JPH10510144A

JPH10510144A - 培養真核細胞の解離方法

Info

Publication number: JPH10510144A
Application number: JP8515089A
Authority: JP
Inventors: − ルーサルズマン、ジャン
Original assignee: ユニベルシテ・ピエール・エ・マリー・キュリー（パリ・シジエーム）
Priority date: 1994-11-04
Filing date: 1995-10-31
Publication date: 1998-10-06
Also published as: WO1996014395A1; FR2726574B1; US5906939A; FR2726574A1; EP0789756A1

Abstract

(57)【要約】増殖後に細胞を回収する少なくとも一つの工程と、適宜該細胞を凍結解凍する工程とにより、付着性の真核細胞を調製する方法であって、調製液が少なくとも一つの多糖ポリマの誘導体を含んでいることを特徴とする、方法。

Description

【発明の詳細な説明】培養真核細胞の解離方法本発明は、付着性の真核細胞、または培養組織の回収及び操作方法の改良に関する。現在において細胞培養は、組み換えタンパク質を発現するための、またはこれらの細胞が組み換えウイルスで形質転換される時には、遺伝子治療で投与される宿主細胞用としての、方法の一つであって、遺伝子工学技術に課せられた避けることのできないものである。後者の場合には、ウイルスまたはレトロウイルスベクタで形質転換された細胞は、ある場合には直接、組織に再移植される：この異なる技術のレビュ−は文献に記載されている（Ｔherapie geniques，1'ＡＤＮ m edicaments coordinated by Ａxel Ｋahn，publisher Ｊohn Ｗiley Ｌibby，(1 993);また次の文献を参照するのも有益であろう：Ｒ.Ｃ．Ｍulligan，Ｓcience( 1993),Ｖol260，p926）。生細胞の収量は、真核細胞を培養する場合には、細胞自体、及びそれより得られる産物の実際の質に関して、並びに得られる産物の量と、該産物の生産コストの両方に関して重要である。これは特には遺伝子治療の方法が、細胞、例えばパッケ−ジング細胞で組み換えのウイルスまたはレトロウイルスを含有するものの注射により行なわれる場合であって、上記の組み換えウイルスまたはレトロウイルスの感染性力価が直接的に、パッケ−ジング細胞の生理学的状態とその濃度に依存する場合には、重要である。付着性細胞はしばしば、細胞により分泌される産物を産生するのに使用されるか、またはそれ自体で遺伝子治療において使用される。最も古典的な例は、組み換え分子またはクロ−ン化受容体の産生用のＣＨＯ細胞(Ｃhinese hamster ovar y cells)、または遺伝子治療で使用されるその他の線維芽細胞、及び特にはＮＩＨ3Ｔ3のような3Ｔ3に由来する細胞である。細胞をその支持体より剥離するために、種々の物理学的手法(スクレ−パ−)、または化学的手法（ＥＤＴＡ型のキレ−ト剤、若しくはトリプシン型のタンパク質分解性の酵素）が使用されてきた。これら全ての技術には幾つかの欠点がある。物理学的方法またはＥＤＴＡのようなキレ−ト剤を使用することは込み入っていて、凝集物の出現や、生存度の低減が生じる。トリプシンのようなタンパタ質分解性酵素は細胞表面のタンパク質を分解し、生存度を低減し、凝集物の存在を完全にはなくさずに、生物学的な特徴を阻害して、結果的に実際よりも感染性を低減させる。細胞は、レトロウイルスを最適の力価で産生することを可能にする表面の糖タンパク質をもはや有さない。このことは例えば、遺伝子治療で使用されるマウスの線維芽細胞であって、またプラスティックの支持体上で培養されて、次いで回収され、腫瘍に直接注射される、ＮＩＨ3Ｔ3のパッケ−ジング細胞の使用にあてはまる。このタイプの治療の原理は、Ｍ11細胞として知られる、ＮＩＨ3Ｔ3の特異的な誘導体を作成し、腫瘍内においてin vivoで、治療用のレトロウイルスを産生させることである。