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EP0789756A1 - Procede de dissociation des cellules eucaryotes en culture - Google Patents

Procede de dissociation des cellules eucaryotes en culture

Info

Publication number
EP0789756A1
EP0789756A1 EP95939309A EP95939309A EP0789756A1 EP 0789756 A1 EP0789756 A1 EP 0789756A1 EP 95939309 A EP95939309 A EP 95939309A EP 95939309 A EP95939309 A EP 95939309A EP 0789756 A1 EP0789756 A1 EP 0789756A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
polymer
heparin
culture
polysaccharide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP95939309A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Loup Salzmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Pierre et Marie Curie
Original Assignee
Universite Pierre et Marie Curie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Pierre et Marie Curie filed Critical Universite Pierre et Marie Curie
Publication of EP0789756A1 publication Critical patent/EP0789756A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/12—Chemical aspects of preservation
    • A01N1/122—Preservation or perfusion media
    • A01N1/125—Freeze protecting agents, e.g. cryoprotectants or osmolarity regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C12N2501/91—Heparin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Definitions

  • the present invention relates to an improvement in the methods of collecting and handling adherent eukaryotic cells or cultured tissues.
  • Cell culture is currently one of the obligatory passages of genetic engineering techniques either to express recombinant proteins, or when these cells have been transfected by recombinant viruses, as host cells which can be administered in gene therapy. In the latter case it happens that cells transfected by viral or retroviral vectors are directly reimplanted into tissues; a review of these different techniques is given in the work entitled “Gene therapy, DNA drugs” coordinated by Axel Kahn, Publisher John Libby, (1993); one can also usefully refer to the article of RC. MULLIGAN, Science (1993), Vol. : 260, p 926.
  • the yield of viable cells is a critical point when cultivating eurkaryotic cells both for the very quality of the cells or the products obtained therefrom and for the yield questions which affect both the quantities of products obtained and the cost price of said product; in particular when gene therapy is carried out by injection of cells, for example packaging cells, containing a recombinant virus or retrovirus, the infectious titer of the virus or retrovirus depending directly on the physiological state of the packaging cells and of their concentration.
  • Adherent cells are often used in cell culture for the production of products either secreted by these cells or as such in gene therapy; the most classic examples are either CHO (Chinese Hamster Ovary Cells) cells for the production of recombinant molecules or cloned receptors or other fibroblastic cells used in gene therapy and in particular cells derived from 3T3 such as NIH-3T3.
  • CHO Choinese Hamster Ovary Cells
  • NIH-3T3 packaging cells which are mouse fibroblasts used in gene therapy, and cultured on plastic supports to then be collected and injected directly into tumors; the principle of this type of therapy is to produce, by specific derivatives of NIH-3T3 cells, called M11 cells, in vivo within tumors, therapeutic retroviruses; as an example of such treatment, reference is made to the articles by M. Caruso et al in Proc Nat. Acad. Sci. USA, (1993) 90_: 70-24, 70-28; or KW Culver et al, Science 256 n ° 5063 p. 1550-1551 - (1992). The integrity and the capacity of these cells to produce viruses are therefore essential for the therapeutic efficacy of the treatment.
  • Aggregates have a whole series of drawbacks, the most important of which are that they underestimate the number of cells and very poor reproducibility of cell counts.
  • the presence of aggregates disrupts the freezing processes essential for the proper storage of cells, the cells located in the center of the aggregates, not being affected by preservatives such as dimethyl sulphoxide (DMSO) which makes them more fragile and leads to higher mortality.
  • DMSO dimethyl sulphoxide
  • the devices allowing mass cell culture of adherent eukaryotic cells are of different types, the principle always being to have a maximum surface allowing the adhesion of the cells to the latter;
  • - roller bottles in which cells line a cylindrical wall of bottles - the so-called “multi tray” devices consisting of a series of superimposed plates on which the cells are attached and immersed in the culture medium, or even of the CelICube type,
  • micro-carriers or micro-beads such as those sold by the company Pharmacia under the brands Cytodex 1, 2 or 3 or even Cytopore,
  • the succession of steps is as follows: a) cell culture or tissues in nutrient medium, b) elimination of the cell culture medium, c) addition of a dissociation medium comprising a chelator or a proteolytic enzyme, or a combination of the two, d) one or more stages of washing in a medium suitable for the use which one wishes to make of these cells.
  • these cells are intended to be frozen, they are taken up in a medium containing 5 to 20% DMSO and 30 to 70% fetal calf serum; the frozen cells are then thawed by resuspension in a medium composed of physiological saline to which 10% albumin is added and the cells are then washed and centrifuged several times in the same medium until the cell pellet is taken up in the final medium suitable for their use.
  • the problem of preserving these cells in an isolated state, having their membrane integrity and retaining maximum viability is a problem today that has not been solved.
  • the invention solves this problem by presenting a process for the preparation of adherent eukaryotic cells comprising at least one of the steps mentioned above including that of culture itself and consisting of the addition in a solution in contact with the cells during one of these steps a derivative of a polysaccharide polymer.
