z kurczliwego w stan syntetyczny. Makrofagi, komórki nabłonkowe, limfocyty T i płytki krwi odgrywają rolę w rozwoju płytek miażdżycowych poprzez wpływ na wzrost modulowanie fenotypu komórki mięśni gładkich. Test in vitro, w którym mierzy się szybkość proliferacji i modulowanie fenotypu komórek mięśni gładkich w wielokomórkowym otoczeniu, wykorzystuje się do oceny wpływu SOM175 na komórki mięśni gładkich. W układzie wykorzystuje się zmodyfikowaną komorę Rose'a, w której różne typu komórek wysiewa się na przeciwległych szkiełkach nakrywkowych.
Wpływ SOM175 na kości. Zdolność SOM175 do regulowania proliferacji osteoblastów ocenia się w sposób opisany przez Lowe’a i innych (1991). Jakikolwiek wpływ na resorpcję kości ocenia się w sposób opisany przez Lowe’a i innych (1991). Wpływ na migrację osteoblastów oraz zmiany w cząsteczkach wewnątrzkomórkowych (np. nagromadzanie cAMP. poziomy fosfatazy alkalicznej) analizuje się w sposób opisany przez Midy’ego i innych (1994).
Wpływ na komórki mięśni szkibletowych.Wpływ SOM175 na proliferację mioblastów i rozwój miotubuli określić można w sposób opisany przez Ewtona i innych (1980) oraz Gospodarowicza i innych (1976).
Przykład 5. Klonowanie mysiego DNA VEGF
Wydzielanie cDNA. Mysie klony VRF (mVRF) wybrano biblioteki cDNA z całego mózgu noworodków /.zap (Stratagene). Pierwotne fagi z filtrów o wysokiej gęstości (5 x 104 pfu/płytkę) zidentyfikowano na drodze hybrydyzacji z 32P-znaczoną sondą o 628 bp wytworzoną w PCR z cDNA hVRF (pSOM175) w sposób opisany powyżej. Hybrydyzację i przemywanie z określoną ostrością membran poliamidowych (Hybond-N) prowadzono w 65°C w warunkach opisanych przez Churcha i Gilberta (1984). Dodatnie łysinki wyizolowano, oczyszczono i wycięto in vivo uzyskując kolonie bakteryjne zawierające klony cDNA w pBluescript SK-.
Wydzielanie klonów genomowych. Genomowe klony wydzielono z biblioteki mysiego szjZbpuSV/129 klonowanego w wektorze X Fix II (Stratagene). Filtry o wysokiej gęstości (5 x 104 pfu/filtr) selekcjonowano 32P-znaczoną sondą o 563 bp wytworzoną przez amplifikację PCR nukleotydowego obszaru 233-798 z cDNA mVRF (patrz fig. 9). Dodatnie klony zebrano tamponem i ponownie selekcjonowano z wykorzystaniem filtrów zawierających 400-800 pfu. Preparaty fagowe w dużej skali otrzymano z wykorzystaniem zestawu QUIAGEN X lub stosując oczyszczanie za pomocą ZnCl2 (Santos, 1991).
185 293
Sekweccjonowanie i analiza nukleotydów. cDNA sekwencjonowano w obydwu niciach z wykorzystaniem różnych opartych na wektorach i wewnętrznych starterów, stosując zestawy do sekwencjonowania z terminatorem barwnika, z Applied Biosystems, Incorporated (ABI), zgodnie ze specyfikacją producenta. Sekwencje analizowano w zautomatyzowanym aparacie DNA tequeneey Model 373A z ABI. Dopasowywanie homologii peptydów przeprowadzono z wykorzystaniem programu BESTFIT (GCG, Wisconsm).
Identyfikacja granic ictrocu/egzocu. Identyfikację granic egzonu oraz obszarów flankujących przeprowadzono z wykorzystaniem PCR z mysim genomowym DNA lub z genomowymi klonami XX mVFR jako matrycami. Startery zastosowane w PCR do identyfikacji intronów pochodziły z sekwencji hVRF, a w celu umożliwienia potencjalnej hybrydyzacji błędnych sekwencji ludzko-mysich reakcję prowadzono w temperaturze o 5-10°C niższej od oszacowanej T Wszystkie produkty PCR rozdzielono pod względem wielkości na drodze elektroforezy na żelu agarozowym oraz oczyszczano na żelu z wykorzystaniem szybko wirujących kolumn QIAquick (Quiagen), a granice mtron/egzon sekwencjonowano bezpośrednio z tych produktów. Dodatkowo pewne połączenia składane sekwenejonowano z tubklonowanyeh genomowych fragmentów MVRF. Granice intron/egzon identyfikowano porównując cDNA z sekwencjami genomowego cDNA.
Analiza northern. Całkowity komórkowy RNA otrzymano z zestawu świeżych tkanek normalnych dorosłych myszy (mózg, nerki, wątroba, mięśnie) wykorzystując metodę Chomezyctki’ego i SacchRego (1987). 20 pg całkowitego RNA poddano elektroforezie, przeniesiono na membranę poliamidową (Hybond N, Amersham) i hybrydyzowano w zwykłych warunkach (Church i Gilbert, 1984). Filtry przemyto w 65°C w 0,1 x SsC (20 x SSC w 3M NaCl/O,3 M cytrynianie trisodowym), 0,1% SDS, po czym wykonano ekspozycję z błoną rentgenowską z ekranami intensyfikującymi, w -70°C przez 1-3 dni.
Charakterystyka cDNA mVRF, Mysie homologi mVRF wydzielono przez selekcjonowanie mysiej biblioteki cDNA klonem cDNA hVRF. Odzyskano 5 klonów o wielkościach w zakresie 0,8-1,5 kb, które następnie poddano sekwencjocowaniu. Sekwencje cDNA złożono uzyskując pełnej długości sekwencję cDNA o 1041 bp obejmującą całą otwartą ramkę odczytu (621 bp lub 564 bp, w zależności od postaci złożenia, patrz poniżej) oraz 3’ UTR (379 bp), a także 163 bp z 5' UTR (fig. 9).
Przewidywany kodon inicjacyjny pasował do pozycji kodonu startowego w hVRF. Inny kodon z ramki ATG zlokalizowano w pozycji -47, a dwa kodony terminacyjne zaobserwowano w górę (odpowiednio w pozycjach -9 i -33) oraz w ramce z domniemanym kodonem inicjacyjnym.
Okazało się, że przewidywany N-końcowy peptyd sygnałowy z hVRF występuje w mVRF z 81% identyczności (aminokwasy 17/21). Oczekuje się, że rozszczepienie peptydu w mVRF wystąpi po reszcie 21 (fig. 10). Dane te sugerują, że dojrzały mVRF jest wydalany, w związku z czym nie wyklucza się, że może on działać jako czynnik wzrostu.
Podobnie jak w hVRF, dwie otwarte ramki odczytu (ORF) wykryto również w cDNA wydzielonych na drodze selekcjonowania biblioteki. Stwierdzono, że 4 lub 5 klonów stanowią klony przemiennie złożone, nie zawierające fragmentu o 101 bp, homologicznego z egzonem 6 w hVRF. Ustalono przewidywane sekwencje peptydowe dwóch izoform mVRF, dopasowując je następnie do odpowiednich izoform ludzkich (fig. 10).
Informacja kodująca mVRF,86 zawiera ORF o 621 bp z sekwencjami kodującymi kończącymi się w pozycji +622, w kierunku końca egzonu 7 (fig. 9). Mniejsza informacja kodująca mVR^167 w rzeczywistości kończy się w dół od miejsca +622 TAG z uwagi na przesunięcie ramki spowodowane odszcze^^em egzonu 6 o 101 bp oraz wprowadzeniem kodonu stopu w pozycji +666, blisko początku egzonu 8 (fig. 9).
Białko VRFj86 wykazuje silną homologię z aminową i środkową częścią VEGF, natomiast koniec karboksylowy jest zupełnie odmienny i jest wzbogacony w alaninę. mVRF]86 wykazuje te podobieństwa, a także zachowuje homologię z mVEGF na prawo do końca C (fig. 11). Ogólna homologia mYRF^ z hVRF167 obejmowała odpowiednio 85%
185 293 identyczności i 92% podobieństwa (fig. 10). Natomiast homologia pomiędzy mVRF167 i VEGF (Breier i inni, 1992) obejmowała odpowiednio 49% identyczności i 71% podstawienia zachowawczych aminokwasów (fig. 11).
Kanoniczny sygnał poliadenylowania kręgowców (AATAAA) (Bimstiel i inni, 1986) nie występował w cDNA mVRF, natomiast bardzo zbliżona sekwencja GATAAA występuje w podobnych pozycjach zarówno w mysim jak i w ludzkim cDNA VRF (fig. 9). Stwierdzono, że w przeciwieństwie do hVRF w mVRF znajduje się dinukleotydowa powtórka AC na samym końcu 3' w 3' UTR (pozycje nukleotydów 998 do 1011, fig. 9). Polimorfizm tego obszaru powtórkowego zaobserwowano w pewnych cDNA mVRF z liczbą dinukleotydów wahającą się od 7 do 11.
Genomowa charakterystyka mVRF, Granice intron/egzon (tabela 3) zmapowano z wykorzystaniem starterów, które flankują sekwencje homologiczne z odpowiednimi granicami hVRF. Introny I, III, IV oraz VI z mVRF (tabela 3, fig. 12) były mniejsze niż sekwencje intronowe hVRF. Pełną sekwencję genomową złożono z 5' UTR z mVRF do intronu VI, największego obszaru intronowego (2,2 kb), poddając sekwencjonowaniu zamplifikowane introny i klonowane genomowe części mVRF. Pomiędzy mVRF i hVRF występowała tylko jedna znacząca różnica 'w strukturze genomowej, polegająca na tym, że granica egzon 7/intron VI w mVRF była zlokalizowana o 10 bp bardziej w dół w stosunku do sekwencji cDNA, tak że egzon 7 w mVRF jest o 10 bp dłuższy od odpowiedniego egzonu w hVRF.
Egzony 6 i 7 sąsiadują w mVRF, podobnie jak w ludzkim homologu. Silna homologia sekwencji egzonu 6 w mVRF i hVRF (fig. 10) sugeruje, że sekwencja ta nie stanowi zachowanej sekwencji intronowej, ale raczej koduje funkcyjną część izoformy VRF186.
Ogólna struktura intron/egzon jest zachowana w różnych elementach rodziny genu VEGF (VEGF, PIGH, hVRF) i z tego względu nie jest zaskoczeniem, że ogólna organizacja genomowa genu mVRF jest bardzo podobna do organizacji tych genów (fig. 12).
Przeprowadzone wcześniej porównawcze mapowania wykazały, że obszar otaczający locus choroby ludzkich licznych nowotworów układu gruczołów hormonalnych typu 1 w chromosomie 19 jest synteniczny z bliskim segmentem mysiego chromosomu 19 (Rochelle i inni, 1992). w związku z tym, że twórcy wynalazku zmapowali gen hVRF w ludzkim locus MEN1 o 1 kb (patrz wyżej), jest bardzo prawdopodobne, że mysi gen VRF mapuje się w pobliżu centromeru chromosomu 19.
Badania ekspresji mVRF. Analiza northem RNA z tkanek dorosłej myszy (mięsień, serce, płuca i wątroba) wykazała, że ekspresja jest bardzo rozpowszechniona i objawia się przede wszystkim jako główne pasmo o wielkości około 1,3 kb (fig. 14). Różni się to w pewnym stopniu od układu obserwowanego w hVRF, gdzie zidentyfikowano dwa główne pasma o 2,0 i 5,5 kb we wszystkich badanych tkankach. Informacja mysia o 1,3 kb prawdopodobnie odpowiada krótszemu z ludzkich transkryptów, a odmienna jej wielkość jest najprawdopodobniej spowodowana różnicą w długości odpowiednich 5' UTR.
Przykład 6. Ekspresja mysiego VEGF w nienarodzonych i narodzonych myszach
Zwierzęta. Ciężarne (n=4) i młode dorosłe (n-2) myszy (szczep wsobny C57, ALAB, Szwecja) uśmiercono dwutlenkiem węgla, po czym odpowiednie tkanki pobrano i zamrożono na pożywce. Tkanki trzymano w 70°C przed dalszym wykorzystaniem, w badaniach zastosowano myszy o dwóch różnych wiekach ciążowych: embrionalny dzień 8 *E8), 14 i E17.
Histochemia hybrydyzacji in situ
Hybrydyzację in situ przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (Dagerlind i inni, 1992). w skrócie poprzeczne sekcje (14 pm) wycięto w kriostacie (Mierom, Niemcy), odmrożono na szkiełkach Probe-On (Fisher Scientific, USA) i przechowywano w zamkniętych czarnych pudełkach w -70°C aż do wykorzystania. Sekwencje syntetycznych 42-merowych oligonukleotydów komplementarnych z mRNA kodującym mVRF były następujące:
ACCACCACCTCCCTGGGCTGGCATGTGGCACGTGCATAAACG [SEQ ID nr 11] (komplementarna z nt 120-161) oraz
AGTTGTTTGACCACATTGCCCATGAGTTCCATGCTCAGAGGC [SEQ ID nr 12]
185 293 (komplementarna z nt 162-203). W celu wykrycia dwóch wariantowych składanych form użyto oligonukleotyd
GATCCTGGGGCTGGAGTGGGATGGATGATGTCAGCTGG [SEQ ID nr 13] (komplementarna z ny xxx-xxx) oraz
GCGGGCAGAGGATCCTGGGGCTGTCTGGCCTCACAGCACT [SEQ ID nr 14]. Sondy znaczono na końcu 3' [tio]trifosforanem dezoksyadenozyny [35S] (NEN, USA) stosując terminalną transferazę dezoksynukleotydylową (IBI, USA), do uzyskania aktywności właściwej 7-10 x 108 impulsów na sekundę/pg, a następnie hybrydyzowano z sekcjami bez obróbki wstępnej przez 16-18 godzin w 42°C. Mieszanina hybrydyzacyjna zawierała 50% objęt. formamidu, 4 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl i 0,015 M cytrynian sodu), 1 x roztwór Denhardta (po 0,02% poliwinylopirolidonu, BSA i Ficollu), 1% objęt. sarkozylu (N-laurylosarkozyny, Sigma), 0,02 M bufor fosforanowy (pH 7,0), 10% wag./objęt. siarczanu dekstryny (Pharmacia, Szwecja), 250 pg/ml drożdżowego tRNA (Sigma), 500 pg/ml DNA ucieranego i zdenaturowanego cieplnie nasienia łososia oraz 200 mM ditiotreitol (DTT, LKB, Szwecja), w sekcjach kontrolnych specyficzność obydwu sond sprawdzano dodając 20-krotny nadmiar sondy nieznaczonej do mieszaniny hybrydyzacyjnej. Dodatkowo sąsiednie sekcje hybrydyzowano z sondą nie spokrewnioną z sekcjami stosowanymi w tym badaniu, uzyskując odmienny układ ekspresji. Po hybrydyzacji sekcje przemywano szereg razy w 1 x SSC w 55°C, odwadniano etanolem i zanurzano w emulsji do wykrywania promieniotwórczości NTB2 (Kodak, USA). Po 3-5 tygodniach sekcje wywoływano w wywoływaczu D-19 (Kodak, USA) i nakrywano szkiełkiem przykrywkowym, w pewnych przypadkach sekcje nanoszono na błonę autoradiograficzną (błoną do autoradiografii Beta-max z Amersham Ltd., W. Brytania) przed zanurzeniem w emulsji.
różne sondy dały identyczne obrazy hybrydyzacyjne we wszystkich badanych tkankach. Ekspresję mysiego VRF wykryto już w embrionie E8, w którym dodatni sygnał zarejestrowano nad strukturą najprawdopodobniej odpowiadającą cewie nerwowej, w sekcjach strzałkowych mysiego embriona E14 najsilniejszy sygnał hybrydyzacji występował nad sercem i w układzie nerwowym, zwłaszcza w korze mózgowej (fig. 14A). Niski poziom ekspresji występował we wszystkich innych tkankach, w późniejszym wieku ciążowym, E17, wysoki sygnał mRNA mVRF przypisano sercu i brunatnej tkance tłuszczowej w grzbiecie i wokół szyi (fig. 14B). Wyraźne dodatnie sygnały hybrydyzacji występowały w istocie szarej rdzenia kręgowego oraz w języku (fig. 14B). Ekspresja w korze mózgowej była wyraźnie słabsza niż w dniu 14. Słaba ekspresja tła obserwowana u embriona E14, np. w mięśniu, w tym wieku ciążowym uległa osłabieniu. Silny sygnał hybrydyzacji mRNA mVRF u młodych dorosłych myszy występował jedynie nad sercem i w brunatnej tkance tłuszczowej (fig. 14C). Sygnał nad sercem był równomiernie rozmieszczony na całej ściance przedsionka, w tym na mięśniach brodawkowych (fig. 14D). W sekcjach tkanki sercowej hybrydyzowanej z nadmiarem zimnej sondy nie wykryto swoistego znakowania ponad poziomem tła (fig. 14E).