このような処置の例として、次のような文献がある（Ｍ．Ｃaruso et al.，Ｐroc ．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ(1993)90:7024-7028; またはＫ.Ｗ．Ｃulver et al.，Ｓcience 256 Ｎo．5063 pp．1550-1551(1992)）。よってこれらの細胞の完全性とウイルス産生能力は、上記の処置の治療効果にとって基礎的である。凝集物には一連した欠点があって、最大の欠点は細胞数の過小評価と細胞計測の再現性が非常に低いことである。更に、凝集物の存在は、細胞の良好な貯蔵にとって必須の凍結工程を阻害するが、凝集物の中ほどの細胞には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような保存剤が届かなく、よって該凝集物をより脆弱にし、その死亡率を上昇させてしまう。最終的には、凝集物は遺伝子治療の際に組織や腫瘍に注射されたときに、細胞の拡散を阻害する。付着性の真核細胞のバルクな細胞培養を可能にする装置には種々のタイプがあるが、その原理は常に、細胞が表面に付着できるような最大限の表面積を有していることである。以下のものを、具体的に言及することができるが、それはこれらがありふれた装置であるためである：内部のシリンダ−壁に細胞がコ−トするロ−ラ−ボトル；細胞が重なり合った一連の板の上に付着して培養液とインキュベ−ションする、いわゆるマルチトレ−装置か、またはセルキュ−ブ（ＣellＣube）タイプの装置；サイトデックス（Ｃytodex）１、２、３またはサイトポア（Ｃytopore ）のブランド名で、ファルマシアにより販売されているマイクロキャリア−、またはマイクロビ−ズ；例えば、内部に細胞をいれる、くぼみファイバ−（hollow fibres）のカ−トリッジを含有する、既存の種々のシステムであって、その中では、セルマックス（Ｃellmax）、またはエンドトロニックス（Ｅndotronix）型のものがある。何等かの理由で細胞を回収することが望ましい時、特には細胞バンクを作り、それらを再び培養するとき、または治療剤としてそれらを使用する時には、連続する工程は以下の通りである： (a)細胞、または組織を栄養培地内で培養する； (b)細胞培養液を除去する； (c)キレ−ト剤、またはタンパク質分解性酵素、または両方の組み合わせを具備した解離液を加える； (d)上記の細胞を用いることがが望ましい使用に適した液体での、１またはそれより多い回数の洗浄工程。上記の細胞が凍結される場合には、該細胞は、５から２０％のＤＭＳＯと、３０から７０％のウシ胎仔血清を具備した培地に入れられる。凍結した細胞は次いで、１０％アルブミンを加えた生理食塩水からなる液体に再懸濁して解凍し、その次に該細胞を洗浄して、使用に適した最終的な液体内に細胞のペレットが取り入れられるまで、同じ液体で数回遠心した。膜の完全性と生存度を最大に維持しつつも、上記細胞を単離した状態で保存する際の問題は、現在では解決されていない。本発明は、上記した、培養工程が含まれる少なくとも一つの工程を具備し、さらに１またはそれ以上の工程中で細胞と接触している液にポリグリコシドポリマ−を加えることが含まれた、付着性真核細胞の調製方法を提供することにより、上記の問題を解決する。好ましくは、このポリグリコシドポリマ−は、多糖、また好ましくは硫酸化多糖である。このような硫酸化多糖の例は、例えばヘパリン、デキストラン硫酸、及びヒドロキシエチレンデンプン硫酸塩（hydroxyethyl starch sulphate）である。真核細胞の処置用液に加えられる本発明の多糖は、好ましくは分子量が５,０００から５００,０００の間にある。分子量が２０,０００のヘパリンは、本発明の方法が特に効果的である特別な場合となっている。ヘパリンは現在では、抗凝集剤として知られており、またそのように使用されている。