  • this polysaccharide polymer is a polysaccharide and preferably a sulfated polysaccharide; examples of such sulfated polysaccharides are for example heparin, dextran sulfate, or hydroxyethyl starch sulfate.
  • a polysaccharide according to the invention to be added to the solutions for treating eukaryotic cells has a molecular weight preferably between 5000 and 500,000.
  • Heparin with molecular weight 20,000 constitutes a particular case which is particularly effective in the process of the invention .
  • Heparin is currently known and used as an anti-coagulant.
  • drugs based on heparin or heparin derivatives have received marketing authorization for this indication.
  • the dose of sulfated polysaccharides to be added in the process of the invention is 50 to 500 units per ml and preferably 75 to 150 units per ml, when the medium is a dissociation solution containing a chelator or an enzyme (steps b ) to d)).
  • This dose is 500 to 5000 IU / ml when the polysaccharide is added directly to the cell or tissue culture medium (step a)), and preferably 800 to 2000 IU / ml; a concentration of around 1600 IU / ml can be considered optimal.
  • This effect of sulfated polysaccharides on the prevention of aggregation of adherent cells cannot be explained either by its known anti-aggregating properties, nor by its well-known action of inhibiting the transformation of prothrombin into thrombin. In fact, the action of heparin on the adhesion capacities of cells to their support is still poorly understood and the few results published contradictory.
  • heparin causes detachment of cells or an inhibition of their attachment to artificial substrates (heparin inhibits the attachment and growth of BALB / C / 3T3 fibroblasts on collagen substrata, J. Cellular Physiol. 1992, 150, 8-16).
  • the invention also relates to the use of a polysaccharide polymer derivative, in particular sulfated polysaccharides in the culture medium, in a dissociation medium as well as in the freezing or thawing media of adherent eukaryotic cells or of tissue in culture.
  • a polysaccharide polymer derivative in particular sulfated polysaccharides in the culture medium
  • a dissociation medium as well as in the freezing or thawing media of adherent eukaryotic cells or of tissue in culture.
  • Heparin, dextran sulfate or hydroxyethyl starch sulfate are preferred sulfated polysaccharides of the invention. This use allows: - to obtain a better dissociation of cells,
  • the optimal dose is between 75 and 150 IU / ml.
  • its optimum concentration is between 500 and -5000 IU / ml, preferably between 800 and 2000 IU / ml with an optimal concentration around 1600 IU / ml.
  • the invention also relates to eukaryotic cells obtained by the implementation of a method as described above, as well as to products derived from these cells or tissues, in particular viruses, recombinant proteins or receptors.
  • eukaryotic cells obtained by the implementation of a method as described above, as well as to products derived from these cells or tissues, in particular viruses, recombinant proteins or receptors.
  • Particular examples of this type of cell are in particular: L cells, the 3T3 NIH line, the packaging lines ⁇ CRE and ⁇ CRIP, TS13 cells (hamster cells), MC26 tumor cells, 143b tumor cells, tumor cells MDF7, B16 F1 tumor cells, GP + envAM 12 packaging lines, HeLa cells.
  • An example of tissue in culture is that of keratinocyte monolayers.
  • the use of recombinant or transformed eukaryotic cells for use in gene therapy is currently becoming increasingly important and the volumes to be produced also.
  • the process of the invention is considerably improved when, after the first step of dissociation of the cells, the rest of the treatment process, suspension, re-suspension, washes are carried out at a temperature of 4 ° C. instead of being carried out at a temperature ambient.
  • the process as described above is therefore particularly advantageous when all of these intermediate steps are carried out at 4 ° C.
  • heparin is between 500 and 5000 IU / ml in the culture medium and preferably between 800 and 2000 IU / ml
  • the cells are dissociated without carrying out the steps of eliminating the culture medium, nor adding dissociating medium containing in particular an EDTA-type chelator.
  • An advantage of this particular embodiment is the increase in the viability of the cell; in fact, EDTA, which causes certain cell mortality, is no longer necessary.
  • the heparin added directly to the culture medium is left in the presence of the cells for 5
  • Step d cited above, of washing in a medium suitable for the use that one wishes to make of these cells, is always possible later.
  • heparin as sulfated polysaccharides as marketed by the company Choay (Sanofi Winthrop, 9, rue du Arthur Allend, 94958 Gentilly Cedex), the lyophilized heparin being dissolved in l distilled water at a rate of 25,000 units per ml.
  • the cells used are fibroblastic type cells derived from NIH-3T3 transfected with a recombinant Moloney type retrovirus integrating into its genome the gene for a thymidine kinase, and described in Caruso et al 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90: 7024- 7028, and called cells M11.
  • Example No. 1 Effect of the addition of heparin on the number of cells dissociated and collected.
  • the cells are grown at confluence in roller bottles until the 6th or 8th day (D6 or D8) of production, then the culture medium is discarded and the cells are brought into contact with a dissociation medium consisting of PBS buffer to which 0.02% of EDTA is added.