Poza sercem sygnał mRNA mVRF występował w pewnych tkankach na zewnątrz klatki piersiowej, morfologicznie przypominających brunatny tłuszcz. Potwierdzono to na podstawie przeciwbarwienia czernią sudańską, które wykazało silne zabarwienie w tych samych obszarach (fig. 15A i 15B). w poprzecznych sekcjach rdzenia kręgowego dorosłej myszy sondy mVRF uwidaczniają neuronalny układ barwienia nad istotą szarą (fig. 15C). Przeciwbarwienie toluidyną (fig. 15D) wykazało, że neurony ruchowe w rogu brzusznym (fig. 15C i 15D), neurony wstawkowe (fig. 15C) w głębokiej części rogu grzbietowego oraz wokół kanału centralnego (nie pokazano) były silnie dodatnie w stosunku do mRNA mVRF.
Przykład 7. Wpływ białek VEGF i SOM175 na neurony czuciowe kurczęcia
Wpływ białek VEGF i SOM175 na neurony czuciowe 8-dniowego embriona kurczęcia określono z wykorzystaniem metody Nurcombre’a i innych (1992). Test neuronalny odczytywano po 48 godzinach stosując 2000 komórek/studzienkę. Wyniki uzyskano przez zliczanie 3H-tymidyny. Procent przeżycia neuronów, przerost neurytów oraz średnią długość
185 293 neurytów w pm wyznaczono stosując NGF jako dodatnią próbę kontrolną oraz VEGF w różnych stężeniach, VEGF wo becności heparyny i VEGF wo beckości heparyny i 5 pM 5'-fluoroureeylu (5FU). 5FU zabija komórki glejowe.
Wyniki przedstawiono na fig. 16. Wyniki te wskazują, że VEGF skutecznie podtrzymuje przetrwanie neuronów, z tym że wymaga to obecności komórek glejowych. Na fig. 17 przedstawiono wyniki wpływu VEGF i SOM175 na 3 typy gleju kurczaka. Zbadano gleje CNS, gleje obwodowe i oligodendrocyty CNS. Heparynę zastosowano w stężeniu 10 pg/ml we wszystkich hodowlach, a test odczytywano po 24 godzinach. Wyniki oznaczano jako zliczenia 3H-tymidyny stosując 2000 komórek/studzienkę.
Wyniki wskazują, że dla ośrodkowych i obwodowych neuronów kurczaka proliferacja astroglaju była znacząco pobudzana przez SOM175 wo becności heparyny, natomiast dla oligodakdronytów kurczaka zaobserwowano minimalny wzrost szybkości podziału.
Przykład 8. Wpływ białek SOM175 na neurony główne i ośrodkowe
Wyniki uzyskane w przykładzie 7 wskazują, że izoforma VEGF wywiera wpływ na główne i ośrodkowe neurony kurczaka poprzez oddziaływanie na komórki astroglejowe. Podobne doświadczenia powtórzono na komórkach mysich.
Warunki hodowli
Komórki naurokalna i glejowe do wszystkich doświadczeń in vitro preparowano i hodowano zgodnie z technikami opisanymi w „Methods in Neurosniannes (Vol. 2): Cell Culture”, red. P.M. Conn, Academin Press, San Diego, 1990, str. 33-46 dla komórek astroglejowych, str. 56-74 dla komórek oligodendroglejowych oraz 87-102 dla neuronów ośrodkowych.
Komórki wysiano na 24-studziekkowynh płytkach do hodowli (Nunc) powleczonych poli-L-óluityką (0,1 mg/ml, 1 godzina) w ilości 2000 komórek/studzienkę. Po hodowaniu przez 48 godzin neurony zliczono w studzienkach z wykorzystaniem światła z odwróconą faza, stosując dobrze znane techniki (Maruta i inni, 1993), a komórki glejowe oszacowano na podstawie wchłaniania [3H]tymidyny, w celu monitorowania szybkości podziału komórek, jak to opisano poniżej. Heparyna (10 pg/ml, frakcja o niskim ciężarze cząsteczkowym. Sigma Chemical Corp.) była obecna w hodowli we wszystkich przypadkach z zaznaczonymi wyjątkami. Hodowle keurokalna uzupełniono 5 mM 5-fluoro-2-dezoksyurydyną (Sigma) w celu zahamowania wzrostu gleju stanowiącego tło.
Badanie wpływu wprowadzania 3H-tymidyny na proliferację komórek glejowych
Komórki pulsacyjnie zasilano przez 14 godzin 3H-tymidyną (aktywność właściwa 103 pCi/pg) w postaci podstawowego roztworu o stężeniu 0,1 mCi/ml w standardowym ośrodku, uzyskując końcową objętość inkubacyjną 20 pl/studzienkę. Zawartość studzienek zbierano i absorbowano na papierze nitrocelulozowym (Titertek, Flow). Pozostające przyklejone komórki usuwano przez 5-mikutówą inkubację z trypsyną/wersekem (CLS Limited, Victoria, Australia). Procedurę tą powtarzano dwukrotnie. Krążki z nitrocelulozy przemywano w standardowym aparacie do zbierania komórek Titertek (Flow) stosując najpierw wodę destylowan<ą a następnie metanol. Krążki nitrocelulozowe suszono, dodawano płyn scyntylacyjny (zawierający 5% objęt. środka Triton-N) i krążki zliczano w liczniku scyntylacyjnym.
Największą aktywność zaobserwowano dla preparatów SOM175 bez egzonu 6 SOMaX6 w hodowlach mysich komórek astroglej owych, gdzie wystąpiło znaczące pobudzenie ich proliferacji przy zastosowaniu preparatów w połączeniu z heparyną (fig. 16). Niewielkie pobudzanie proliferacji wystąpiło w przypadku komórek oligodendroglejowych (fig. 17), oraz bardzo mało wyróżniające się wzmocnienie przetrwania izolowanych neuronów przedmózgowia (fig. 18). Odchylenie standardowe na wszystkich trzech wykresach dla każdego punktu wynosiło poniżej 8%.
Żywotność neuronów można utrzymać pobudzając proliferację komórek glejowych. Ponadto SOMAX6 stanowi dobry środek indukujący proliferację astrogleju i może być eksprymoweeky w połączeniu z powstawaniem astroglejowych stopek końcowych na komórkach nabłonkowych ośrodkowego układu karuΌwego.
185 293
Dla specjalistów zrozumiałe jest, że w opisanym wynalazku dokonać można zmian i modyfikacji innych niż konkretnie opisane. Należy zdawać sobie sprawę, że wynalazek obejmuje wszystkie takie zmiany i modyfikacje. Wynalazek obejmuje również swym zakresem wszystkie etapy, cechy, kompozycje i związki przywołane lub zaznaczone w opisie, pojedynczo lub łącznie, a także każdą oraz wszystkie kombinacje dwóch lub więcej takich etapów lub cech.
Tabela 3
Połączenia składane, mysiego genu VRF
| 5' UTR... | Egzon 1 | >223bp | CCCAGgtacgtgcgt | Intron I | 495bp |
| ttccccacagGCCC | Egzon 2 | 43bp | GAAAGgtaataaatag | Intron II | 288bp |
| ctgcccacagTGGTG | Egzon 3 | 197bp | TGCAGgtaccagggc | Intron III | 196bp |
| ctgagcacagATCCT | Egzon 4 | 74bp | TGCAGgtgccagccc | Intron IV | 182bp |
| ctcttttcagACCTA | Egzon 5 | 36bp | GACAGattcttggtg | Intron V | 191bp |
| ctcctcctagGGTTG | Egzon 6 | 101bp | (bez intronu) | ||
| CCCACTCCAGCCCCA | Egzon 7 | 135bp | TGTAGgtaaggagtc | Intron VI | ~2200bp |
| cactccccagGTGGC | Egzon 8 | 394bp | AGAGATGGAGACACT |
Duże i małe litery oznaczają odpowiednio sekwencje egzonowe i intronowe * Oznacza, że koniec 5' egzonu 1 nie został jeszcze ustalony.
185 293
Bibliografia
Adams MD, Soares MB, Kerlavage· AR, Fields C, Venter JC, (1993) Nature Genet. 4,
373-380.
Bimstiel ML, Busslinger M and Strub K (1985) Cell 41, 349-359.
Breier G, Albrecht U, Sterrer S and Risau W (1992) Development 114, 521-532.
Chomczynski P and Sacchi N (1987) Analyt. Błochem. 162, 156-159.
Church G and Gilbert w (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 18, 1991-1995.
Dagerlind A, Friberg K. Bean AJ and Hokfelt T (1992) Histochemistry 98, 39-49.
Dissen GA, Lara HE, Fabrenbach WH, Costa ME, Ojeda SR, (1994) Endocrinology 134,
1146-1154.
Drinkwater CC, Barker PA, Suter U and Shooter EM (1993) J. Biol. Chem, 268,
23202-23207.
Drinkwater CC, Suter U, Angst C and Shootar EM (1991) Proc:. Roy Soc. Lond. (Series B), 246,
307-313.
Ewton DZ & Florini JR (1980) Endocrinology, 106: 577-583.
Ferrara N & Henzel WJ (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 161, 851-858. Folkman J & Shing Y (1992) J Biol. Chem. 267, 10931-10934.
Gospodarow^ D, Abraham JA & Schilling J (1989) Proc:. Natl. Acad. Sci USA 86,
7311-7315.
Gespodarowicz D, Weseman J, Morgan JS & Lindstrom J (1976) J. Cell Biol., 70:
395-405.
Hagg T. Quek D, Higaki J & Varon S (1992) Neuron, 8, 145-158.
Hefti S (1986) J. Neurosci, 6, 2155-2162.
Hendry IA& Campbell J (1976) J. Neurocytol, 5, 351-360.
Hendry IA, Murphy M, Hilton DJ, Nicola NA & Bartlett PF (1992) J. Neurosci. 12,
3427-3434.
Hunt et al., (1967) Am. J. Surgery, 114: 302-307.
Koch AE, Harlow LA, Haines GK, Amento EP, Unemoti EN, Wong WL, Pope RM,
Ferrara N, (1994)7. Immunol. 152, 4149-4156.
Kromer AF (1987) Science, 235, 214-216.
Larsson C, Weber G, Kvanta E, Lewis C, Janson M, Jones C, Glaser T, Evans G. Nordenskjold M, (1992) Hum. Genet. 89, 187-193.
OZUS Leung DW. Cachianes G, Kuang W-J. Goeddel DV & Ferrara N (1989) Science
246:1306-1309.
Lowe C, Cornish J, Callon K, Martin TJ & Reid IR (1991) J. Bone Mineral Res, 6.
1277-1283.
Lowe C, Cornish J, Martin TJ & Reid IR (1991) Calcif. Tissue Int., 49, 394-397. Martinou JC, Martinou I & Kato AC (1992) Neuron, 8, 737-744.
Maruta et al (1993) Growth Factors 8: 119-134.
Midy V & Plouet J (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun, 199: 380-386.
Miles AA & Miles EM (1952) J Physiol. (Lond) 118: 228-257.
Montano R, Vassalli JD, Baird A, Guillamik R & Orci, L (1986) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 83, 7297-7301.
Nurcombe et al (1992) Development 116: 1175-1183.
Otto D., Frotscher M & Unsicker K (1989) J. Neurosci. Res., 22, 83-91.
Pepper MS, Ferrara N, Orci L, Montesano R. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181,
902-906).
Rochell JM, Watson ML, Oakey RJ and Seldin MF (1992) Genomics 14, 26-31.
Roth S & Weston J (1967) Proc. Natl. Acad. Sei USA, 58: 974-980.
Sambrook J. Fritsch EF, Maniatis T, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd £i/.Cold Sppring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
Santos MA (1991) Nucleic Acids Res. 19, 5442.
185 293
Schilling et al, (1959) Surgery, 46: 702-710.
Senger DR, Van De Water L, Brown LF, Nagy JA, Yeo KT, Yeo TK, Berse B, Jackman RW, Dvorak AM, Dvorak HF (1993) Cancer Netastasis Rev. 12, 303-324.
Sharkey AM, Chamock-Jones DS, Boocock CA, Brown KD, Smith SK, (1993) J. Reprod. Fertil. 99, 609-615.
Sunderkotter C, Steinbrink K, Goebeler M, Bhardway R, Sorg E, (1993) J. Leukocyt, Biol. 55, 410-422.
Suter U, Angst C, Tien C-L, Drinkwater CC, Lindsay RM and Shooter EM (1992) J. Neurosci, 12, 306-318.
Tischer E, Mitchell R, Hartman T, Silva M, Gospodarowicz D. Fiddes JC, & Abraham J. (1991) J. Biol. Chem. 266, 11947-11954.
Williams LR, Varon S, Peterson GM, Wictorin K, Fischer W, Bjorklund A & Gage FH (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9231-9235.
Yan Z, Weich HA, Bemart W, Breckwoldt M, Neulen J, (1993) J. Clin.. Endocrinol. Metab. 77, 1723-1725.
Yip NK, Rich KM, Lampe PA & Johnson EM Jr (1984) J. Neurosci., 4, 2986-2992.
185 293
Zestawienie sekwencji (1) Informacje ogólne:
(1) Zgłaszający:
(kraje inne niż USA): AMRAD OPERATIONS PTY. LTD.