ヘパリン、またはヘパリン誘導体をベ−スにした幾つかの薬用製品がこの性質のため、認可されて市場に出回っている。しかしながら、ヘパリンを本発明の方法で加えることの利点は、凝固または止血に関わるような生理学的機構によて説明することはできない。本発明の方法中で加える、硫酸化多糖の投薬量は、液体がキレ−ト剤、または酵素を含有する解離用液体のときには（工程(b)から(d)）、ml当たり５０から５００単位であり、好ましくはml当たり７５から１５０単位である。この投薬量は、細胞または組織の培養液に多糖を直接的に加える場合には(工程(a))、５００から５,０００ＩＵ／mlであり、好ましくは８００から２,０００ＩＵ／mlであり、１,６００ＩＵ／mlの濃度が、最適であると考えられる。この硫酸化多糖の、付着性細胞の凝集化予防効果は、その抗凝集性の性質によっても、またよく知られた、プロトロンビンからトロンビンへの変換の阻害作用によっても説明がつかない。実際に、細胞の支持体への付着能へのパリンの作用は、いまだよく分かっておらず、発表された結果には矛盾点がある。ヘパリンを加えることはしばしば細胞の凝集を増加させ(Ｈeparin induced aggregation of lymphoid cells：Ｊ.Ｃell Ｐhysiol．1986，126，352-358)、またヘパリンはしばしば細胞の剥離と人工的基質への付着を阻害する(Ｈeparin inhibits the a ttachment and growth of ＢＡＬＢ/Ｃ/3Ｔ3 fibroblasts of collagen substra ta，Ｊ．Ｃellular Ｐhysiol．1992，150，8-16)。本発明は更に、ポリグリコシドポリマ−誘導体の使用に関し、特には培養する付着性細胞または組織用の、培養液、解離液、更には凍結解凍液内での硫酸化多糖の使用に関する。ヘパリン、デキストラン硫酸、またはヒドロキシエチルデンプン硫酸塩は、本発明における好ましい多糖硫酸である。この使用により、以下のことが可能になる：細胞をよりよく解離させること；伝統的な方法により得られるものよりもより高い収量で上記の細胞を得ること；解離工程の後でも持続する凝集物の数とサイズとを下げること；細胞数計測において、よりよい再現性を得ること；凍結解凍、及び当該細胞の注射（これが最終的な使用であるとき）の方法を最適化すること。キレ−ト剤、またはタンパク質分解性酵素、あるいはその両方を含有する、細胞または組織解離液中において、ポリマ−誘導体が使用されるときには、最適の投薬量は、７５から１５０ＩＵ／mlの間である。ポリマ−誘導体が培養液で直接的に使用されるときには、最適濃度は５００から５,０００ＩＵ／mlの間であり、好ましくは８００と２,０００ＩＵ／mlの間であり、その最適濃度は１, ６００ＩＵ／mlの周辺である。後者の場合の利点は、一つにはそれが可能にする細胞生存度の上昇であり、他方では解離工程を回避しつつも培養している細胞または組織を回収する時の方法が経済的なことである；要するにすぐに凍結可能な細胞ペレットを得るのには、簡単な遠心、適切であればその後に行う洗浄工程で充分である。本発明はまた、上記した方法を実施して得られる真核細胞に関し、また同様に上記の細胞、または組織に由来する産物にも関するが、特にウイルス、組み換えタンパク質、または受容体に関する。このタイプの細胞の特別な例としては、特には次のものがある：Ｌ細胞、ＮＩＨ3Ｔ3株、ψＣＲＥ、及びψＣＲＩＰエンキャプシデ−ション株、ＴＳ13株（ハムスタ−細胞）、ＭＣ26腫瘍細胞、１４３ｂ腫瘍細胞、ＭＤＦ７腫瘍細胞、Ｂ16 Ｆ1腫瘍細胞、ＧＰ+envＡＭ12パッケ−ジング株、及びＨeＬa細胞。培養組織の例としては、ケラチノサイトの単層がある。組換え型の真核細胞、または遺伝子治療用に形質転換した細胞を使用することが、重要になっていくと現在では考えられていて、これは産製される容量についても当てはまる。本発明の方法は、細胞の解離の第一工程の後の残りの、処置プロセス、懸濁、再懸濁、及び洗浄が、室温ではなくて４℃で行なわれるようになり、かなり改善された。よって、上記したプロセスは、これら中間工程の全てが４℃で行なわれる際には特に有益である。