  • the cells are then counted at the Coulter counter on D6 or D8 either without the addition of heparin or with the addition of 100 units per ml of heparin; the results are presented in the following table 1:
  • Example No. 2 Freezing and then thawing of cells in the absence or presence of heparin.
  • 75 cm2 culture dishes contain a mat of confluent M11 cells.
  • the dissociation medium is placed in the presence of the cell carpet for 5 minutes then the cells are recovered and the dissociation is completed with a 5 ml pipette. The cells are then counted, centrifuged and the cell pellet taken up in an appropriate volume of freezing medium composed of
  • the DME medium is the DMEM medium (reference Gibco 41965) to which 6 ml of glutamine, 6 ml of antibiotic solution (penicillin, streptomycin, neomycin (reference GIBCO 15640-048) and 10% of newborn calf serum are added. The cells are finally frozen in 50% newborn calf serum and 10% DMSO in DME.
  • the ampoules containing the cells frozen in the medium described above are removed from liquid nitrogen and placed in ice then transferred to a water bath at 37 ° until the appearance of a first ice cube, a time favorable for transfer to a 15 ml falcon tube containing 10 ml of medium consisting of physiological saline to which 10% human albumin is added.
  • the cells are then washed two or three times with this same medium and then the cell pellet is resuspended in an adequate volume of DME (as defined above) containing 10% of newborn calf serum then the cell suspension is distributed again in culture flasks, the culture being carried out under conventional conditions at 37 ° in the presence of 5% of CO 2.
  • Table 2 summarizes the results obtained under the following experimental conditions: during their growth after thawing the DMEM culture medium contains from 0 to 100 units per ml of heparin then the cells are harvested in PBS-EDTA buffers with or without 10 heparin units.
  • the parameters measured are the number of living cells, the viability, the density of the cells in the flasks, the doubling time, the number of doubling. Table 2
  • the presence of heparin in the detachment medium very significantly increases the number of living cells, the viability, the density of the cells.
  • Example No. 3 Infectious titre of cells in culture before being in contact with heparin during the various harvesting, freezing and thawing phases as described in the examples above.
  • the infectious titer was calculated according to the method described in
  • L cells in culture were infected with the M11 lines harvested as described in the examples above. L cells infected with M11 cells are then stained with trypan blue. The measurement of the infectious titer of these cells is identical to or higher than that obtained in a simple PBS-EDTA medium, and constantly higher if the titer is related to the number of cells actually counted; it is also significantly higher than the titer of cells collected with trypsin.
  • heparin has been tested for the dissociation of different cell lines. Mention may be made of the NIH 3T3 line, the ⁇ CRE and ⁇ CRIP encapsidatio ⁇ lines, TS13 cells (hamster cells), MC26 tumor cells, 143b tumor cells, MCF7 tumor cells, B16 F1 tumor cells, GP + envAM12 packaging, Hela cells.
  • Heparin is added directly to the cell culture medium at a concentration of 1200 IU / ml, the viability of the cells after dissociation is then 95%.
  • Example No. 5 Use of heparin for dissociation of cells in culture in serum-free medium.
  • the experiment was carried out using MDCK type cells which must grow in a serum-free medium in order to be able to produce appreciable quantities of influenza virus after appropriate treatment.
  • This type of cell line grown without serum makes cell dissociation extremely difficult.
  • the usual procedure is treatment with a PBS EDTA buffer for 30 minutes, followed by very vigorous trypsin dissociation.
  • This difficulty in dissociating cells is a major obstacle to the industrial use of this type of cell culture, however essential for the manufacture of influenza vaccine.
  • the pre ⁇ incubation step with PBS EDTA was replaced by the addition of heparin in high doses (1200 IU / ml) in the culture medium. In most cases, a very large increase in subsequent dissociation has been observed in the presence of trypsin, and in some cases the cells have been able to dissociate without the addition of trypsin.
  • Example No. 6 Detachment of epithelial cell monolayers.
  • the reconstruction of the epidermis of burn victims is obtained by in vivo culture of keratinocytes which are arranged in single-cell layers on the culture dishes.
  • the usual procedure used to recover these monolayers is an energetic trypsin digestion followed by a physical detachment.
  • the use of heparin advantageously replaces the use of trypsin, on the one hand, because heparin alters the proteins on the surface of these cells less, on the other hand, heparin is much less expensive and human use (there is a marketing authorization) while trypsin must, in order to be used, require numerous bacterial and viral controls which make it an extremely expensive product.
  • the addition of an amount of sulfated polysaccharides such as heparin at a concentration of 50 to 500 units per ml and preferably a hundred units per ml in the media for handling adherent cells used during their collection, freezing, or thawing, or an amount of 500 to 5000 IU / ml in the culture medium makes it possible to increase the viability and the absolute number of living cells obtained; concomitantly, a decrease in the aggregates and a more vigorous physiological behavior of the cells is observed since an increase in the infectivity of the cells transformed by a retrovirus is observed.