(tylko USA): N. Hayward, G. Weber (ii) Tytuł wynalazku: Nowy czynnik wzrostu i kodująca go sekwencja genetyczna (iii) Liczba sekwencji: 14 (iv) Adres do korespondencji:
(A) Adresat: Davies Collison Cave (b) Ulica: 1 Little Collins Street (C) Miasto: Melbourne (D) Stan: Victoria (E) Państwo: Australia (F) Kod: 3000 (v) Postać odczytywana komputerowo:
(A) Nośnik: Dyskietka (b) Komputer: Kompatybilny z IBM PC (c) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) Dane dotyczące niniejszego zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia: Międzynarodowe PCT (b) Data zgłoszenia: 22 lutego 1996 (vii) Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia: AU PN 1457 (B) Data zgłoszenia: 2 marca 1995 (A) Numer zgłoszenia: AU PN6647 (B) Data zgłoszenia: 20 listopada 1995 (A) Numer zgłoszenia: AU PN7274 (B) Data zgłoszenia: 22 grudnia 1995 (viii) Informacja dotycząca pełnomocnika/rzecznika:
(A) Nazwisko: dr E. John L. Hughes (C) Numer rejestracyjny: EJH/EK (ix) Ιηί'οπηΗφι (A) Telefon: +61 3 9254 2777 (B) Faks: +61 3 9254 2770 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 1:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 649 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: CDS (b) Lokalizacja: 17...589 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:l:
185 293
TCGGGCCTCC GAAACC ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser
10
| CTT | GCC | TTG | CTG | CTC | TAC | CTC CAC | CAT GCC AAG TGG | TCC CAG GCT GCA |
| Leu | Ala | Leu | Leu | Leu | Tyr | Leu His | His Ala Lys Trp | Ser Gin Ala Ala |
| 15 | 20 | 25 | ||||||
| CCC | ATG | GCA | GAA | GGA | GGA | GGG CAG | AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAG TTC | |
| Pro | Met | Ala | Glu | Gly | Gly Gly Gin Asn His His Glu | Val Val Lys Phe | ||
| 30 | 35 | 40 | ||||||
| ATG | GAT | GTC | TAT | CAG | CGC | AGC TAC | TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG | |
| Met | Asp | Val | Tyr | Gin | Arg | Ser Tyr | Cys His Pro Ile | Glu Thr Leu Val |
| 45 | 50 | 55 | ||||||
| GAC | ATC | TTC | CAG | GAG | TAC | CCT GAT | GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA | |
| Asp | Ile | Phe | Gin | Glu | Tyr | Pro Asp | Glu Ile Glu Tyr | Ile Phe Lys Pro |
| 60 | 65 | 70 | 75 | |||||
| TCC | TGT | GTG | CCC | CTG | ATG | CGA TGC | GGG GGC TGC TGC , | AAT GAC GAG GGC |
| Ser | Cys | Val | Pro | Leu | Met | Arg Cys | Gly Gly Cys Cys | Asn Asp Glu Gly |
| 80 | 85 | 90 | ||||||
| CTG | GAG | TGT | GTG | CCC | ACT | GAG GAG | TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG | |
| Leu | Glu | Cys | Val | Pro | Thr | Glu Glu | Ser Asn Ile Thr | Met Gin Ile Met |
| 95 | 100 | 105 | ||||||
| CGG | ATC | AAA | CCT | CAC | CAA | GGC CAG i | CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA | |
| Arg | Ile | Lys | Pro | His | Gin | Gly Gin | His Ile Gly Glu | Met Ser Phe Leu |
| 110 | 115 | 120 |
5
193
241
289
33?
3Θ5
CAG CAC AAC AAA TGT GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA Gin His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gin
125 130 135
GAA AAT CCC TGT GGG CCT TGC TCA GAG CGG AGA AAG CAT TTG TTT GTA Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val 140 145 ISO 155
CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC ACA GAC TCG CGT Gin Asp Pro Gin Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg
160 165 170
TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT TGC AGA TGT GAC Cys Lys Ala Arg Gin Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp
175 180 185
AAG CCG AGG CGG TGAGCCGGGC AGGAGGAAGG AGCCTCCCTC AGCGTTTCGG Lys Pro Arg Arg
190
433
481
529
577
629
GAACCAGATC T.CTCACCAGG
649
185 293 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:2:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 191 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:2:
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 15 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gin Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30
Gly Gly Gin Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gin 35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gin Glu 50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
90 95
| Thr | Glu | Glu | : Ser 100 | Asn | , Ile | Thr | Met | Gin 105 | Ile | 1 Met | Arg | Ile | Lys 110 | Pro | His |
| Gin | Gly | Gin 115 | His | Ile | Gly | Glu | Met 120 | Ser | Phe | Leu | Gin | His 125 | Asn | Lys | Cys |
| Glu | Cys 130 | Arg | Pro | Lys | Lys | Asp 135 | Arg | Ala | Arg | Gin | Glu 140 | Asn | Pro | Cys | Gly |
| Pro 145 | Cys | Ser | Glu | Arg | Arg 150 | Lys | His | Leu | Phe | Val 155 | Gin | Asp | Pro | Gin | Thr 160 |
| Cys | Lys | Cys | Ser | Cys 165 | Lys | Asn | Tnr | Asp | Ser 170 | Arg | Cys | Lys | Ala | Arg 175 | Gin |
| Leu | Glu | Leu | Asn 180 | Glu | Arg | Thr | Cys | Arg 185 | Cys | Asp | Lys | Pro | Arg 190 | Arg |
185 293 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:3:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 1094 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niniowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: CDS (b) Lokalizacja: 3...624 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:3:
CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 47
Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln
10 15
| CTG | GCC | CCC | GCC | CAG | GCC | CCT | GTC | TCC | CAG | CCT GAT | GCC | CCT GGC CAC | 95 |
| Leu | Ala | Pro | Ala | Gln | Ala | Pro | Val | Ser | Gln | Pro Asp | Ala | Pro Gly His | |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||
| CAG | AGG | AAA | GTG | GTG | TCA | TGG | ATA | GAT · | GTG ' | TAT ACT CGC GCT ACC TGC | 143 | ||
| Gln | Arg | Lys | Val | Val | Ser | Trp | Ile | Asp | Val | Tyr Thr | Arg | Ala Thr Cys | |
| 35 | 40 | 45 |
CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC 191.
Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr
55 60
GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT 239
Val Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly
70 75
GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC 237
Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His
75 90 95
CAA GTC CCG7 ATG CIAG ATC CTC ATG ATC CGG TAC CCG AGC AGT CAG CTG 3 3 3
Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile .Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu
900 10t 110
GGG GAG ATT CCC CTG CGA CGA CCAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 3 9 7
Gly Glu Mmi tse Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys
995 920 935
| AAA | AAG | GAC | AGT | GCT | GTG | AAAG | CCA | CGAC ACG GCT GCC ACT CCC CCAC CAC | 443. |
| Lys | Lys | Asp | tse | Ala | Val | Lys | Pro | Asp Arg AHa AHa Thr Pro His His | |
| 930 | 935 | 940 | |||||||
| CGT | CCC | CAC | GCC | CGT | TTCT | GGC | CCG | CGC TTG CAC CCT CCC CCC CGA GCA | 479 |
| Arg | Pro | Gln | P ro | Arrg | Ser | Val | Pro | Gly Trp Asp Ser AHa Pro Gly AHa | |
| 945 | 950 | 9S5 | |||||||
| CCC | TCC | CCA | GCT | GAC | ATC | ACC | CAT , | CCC ACT CCA GCC CCA GGC CCC TCT | 557 |
| Pro | Ser | Pro | AHa | Assp | I1c | Thr | His | PrC Thr Pro AH. a rro Gly Pro Ssi |
960 16t 970 197
GCC CAC GCT GCA CCC AGC ACC ACC AGC GCC CTG ACC CCC GGA CCT GCC 5*7 5
Ala His AALa Ala Pro Ser Thr Thr Ser ALa Leu Thr Pro Gly Pro Ala
170 18C 190
185 293
GCT GCC GCT GCC GAC GCC GCA GCT TCC TCC GTT GCC AAG GGC GGG GCT T 624 Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala
195 200 205
AGAGCTCAAC CCAGACACCT GCAGGTGCCG GAAGCTGCGA AGGTGACACA TGGCTTTTCA 684
GACTCAGCAG GGTGACTTGC CTCAGAGGCT ATATCCCAGT GGGGGAACAA AGGGGAGCCT 744
GGTAAAAAAC AGCCAAGCCC CCAAGACCTC AGCCCAGGCA GAAGCTGCTC TAGGACCTGG B04
GCCTCTCAGA GGGCTCTTCT GCCATCCCTT GTCTCCCTGA GGCCATCATC AAACAGGACA 864
GAGTTGGAAG AGGAGACTGG GAGGCAGCAA GAGGGGTCAC ATACCAGCTC AGGGGAGAAT 924
GGAGTACTGT CTCAGTTTCT AACCACTCTG TGCAAGTAAG CATCTTACAA CTGGCTCTTC 984
CTCCCCTCAC TAAGAAGACC CAAACCTCTG CATAATGGGA TTTGGGCTTT GGTACAAGAA 1044
CTGTGACCCC CAACCCTGAT AAAAGAGATG GAAGGAAAAA AAAAAAAAAA 1094 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:4:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 207 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:4:
| Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu | [ Ala | l Ala Leu Leu | i Gln Leu | ||||||||||||
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Ala | Pro | Ala | Gin | All | Ipo | Vs1 | Ser | Gln | Pro | Asp | Alu | Pro | Gly | His | Gin |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Arg | Lys | Val | val | Ser | STp | I le | Asp | Val | Tyr | Thr | Arg | Ala | TTr | Vcs | dn |
| S5 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Pro | Arg | Glu | val | Val | Val | Pro | Leu | Thr | Val | du | Leu | Met | Gly | Tho | Val |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ala | Lys | Gln | Leu | Val | Pro | S er | CCs | Val | Thr | Val | Gln | Arg | Cyy | Ul | dl |
| 65 | 70 | 77 | 80 | ||||||||||||
| Cys | Cys | Pro | Asp | Asp | G ly | Lsu | dl | Syy | imi | Ppo | Tho | Gly | Gin | Hii | Gin |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Val | JAg | Met | Min | Ile | Irnu | Met | Ile | Arg | Tyv | Pao | Ser | Ser | Glo | Seu | d v |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Glu | Met | Ser | Igo | Glu | Glu | His | Ser | Gin | Cys | GSg | Sys | lny | sso | Lys | lys |
| 115 | 120 | 125 |
Lys Αυρ Ser Ala Val Lys Prr Asp Arg W. a Ala Thr Pro His His Aro 130 11S 140
185 293
| Pro 145 | Gln | Pro | Arg | Ser | Val 150 | Pro | Gly | Trp | Asp | Ser 155 | AVa | Pro | Gly | A. a | Pro 160 |
| Ser | Pro | Ala | Asp | Ile 16S | Thr | His | Pro | Thr | Pro 170 | ALa | Pro | Gly | Pro | Ser 17 5 | Ala |
| His | Ala | Ala | Pro 180 | Ser | Tir | Tłhr | Ser | JA.a 115 | Leu | Tlhr | Pro | Gly | Pro 190 | ALs | ALa |
| Ala | Ala | AL a | Asp | Ala | ALa | ALa | Ser | Ser | Val | ALa | Lys | Gly | Gly | Ala |
195 200 205 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:5:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 993 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: CDS (b) Lokalizacja: 3...566 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:5:
| CC | ATG | AGC | CCT | CTG | CTC | CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG | n |
| Met | Ser | Pro | Leu | Leu | Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln | ||
| 1 | 5 | 10 15 | |||||
| CTG | GCC | CCC | GCC | CAG | GCC | CCT GTC TCC CAG CCT GAT GCC CCT GGC CAC | 95 |
| Leu | Ala | Pro | Ala | Gln | . Ala | , Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His | |
| 20 | 25 30 | ||||||
| CAG | AGG | AAA | GTG | GTG | TCA | TGG ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT ACC TGC | 143 |
| Gln | Arg | Lys | Val | Val | Ser Tjp> Ile Asp Val Tyr ΤΓ Arg Ala Thr Cys | ||
| 35 | 40 45 | ||||||
| CAG | CCC | CGG | GAG | GTG | GTG | GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC | 111 |
| Gln | Pro | Arg | Glu | Val | Val | Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr | |
| 50 | 55 60 | ||||||
| GTG | GCC | AAA | CAG | CTG | GTG | CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT | 23 9 |
| Val | Ala | Lys | Gln | Leu | Val | Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Taoj SCys Gly | |
| 65 | 77 77 | ||||||
| GGC | TGC | TGC | CCT | GAC | GAT | GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC | 280 |
| Gly | Cys | Cys | Pro | Asp | Asp | Gly Leu Glu Cys Val Poo TIot Gly Gln His | |
| 80 | 85 | 90 95 | |||||
| CAA | GTC | CGG | ATG | CAG | ATC | CTC ATG ATC CGG TAC CCG AGC AGT CAG CTG | 333 |
| Gln | Val | JArg | Mes | Gln | lis | Leu Met ISe leg rys Pro res Sos O1v Leu | |
| 100 | 1105 HO | ||||||
| GGG | GAG | ATG | TCC | CTG | GAA | GAA CAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA | 333 |
| Gly | Glu | Met | Ser | Ie*u | Glu | Glu His Ser Gln Cys Glu Cys łArg Spo Lys | |
| 115 | 120 112 | ||||||
| AAA | AAG | GAC | AGT | GCT | GTG | AAG CCA GAT AGC CCC AGG CCC CTC TGC CCA | 431 |
| Lys | Lys | JAp | See | Ala | VaS | Lys Sro LU»p Ser oso Arg ProLeu Cys Pro | |
| 130 | 13S 140 |
185 293
CGC TGC ACC CAG CAC CAC CAG CGC CCT GAC CCC CGG ACC TGC CGC TGC 4 7 9
Arg Cys Thr Gln His His Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys
145 150 155
CGC TGC CGA CGC CGC AGC TTC CTC CGT TGC CAA GGG CGG GGC TTA GAG 52 7
Arg Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu 160 165 170 175
CTC AAC CCA GAC ACC TGC AGG TGC CGG AAG CTG CGA AGG TGACACATGG 557
Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg
180 1S5