これらの細胞タイプの使用は必須的に、ヒトでの治療用であるので、上記したもののような硫酸化多糖が、市場に出回ることの認可をすでに受けていることを強調することには利点があり、また、潜在的な残基が細胞に付着し続けるのであれば原理的には、それ自体で如何なる毒性の問題も生じない。ヘパリンの培養液への添加が５００から５,０００ＩＵ／ml、好ましくは８００から２,０００ＩＵ／mlである、本発明の方法の態様においては、細胞がコンフルエントになったときに、培養液の除去工程や、特にＥＤＴＡタイプのキレ− ト剤を含む解離液の添加工程を行わずに、細胞を解離させる。この特異的な態様の利点は、細胞の生存度を上昇させることにある。実際に、細胞死亡率をある程度上昇させてしまうＥＤＴＡはもはや必要ない。この態様においては培養液に直接加えられるヘパリンは、細胞と５から１０分間接触するように放置される。次いで細胞は緩やかな攪拌とその後の再懸濁、例えばピペットの使用によりすぐに解離され、その後に回収される。これらの細胞の使用に適した液体での洗浄工程である上記の工程(d)を、次に行うこともまた可能である。このタイプの使用により、回収するのボトルの数が多いときに、ロ−ラ−ボトル中の細胞の回収方法を大幅に改善することが可能になる。これにより、特に、さもなくば実行可能ではない工業的プロセスを実行可能にする操作が経済的になる。例としては、２０のロ−ラ−ボトルから細胞を、伝統的な解離方法で回収するには、狭い場所で６人が２から３時間かけて作業する必要がある。新規の方法では、２人で充分であり、必要となる時間を増やさなくてもよい。この改善は、ロ−ラ−ボトルが１００個にまでスケ−ルアップされたときには特に顕著であり、この場合には、制御された室内に非常に多くの人がいるために、培養液を交換して解離する方法は実質的に不可能になる。最後に、ＥＤＴＡの非存在下での細胞生存度の上昇は、解離した細胞または組織よりえられる産物の質と量とを増大させる。指標として記載するが、以下の実験は、本発明の方法によりもたらされる、細胞の収量と質との改善、およびψＣＲＩＰパッケ−ジング細胞(ＤanosＯ．et al .，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 85: 64，60-64(1988))のような、組み換えレトロウイルスで形質転換されたマウス線維芽細胞に由来した細胞の感染性力価の改善を示す例である。これらの実験は、本発明の方法の性能的特徴を例示することを目的としているが、表示の細胞タイプ、使用する培養液、解離工程以降の細胞の処理、緩衝液、または培養液を限定するものではない。以下に示した全ての例は、硫酸化多糖と同様に、チョアイ(Ｃhoay)社(Ｓanofi Ｗinthrop，9 rue du Ｐresident Ａllend，94958 Ｇentilly Ｃedex)により市販されているヘパリンを使用して行ったが、凍結乾燥されているヘパリンを、無菌の蒸留水で２５,０００単位／mlの割合で再溶解して使用した。使用した細胞は、ＮＩＨ−3Ｔ3に由来する線維芽細胞タイプのものであり、チミジンキナ−ゼをそのゲノム内に組み込み、文献に記載されている（Ｃaruso et al.，1993 Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ90：7024-7028；Ｍ11としても知られる）モロニ−型の組み換えレトロウイルスで形質転換された細胞である。例１：ヘパリンを付加することの、解離回収細胞の数への影響。産生の６日目または８日目（Ｄ6、またはＤ8）まで細胞を増殖させて、ロ−ラ −ボトル内でコンフルエントにさせ、次いで培地を捨てて、０.０２％にまでＥＤＴＡを添加したＰＢＳ緩衝液からなる解離液に細胞を接触させた。細胞を次いで、ml当たりに１００単位のヘパリンを加えるか、または加えずに、クルタ−カウンタ−で計測した；結果は以下の表１に表示してある。 ml当たり１００単位のヘパリンをＰＢＳ-ＥＤＴＡ液に添加した場合の、ロ− ラ−ボトル当たりの回収された細胞の数は、２０％多かった。