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Abstract

Procédé de préparation des cellules eucaryotes adhérentes comportant au moins une étape de recueil des cellules après leur croissance complétée le cas échéant par des étapes de congélation et de décongélation desdites cellules, caractérisé en ce que les solutions de préparation contiennent au moins un dérivé d'un polymère polyosidique.

Description

PROCEDE DE DISSOCIATION DES CELLULES EUCARYOTES EN CULTURE
La présente invention est relative à une amélioration des procédés de recueil et de manipulation des cellules eucaryotes adhérentes ou de tissus cultivés.
La culture cellulaire est actuellement un des passages obligés des techniques de génie génétique soit pour exprimer des protéines recombinantes, soit lorsque ces cellules ont été transfectees par des virus recombinants, comme cellules hôtes administrables en thérapie génique. Dans ce dernier cas il arrive qu'on réimplante directement des cellules transfectees par des vecteurs viraux ou rétroviraux dans des tissus ; une revue de ces différentes techniques est donnée dans l'ouvrage intitulé « Thérapie génique, l'ADN médicaments » coordonné par Axel Kahn, Editeur John Libby, (1993); on pourra également se référer utilement à l'article de RC. MULLIGAN, Science (1993), Vol. : 260, p 926. Le rendement en cellules viables est un point critique lorsque l'on cultive des cellules eurcaryotes tant pour la qualité même des cellules ou des produits qui en sont obtenus que pour les questions de rendement lesquels jouent à la fois sur les quantités de produits obtenus et sur le prix de revient dudit produit ; en particulier lorsqu'une thérapie génique est réalisée par injection des cellules, par exemple des cellules d'empaquetage, contenant un virus ou retrovirus recombinant, le titre infectieux du virus ou du retrovirus dépendant directement de l'état physiologique des cellules d'empaquetage et de leur concentration.
Les cellules adhérentes sont souvent utilisées en culture cellulaire pour la production de produits soit sécrétés par ces cellules soit en tant que tel en thérapie génique ; les exemples les plus classiques sont soit les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary Cells) pour la production de molécules recombinantes ou récepteurs clones ou d'autres cellules fibroblastiques utilisées en thérapie génique et en particulier des cellules dérivées de 3T3 telles NIH-3T3.
Pour décoller les cellules de leur support, différentes techniques physiques (racloir) ou chimique (chélateurs de type EDTA ou enzymes protéolytiques de type trypsine) ont été employées. Ces techniques présentent toutes des inconvénients. L'utilisation de moyens physiques ou de chélateurs tels l'EDTA est délicate et entraîne l'apparition d'agrégat ainsi qu'une diminution de la viabilité ; les enzymes protéolytiques comme la trypsine dégradent les protéines de surface de la cellule, diminuent la viabilité et perturbent leur propriété biologique sans même supprimer totalement la présence des agrégats, conduisant à des taux d'infectivité plus faibles qu'ils ne pourraient l'être ; les cellules ne disposent plus des glycoprotéines de surface leur permettant de produire des retrovirus à un titre optimum.
C'est le cas par exemple de l'utilisation de cellules d'empaquetage NIH- 3T3 qui sont des fibroblastes de souris utilisées en thérapie génique, et cultivées sur supports plastiques pour être ensuite collectées et injectées directement dans des tumeurs ; le principe de ce type de thérapie est de faire produire par des dérivés particuliers de cellules NIH-3T3, appelées cellules M11, in vivo au sein des tumeurs, des retrovirus thérapeutiques ; à titre d'exemple d'un tel traitement on se référera aux articles de M. Caruso et al dans Proc Nat. Acad. Sci. USA, (1993) 90_: 70-24, 70-28 ; ou KW Culver et al, Science 256 n° 5063 p. 1550-1551 -(1992). L'intégrité et la capacité de ces cellules à produire des virus sont donc primordiales pour l'efficacité thérapeutique du traitement.
Les agrégats présentent toute une série d'inconvénients dont les plus importants sont d'entraîner une sous-estimation du nombre des cellules et une très mauvaise reproductibilité des comptages cellulaires. De plus la présence d'agrégats perturbe les procédés de congélation indispensables au bon stockage des cellules, les cellules situées au centre des agrégats, n'étant pas atteintes par les produits de conservation tels le dimethyl-sulphoxide (DMSO) ce qui les rend plus fragiles et entraîne une mortalité supérieure. Enfin les agrégats perturbent la diffusion des cellules quand elles sont injectées au sein des tissus ou de tumeurs au cours de traitements de thérapie génique.
Les dispositifs permettant la culture cellulaire en masse de cellules eucaryotes adhérentes sont de différents types, le principe étant toujours d'avoir une surface maximale permettant l'adhésion des cellules sur cette dernière ; on pourra citer à titre d'exemple et comme étant les plus fréquentes : - les bouteilles roulantes (roller bottles) dans lesquelles les cellules tapissent une paroi cylindrique des bouteilles, - les appareils dits « multi tray » constitués d'une série de plaques superposées sur lesquelles s'attachent les cellules et baignant dans le milieu de culture, ou encore de type CelICube,
- des micro-porteurs ou micro-billes tels ceux commercialisés par la société Pharmacia sous les marques Cytodex 1 , 2 ou 3 ou encore Cytopore,
- différents systèmes existants comportant des cartouches de fibres creuses dans lesquelles les cellules sont logées à titre d'exemple, parmi lesquels on peut citer les systèmes de type Cellmax, Endotronix.