CTTTTCAGAC TCAGCAGGGT GACTTGCCTC AGAGGCTATA TCCCAGTGGG GGAACAAAGG 636
GGAGCCTGGT AAAAAACAGC CAAGCCCCCA AGACCTCAGC CCAGGCAGAA GCTGCTCTAG 639
GACCTGGGCC TCTCAGAGGG CTCTTCTGCC ATCCCTTGTC TCCCTGAGGC CATCATCAAA 776
CAGGACAGAG TTGGAAGAGG AGACTGGGAG GCAGCAAGAG GGGTCACATA CCAGCTCAGG 811
GGAGAATGGA GTACTGTCTC AGTTTCTAAC CACTCTGTGC AAGTAAGCAT CTTACAACTG 0 0 7
GCTCTTCCTC CCCTCACTAA GAAGACCCAA ACCTCTGCAT AATGGGATTT GGGCTTTGGT 996
ACAAGAACTG TGACCCCCAA CCCTGATAAA AGAGATGGAA GGAAAAAAAA AAAAAAA 999 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:6:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 188 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:6:
| Met | See | Pro | Leu | Ilu | Arr | Arg | Seu | Se»u | Lsu | GAl | Gla | Leu | Leu | Gln | Llu |
| 1 | 5 | 11 | 15 | ||||||||||||
| Ala | Prp | Ala | Gln | Ala | Pro | Val | Ser | Gln | Pro | ASp | KLa | Pito | Gly | His | Gln |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Arg | Lys | Val | Gal | Ser | Tir? | Ile | Val | Tyr | Tir | JArg | GAL a | Thr | Gln | ||
| 35 | 40 | 40 | |||||||||||||
| Pro | Arg | Gla | Val | Val | Val | Pro | Leu | Thr | Val | Glu | Leu | Met | Gly | Thr | Val |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ala | Lys | Gln | lan | Val | Vaa | roG | ce^s | Val | Thr | Val | hla | lrg | AIb | Gly | Gly |
| 65 | 70 | 75 | 80 |
Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln 85 99 95
Val Arg Met Gln Ile Leu Met liis Arg T/r Pro Ser Ser Gln Leu dy 100 105 110
185 293
| Glu | Met | Ser | Leu | Glu | . Gl s | HZ s | Se r | Gin | Cys | Glu | Cys | ZArg | Pos | Lss | Lys |
| 115 | 120 | 115 | |||||||||||||
| Lys | JAp | Ser | ZALa | Val | Lys | Pro | Asp | Ser | Pro | fAg | Pro | Leu | Cys | Pro | ZLrp |
| 130 | 115 | 170 | |||||||||||||
| Cys | Thr | Gin | His | His | Gin | Arg | Pos | Asp | Pro | tAg | Thr | Cys | Arg | Cys | ZArg |
| 145 | 150 | 155 | 110 | ||||||||||||
| Cys | Arg | ZAg | Arg | Ser | Phe | Leu | frrg | Cys | Gin | dy | Ztrg | Gly | Leu | Glu | LLe |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Asn | Pro | Asp | Thr | Cys | Arg | Cys | Arg | Lys | Leu | Arg | Arg |
180 185 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:7:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 858 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: CDS (b) Lokalizacja: 3...431 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:7:
CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 4 7
Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||
| CTG | GCC | CCC | GCC | CAG | GCC | CCT | GTC TCC CAG CCT GAT GCC | CCT GGC CAC | 95 |
| Leu | Ala | Pro | Ala | Gln | Ala | Pro | Val Ser Gln Pro Asp Ala | Pro Gly Hia | |
| 20 | 25 | 30 | |||||||
| CAG | AGG | AAA | GTG | GTG | TCA | TGG | ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT ACC TGC | 143 | |
| Gln | Arg | Lys | Val | Val | Ser | Trp | Ile Asp Val Typ Thr Arg | Ala Thr Cys | |
| 35 | 40 | 45 | |||||||
| CAG | CCC | CGG | GAG | GTG | GTG | GTG | CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC | 191 | |
| Gln | Pro | Arg | Glu | Val | Val | Val | Pro Leu Thr Val Glu Leu | Met Gly Thr | |
| 50 | 55 00 | ||||||||
| GTG | GCC | AAA | CAG | CTG | GTG | CCC | AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT | 23Z | |
| Val | Ala | Lys | Gln | Leu | Val | Pro | Spz Cy'z VaZ TPz VlZ Gln | As. Cyz Gly | |
| 05 | 70 | 75 | |||||||
| GGC | TGC | TGC | CCT | GAC | GAT | CGC | CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC | 28Z | |
| Gly | Cys | Cyy | Pro | Asp | Asp | Gly | Leu Glu Cys Val Pro Thr | Gly Gln His | |
| 80 | 85 | 90 | 95 | ||||||
| CAA | GTC | CGG . | ATG - | CAG ATC CTC ATG ATC CGG TAC CCG AGC AGT CAG CTG | 3Z 3 | ||||
| Gln | Val | Arg | Met | Gln | lie | Leu | Met lie Arg Typ Pro Ser | Ser Gln Leu | |
| 100 | 105 | 110 |
185 293
GGG GAG ATG TCC CTG GAA GAA CAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 383
Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys
115 120 125
AAA AAG GlA AGT GCT GTG AAG CCA GAT AGG TGC CGG AAG CTG CGA AGG 511
Lys Lys Aap Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg
130 135 140
TGACACATGG CTTTTCAGAC TCAGCAGGGT GACTTGCCTC AGAGGCTATA TCCCAGTdlG 591
GGACCCACGG GGAGCCTGGT CACCAACCGC CAAGCCCCCA AGACCTCAGC CCAlAlCAGAA 5 51
GCTGCTCTAG GACCTGGGCC TCTCAGAGGG CTCTTCTGCC ATCCCTTGTC TCC<CTGA(AlC 611
CCTCATCCCA CAGGACAGAG TTGGCCGCGG AGACTGGGAG GCAGCAAGAG GGCTCAGCTA (5 71
CCAGCTCAGG GGAGAATGGA GTACTGTCTC AGTTTCTAAC CACTCTGTGC GAGT^^O^ 731
CTTCCACCTG GCTCTTCCTC CCCTCACTAA GCCGΑCCCCΑ ACCTCTGCAT AATtUlATir 791
GGGCTTTGGT ΑCCCGΑCCTG TGACCCCCAA CCCTGATAAA CGCGCTGGCC GGA^CACCACC 8 51
CACAACC 8 58 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:8:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 143 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:8:
| Met 1 | Ser | Pro | Leu | Leu 5 | Arg Arg | Leu | Leu | Leu 10 | Ala | Ala | Leu | Luu | Gln 11 | Leu | |
| Ala | Pro | Ala | Gln 20 | Ala | Pro | Val | Ser | Gln 25 | Pro | Asp | Ala | Pro | Gly 30 | Hii | Gln |
| Arg | Lys | Val 35 | Val | Ser | Trp | Ile | Asp 40 | Val | iyr | Thr | Alg | Ala 45 | Thr | Cys | Gln |
| Pro | Arg | Glu | VvU | Vu5 | Val | Pro | leu | Thr | VvU | Glu | Leu | Met | Gly | Thr | Val |
55 60
| Ala Lys 65 Cys Cys | dl Ueu Ppo Usp | Val Asp 85 | Pro aeu Cpo eel 70 | TPu Vu1 Gln Hg | lys Gly | Gly 80 GUn | |||||||||
| euU 90 | 75 | Gln | Hu 95 | ||||||||||||
| Gly | Leu Glu | uys | Pro | Thr | Gly | ||||||||||
| Val | Arg | MMt | Gln | He | Iueu | MeU | Ile | Utrg | Tyr | Pro | Ser | Ser | Gln | Lee | 05 y |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Glu | Met | See | ULe | Glu | Glu | His | Ser | Gln | Cys | du | Cys | Hg | Pro | Lys | Lys |
| 115 | 120 | H2 | |||||||||||||
| Lys | Asp | See | Ala | Val | Lys | Puu | ALy | roo | Aps | Hg | Lys | jg^u | Arg | Arg | |
| 130 | 115 | 140 |
185 293 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:9:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 910 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: CDS (b) Lokalizacja: 3...305 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:9:
| CC ATG AGC | CCT CTG CTC | CGC CGC CTG | CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG | 45 | |||||||
| Met 1 | Ser | Pro | Leu Leu 5 | Arg | Arg Leu | Leu | Leu 00 | Ala Ala | Leu Leu Gln 15 | ||
| CTG | GCC | CCC | GCC | CAG GCC | CCT | GTC TCC | CAG | CCT | GAT GCC | CCT GGC CAC | 95 |
| Leu | Ala | Pro | Ala | Gln Ala | Pro | Val Ser | Gln | , Pro | Asp Ala | Pro Gly His | |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||
| CAG | AGG | AAA | GTG | GTG TCA | TGG | ATA GAT | GTG | TAT ACT CGC GCT ACC TGC | 113 | ||
| Gln | Arg | Lys | Val | Val Ser | Trp | He Asp | Val | Tyr | Thr Arg | Ala Thr Cys | |
| 35 | 50 | 55 | |||||||||
| CAG | CCC | CGG | GAG | GTG GTG | GTG | CCC TTG . | ACT i | GTG GAG CTC ATG GGC ACC | 195 | ||
| Gln | Pro | Arg | Glu | Val Val | Val | Pro Leu | Thr | Val | Glu Leu | Met Gly Thr | |
| 50 | 55 | 30 | |||||||||
| GTG | GCC | AAA | CAG | CTG GTG | CCC | AGC TGC . | GTG . | ACT GTG CAG CGC TGT GGT | 239 | ||
| Val | Ala | Lys | Gln | Leu Val | Pro | Ser Cys | Val | Thr | Val Gln | Arg Cys Gly | |
| 35 | 70 | 75 | |||||||||
| GGC | TGC | TGC | CCT | GAC GAT | GGC | CTG GAG ’ | TGT . | GTG CCC ACT GGG CAG CAC | 228 | ||
| Gly | Cys | Cys | Pro | Asp Asp Gly | .Leu Glu | Cys | Val | Pro Thr | Gly Gln Hii | ||
| 80 | 85 | 90 | 95 | ||||||||
| CAA | GTC | CGG | ATG | CAG ACC | TΑGΑΑGAGAG GGCAGCGCCG TGGGGCCGGG | 333 | |||||
| Gln | Val | Arg | Met | Gln Thr |
100
CAGGGCTGCC ACTCCCCACC ACCGTCCCCA GCCCCGTTCT GTTCCGGGCT GGGACTCTGC 395
CCCCGGAGCA CCCTCCCCAG CTGACATCAC CCATCCCACT CCAGCCCCAG GCCCCTCTGC 455
CCACGCTGCA CCCAGCACCA CCAGCGCCCC GACCCCCtG» CCTGCCGCTG CCCGCTGCCG 551
CGCCGCAGCT TCCTCCGTTG CCAAKKGGCG GGCTTAGAtGZ TCAACCCAGA OA^(7TGCIAG> 575
TGCCGGAAGC TGCGAAGGTG ACACATOGCT TTTCAGACTC AGC^GGGTGA CrTCCCCnCA; 639
AGGCTATATC CCAGTGGGGA ACAAAlG^tGGA C^C^CTGGTAAA AiACCAGCCAA. (GCC^t^CCCAAGA 635
CCTCAGCCCA GGCAGAAGCT GCTCTACG3AC CGGGGCCTCT CAGAGGCCCC TTCTGCCATC 75.
CCTTGTCTCC CTGGGGCCGC CA’ΓCGGGCGG ACAAG,A(3^(3 GGAGAGGAAA CTGGGAGGCA 815
GCG.GGGGGGG CCGCGCGCCG GCTO^GGGGA AAATGGAGTA CGTTCTAAGT TTCTAiCCAC 9 ’5
CCCGTGCAGG CG.GGCGTCCC ACAACTGGCT CCTTC
950
185 293 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 10:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 101 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:10:
| Met 1 | Ser | Pro | Leu | Leu 5 | Arg | Arg | Leu | Leu | Leu 10 | Ala | Ala | Leu | Leu | Gln 15 | Leu |
| Ala | Pro | Ala | Gln 20 | Ala | Pro | Val | Ser | Gln 25 | Pro | Asp | Ala | Pro | Gly 30 | His | Gln |
| Arg | Lys | Val 35 | Val | Ser | Trp | Ile | Asp 40 | Val | Tyr | Thr | Arg | Ala 45 | Thr | Cys | Gln |
| Pro | Arg 50 | Glu | Val | Val | Val | Pro 55 | Leu | Thr | Val | Glu | Leu 60 | Met | Gly | Thr | Val |
| Ala 65 | Lys | Gln | Leu | Val | Pro 70 | Ser | Cys | Val | Thr | Val 75 | Gln | Arg | Cys | Gly | Gly 80 |
| Cys | Cys | Pro | Asp | Asp 85 | Gly | Leu | Glu | Cys | Val 90 | Pro | Thr | Gly | Gln | His 95 | Gln |
Val Arg Met Gln Thr 100 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 11:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 42 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Oligonukleotyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 11:
ACCACCACCT CCCTGGGCTG GCATGTGGCA CGTGCATAAA CG 42 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 12:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 42 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: OLigonukleotyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 12:
AGTTGTTTGA CCACATTGCC CATGAGTTCC ATGCTCAGAG GC
185 293 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 13:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Oligonukleotyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:13:
GATCCTGGGG CTGGAGTGGG ATGGATGATG TCAGCTGG 313 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 14:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 40 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Oligonukleotyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 14:
GCGGGCAGAG GATCCTGGGG CTGTCTGGCC. TCACAGCACT 40
185 293
| 2/52 | 3/52 |
| Ftg.1(i) | Fig. Kii} |
| 4/52 | 5/52 |
| Fig.Kiii) | Fig.1 (i v) |
185 293
TCGGCCTCC GAAACC ATG AAC TTT CTG
Met Asn Phe Leu
| 50 | CTT Leu | GCC Ala | TTG Leu | CTG Leu 15 | CTC Leu | TAC CTC CAC | ||
| Tyr | Leu | His | ||||||
| 98 | CCC | ATG | GCA | GAA | GGA | GGA | GGG | CAG |
| Pro | Met | Ala 30 | Glu | Gly | Gly | Gly | Gin 35 | |
| 146 | ATG | GAT | GTC | TAT | CAG | CGC | AGC | TAC |
| Met | Asp 45 | Val | Tyr | Gin | Arg | Ser 50 | Tyr | |
| 194 | GAC | ATC | TTC | CAG | GAG | TAC | CCT | GAT |
| Asp 60 | Ile | Phe | Gin | Glu | Tyr 65 | Pro | Asp | |
| 242 | TCC | TGT | GTG | CCC | CTG | ATG | CGA | TGC |
| Ser | Cys | Val | Pro | Leu 80 | Met | Arg | Cys | |
| 290 | CTC | GAG | TGT | GTG | CCC | ACT | GAG | GAG |
| Leu | Glu | Cys | Val 95 | Pro | Thr | Glu | Glu | |
| 338 | CGG | ATC | AAA | CCT | CAC | CAA | GGC | CAG |
| Arg | Ily | Lys 110 | Pro | His | Gin | Gly | Gin 115 |
Fig. Ki)
185 293
CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC 49
Leu Ser Trp Val His Trp Ser
10
CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA 97
| His 20 | Ala | Lys | Trp | Ser | Gln 25 | Ala | Ala | |
| AAT | CAT | CAC | GAA | GTG | GTG | AAG | TTC | 145 |
| Asn | His | His | Glu | Val 40 | Val | Lys | Phe | |
| TGC | CAT | CCA | ATC | GAG | ACC | CTG | GTG | 193 |
| Cys | His | Pro | Ile 55 | Glu | Thr | Leu | Val | |
| GAG | ATC | GAG | TAC | ATC | TTC | AAG | CCA | 241 |
| Glu | Ile | Glu 70 | Tyr | Ile | Phe | Lys | Pro 75 | |
| GGG | GGC | TGC | TGC | AAT | GAC | GAG | GGC | 289 |
| Gly | Gly 85 | Cys | Cys | Asn | Asp | Glu 90 | Gly | |
| TCC | AAC | ATC | ACC | ATG | CAG | ATT | ATG | 337 |
| Ser 100 | Asn | Ile | Thr | Met | Gln 105 | Ile | Met | |
| CAC | ATA | GGA | GAG | ATG | AGC | TTC | CTA | 385 |
| His | Ile | Gly | Glu | Met 120 | Ser | Phe | Leu |
Fig. Kii)
185 293
| 386 | CAG CAC AAC AAA TGT GAA TGC AGA Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg 125 130 |
| 434 | GAA AAT CCC TGT GGG CCT TGC TCA Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser 140 145 |
| 482 | CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys 160 |
| 530 | TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu 175 |