更に細胞のペレットが凍結液に入れられると、再形成された凝集物の数は、ヘパリン非存在下の時よりもかなり少ない。例２：ヘパリン存在下、または非存在下での凍結と、その後の解凍。５７cｍ²の培養皿で、Ｍ11細胞をコンフルエントにする。細胞を、１００単位／mlのヘパリン含有、または非含有のＰＢＳ-0.02％ＥＤＴＡ解離液により、培養皿より剥離する。解離液を細胞と５分間接触させ、細胞を次いで回収して５ｍlのピペットで解離を完全にする。細胞を次いで計測し、遠心し、細胞のペレットを適切な容量の凍結液（５０％の新生ウシ胎仔血清、（Ｈyclone レファレンスＡ-2111）と、２０％ＤＭＳＯ含有５０％ＤＭＥ培地とからなる）に入れた。このＤＭＥ培地は６ｍlのグルタミン（Ｇibco レファレンス41965）と、６mlの抗生物質溶液（ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン（Ｇibco レファレンス15640-048））と、１０％の新生ウシ胎仔血清とを加えたＤＭＥＭ培地である。細胞を最終的には５０％新生ウシ血清と１０％ＤＭＳＯとを有するＤＭＥで凍結した。解凍方法：上記した培地で凍結された細胞を有するアンプルを液体窒素より取り出して氷上に置き、次いで分離しつつある氷の兆候が最初に見られるまで３７℃の水浴に移し、適切なときに１０mlの培地（１０％のヒトアルブミンが添加された生理食塩水からなる）を含む、１５mlのファルコン製のチュ−ブへ移す。その後に、細胞を同じ液体で２回または３回洗浄し、細胞のペレットを適切な容量の、１０％新生ウシ血清を含むＤＭＥ（上記したような）に再懸濁し、細胞懸濁液を再び培養ボトルへ分配し、標準的な条件下（３７℃、５％ＣＯ₂）で培養する。以下の表２では、以下の実験条件下で得た結果を要約している。解凍後の増殖には、０から１００単位／ｍlのヘパリンを含有するＤＭＥＭ培地を使用する；細胞を次いで１００単位のヘパリン含有、または非含有のＰＢＳ-ＥＤＴＡ緩衝液中に回収する。測定したパラメ−タは、生細胞数、生存度、ボトル中の細胞密度、倍加時間、及び倍加数である。増殖培地中のヘパリンの存在は、回収後に得れれる生細胞の数にとって好ましくないことは明らかである。対照的に、ヘパリンの剥離液中での存在は、生細胞数、生存度、及び細胞密度を非常に顕著に増大させる。Ｄ3で、顕微鏡で細胞を観察すると、液体中のヘパリンとともに、浮遊細胞の数が増大することが明らかであり、逆に付着している細胞がより低密度になる。ヘパリン存在下で培養され、次いでヘパリン非存在下のＰＢＳとＥＤＴＡとで処置された細胞は、付着している細胞の剥離現象を現わすが、これは付着してる細胞の剥離物よりえられる細胞カウントが誤りであることを立証し、実際には、得られる細胞の収量を低減する。ＰＢＳ-ＥＤＴＡ液、及び凍結解凍液中にヘパリンが存在することにより、細胞に９０％程度の生存度と、ヘパリン非存在下で得られるよりも大きい生細胞収量が得られることを、この例は明らかに示している。例３：上の例に記載した、回収、凍結、解凍の種々の段階で、ヘパリンと接触した培養細胞の感染性力価。感染性力価の計算は、文献に記載の方法によって行った(Ｃaruso et al.，Ｐr oc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ(1992)89:182-186)。培養したＬ細胞を、上記の例で記載した方法で回収したＭ11株で感染させた。この、Ｍ11株で感染したＬ細胞を次いでトリパンブル−で染色する。上記細胞の感染性力価の測定結果は、単純なＰＢＳ-ＥＤＴＡ液で得られたものと等しいか、または大きく、実際に計測された細胞数を参照すると、一貫して大きい。更にまた、トリプシンで回収した時の細胞の力価よりも顕箸に大きい。更には、トリプシンを使用すると、感染性力価は４時間までは変化せずに０であり、一方、１００単位／mlのヘパリンを加えたＰＢＳ及びＥＤＴＡの存在下では、Ｌ細胞をM11細胞と接触した後１時間もの早い時期に感染性力価が明らかになった。