Lorsque l'on veut récupérer des cellules pour quelque motif, notamment pour constituer des banques cellulaires, pour les réensemencer, ou encore pour les utiliser à titre d'agents thérapeutiques, la succession d'étapes est la suivante: a) la culture des cellules ou tissus en milieu nutritif , b) l'élimination du milieu de culture de cellules, c) l'addition d'un milieu de dissociation comprenant un chélateur ou un enzyme protéolytique, ou une combinaison des deux, d) une ou plusieurs étapes de lavage dans un milieu approprié à l'utilisation que l'on souhaite faire de ces cellules.
Si ces cellules sont destinées à être congelées, elles sont reprises dans un milieu contenant du DMSO de 5 à 20 % et du sérum de veau fœtal de 30 à 70 % ; les cellules congelées sont ensuite décongelées par resuspension dans un milieu composé de sérum physiologique auquel est ajoutée de l'albumine à 10 % et les cellules sont ensuite lavées et centrifugées plusieurs fois dans le même milieu jusqu'à reprise du culot cellulaire dans le milieu final adapté à leur utilisation. Le problème de la conservation de ces cellules à l'état isolé, en ayant leur intégrité membranaire et conservant une viabilité maximale est un problème aujourd'hui non résolu. L'invention résout ce problème en présentant un procédé de préparation de cellules eucaryotes adhérentes comprenant au moins une des étapes citées ci-dessus incluant celle de culture elle-même et consistant en l'addition dans une solution au contact des cellules pendant l'une de ces étapes un dérivé d'un polymère polyosidique. De façon préférée ce polymère polyosidique est un polysaccharide et de préférence un polysaccharide sulfaté ; des exemples de tels polysaccharides sulfatés sont par exemple l'héparine, le dextran sulfate, ou le sulfate d'hydroxy- éthyl-amidon. Un polysaccharide selon l'invention à ajouter dans les solutions de traitement des cellules eucaryotes a un poids moléculaire compris de préférence entre 5000 et 500 000. L'héparine de poids moléculaire 20 000 constitue un cas particulier particulièrement efficace dans le procédé de l'invention. L'héparine est actuellement connue et utilisée comme anti-coagulant. Plusieurs médicaments à base d'héparine ou de dérivés d'héparine ont reçus une autorisation de mise sur le marché pour cette indication.
Mais l'avantage de l'addition d'héparine dans le procédé de l'invention ne peut être expliqué par un mécanisme physiologique tel celui impliqué dans la coagulation ou l'hémostase.
La dose de polysaccharides sulfatés à ajouter dans le procédé de l'invention est de 50 à 500 unités par ml et de préférence de 75 à 150 unités par ml, quand le milieu est une solution de dissociation contenant un chélateur ou une enzyme (étapes b) à d)).
Cette dose est de 500 à 5000 Ul/ml quand le polysaccharide est ajouté directement dans le milieu de culture des cellules ou des tissus (étape a)), et de préférence 800 à 2000 Ul/ml ; une concentration d'environ 1600 Ul/ml peut être considérée comme optimale. Cet effet des polysaccharides sulfatés sur la prévention de l'agrégation des cellules adhérentes ne peut pas être expliqué ni par ses propriétés anti- agrégantes connues, ni par son action bien connue d'inhibition de la transformation de la prothrombine en thrombine. De fait, l'action de l'héparine sur les capacités d'adhésion des cellules à leur support est encore mal comprise et les rares résultats publiés contradictoires. Parfois, l'addition d'héparine dans le milieu de culture entraîne une agrégation accrue des cellules (heparin iπduced agrégation of lymphoid cells : J. Cell. Physiol. 1986, 126, 352-358), parfois l'héparine entraîne un détachement des cellules ou une inhibition de leur accrochage à des substrats artificiels (heparin inhibits the attachment and growth of BALB/C/3T3 fibroblasts on collagen substrata, J. Cellular Physiol. 1992, 150, 8-16).
L'invention est également relative à l'utilisation d'un dérivé de polymère polyosidique, notamment des polysaccharides sulfatés dans le milieu de culture, dans un milieu de dissociation ainsi que dans les milieux de congélation ou de décongélation de cellules eucaryotes adhérentes ou de tissus en culture. L'héparine, le dextran sulfate ou le sulfate d'hydroxyéthyl-amidon sont des polysaccharides sulfatés préférés de l'invention. Cette utilisation permet : - d'obtenir une meilleure dissociation des cellules,
- d'obtenir ces cellules avec un rendement supérieur à celui obtenu par les méthodes classiques,
- de diminuer la taille et le nombre des agrégats qui subsistent après l'étape de dissociation, - d'obtenir une meilleure reproductibilité dans les comptages cellulaires.