| 578 | AAG CCG AGG CGG TGAGCCGGGC AGGAG Lys Pro Arg Arg. 190 |
| 630 | GAACCAGATC TCTCACCAGG |
Fig. 1 (iii)
185 293
| CCA Pro | AAG Lys | AAA Lys | GAT Asp 135 | AGA Arg | GCA Ala | AGA Arg | CAA Gln | 433 |
| GAG | CGG | AGA | AAG | CAT | TTG | TTT | GTA | 481 |
| Glu | Arg | Arg 150 | Lys | His | Leu | Phe | Val 155 | |
| TCC | TGC | AAA | AAC | ACA | GAC | TCG | CGT | 529 |
| Ser | Cys 165 | Lys | Asn | Thr | Asp | Ser 170 | Arg | |
| AAC | GAA | CGT | ACT | TGC | AGA | TGT | GAC | 577 |
| Asn 180 | Glu | Arg | Thr | Cys | Arg 185 | Cys | Asp |
GAAGG AGCCTCCCTC AGCGTTTCGG 629
Fig.1 (i v)
649
185 293
| 7/52 | 8/52 |
| Fig. 2 (i) | Fig. 2 (ii) |
| 9/52 | 10/52 |
| Fig 2(iii) | Fig 2 (iv) |
| 11/52 | 12/52 |
| Fig 2(v) | Fig 2(vi) |
185 293
CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC
| Met 1 | Ser | Pro | Leu | Leu 5 | Arg | Arg | ||
| 48 | CTG | • GCC | CCC | GCC | CAG | GCC | CCT | GTC |
| Leu | Ala | , Pro | Ala | . Gln 20 | . Ala | . Pro | Val | |
| 96 | CAG | AGG | AAA | GTG | GTG | TCA | TGG | ATA |
| Gln | Arg | Lys | Val 35 | Val | Ser | Trp | Ile | |
| 144 | CAG | CCC | CGG | GAG | GTG | GTG | GTG | CCC |
| Gln | Pro | Arg 50 | Glu | Val | Val | Val | Pro 55 | |
| 192 | GTG | GCC | AAA | CAG | CTG | GTG | CCC | AGC |
| Val | Ala 65 | Lys | Gln | Leu | Val | Pro 70 | Ser | |
| 240 | GGC | TGC | TGC | CCT | GAC | GAT | GGC | CTG |
| Gly 80 | Cys | Cys | Pro | Asp | Asp 85 | Gly | Leu | |
| 288 | CAA | GTC | CGG | ATG | CAG | ATC | CTC | ATG |
| Gln | Val | Arg | Met | Gln 100 | Ile | Leu | Met | |
| 336 | GGG | GAG | ATG | TCC | CTG | GAA | GAA | CAC |
| Gly | Glu | Met | Ser 115 | Leu | Glu | Glu | His |
Fig.2(i)
185 293
| CTG | • CTG | • CTC | GCC | GCA | CTC | CTG | CAG | 47 |
| Leu | Leu | Leu 10 | Ala | Ala | Leu | Leu | Gln 15 | |
| TCC | CAG | CCT | GAT | GCC | CCT | GGC | CAC | 95 |
| Ser | Gln 25 | Pro | Asp | Ala | Pro | Gly 30 | His | |
| GAT | GTG | TAT | AGT | CGC | GCT | ACC | TGC | 143 |
| Asp 40 | Val | Tyr | Thr | Arg | Ala 45 | Thr | Cys | |
| TTG | ACT | GTG | GAG | CTC | ATG | GGC | ACC | 191 |
| Leu | Thr | Val | Glu | Leu 60 | Met | Gly | Thr | |
| TGC | GTG | ACT | GTG | CAG | CGC | TGT | GGT | 239 |
| Cys | Val | Thr | Val 75 | Gln | Arg | Cys | Gly | |
| GAG | TGT | GTG | CCC | ACT | GGG | CAG | CAC | 287 |
| Glu | Cys | Val 90 | Pro | Thr | Gly | Gln | His 95 | |
| ATC | CGG | TAC | CCG | AGC | AGT | CAG | CTG | 335 |
| Ile | Arg 105 | Tyr | Pro | Ser | Ser | Gln 110 | Leu | |
| AGC | CAG | TGT | GAA | TGC | AGA | CCT | AAA | 383 |
| Ser 120 | Gln | Cys | Glu | Cys | Arg 125 | Pro | Lys |
Fig. 2 Fu)
185 293
| 384 | AAA Lys | AAG Lys | GAC Asp 130 | AGT Ser | GCT Ala | GTG Val | AAG Lys | CCA Pro 135 |
| 432 | CGT | CCC | CAG | CCC | CGT | TCT | GTT | CCG |
| Arg | Pro | Gln | Pro | Arg | Ser | Val | Pro | |
| 145 | 150 | |||||||
| 480 | CCC | TCC | CCA | GCT | GAC | ATC | ACC | CAT |
| Pro | Ser | Pro | Ala | Asp | Ile | Thr | His | |
| 160 | 165 | |||||||
| 528 | GCC | CAC | GCT | GCA | CCC | AGC | ACC | ACC |
| Ala | His | Ala | Ala | Pro | Ser | Thr | Thr |
180
576 GCT GCC GCT GCC GAC GCC GCA GCT Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala
195
Fig. 2 (iii)
185 293
| GAC Asp | AGG Arg | GCT Ala | GCC Ala | ACT Thr 140 | CCC Pro | CAC His | CAC His | 431 |
| GGC | TGG | GAC | TCT | GCC | CCC | GGA | GCA | 479 |
| Gly | Trp | Asp | Ser 155 | Ala | Pro | Gly | Ala | |
| CCC | ACT | CCA | GCC | CCA | GGC | CCC | TCT | 527 |
| Pro | Thr | Pro 170 | Ala | Pro | Gly | Pro | Ser 175 | |
| AGC | GCC | CTG | ACC | CCC | GGA | CCT | GCC | 575 |
| Ser | Ala 185 | Leu | Thr | Pro | Gly | Pro 190 | Ala | |
| TCC | TCC | GTT | GCC | AAG | GGC | GGG | GCT T | 624 |
| Ser 200 | Ser | Val | Ala | Lys | Gly 205 | Gly | Ala |
Fig.2(iv)
185 293
| AGAGCTCAAC | CCAGACACCT | GCAGGTGCCG |
| GACTCAGCAG | GGTGACTTGC | CTCAGAGGCT |
| GGTAAAAAAC | AGCCAAGCCC | CCAAGACCTC |
| GCCTCTCAGA | GGGCTCTTCT | GCCATCCCTT |
| GAGTTGGAAG | AGGAGACTGG | GAGGCAGCAA |
| GGAGTACTGT | CTCAGTTTCT | AACCACTCTG |
| CTCCCCTCAC | TAAGAAGACC | CAAACCTCTG |
| CTGTGACCCC | CAACCCTGAT | AAAAGAGATG |
Fig.2(v)
185 293
| GAAGCTGCGA | AGGTGACACA | TGGCTTTTCA | 684 |
| ATATCCCAGT | GGGGGAACAA | AGGGGAGCCT | 744 |
| AGCCCAGGCA | GAAGCTGCTC | TAGGACCTGG | 804 |
| GTCTCCCTGA | GGCCATCATC | AAACAGGACA | 864 |
| GAGGGGTCAC | ATACCAGCTC | AGGGGAGAAT | 924 |
| TGCAAGTAAG | CATCTTACAA | CTGGCTCTTC | 984 |
| CATAATGGGA | TTTGGGCTTT | GGTACAAGAA | 1044 |
| GAAGGAAAAA | AAAAAAAAAA | 1094 |
Fig. 2 (vi)
185 293
14/52
Fig. 3 (ι)
15/52
Fig 3 (ii)
185 293 >VEGF_ LUDZKI VEGF_ PREKURSOR LUDZKIEGO NACZYNIOWEGC (NACZYNIOWY 215 AA.
DŁUGOŚĆ = 215
OCENA = 181 (92.4 BITY), OCZEKIW. = 6.4e-20, IDENTYCZNE = 33/75 (44%), DODATNIE = 48/75
| ZAPYTANIE PRZEDMIOT: | 31 HQRKWSWIDVYTRATCQPREVWPLTVEL | |
| 36 | +++ W +DVY R+ C+P E +V - E NHHEWKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEY | |
| ZAPYTANIE ; | 91 | PTGQHQVRMQILMIR 105 PT + + MQI + 1+ |
| PRZEDMIOT : | 96 | PTEESNITMQIMRIK 110 |
| OCENA = | 76 | (38.8 BITS) , OCZEKIW. = 0.0011, |
| IDENTYCZNE | = | 12/19 (63%) , DODATNIE = 16/19 |
| ZAPYTANIE : | 110 | QLGEMSLEEHSQCECRPKK 128 ++GEMS +H+ CECRPKK |
| PRZEDMIOT : | 116 | HIGEMSFLQHNKCECRPKK 134 |
| OCENA - | 72 | (36.8 BITS), OCZEKIW. = 0.0046, |
| IDENTYCZNE = | 14/21 (66%), DODATNIE = 15/21 | |
| ZAPYTANIE . | 202 | RCQGRGLELNPDTCRCRKLRR 222 RC +R LELN TCRC K RR |
| PRZEDMIOT : | 195 | RCKARQLELNERTCRCDKPRR 215 |
| OCENA - | 46 | (23.5 BITS) , OCZEKIW. = 47 . , |
| IDENTYCZNE = | = 6/10 (60%), DODATNIE = 9/10 | |
| ZAPYTANIE ; | 187 | DPRTCRCRCR 196 DP+TC+C C+ |
| PRZEDMIOT : | 1-81, | DPOTCKCSCK 190 F'gJ(') |
PRZEDMIOT
Fig.3 (i)
185 293
NABŁON KOWEGO CZYNNIKA WZROSTU (VEGF)
P = 6.4e-20 (64%)
MGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECV 90 + PSCV + RCGGCC D+GLECV
PDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECV 9 5
POISSON P(2) = 9.1e-12 (84%)
POISSON P(3) = 3.6e-18 (71%)
POISSON P(4) = 7.3e-10 (90%)
Fig. 3(i)
185 293
| 17/52 | 18/52 |
| Fig 4(i) | Fig.4(u) |
| 19/52 | 20/52 |
| Fig.4(iii) | Fig.4(iv] |
185 293
Przedział ważony : 3.00 Długość ważona .-0.100
Jakość :100.9 Stosunek .-0.175
Procent podobieństwa .-69.70:
Średnie dopasowanie ; 1. o 0 0 Średnie niedopasowanie: - 0.9 00
Długość ; 7 3 9 Szczeliny 3 0
Procent identyczności :69.703
8 ATGAGCCCTCTGCTCCGCCGCCTGC
ATGAACTTTCTGCT.....GTCT. .
TGCAGCTGGCCCCCGCCCAGGCCCC
III III II I III III
TGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAA
118 CACCAGAGGA...............
mu
106 AGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCAC
140 GTGTATACTCGC.GCTACCTGCCAG
II III III INI llllll
152 GTCTATCAGCGCAGCTA. CTGCCAT
194 T .... GA.....CTGTGGAGCTCAT
I II III III II
201 TCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGA
235 CCCAGCTGCGTGACTGTGCAGCGCT
II III III I II III I
239 CCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGAT
285 CCTGGAGTGTGTGCCCACTGGGCAG
CCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAG
Fig. 4(i)
289
185 293
TGCTCGCCGCACT..........CC 67
I I III I I
...TGGGTGCATTGGAGCCTTGCCT 56
TGTCTCCCAGCCTGATGCCCCTGGC 117
GTGGTCCCAGGCTGCA.CCCATGGC 105 .AAGTGGTG....TCATGGATAGAT 147 llllllll lilii III
GAAGTGGTGAAGTTCATG....GAT 151
CCCCGGGAG...GTGGTGGTGCCCT 193
CCAATCGAGACCCTGGTGGACATCT 200
GGGCACCGTGGCCAAACAGCTGGTG 234
GTACATCTT . . . CAA.........G 238
GTGGTGGCTGCTGCCCTGACGATGG 284
GCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGG 288
CACCAAGTCCGGATGCAGAT..... 329
I I II llllllll
TCCAACATCACCATGCAGATTATGC 338
Fig4(ii)
185 293
3 0 CCTCATGATCCGGTACC
INN I
3 9 GGATCAAACCTCA...........C
369 GTCCCTGGAAGAACACAGCCAGTGT
III II INI I I III
376 GAGCTTCCTACAGCACAACAAATGT
419 GTGCTGTGAAGCCAGACAGGGCTGC
I III lilii I
423 G........AGCAAGAC AAG.....
469 CGTTCTGTTCCGGGCTGGGACTCTG
443 ...TGTGGGCCTTGCTCAGA.....
519 CATCACCCATCCCACTCCAGCCCCA
468 .........................
569 GC..........ACCACCAGCGCCC
469 GCATTTGTTTGTACAA.........
609 TGCCGACGCCGCAGCTTCCTCCGTT
II I I I III II INI
509 TG.CAAAAACACAGACTC..GCGTT
657 AACCCAGACACCTGCAGGTGCCGGA
554 AACGAACGTACTTGCAGATGTGACA
Fg
185 293
CGAGCAGTCAGC...TGGGGGAGAT
CAAG. .GCCAGCACATAGGAGAGAT
GAATGCAGACCTAAAAAAAAGGACA iiiiiiimi m ii ιι i
GAATGCAGACC . . . AAAGAAAGATA
CACTCCCCACCACCGTCCCCAGCCC
...........AAAATCCC......
CCCCCGGAGCACCCTCCCCAGCTGA . . .GCGGAGAA..............
GGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCA
........................A
TGACCCCCGGACCTGCCGCTGCCGC .GATCCGCAGACGTGTAAATGTTCC
GCCAAGGGCGGGGC..TTAGAGCTC
GC..AAGGCGAGGCAGCTTGAGTTA
AGCTGCGAAGGTGA
AGCCGAGGCGGTGA
Fig.4(iv)
368
375
418
422
468
442
518
467
568
468
608
508
656
553
695
592
185 293
| 22/52 | 23/52 | 24/52 |
| Fig.5li) | Fig. 5 (i i | Fig 51 iii) |
| 25/52 | 26/52 | 27/52 |
| Fig.5(iv) | Fig.5(v) | Fig.5(vi) |
185 293
165SOMSQ.MSF.msf MSF.-687 Typ : D Wtorek, 20 czerwca 1995
| Próba :3140 | 1 |
| VEGF165 SOM175 SOM175-e6 SOMl75-e6&7 SOM175-e4 | X ATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTG ATGAGCCCTCTGCTCCGCCGCCTG ATGAGCCCTCTGCTCCGCCGCCTG ATGAGCCCTCTGCTCCGCCGCCTG ATGAGCCCTCTGCTCCGCCGCCTG |
| VEGF165 SOM175 SOM175-e6 SOM175-e6&7 SOM175-e4 | 81 CACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGC TGCCCCTGGCCACCAGAGGAAAGT TGCCCCTGGCCACCAGAGGAAAGT TGCCCCTGGCCACCAGAGGAAAGT TGCCCCTGGCCACCAGAGGAAAGT |
| VEGF165 SOM175 SOM175-e6 SOMl75-e6&7 SOM175-e4 | 161 CCAATCGAGACCCTGGTGGACATC GTGGTGGTGCCCTTGACTG.TGGA GTGGTGGTGCCCTTGACTG.TGGA GTGGTGGTGCCCTTGACTG.TGGA GTGGTGGTGCCCTTGACTG.TGGA |
| VEGF165 SOM175 SOM175-e6 SOM175-e6&7 SOM175-e4 | 241 GATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAA GCAGCGCTGTGGTGGCTGCTGCCC GCAGCGCTGTGGTGGCTGCTGCCC GCAGCGCTGTGGTGGCTGCTGCCC GCAGCGCTGTGGTGGCTGCTGCCC |
Fig.5(i)
185 293
CATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACC
CTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCC
CTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCC
CTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCC
CTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCC
AGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCAT
GGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGC
GGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGC
GGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGC
GGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGC
TTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGT GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGC GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGC GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGC GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGC
TGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
TGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
TGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
TGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
TGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
Fig.5(ii)
185 293
TCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTG.
CCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGA
CCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGA
CCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGA
CCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGA
160
GGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCAT
G.....CTACCTGC . CAGCC . CCGGGAG
G.....CTACCTGC . CAGCC . CCGGGAG
G.....CTACCTGC . CAGCC . CCGGGAG
G.....CTACCTGC . CAGCC . CCGGGAG
240
ACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCT
TGGTGCCCAG......CTGCGTGACTGT
TGGTGCCCAG......CTGCGTGACTGT
TGGTGCCCAG......CTGCGTGACTGT
TGGTGCCCAG......CTGCGTGACTGT
320
GAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTA GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGATCC GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGATCC GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGATCC GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGA...
Fig. 5 (iii)
185 293
VEGF165
SOM175
SOM175-e6
SOMl75-e6&7
SOMl75-e4
VEGF165
SOM175
SOMl75-e6
SOM175-e6&7
SOMl75-e4
VEGF165
SOM175
SOMl75-e6
SOMl75-e6&7
SOMl75-e4
VEGF165
SOM175
SOM175-E6
SOMl75-e6&7
SOMl75-e4
VEGF165
SOM175
SOMl75-e6
SOMl75-e6&7
SOM175-e4
321
TGCGGATCAAACCTCACCAAGGCC TCATGATCCGG...TACCCGAGCA TCATGATCCGG...TACCCGAGCA TCATGATCCGG...TACCCGAGCA
401
AAGAAAGATAG........AGCAA
AAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCA
AAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCA
AAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCA
AAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCA
481
...........AAGCA........