これらの結果は、回収、凍結、及び解凍の工程中に、前もってヘパリンと接触させると、ＥＤＴＡ、トリプシン、またはその組み合わせの存在下でのみ接触させるときよりも、Ｍ11細胞がよりよい生理学的条件にあるという事実を明らかに反映している。例４：低濃度、及び高濃度のヘパリンが与える、異なるタイプの培養細胞への影響。ヘパリンの使用を、異なる細胞株の解離との関係で試験した。ＮＩＨ−3Ｔ3株、ψＣＲＥとψＣＲＩＰのエンキャプシデ−ション株、ＴＳ13細胞(ハムスタ− 細胞)、ＭＣ26腫瘍細胞、１４３ｂ腫瘍細胞、ＭＣＦ7腫瘍細胞、Ｂ16Ｆ1腫瘍細胞、ＧＰ+envＡＭ12パッケ−ジング株、及びＨeＬa細胞について述べる。 (a)ヘパリンの濃度は、ＰＢＳ-ＥＤＴＡ液（pＨ8）中で１００ＩＵ／ml：１００ＩＵ／mlのヘパリン濃度での解離時間は室温で５分間である。これらの細胞はコンフルエントに近づくにつれて解離しやすくなる。ヘパリン濃度が約２００ＩＵ／mlに増加されると、生存度が若干上昇する。１００ＩＵ／mlで８３％であったのが、８７％である。 (b)８００ＩＵ／mlと２,０００ＩＵ／mlとの間の濃度で使用するヘパリン：ヘパリンを細胞培養培地へ、１.２００ＩＵ／mlの濃度で直接加える；解離後の細胞生存度は９５％である。例５：無血清培地での培養細胞の解離のための、ヘパリンの使用。実験はＭＤＣＫタイプの細胞を使用して行ったが、この細胞は、適切な処置後に、評価できる量のインフルエンザウイルスを産生することが可能であるように、無血清培地内で増殖させなくてはならない。残念ながら、血清なしで培養したこのタイプの細胞株では、細胞を解離することが非常に困難である。通常の方法は、ＰＢＳ-ＥＤＴＡ緩衝液で３０分間処置し、次いでトリプシンによる非常に激しい解離を行う。細胞を解離するこの困難性は、このタイプの細胞培養を工業的に使用する際の難しい問題であるが、これはインフルエンザワクチンの製造にとっては必須である。本発明の方法では、ＰＢＳ-ＥＤＴＡによる前インキュベーション工程を、高投薬量の（１,２００ＩＵ／mｌ）ヘパリンの培地への添加により置き換えられている。ほとんどの場合には、引き続くトリプシンの存在下での解離において、非常に顕著な上昇が見られ、ある場合にはトリプシンを添加しないで細胞を解離することも可能であった。例６：上皮細胞の単層の剥離。第三度のやけどを負った患者の表皮の再構成はケラチノサイトのin vitro培養により得られるが、これは自身で単一細胞の層を、培養皿で構成する。これらの単一層を回復させるこの方法は通常は、トリプシンによる激しい消化と、それに続く物理的剥離である。ヘパリンを使用することの利点は、トリプシンの使用を代わりにやめることであり、これは一方において、ヘパリンが細胞表面のタンパク質により障害を与えず、また他方において、ヘパリンがかなり安価であってヒトでの使用に適するためであり（市販する認可が降りている）、これに対してトリプシンは、使用するためには多くの細菌学的及びウイルス学的対照が必要になり、これにより非常に高価な製品となってしまう。まとめると、ヘパリンのような硫酸化多糖を、５０から５００単位／ml、好ましくは１００単位／ml位の量で、付着性細胞の操作に使用される液体に、回収、凍結、及び解凍工程中に添加すること、または培地に５００から５,０００ＩＵ／mlの量で添加することにより、生存度と、生細胞の絶対数が上昇する。同時に、凝集の減少と、より多くの、細胞の激しい生理学的挙動が見られるが、それはレトロウイルスで形質転換された細胞の感染性が上昇するためである。最後に、これらの実験条件により、細胞回収操作を４℃で行えるようになり、これによって大量の細胞の均一な処置を予想することが可能になるが、これは治療用のバッチの調製には必須である。ヘパリンや、ヒドロキシエチルデンプンのような基質を使用することに関し、すでに治療用の使用のために市販する認可が降りていることは特に興味深いが、とりわけ前者の場合には抗凝集剤として、また後者の場合には血漿の代替物として使用されている。