- d'optimiser les procédures de congélation ou de décongélation et d'injection (lorsque c'est leur utilisation finale) de ces cellules.
Quand le dérivé de polymère est utilisé dans le milieu de dissociation des cellules ou de tissus et contenant soit un chélateur, soit une enzyme proteolytique, soit les deux, la dose optimale est comprise entre 75 et 150 Ul/ml. Quand le dérivé de polymère est utilisé directement dans le milieu de culture, sa concentration optimale est comprise entre 500 et -5000 Ul/ml, de préférence entre 800 et 2000 Ul/ml avec une concentration optimale autour de 1600 Ul/ml. L'avantage de cette dernière solution se situe, d'une part, au niveau de l'augmentation de la viabilité des cellules qu'elle permet et, d'autre part, de l'économie de moyens pour aboutir à la récolte des cellules en culture ou des tissus en évitant l'étape de dissociation ; en effet, une simple étape de centrifugation, le cas échéant suivie d'une étape de lavage, est suffisante à l'obtention d'un culot cellulaire prêt à une congélation éventuelle. L'invention est également relative aux cellules eucaryotes obtenues par la mise en oeuvre d'un procédé tel que décrit ci-dessus, ainsi qu'aux produits issus de ces cellules ou tissus, notamment des virus, protéines recombinantes ou des récepteurs. Des exemples particuliers de ce type de cellules sont notamment : des cellules L, la lignée 3T3 NIH, les lignées d'encapsidationΨCRE et ΨCRIP, les cellules TS13 (cellules de hamster), les cellules tumorales MC26, les cellules tumorales 143b, les cellules tumorales MDF7, les cellules tumorales B16 F1 , les lignées de packaging GP + envAM 12, les cellules HeLa. Un exemple de tissu en culture est celui de monocouches de kératinocytes.
L'utilisation des cellules eucaryotes recombinantes ou transformées pour utilisation en thérapie génique prend actuellement de plus en plus d'importance et les volumes à produire également. Le procédé de l'invention est considérablement amélioré lorsque après la première étape de dissociation des cellules, le reste du processus de traitement, suspension, re-suspension, lavages sont effectués à la température de 4°C au lieu d'être effectués à température ambiante. Aussi le procédé tel que décrit ci-dessus est-il particulièrement avantageux quand l'ensemble de ces étapes intermédiaires, sont réalisées à 4°C
L'utilisation de ces types de cellules étant essentiellement à but thérapeutique chez l'homme, il est intéressant de souligner que les polysaccharides sulfatés tels que ceux cités plus haut sont des produits qui ont déjà obtenus une autorisation de mise sur le marché et à ce titre ne posent a priori aucun problème de toxicité si des résidus potentiels restent associés aux cellules.
Dans le mode de réalisation du procédé de la présente invention où l'adjonction d'héparine se situe entre 500 et 5000 Ul/ml dans le milieu de culture et de préférence entre 800 et 2000 Ul/ml, lorsque les cellules arrivent à confluence, les cellules sont dissociées sans effectuer les étapes d'élimination du milieu de culture, ni addition de milieu dissociant contenant notamment un chélateur de type EDTA. Un avantage de ce mode de réalisation particulier est l'augmentation de la viabilité de la cellule ; en effet, l'EDTA qui entraîne une certaine mortalité cellulaire n'est plus nécessaire. Dans ce mode de réalisation, l'héparine ajoutée directement au milieu de culture est laissée en présence des cellules pendant 5
' à 10 minutes ; les cellules sont alors facilement dissociables par une agitation modérée suivie d'une remise en suspension par exemple à la pipette, et peuvent ensuite être recueillies. L'étape d, citée ci-dessus, de lavage dans un milieu appropriée à l'utilisation que l'on souhaite faire de ces cellules, est toujours possible ultérieurement.
Ce type d'utilisation permet d'améliorer grandement les procédés utilisés pour le recueil des cellules en flacons roulants quant le nombre de flacons à récupérer est important. Ceci entraîne notamment une économie de manipulations qui permet de rendre viable un process industriel qui sans cela ne l'aurait pas été. A titre d'exemple, pour recueillir les cellules de 50 flacons roulants suivant un procédé de dissociation classique, il faut utiliser 6 personnes qui travaillent dans un espace réduit pendant une durée de 2 à 3 heures. Avec le nouveau procédé, 2 personnes suffisent, sans augmentation de durée. Cette amélioration est extrêmement sensible lorsqu'il s'agit de passer à 100 flacons roulants où le procédé de dissociation avec changement de milieux devient quasiment impossible à cause du trop grand nombre de personnes présentes dans une salle à atmosphère contrôlée. Enfin, l'augmentation de la viabilité des cellules en l'absence d'EDTA augmente la qualité et la quantité du produit obtenu à partir des cellules ou tissus dissociés.