CTCTGCCCCCGGAGCACCCTCCCC
CTCTGCCCCCGGAGCACCCTCCCC
561
A...............GATCCGCA
GCACCACCAGCGCCCTGACCCCCG
GCACCACCAGCGCCCTGACCCCCG
GCACCACCAGCGCCCTGACCCCCG
641
TTGAGTTAAACGAACGTACTTGCA
TAGAGCTCAACCCAGACACCTGCA
TAGAGCTCAACCCAGACACCTGCA
TAGAGCTCAACCCAGACACCTGCA
Fig5(iv)
185 293
AGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACA
GTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGA
GTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGA
GTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGA
GACAAGAA....AATCCCTGTGG.....
GACAGGGCTGCCACTCCCCACCACCGTC
GATAG.......................
GATAG.......................
GACAGGGCTGCCACTCCCCACCACCGTC
AGCTGACATCACCCATCCCACTCCAGCC ..........................CC
AGCTGACATCACCCATCCCACTCCAGCC
GACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAAC.AC GACCTGCCGCTGCCGCTGCCGACGCCGC GACCTGCCGCTGCCGCTGCCGACGCCGC
GACCTGCCGCTGCCGCTGCCGACGCCGC
687
GATGTGACAAGCCGAGGCGGTGA
GGTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGA
GGTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGA
GTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGA
GGTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGA
Fig.5(v)
185 293
400
GCACAACAAATGTGAATGCAGACC...A ACACAGCCAGTGTGAATGCAGACCTAAA ACACAGCCAGTGTGAATGCAGACCTAAA ACACAGCCAGTGTGAATGCAGACCTAAA ......................CCTAAA
480
.........GCCTTGCTCAGAGCGGAGA
CCCAGCCCCGTTCTGTTCCGGGCTGGGA
CCCAGCCCCGTTCTGTTCCGGGCTGGGA
560
.........TTTGTT.....TGTAC . . A
CCAGGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCA
CCAGGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCA
CCAGGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCA
640
AGACTCG..CGTTGCAAGGCGAGGCAGC AGCTTCCTCCGTTGCCAAGGGCGGGGCT AGCTTCCTCCGTTGCCAAGGGCGGGGCT
AGCTTCCTCCGTTGCCAAGGGCGGGGCT
Fig.5(vi)
185 293
Rj
Fig 6(ι) 'Χ.
Fig 6 (ii) fs/of
Fig 6 (iii)
J-n
185 293
| X X1 | 2 X | |
| < < | u o | |
| < | CJ u | |
| α · | o 0 | |
| cn · | CJ o | |
| S · | u u | |
| X o | X X |
K CU
O X > CL X
X
X
CL
| X χΐ | X X | |
| Q < | < < |
x iJ X > > u u cn cn CL CL x
x >
ω
Q
X o > X w u cn H < X < w < 2 Q X < w < X < o < X (<
x x x <
Eł3 ϊη σ < o · cn · 3:
χ α
| u | u |
| u | u |
| o | 0 |
| u | o |
| υ | u |
| X | X |
σ x > x x
X < >
| < < | X X | X X |
| X X | ł—ł O | X X |
| cn · | >< X | X X |
| · | W »=4 | X X |
| X X | H > | u u |
| > X | W E-* | w w |
| 5 X | Q CJ | u cj |
cn X cu 2 θ' x 4 « >
| X o | < <C | X X | X X |
| CJ X | X X | H o | X X |
| X X | cn · | >< X | X X |
| cn X | 2 · | X < | X X |
| Q < | X X | K > | CJ o |
| χ cn | > X | X X | X X |
| •Τ’. X | 3 X | Q O | CJ CJ |
> > o u cn cn x x
| • X | • X | |
| • X | cn x | |
| • X | G cn | |
| • X | χ X · | |
| • < | 2 X _ | |
| X X X | ||
| X X | [53 | |
| O Q | cn X · | |
| • X | iW | |
| • X | X X · | |
| • > | u U | |
| • < | Ε- H | |
| • cn | O X | |
| • o | X X | |
| • X | Q G |
| X X | >4 X | 2 cn | |
| X X | W X | X X | |
| X x | o > | ο X | |
| 2 cn | X X | X X | |
| 2 2 | Μ X | X X |
ZE
-O
I—
X
X EH o cn cn x o < X < u X cn X X 2
| X X X X | X |
| X X | |
| X X 2 cn | O* > X Eh w X |
| 2 2 | |
X O 2 cn X X α w x w x x ο» X > · X · X · X X χ α x x x x w α cn h ze
Ό
u.
£tn hU X r-ł 0 2 W O >
cn in \jOLD
X ,-ι O S x O > cn
| ZE | ba | en | en | |
| Ό | -o ł .. | 25 Q £m ^r-~ X 'L O 2 X O > en | J3 | |
| u. ić tScn Hl> X r-t <J 2 X O > cn | X Sm r-lt> X rH O 2 X o > cn | ó JQ (0 | £tn ΗΓ X rH CJ 2 X O > X |
o>
s ‘Nn u?u 1
X £} 0 & X o > cn σ>
□ r-łO χ d 0 w o > cn
185 293
| t—1 | LO | O | LO | t—1 | o | O | LO | i—1 | m | O | > |
| CN | H | o | Γ | OL | o | LO | LO | CN | r—1 | o | u |
| rH | t—1 | ϊ—1 | I-1 | t—1 | CN | τ—1 | H | I-1 | i—1 |
H CN σ> cn 1-I CN
O LO LO LO
| Q CL | co co | |||
| > > | £ £ | |||
| fc > | fc fc | |||
| H > | O O | |||
| W W | H fc | |||
| HI PC | fc O | |||
| CL CL | O CO | |||
| fc o | O CO | |||
| o o | O CL | |||
| >H Eh | fc >4 | |||
| w < | CL · | |||
| PC PC | fc PC | |||
| O Eh | Η H | |||
| >H >4 | PC £ | |||
| > > | * | 3 fc | ||
| Q Q | Η H | |||
| £ H | O O | |||
| fc <: | £ £ | |||
| fc co | E4 PC |
O (Λ
CC (C a o O CC > <
• CL fc H fc CL fc fc £ Eh PC H PC Q W < CO CL U CO
CL CL
O < U O
Q CL
HZE d > E- > 'fc fc~ H PC
| co | CO |
| £ | £ |
| fc | W |
| O | o( |
| H | fc |
| fc | o |
O O • fc • CL • O
CL • <
CL CL £ <
| CL CL | O CO | • CL | |
| fc O | O co | • E4 | |
| O u | O CL | • fc | |
| >4 Eh | fc >4 | • fc | |
| co < | CL · | • Eh | |
| PC PC | fc pc | • H | |
| O Eh | Η H | • Q | |
| >H >H | PC £ | • < | |
| > > | £ fc | • fc | |
| Q O | Η H | • CO | |
| £ H | O O | • fc | |
| fc SC | £ £ | • < | |
| fc co | Eh PC | • O | |
| > > | H > | • fc | |
| > > | £ α | • < | |
| • fc | CO fc | • co | |
| W PC | W O | • Q | |
| fc o | fc O | • 3. | |
| fc fc | Eh Eh | O | |
| £ O | CL CL | • fc | |
| O CL | > > | • > | |
| o < | O U | • co | |
| O Q | W fc | CL PC | |
| O CL | fc fc | £ fc | |
| W O | O O | fc O | |
| < CO | fc Q | a cl |
£ > |q q| |pc £
Fig. 6 (ii) pc pc pc pc CL fc £ £ Q PC o o PC PC u o Eh Ęh PC Q W CL £ £ fc j ω ω fc fcl o o ;PC PC < o £ o o ó
PC PC
185 293
Obszary o 100% homologii sąw ramkach, a reszry zachowane pomimo udziału w homodimeryzacji są podkreślone.
Przedstawiona sekwencja VEGF zawiera sekwenc liderową o 26 aminokwasach (której usunięcie prowadzi do dojrzałego VEGF165), tak żem jej całkowita długość wynosi 191 aminokwasów.
Homologia SOM175 z VEGF wynosi 27% (33%) na poziomie 165 białka, choć znajdują się w niej bloki o homologii 100%.
W szczególności wiele reszt strukturalnych zostało zachowanych, w: tym te, które mimo to odgrywają rolę w homodimeryzacji
VEGF (przez porównanie z PDGF) np. Cysteina-47
Prolina-70, Cysteina-72, Waliba-74 Arginina-77, Cysteina-78, Glicyna-80, Cysteiny 81 i 82 Cystein-89, Prolina-91
Cysteina 122 i 124
185 293 m
rO
W
LU £
O
Z
LU
N £
N r
z <
tr <
I 1
Ί u-) i co
sj
LU
CD
Z o
N
O
LU ω
Z
ID hFig.7
185 293
GENOMOWA STRUKTURA LUDZKIEGO SOM175
185 293 cn fd cn u (T5 td cn o>
u cn o u cd rd 0 j_) (d
Cn cd
O O <
o <
u <
O 0
O O
| cn | <d | 40 | U |
| 40 | u | 40 | U |
| rd | cn | 40 | u |
| cn | cn | υ | 0 |
| id | rd | 40 | 0 |
| 0 | u | 0 | td |
| u | 40 | (d | υ |
| o | 0 | 0 | u |
| 40 | 40 | 40 | u |
| cn | 0 | 0 | u |
| O | 0 | 0 | 0 |
| < | < | ||
| O | 0 | U | 0 |
| 0 | 0 | < | 0 |
| Eh | Eh | 0 | Eh |
| 0 |
σι (d u
cn u
u u
id u
rd u
o u
<
CĆ
ΓΩ
O
Ε» <
o
LO
| a X) co | a X) on o | a -Śj* on | a λ t—l o | a Ό cn o | a X5 co co | 99 |
| r-i | r-H | r—i |
S}ł lo cn
Ol co
G
O
X
W
-K
G
O
X ω
G o
x w
G
O
X
W
G
O
X ω
G o
X w
r~~
G
O
X w
oo
G
O
X
W o
o <
Et (4 a
Lf)
Eh
U
O u
U
O cn <d υ
td u
υ υ
η u
Eh
O
H o
O
Ε» td υ
υ u
4J υ
cn jo u
u
Eh u
u
Eh ś
Eh
O
Cn Cn fd rd υ id td u
40 td 40 id -u
Cn -u
-u u u (d u
O
Eh
O
O td jo cn υ
υ u
u υ
u o
o <
u υ
u u
cn td u
υ u
υ rd υ
u u
O o
o
O
Eh o
Cn rd υ
u
Cn u
u υ
185 293
| 36/52 | 37/52 |
| Fig. 9 (i) | Fig. 9( i i) |
| 38/52 | 39/52 |
| Fig. 9 (iii) | Fig. 9(iv) |
185 293
-163 gcacgagctcaggccgtcgctgcggcgc tg -103 gggggccgcggaggagccgccccctgcgcc
-43 ggcggctctggctgacccccccccacaccg
CGTCGCCTGCTGCTTGTTGCACTGCTGCAG RRLLLVALLQ
I
6 TTTGATGGCCCCAGTCACCAGAAGAAAGTG FDGPSHQKKV
136 ACATGCCAGCCCAGGGAGGTGGTGGTGCCT TCQPREVVVP
196 AAACAACTAGTGCCCAGCTGTGTGACTGTG KQLVPSCVTV
256 GGCCTGGAATGTGTGCCCACTGGGCAACAC GLECVPTGQH
316 TACCCGAGCAGTCAGCTGGGGGAGATGTCC YPSSQLGEMS
6 CCTAAAAAAAAGGAGAGTGCTGTGAGGCCA PKKKESAVRP
436 CAGCCCCGCTCTGTTCCGGGCTGGGACTCT QPRSVPGWDS
Fig.9(i)
185 293 cgttgcgctgcctgcgcccagggctcggga ccgccccgggtccccgggtccgcgccatgg ccgggctagggcccgATGAGCCCCCTGCTG
M S P L L -17 (
CTGGCTCGCACCCAGGCCCCTGTGTCCCAG LARTQAPVSQ 4
GTGCCATGGATAGACGTTTATGCACGTGCC VPWIDVYARA 24
CTGAGCATGGAACTCATGGGCAATGTGGTC LSMELMGNVV 44
CAGCGCTGTGGTGGCTGCTGCCCTGACGAT QRCGGCCPDD 64
CAAGTCCGAATGCAGATCCTCATGATCCAG QVRMQILMIQ 84
I
CTGGGAGAACACAGCCAATGTGAATGCAGA LGEHSQCECR 104
I
GACAGGGTTGCCATACCCCACCACCGTCCC D R V A I PHHRP 124
ACCCCGGGAGCACCCTCCCCAGCTGACATC TPGAPSPADI 144
Fig.9(ii)
185 293 ł
496 ATCCATCCCACTCCAGCCCCAGGATCCTCT IHPTPAPGSS
S P R I L
556 CTGACCCCCGGACCTGCCGTTGCCGCTGTA LTPGPAVAAV
PDPRTCRCRC
616 GGGGCTTAGAGCTCAACCCAGACACCTGTA GA*
RGLELNPDTC
676
736
796
856
916
976
1036 ctttccagactccacgggcccggctgcttt agcacaggcgtaacctcctcagtctgggag gagctctctcgccatcttttatctcccaga atgtctcacctcaggggccagggtactctc ttctggctggctgtctcccctcactatgaa gggttctgttatgataactgtgacacacac gacactaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
Fig.9 (iii)
185 293
GCCCGCCTTGCACCCAGCGCCGCCAACGCC ARLAPSAANA 164
CPPCTQRRQR 130
GACGCCGCCGCTTCCTCCATTGCCAAGGGC DAAASSIAKG 184
RRRRFLHCQG 150 i
GGTGCCGGAAGCCGCGAAAGTGĄcaagctg
186
RCRKPRK* 167 acacac tatggccctgcttcacagggagaagagtgg gtcactgccccaggacctggaccttttaga gctgccatctaacaattgtcaaggaacctc tcacttaaccaccctggtcaagtgagcatc aaccccaaacttctaccaataacgggattt iltcacactctgataaaagagatgga aaaaaaaaaaaa
Fi g.9(iv)
185 293
47/52
Fig 10(i)
42/52
Fig (0(H)
185 293
A
I
| hVRF167 | -21 MSPLLRRLLLAALLQLAPAQAP 1 1 1 I II 1 II II 1 II I 1 1 III |
| mVRF167 | 1 II I 1 i 1 1 1 1 1 I 1 1 I I 1 III -21 MSPLLRRLLLVALLQLARTQAP |
| hVRF167 | 3 0 EVWPLTVELMGTVAKQLVPSC 1 1 1 1 1 1 -llll 1 1 1 1 1 1 1 1 |
| mVRFl67 | 1 1 1 1 1 1 · 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 0 EVWPLSMELMGNWKQLVPSC |
| hVRF167 | 80 ILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQC |
| mVRFl67 | 80 ILMIQYPSSQLGEMSLGEHSQC |
| hVRF167 | 130 RPDPRTCRCRCRRRSFLRCQGR |
| mVRFl67 | 130 RPDPRTCRCRCRRRRFLHCQGR |
Β
| hVRF186 | 116 RAATPHHRPQPRSVPGWDSAPG |
| mVRFl86 | 116 RVAIPHHRPQPRSVPGWDSTPG |
| hVRF186 | 166 TPGPAAAAADAAASSVAKGGA* |
| mVRF186 | 166 TPGPAVAAVDAAASSIAKGGA* Fig. 10(i) |
185 293
VSQPDAPGHQRKWSWIDVYTRATCQPR 2 9
VSQFDGPSHQKKWPWIDVYARATCQPR 2 9
VTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQ 7 9
111II11IIIIII11IIIII11II11II
VTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQ 7 9
ECRPKKKDSAVKPDSPRPLCPRCTQHHQ 129 lilii Ml MIII II III MM
ECRPKKKESAVRPDSPRILCPPCTQRRQ 129
GLELNPDTCRCRKLRR* 167
111111111111111:
GLELNPDTCRCRKPRK* 167
APSPADITHPTPAPGPSAHAAPSTTSAL 165
APSPADIIHPTPAPGSSARLAPSAANAL 165
186
186
Fig.Odi)
185 293
44/52
Fig (((ι)
45/52
Fig ((ii)
185 293
| mVRF167 | -21 | MSPLLRRL..LLVALLQL.. |
| mVEGFl88 | -26 | MNFLLSWVHWTLALLLYLHH |
| mVRF167 | 25 | TCQPREWVPLSMELMGNW |
| mVEGF188 | 24 | YCRPIETLVDIFQEYPDEIE |
| mVRFl67 | 75 | QVRMQILMIQYPSSQ.LGEM |
| mVEGFl88 | 74 | NITMQIMRIKPHQSQHIGEM |
| mVRFl67 | 119 | ..............ILCPPC • 1 1 1 |
| mVEGF188 | 124 | 1 I 1 QKRKRKKSRFKSWSVHCEPC |
| mVRFl67 | 152 | GLELNPDTCRCRKPRK |
| mVEGFl88 | 173 | QLELNERTCRCDKPRR |
Fig.11(i)
185 293 ł
| AR. TQAPVSQFDGPSHQKKWPWIDVYARA | 24 |
| AKWSQAAPTT.EGEQKSHEVIKFMDVYQRS | 23 |
| KQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQH | 74 |
| YIFKPSCVPLMRCAGCCNDEALECVPTSES | 73 |
| SLGEHSQCECRPKKKESAVRPDSPR..... I . . II II I I (I 1 II | 118 |
| 1 * - 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I SFLQHSRCECRPKKDRTKPEKKSVRGKGKG | 123 |
| TQRRQR...PDPRTCRCRCRRRRFLHCQGR | 151 |
| SERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDS.RCKAR | 172 |
| 167 |
188
Fig. (((ii)
185 293
Fig. 12 <Ν W&a co 2Ζ223 σ} ππνΛ <?μ νππη <ν
185 293
SERCE s
s<
o
ZD
U
0.