このことは、上記を含有する液体を使用しても、遺伝子治療の場合の細胞、または組み換えタンパク質の場合の細胞により分泌される基質にベ−スがおかれた新規の治療用製品に対する、臨床登録関係書類一式の編集に関して大きな問題とはならない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１.増殖後に細胞を回収する少なくとも一つの工程、適当であれば該細胞の凍結解凍工程を補充した上記工程を具備した、付着性真核細胞または培養組織を調製する方法であって、調製媒体の一つが、少なくとも一つのポリグリコシドポリマの誘導体を含有していることを特徴とする、方法。２.前記のポリマ−が、以下の工程のうち少なくとも一つで、前記の媒体に加えられることを特徴とする、請求項１に記載の方法：培養、細胞の解離及び回収、その凍結、その解凍。３.前記のポリマ−が、多糖の誘導体であることを特徴とする、請求項１、または２に記載の方法。４.前記のポリマ−が、分子量が５,０００から５００,０００の間にある、硫酸化多糖であることを特徴とする、請求項１乃至３に記載の方法。５.前記のポリマ−が好ましくは、ヘパリン、デキストラン硫酸、及びハイドロキシエチルデンプン硫酸塩（hydroxyethylstarch sulphate）のなかより選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。６.前記のポリマ−がヘパリンであることを特徴とする、請求項１乃至４の何れか一項に記載の方法。７.前記のポリマ−が、培養液に対して５００から５,０００ＩＵ／mlの濃度、好ましくは８００から１,６００ＩＵ／mlの濃度で加えられることを特徴とする、請求項１乃至５に記載の方法。８.前記のポリマ−が、別の解離剤を含んでいる解離液に、７５から１５０ＩＵ／mlの濃度で加えられることを特徴とする、請求項２に記載の方法。９.解離工程と凍結解凍工程との間の中間工程が４℃で行なわれることを特徴とする、請求項１乃至８のうちの一項に記載の方法。１０.前記の培養系が、細胞の解離と、それに次ぐ回収が行われる閉じた回路系である培養系、特には細胞キュ−ブ型、くぼみファイバ−、またはマイクロキャリア−の系であることを特徴とする、請求項１乃至８のうちの一項に記載の方法。１１.前記の付着性細胞が、線維芽細胞、または上皮性タイプであることを特徴とする、請求項１乃至８のうちの一項に記載の方法。１２.前記の細胞が、組換え型のタンパク質または受容体を発現することが可能な組み換え細胞であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。１３.前記の細胞が、遺伝子治療に使用することが可能な組み換えのレトロウイルスを具備した宿主細胞であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。１４.前記の培養組織がケラチノサイトの単層であることを特徴とする、請求項１乃至９のうちの一項に記載の方法。１５.請求項１乃至１４のうちの一項に記載の方法を実施して得られる真核細胞。１６.請求項１５に記載の真核細胞に由来する産物であって、特にウイルス、組み換えタンパク質、または受容体。１７.ポリグリコシドポリマ誘導体の使用であって、付着性真核細胞用の培養液、回収液、凍結解凍液中における、ポリグリコシドポリマ−の、該細胞脱凝集化用解離剤としての使用。１８.前記のポリマ−が、ポリ硫酸化した多糖であることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。１９.前記のポリマ−がヘパリンであることを特徴とする、請求項１８に記載の使用。２０.前記のポリグリコシドポリマ−が、前記の細胞または組織に対して、５００から５,０００ＩＵ／mlの濃度、好ましくは８００から１,６００ＩＵ／mlの濃度で培養液に加えられることを特徴とする、請求項１７乃至１９のうちの一項に記載の使用。２１.前記のポリグリコシドポリマ−が、別の解離剤を含有している解離液に対して、７５から１５０ＩＵ／mlの濃度で加えられることを特徴とする、請求項１７乃至１９のうちの一項に記載の使用。