Les expériences ci-dessous sont des exemples donnés à titre indicatif de l'amélioration conférée par le procédé de l'invention dans la qualité et le rendement des cellules obtenues ainsi que dans l'amélioration du titre infectieux des cellules dérivées de fibroblaste de souris transfectees par des retrovirus recombinants tels que les cellules de packaging ΨCRIP (Danos O. et al, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 : 64,60-64-64 (1988). Ces expériences sont destinées à illustrer les performances du procédé de l'invention sans pour autant être limitées ni aux types cellulaires donnés, ni à la méthode de culture utilisée, ni au milieux, tampons ou traitement des cellules utilisées à partir de l'étape de dissociation.
Tous les exemples ci-dessous sont réalisés en utilisant comme polysaccharides sulfatés l'héparine telle que commercialisée par la société Choay (Sanofi Winthrop, 9, rue du Président Allend, 94958 Gentilly Cedex), l'héparine lyophilisée étant remise en solution dans de l'eau distillée stérile et à raison de 25000 unités par ml.
Les cellules utilisées sont des cellules de type fibroblastique dérivées de NIH-3T3 transfectees par un retrovirus recombinant de type Moloney intégrant dans son génome le gène de la un thymidine kinase, et décrit dans Caruso et al 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90 : 7024-7028, et appelées cellules M11.
Exemple n° 1: Effet de l'addition d'héparine sur le nombre de cellules dissociées et collectées. La croissance des cellules est menée à confluence en bouteilles roulantes jusqu'au 6ème ou 8ème jour (J6 ou J8) de la production, puis le milieu de culture est jeté et les cellules sont mises en contact avec un milieu de dissociation constitué de tampon PBS auquel on ajoute 0,02 % d'EDTA. Les cellules sont ensuite comptées au Coulter counter à J6 ou J8 soit sans addition d'héparine soit avec addition de 100 unités par ml d'héparine ; les résultats sont présentés dans le tableau 1 suivant :
Tableau 1 : Nombre des cellules récoltées par bouteilles roulantes
HEPARINE 0 100 U/ml
J6 124.10* 150.10* J8 136.10* 164.10*
On voit que le nombre de cellules récoltées par bouteilles roulantes est 20% supérieur lorsque 100 unités par ml d'héparine sont ajoutées au milieu
PBS-EDTA. En outre lorsque l'on reprend les culots cellulaires en milieu de congélation, le nombre d'agrégats reformés est beaucoup plus faible qu'en l'absence d'héparine.
Exemple n° 2 : Congélation puis décongélation des cellules en absence ou en présence d'héparine. Des boites de cultures de 75 cm2 contiennent un tapis de cellules M11 en confluence.
Les cellules sont décollées de la boite avec du milieu de dissociation
PBS-EDTA 0, 02 % avec ou sans héparine à 100 unités par ml.
Le milieu de dissociation est mis en présence du tapis cellulaire pendant 5 minutes puis les cellules sont récupérées et la dissociation est terminée avec une pipette de 5 ml. Les cellules sont alors comptées, centrifugées et le culot cellulaire repris dans un volume approprié de milieu de congélation composé de
50 % de sérum de veau nouveau-né (Hyclone référence A-2111 ) et 50 % de milieu DME contenant 20 % de DMSO. Le milieu DME est le milieu DMEM (référence Gibco 41965) auquel on ajoute 6 ml de glutamine, 6 ml de solution d'antibiotique (pénicilline, streptomycine, néomycine (Référence GIBCO 15640- 048) et 10 % de sérum de veau nouveau-né. Les cellules sont congelées finalement dans 50 % de sérum de veau nouveau-né et 10 % de DMSO dans le DME.
Protocole de décongélation :
Les ampoules contenant les cellules congelées dans le milieu décrit ci- dessus sont sorties de l'azote liquide et placées dans la glace puis transférées dans un bain-marie à 37° jusqu'à l'apparition d'un premier glaçon, moment propice au transfert dans un tube falcon de 15 ml contenant 10 ml de milieu constitué de sérum physiologique auquel on ajoute 10 % d'albumine humaine. Les cellules sont ensuite lavées deux ou trois fois avec ce même milieu puis le culot cellulaire est remis en suspension dans un volume adéquat de DME (tel que défini ci-dessus) contenant 10 % de sérum de veau nouveau-né puis la suspension cellulaire est distribuée à nouveau dans des flacons de culture, la culture se faisant dans des conditions classiques à 37° en présence de 5 % de C02.
Le tableau 2 ci-dessous résume les résultats obtenus dans les conditions expérimentales suivantes : lors de leur croissance après décongélation le milieu de culture DMEM contient de 0 à 100 unités par ml d'héparine puis les cellules sont récoltées en tampons PBS-EDTA avec ou sans 1 0 unités d'héparine.