UJ
CO ur
*3 .3kb
Fig.(3
185 293
185 293
Fig. 15
185 293
ŚREDNIA DŁUGOŚĆ NEURYTU (um) % PRZEROSTU NEURYTU
185 293
6000
5000 „ 4000 ε
3000
2000
1000 glej mózgowy cns nl
OLIGODENDROCYTY
i 00 ng
185 293
MYSIE KOMÓRKI ASTROGLEJOWE
MYSIE KOMÓRKI OLIGODENDROGLEJOWE
MYSIE NEURONY PRZEDMÓZGOWIA
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 6,00 zł.
Claims (36)
- Zastrzeżenia patentowe1. Izolowany polipeptyd posiadający przynajmniej jedną spośród następujących cech:(i) zdolność do indukowania proliferacji komórek nabłonka naczyniowego;(ii) zdolność do oddziaływania z rodziną receptorówflt-1/flk-1, oraz (iii) zdolność do indukowania migracji komórek, przeżywalności komórek i/lub wzrostu wewnątrzkomórkowych poziomów alkalicznej fosfatazy;przy czym polipeptyd zawiera:a. sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji w obecności 0,1-1 x SSC/0,1% wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin, lubb. sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4 lub sekwencję aminokwasową posiadającą wobec niej przynajmniej 70% podobieństwo;lub pochodna takiego polipeptydu, wykazująca przynajmniej jedną z cech (i) - (iii).
- 2. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3.
- 3. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 5.
- 4. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 7.
- 5. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 9.
- 6. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4.
- 7. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 6.
- 8. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 8.
- 9. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 10.
- 10. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest pochodzenia ludzkiego.
- 11. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada przynajmniej jedną spośród następujących cech: zdolność indukowania proliferacji astrogleju, zdolność do wspomagania neuronowej żywotności i/lub proliferacji u ssaków.
- 12. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest dojrzałą formą polipeptydu z odtrawioną sekwencją liderową.
- 13. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego posiadająca sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji w obecności 0,1 -1 x SSC/0,1% wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin.
- 14. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 13, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3.185 293
- 15. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 13, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 5.
- 16. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 13, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 7.
- 17. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 13, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 9.
- 18. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 13, znamienna tym, że koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4 lub sekwencję aminokwasową posiadającą wobec niej przynajmniej 70% podobieństwo.
- 19. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 13, znamienna tym, że koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4.
- 20. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 13, znamienna tym, że koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 6.
- 21. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 13, znamienna tym, że koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 8.
- 22. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 13, znamienna tym, że koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasowa przedstawioną na SEQ ID nr 10.
- 23. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 13, znamienna tym, że koduje polipeptyd posiadający przynajmniej jedną spośród następujących cech:(i) zdolność do indukowania proliferacji komórek nabłonka naczyniowego;(ii) zdolność do oddziaływania z rodziną receptorów oraz (iii) zdolność do indukowania migracji komórek, przeżywalności komórek i/lub wzrostu wewnątrzkomórkowych poziomów alkalicznej fosfatazy;lub pochodną takiego polipeptydu, wykazującą przynajmniej jedną z cech (i) - (iii).
- 24. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 23, znamienna tym, że koduje polipeptyd dodatkowo posiadający zdolność indukowania proliferacji astrogleju.
- 25. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 23, znamienna tym, że koduje polipeptyd dodatkowo posiadający zdolność do wspomagania neuronowej żywotności i/lub proliferacji u ssaków.
- 26. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 13, znamienna tym, że ona lub kodowany przez nią polipeptyd jest pochodzenia ludzkiego.
- 27. Sposób otrzymywania polipeptydu posiadającego przynajmniej jedną spośród następujących cech:(i) zdolność do indukowania proliferacji komórek nabłonka naczyniowego;(ii) zdolność do oddziaływania z rodziną receptorów flt-1/flk-19 oraz (iii) zdolność do indukowania migracji komórek, przeżywalności komórek i/lub wzrostu wewnątrzkomórkowych poziomów alkalicznej fosfatazy, znamienny tym, że obejmuje ekspresjonowanie cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd zawierający:a. sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji w obecności 0,1 - 1 x SSC/0, 1% wag./wag. SDS w 60 °C przez 1-3 godzin, lubb. sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4 lub sekwencję aminokwasową posiadającą wobec niej przynajmniej 70% podobieństwo;lub pochodna takiego polipeptydu w odpowiednim gospodarzu hodowanym w warunkach odpowiednich dla syntezy polipeptydu.
- 28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 7 i SEQ ID nr 9, albo sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SEQ ID nr 8, SEQ ID nr 10, przy czym korzystnie izolowany polipeptyd jest pochodzenia ludzkiego.185 293
- 29. Cząsteczka antysensowna hybrydyzująca z cząsteczką kwasu nukleinowego posiadającą sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną lub z cząsteczką kwasu nukleinowego posiadającą sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji w obecności 0,1 - 1 x SSC/0,1% wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin.
- 30. Cząsteczka antysensowna według zastrz. 29, znamienna tym, że hybrydyzuje z cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 7, SEQ ID nr 9, albo cząsteczką kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SEQ ID nr 8, SEQ ID nr 10 lub sekwencji aminokwasowej posiadającej przynajmniej 70% podobieństwo do SEQ ID nr 4.
- 31. Środek farmaceutyczny do wywoływania proliferacji astrogleju u ssaka i/lub zwiększania przetrwania i/lub proliferacji neuronów ssaków zawierający czynnik aktywny oraz jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych nośników i/lub rozcieńczalników', znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera izolowany polipeptyd posiadający przynajmniej jedną spośród następujących cech:(i) zdolność do indukowania proliferacji komórek nabłonka naczyniowego;(ii) zdolność do oddziaływania z rodziną receptoróworaz (iii) zdolność do indukowania migracji komórek, przeżywalności komórek i/lub wzrostu wewnątrzkomórkowych poziomów alkalicznej fosfatazy;przy czym polipeptyd zawiera:a. sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji w obecności 0,1 - 1 x SSC/0,1% wag. /wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin, lubb. sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4 lub sekwencję aminokwasową posiadającą wobec niej przynajmniej 70% podobieństwo;lub pochodna takiego polipeptydu, wykazująca przynajmniej jedną z cech (i) - (iii).
- 32. Środek farmaceutyczny według zastrz. 31, znamienny tym, że izolowany polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 7 i SEQ ID nr 9, albo sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SEQ ID nr 8, SEQ ID nr 10, przy czym izolowany polipeptyd jest korzystnie pochodzenia ludzkiego lub dojrzałą formą polipeptydu z odtrawioną sekwencją liderową.
- 33. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego posiadającą sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji w obecności 0,1 -1 x SSC/0,1% wag./wag. SDS w60°Cprzez 1-3 godzin.
- 34. Komórka gospodarza według zastrz. 33, znamienna tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 7, SEQ ID nr 9 albo koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SEQ ID nr 8, SEQ ID rur 10 lub sekwencji aminokwasowej posiadającej przynajmniej 70% podobieństwo do SEQ ID nr 4.
- 35. Wektor, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego cząsteczkę kwasu nukleinowego posiadającą sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji w obecności 0,1 - 1 x SSC/0,1% wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin.
- 36. Wektor według zastrz. 35, znamienny tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 7, SEQ ID nr 9185 293 albo koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SEQ ID nr 8, SEQ ID nr 10 lub sekwencji aminokwasowej posiadającej przynajmniej 70% podobieństwo do SEQ ID nr 4.* * *Ujawnienie ogólnie dotyczy wydzielonej cząsteczki o właściwościach zbliżonych do właściwości naczyniowego nabłonkowego czynnika wzrostu oraz kodującej go sekwencji genetycznej. Cząsteczka będzie przydatna w opracowywaniu szeregu środków terapeutycznych i diagnostycznych przydatnych w leczeniu zapobieganiu i/lub diagnozowaniu stanów wymagających zwiększonej lub zmniejszonej przepuszczalności układu naczyniowego i/lub naczyń. Cząsteczka według ujawnienia stanowi również przydatny efektor głównych lub ośrodkowych neuronów oraz jest zdolna do wywoływania proliferacji astrogleju.Cząsteczka taka jest również przydatnym efektorem głównych i ośrodkowych neuronów oraz może wywoływać proliferację astroglejową.Szczegóły bibliograficzne dotyczące publikacji określanych w opisie nazwiskiem autora zebrano na końcu opisu. Liczby identyfikujące sekwencje (SEQ ID nr) dotyczące sekwencji nukleotydowych i aminokwasów, wymienione w opisie, określone są po bibliografii.W całym opisie, o ile nie zaznaczono tego inaczej, słowo „obejmują” lub jego warianty takie jak „obejmuje” lub „obejmujący” dotyczy włączenia podanego elementu lub jednostki albo grupy elementów lub jednostek, ale nie wyklucza jakiegokolwiek innego elementu lub jednostki albo grupy elementów lub jednostek. Naczyniowy nabłonkowy czynnik wzrostu (poniżej określany jako „VEGF”), znany także jako naczyniowoczynny czynnik przepuszczalności, stanowi wydzieloną, kowalencyjnie połączoną homodimeryczną glikoproteinę, która swoiście uaktywnia tkankę nabłonkową (Senger i inni, 1993). Do szeregu funkcji przypisywanych VEGF, takich jak jego rola w normalnej angiogenezie należy tworzenie ciała żółtego (Yan i inni, 1993) oraz rozwój łożyska (Sharkey i inni, 1993), regulacja przepuszczalności naczyń (Senger i inni, 1993), stany zapalne w angiogenezie (Sunderkotter i inni, 1994) oraz autotransplantacja (Dissen i inni, 1994), a także rola w chorobach ludzi, takich jak angiogeneza prowadząca do nowotworu (Folkman i Shing, 1992), reumatoidalne zapalenie stawów (Koch i inni, 1994) oraz retynopatia cukrzycowa (Folkman i Shing, 1992) .Z tego względu VEGF jest ważną cząsteczką stanowiącą potencjalnie cenny cel do badań nad środkami terapeutycznymi, profilaktycznymi i diagnostycznymi opartymi na VEGF lub nad jej aktywnością. Istnieje także zapotrzebowanie na identyfikację homologów lub innych zbliżonych cząsteczek do stosowania jako zamienniki VEGF lub w połączeniu z VEGF.W pracach, które doprowadziły do wynalazku poszukiwano genu podatności na liczne nowotwory układu gruczołów hormonalnych typu I (MEN1). Nieoczekiwanie stwierdzono, że sekwencja genetyczna, którą wykluczono jako kandydata genu MEN1 stanowiła nowy czynnik wzrostu wykazujący pewne podobieństwo do VEGF. Ponadto ujawniony czynnik wzrostu stanowi cząsteczkę efektorową dla głównych i ośrodkowych neuronów.W jednym aspekcie niniejszy opis ujawnia biologicznie wydzieloną cząsteczkę białkową zawierającą sekwencję aminokwasów, która:(i) jest w co najmniej 15% podobna do sekwencji aminokwasów podanej w SEQ ID nr 2 oraz (ii) jest w co najmniej 5% niepodobna do sekwencji podanej w SEQ ID nr 2.W innym aspekcie ujawnienie dotyczy biologicznie wydzielonej cząsteczki białkowej, która:(i) zawiera sekwencję aminoawasów asykazującąco naj mniej około 15% podobieństwa, ale także co najmniej około 5% niepodobieństwa z całością lub częścią sekwencji aminokwasów podanej w SEQ ID nr 2; oraz185 293 (ii) wykazuje co najmniej jedną właściwość wspólną z VEGEW zbliżonym aspekcie ujawnienie dotyczy biologicznie wydzielonej cząsteczki białkowej, która:(i) zawiera sekwencję aminokwasów wykazującą co najmniej około 15% podobieństwa, ale także co najmniej około 5% niepodobieństwa z całością lub częścią sekwencji aminokwasów podanej w SEQ ID nr 2; oraz (ii) wykazuje co najmniej jedną z następujących właściwości:(a) zdolność do wywoływania proliferacji naczyniowych komórek nabłonkowych;(b) zdolność do oddziaływania z rodziną receptorów oraz (c) zdolność do wywoływania migracji komórek, przetrwania komórek i/lub zwiększania wewnątrzkomórkowych poziomów fosfatazy alkalicznej.Określenie “biologicznie wydzielona” oznacza, że cząsteczka poddana została co najmniej jednemu etapowi oczyszczania ze źródła biologicznego. Korzystnie cząsteczka jest również biologicznie czysta, co oznacza, że kompozycja zawiera co najmniej około 20%, jeszcze korzystniej co najmniej około 40%, szczególnie korzystnie co najmniej około 65%, a jeszcze korzystniej co najmniej około 80-90% lub więcej cząsteczki w stosunku do innych związków w kompozycji, jeśli oznaczenie wykonuje się wagowo, na podstawie aktywności lub w inny dogodny sposób. Najkorzystniej cząsteczka jest sekwencyjnie czysta.W innym korzystnym aspekcie przedmiotem ujawnienia jest cząsteczka w postaci zrekombinowanej.Zgodnie z tym aspektem ujawnienie dotyczy zrekombinowanej cząsteczki zawierającej sekwencję aminokwasów, która:(i) jest w co najmniej 15% podobna do sekwencji aminokwasów podanej w SEQ ID nr 2 oraz (ii) jest w co najmniej 5% niepodobna do sekwencji podanej w SEQ ID nr 2.W zbliżonym aspekcie ujawnienie dotyczy zrekombinowanej cząsteczki, która:(i) zawiera sekwencję aminokwasów wykazującą co najmniej około 15% podobieństwa, ale także co najmniej około 5% niepodobieństwa z całością lub częścią sekwencji aminokwasów podanej w SEQ ID nr 2; oraz (ii) wykazuje co najmniej jedną właściwość wspólną z VEGRW kolejnym zbliżonym aspekcie ujawnienie dotyczy zrekombinowanej cząsteczki, która:(i) zawiera sekwencję aminokwasów wykazującą, co najmniej około 15% podobieństwa, ale także co najmniej około 5% niepodobieństwa z całością lub częścią sekwencji aminokwasów podanej w SEQ ID nr 2; oraz (ii) wykazuje co najmniej jedną z następujących właściwości:(a) zdolność do wywoływania proliferacji naczyniowych komórek nabłonkowych;(b) zdolność do oddziaływania z rodziną receptorówflt-1/flk-l·, oraz (c) zdolność do wywoływania migracji komórek, przetrwania komórek i/lub zwiększania wewnątrzkomórkowych poziomów fosfatazy alkalicznej.Przedmiotem ujawnienia są także genomowe lub częściowe genomowe klony kodujące białkową cząsteczkę wykazującą co najmniej około 15% podobieństwa, ale także co najmniej około 5% niepodobieństwa z SEQ ID nr 1.Sekwencja aminokwasów podana w SEQ ID nr 2 odpowiada ludzkiemu VEGF (określanemu w opisie jako “VEGF165”). w związku z tym ujawniona cząsteczka jest VEGF-podobna lub stanowi homolog VEGF, z tym że zawiera sekwencję aminokwasów podobną, ale nie identyczną z sekwencją aminokwasów VEGF. Jakkolwiek wynalazek przedstawiono na przykładzie cząsteczki podobnej do ludzkiego VEGF, dokonano tego zdając sobie sprawę, że ujawnienie dotyczy także homologicznej cząsteczki i sekwencji kodującej pochodzącej od innych ssaków, takich jak zwierzęta hodowlane (np. owce, świnie, konie i krowy), zwierzęta domowe (np. psy i koty) oraz laboratoryjne zwierzęta doświadczalne (np. myszy, szczury, króliki i świnki morskie), a także od zwierząt nie będących ssakami, takich jak ptaki (np. drób), ryby i gady. W najkorzystniejszym wykonaniu cząsteczka VEGF-podobna jest185 293 pochodzenia ludzkiego i jest kodowana przez gen zlokalizowany w chromosomie 11q13. w związku z tym ujawnienie rozciąga się na sekwencję genomową lub jej część, kodującą cząsteczkę VEGF-podobną będącą przedmiotem ujawnienia.Korzystnie procent podobieństwa wynosi co najmniej około 30%, jeszcze korzystniej co najmniej około 40%, szczególnie korzystnie co najmniej około 50%, jeszcze korzystniej co najmniej około 60-70%,a wyjątkowo korzystnie co najmniej około 80-95%, w stosunku do całości lub części sekwencji aminokwasów podanej w SEQ ID nr 2.W szczególnie korzystnym wykonaniu VEGF-podobna cząsteczka zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEQ ID nr 4, albo jej część, fragment, pochodną lub analog. Szczególnie korzystne podobieństwa wynoszą około 19-20% i 29-30%. Odniesienia do pochodnych obejmuje również wariantów składanych (spliced). w związku z tym ujawnienie rozciąga się na warianty składane SOM175. Do przykładowych wariantów składanych objętych zakresem ujawnienia należą, ale nie wyłącznie, warianty z sekwencją aminokwasów zasadniczo taką jak sekwencja podana w co najmniej jednej z SEQ ID nr 6, q6, SEQ ID nr 8 i/lub SEQ ID nr 10, albo ich mutanty lub pochodne oraz kolejne warianty składane.W innym wykonaniu ujawnienie dotyczy zrekombinowanej cząsteczki, która:(i) zawiera sekwencję aminokwasów zasadniczo taką jak sekwencja podana w SEQ ID nr 4, albo wykazującą co najmniej około 15% podobieństwa w stosunku do jej całości lub części, z tym że ta sekwencja aminokwasów jest w co najmniej 5% niepodobna do całości lub części sekwencji aminokwasów podanej w sEQ ID nr 2; oraz (ii) wykazuje co najmniej jedną właściwość biologiczną wspólną z VEGF.W kolejnym wykonaniu ujawnienie dotyczy zrekombinowanej cząsteczki, która:(i) zawiera sekwencję aminokwasów zasadniczo taką jak sekwencja podana w SEQ ID nr 6, albo wykazującą co najmniej około 15% podobieństwa w stosunku do jej całości lub części, z tym że ta sekwencja aminokwasów jest w co najmniej 5% niepodobna do całości lub części sekwencji aminokwasów podanej w sEq ID nr 2; oraz (ii) wykazuje co najmniej jedną właściwość biologiczną wspólną z VEGF.W jeszcze innym wykonaniu ujawnienie dotyczy zrekombinowanej cząsteczki, która:(i) zawiera sekwencję aminokwasów zasadniczo taką jak sekwencja podana w SEQ ID nr 8, albo wykazującą co najmniej około 15% podobieństwa w stosunku do jej całości lub części, z tym że ta sekwencja aminokwasów jest w co najmniej 5% niepodobna do całości lub części sekwencji aminokwasów podanej w SEQ ID nr 2; oraz (ii) wykazuje co najmniej jedną właściwość biologiczną wspólną z VEGF.W kolejnym wykonaniu ujawnienie dotyczy zrekombinowanej cząsteczki, która:(i) zawiera sekwencję aminokwasów zasadniczo taką jak sekwencja podana w SEQ ID nr 10, albo wykazującą co najmniej około 15% podobieństwa w stosunku do jej całości lub części, z tym że ta sekwencja aminokwasów jest w co najmniej 5% niepodobna do całości lub części sekwencji aminokwasów podanej w sEq ID nr 2; oraz (ii) wykazuje co najmniej jedną właściwość biologiczną wspólną z VEGF.Do takich właściwości VEGF należy co najmniej jedna z następujących:(a) zdolność do wywoływania proliferacji naczyniowych komórek nabłonkowych;(b) zdolność do oddziaływania z rodziną receptorówflt-1/flk-1; oraz , (c) zdolność do wywoływania migracji komórek, przetrwania komórek i/lub zwiększania wewnątrzkomórkowych poziomów fosfatazy alkalicznej.Korzystnie podobieństwo wynosi co najmniej około 40%, jeszcze korzystniej co najmniej około 50%, a szczególnie korzystnie co najmniej około 65%.W jeszcze innym aspekcie ujawnienie dotyczy fragmentu peptydu odpowiadającego części sekwencji aminokwasów podanej w SEQ ID nr 4, jej wariantu składanego takiego jak wariant podany w SEQ ID nr 6, SEQ ID nr 8 lub SEQ ID nr 10 albo jego chemicznego odpowiednika. Biologicznie wydzielona lub zrekombinowana cząsteczka według ujawnienia może być glikozylowana w sposób naturalny, albo też może zawierać zmieniony układ glikozylowania w zależności od komórek, z których został wydzielony lub w których został185 293 zsyntetyzowany. Tak np. jeśli cząsteczka została wytworzona na drodze rekombinacji w organizmach prokariotycznych, to nie będzie glikozylowana. Cząsteczka może być w formie naturalnej o pełnej długości albo też może być skrócona lub w inny sposób zmodyfikowana.W jeszcze innym aspekcie ujawnienie dotyczy cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej przedstawioną w opisie cząsteczkę VEGF-podobną. w szczególności ujawnienie dotyczy cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję nukleotydów zasadniczo takąjak sekwencja podana w SEQ ID nr 3, albo wykazującej co najmniej 15% podobieństwa z jej całością lub częścią, bądź też zdolną do hybrydyzacji w warunkach o małej ostrości z odwrotnym dopełnieniem sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEQ ID nr 3, pod warunkiem, że sekwencja kwasu nukleinowego wykazuje co najmniej 15% podobieństwa, ale również co najmniej 30% niepodobieństwa z sekwencją nukleotydową przedstawioną w SEQ ID nr 3. Sekwencja nukleotydową przedstawiona w SEQ ID nr 3 jest również określana w opisie jako „SOM175”. Korzystnie procent niepodobieństwa wynosi około 35%, jeszcze korzystniej około 39%, a szczególnie korzystnie około 40-50% lub powyżej.W celu określenia poziomu ostrości można dogodnie powołać się na publikację Sambrooka i innych (1989), str. 9.47-9.51, którą wprowadza się jako źródło literaturowe, gdzie podane warunki etapów przemywania uważa się za warunki o dużej ostrości. Warunki o małej ostrości określa się jako przemywanie w 4-6 x SSC/0, 1 -0,5% wagowo/objętościowych SDS w 37-45°C przez 2-3 godziny, w zależności od źródła i stężenia kwasu nukleinowego biorącego udział w hybrydyzacji, można zastosować warunki o innej ostrości, np. warunki o średniej ostrości, za które uważa się w opisie przemywanie w 1-4x SSC/0,25-0,5% wagowo/objętościowych SDS w > 45°C przez 2-3 godziny, albo warunki o dużej ostrości, za które uważa się przemywanie w 0,1-1 x SSC/0,1% wagowo/objętościowych SDS w 60°C przez 1-3 godziny'.Przedmiotem ujawnienia jest także cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje VEGF-podobną cząsteczkę określoną powyżej, wykazująca co najmniej 15% homologii z SEQ ID nr 3. Korzystnie poziom homologii wynosi co najmniej około 40%, a jeszcze korzystniej około 60-70%.Ujawnienie dotyczy ponadto mysiego homologu ludzkiego VEGF (określanego w opisie jako „mVEGF”). mVEGF wykazuje około 85% identyczności i 92% zachowania reszt aminokwasów w całym obszarze kodującym w stosunku do ludzkiego VEGF. mVEGF jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającego sekwencję nukleotydową zasadniczo takąjak sekwencja przedstawiona na fig. 9.Cząsteczka VEGF-podobna będzie przydatna, sama lub w kombinacji z innymi cząsteczkami takimi jak VEGF, w opracowywaniu szeregu zastosowań terapeutycznych i/lub diagnostycznych, w związku z tym ujawnienie dotyczy także kompozycji farmaceutycznych zawierających cząsteczkę VEGF-podobną albo jej części, fragmenty, pochodne, homologi lub analogi, wraz z jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami i/lub rozcieńczalnikami. Ponadto ujawnienie obejmuje swym zakresem wektory zawierające sekwencję kwasu nukleinowego podaną w SEQ ID nr 3, albo wykazujące w stosunku do niej podobieństwo w co najmniej około 15%, jeszcze korzystniej w około 40%, a szczególnie korzystnie w około 60-70%, ale równocześnie co najmniej 30%, a jeszcze korzystniej około 39% niepodobieństwa, a także zawierające je cząsteczki gospodarza. Na dodatek ujawnienie obejmuje swym zakresem rybozymy i cząsteczki antysensowne oparte na SEQ ID nr 3, a także zobojętniające przeciwciała względem cząsteczki VEGF- podobnej. Cząsteczki takie mogą być przydatne w celu łagodzenia takich efektów jak np. nadekspresja genów VEGF-podobnych, prowadzących do angiogenezy i unaczyniania nowotworów.W innym aspekcie ujawnienie dotyczy sposobu wywoływania proliferacji astrogleju u ssaka, polegającego na tym, że podaje się temu ssakowi skuteczną ilość zrekombinowanej cząsteczki białkowej, która:(i) zawiera sekwencję amrnokwasów vsykazującąco nąjmniej około 15% podobiedstwa, ale także co najmniej około 5% niepodobieństwa z sekwencją podaną w SEQ ID nr 2; oraz185 293 (ii) wykazuje co najmniej jedną właściwość wspólną z naczyniowym nabłonkowym czynnikiem wzrostu (VEGF).Korzystnie zrekombinowana cząsteczka białkowa zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEQ ID nr 3 lub SEQ ID nr 6. w kolejnym wykonaniu ujawnienie dostarcza sposobu zwiększania przetrwania i/lub proliferacji neuronów u ssaków, polegającego na tym, że podaje się temu ssakowi skuteczną ilość zrekombinowanej cząsteczki białkowej, która:(i) zawiera sekwencję aminokwasów wykazującą co najmniej około 15% podobieństwa, ale także co najmniej około 5% niepodobieństwa z sekwencją podaną w SEQ ID nr 2; oraz (ii) wykazuje co najmniej jedną właściwość wspólną z naczyniowym nabłonkowym czynnikiem wzrostu (VEGF), przy czym podawanie takie wykonuje się przez okres czasu i w warunkach wystarczających do wywołania proliferacji astrogleju.Korzystnie zrekombinowana cząsteczka białkowa zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEQ ID nr 3 lub SEQ ID nr 6. Ujawnienie dotyczy także przeciwciał względem cząsteczki VEGF-podobnej albo sond kwasu nukleinowego do genu kodującego cząsteczkę VEGF-podobną, przydatnych jako środki diagnostyczne.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPN1457A AUPN145795A0 (en) | 1995-03-02 | 1995-03-02 | A novel growth factor and a genetic sequence encoding same |
| PCT/AU1996/000094 WO1996027007A1 (en) | 1995-03-02 | 1996-02-22 | A novel growth factor and a genetic sequence encoding same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL322067A1 PL322067A1 (en) | 1998-01-05 |
| PL185293B1 true PL185293B1 (pl) | 2003-04-30 |
Family
ID=3785813
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96322067A PL185293B1 (pl) | 1995-03-02 | 1996-02-22 | Izolowany polipeptyd, izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, sposób otrzymywania polipeptydu, cząsteczka antysensowna, środek farmaceutyczny, komórka gospodarza oraz wektor |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AUPN145795A0 (pl) |
| PL (1) | PL185293B1 (pl) |
-
1995
- 1995-03-02 AU AUPN1457A patent/AUPN145795A0/en not_active Abandoned
-
1996
- 1996-02-22 PL PL96322067A patent/PL185293B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AUPN145795A0 (en) | 1995-03-23 |
| PL322067A1 (en) | 1998-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20070135344A1 (en) | Novel growth factor and a genetic sequence encoding same | |
| DE69734359T2 (de) | Rekombinanter vaskulärer endothelzellen wachstumsfaktor d (vegf-d) | |
| DE69636752T2 (de) | Menschlicher wachstumsfaktor 2, spezifisch für vaskuläre endothelzellen | |
| Kocher et al. | Analysis of α-smooth-muscle actin mRNA expression in rat aortic smooth-muscle cells using a specific cDNA probe | |
| Nedivi et al. | Numerous candidate plasticity-related genes revealed by differential cDNA cloning | |
| DE69534351T2 (de) | Motorneuronlebenserhaltungsgen: ein Gen für spinale Muskelatrophie | |
| KR100640265B1 (ko) | Ｌｙ6ｈ 유전자 | |
| PL185293B1 (pl) | Izolowany polipeptyd, izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, sposób otrzymywania polipeptydu, cząsteczka antysensowna, środek farmaceutyczny, komórka gospodarza oraz wektor | |
| Foster et al. | Nucleotide sequence of the complementary DNA for turkey growth hormone | |
| AU707513B2 (en) | A novel growth factor and a genetic sequence encoding same | |
| US7160991B1 (en) | Vascular endothelial growth factor polypeptides | |
| Khoo | Isolation and characterization of the putative MIH gene sequence from the lobster Jasus edwardsii. | |
| WO2001012126A2 (en) | Cardiomyocyte regeneration | |
| JPH09294589A (ja) | 牛のマクロファージの膜タンパク質をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含むベクターおよび形質転換体 |