Les paramètres mesurés sont le nombre de cellules vivantes, la viabilité, la densité des cellules dans les flacons, le temps de doublement, le nombre de doublement. Tableau 2
Nbe d'UI d'héparine ds 30 ml de DMEM 0 25 U/ml 50 U/ml 75 U/ml 100 U/ml
Nbe d'UI d'héparine ds 10 ml de PBS 1000 0 1000 1000 0 0 1000 1000 0 0 1000 0 000 0 EDTA
Nbe de C vivantes (x106) 3,2 2,1 2,33 2,36 2,48 1 ,74 1,96 2,64 1 ,44 2,48 1 ,98 1 ,32 1.6 1 ,03
Viabilité 90% 72% 91% 86% 86% 75% 87% 92% 89% 91% 83% 80% 83% 82%
Nbe de C vivantes par cm 2 0,042 0,028 0,031 0,032 0,033 0,023 0,026 0,035 0,019 0,019 0;026 0,018 0,021 0,014
Temps de dédoublement 66h 6j 4.7J 4,5j 4,1j 14j 7,8j 3,7 - 4,1j 7,5j - - -
Nbe de doublement 1 ,09 0,48 0,63 0,65 0,72 0,21 0,38 0,81 - 0,72 0,4 - - -
Confluence 2+(+) 2+ (+) 2+(+) 2+(+) 2- +) 2+(+) 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
Il apparaît clairement que la présence d'héparine dans le milieu de croissance apparaît défavorable au nombre de cellules vivantes obtenues après récolte.
Par contre la présence d'héparine dans le milieu de décollement augmente de façon très significative le nombre de cellules vivantes, la viabilité, la densité des cellules.
A l'observation microscopique des cellules à J3, il apparaît que le nombre de cellules en suspension augmente avec la concentration en héparine du milieu et inversement le tapis cellulaire est moins dense.
Les cellules cultivées en présence d'héparine puis traitées en PBS et D'EDTA sans héparine présentent un phénomène de décollement du tapis cellulaire ce qui fausse les comptages obtenus à partir du tapis décollé et diminue de fait le rendement des cellules obtenues.
Cet exemple montre clairement que la présence d'héparine dans le milieu PBS-EDTA et dans les milieux de congélation, décongélation confère aux cellules un taux de viabilité de 90 % et un rendement en cellules vivantes bien supérieur à celui obtenu en absence d'héparine.
Exemple n° 3 : titre infectieux des cellules en culture avant été en contact de l'héparine pendant les différentes Phases de récolte, congélation et décongélation telles oue décrites dans les exemples ci-dessus. Le calcul du titre infectieux a été réalisé selon la méthode décrite dans
Caruso et al, Proc Nat Acad Sci (1992) 89 : 182-186. Des cellules L en culture ont été infectées avec les lignées M11 récoltées de la façon décrite dans les exemples ci-dessus. Les cellules L infectées par les cellules M11 sont ensuite colorées au bleu trypan. La mesure du titre infectieux de ces cellules est identique ou supérieure à celui obtenu en milieu PBS-EDTA simple, et constamment supérieure si on rapporte le titre au nombre de cellules effectivement comptées ; il est également significativement supérieur au titre de cellules recueillies avec de la trypsine. En outre avec l'utilisation de la trypsine il est constant que le titre infectieux soit nul jusqu'à la quatrième heure alors que en présence de PPS et d'EDTA auquel on ajoute 100 unités par ml d'héparine, un titre infectieux apparaît dès la première heure après la mise en présence des cellules L avec les cellules M11. Ces résultats reflètent bien que les cellules M11 sont dans un meilleur état physiologique lorsque les cellules ont été préalablement mises en présence d'héparine lors des étapes de recueil, congélation et décongélation que lorsqu'elles ont été seulement en présence de D'EDTA ou de trypsine ou d'un mélange des deux. Exemple ne 4 : comparaison de l'effet de faibles et fortes concentrations d'héparine sur la dissociation de différentes lignées cellulaires en culture. L'utilisation d'héparine a été testée quant à la dissociation de différentes lignées cellulaires. On peut citer la lignée 3T3 NIH, les lignées d'encapsidatioπ ΨCRE et ΨCRIP, les cellules TS13 (cellules de hamster), les cellules tumorales MC26, les cellules tumorales 143b, les cellules tumorales MCF7, les cellules tumorales B16 F1 , les lignées de packaging GP + envAM12, les cellules Hela. a) concentration d'héparine à 100 Ul/ml dans un milieu PBS EDTA, à pH8 : Le temps de dissociation pour la concentration d'héparine à 100 Ul/ml est de 5 minutes à température ambiante. La dissociation de ces cellules est d'autant plus facile que celles-ci sont proches de la confluence.
Si l'on augmente la concentration d'héparine à 200 Ul/ml environ, la viabilité est légèrement accrue : elle est de 87 % alors que à 100 Ul/ml elle était à 83 %. b) Héparine utilisée à une concentration comprise entre 800 Ul/ml et
2000 Ul/ml.
L'héparine est ajoutée directement dans le milieu de culture des cellules à la concentration de 1200 Ul/ml, la viabilité des cellules après dissociation est alors de 95 %. Exemple n" 5 : utilisation d'héparine pour la dissociation de cellules en culture dans du milieu sans sérum.
L'expérience a été réalisée en utilisant des cellules de type MDCK qui doivent pousser dans un milieu sans sérum pour pouvoir produire des quantités appréciables de virus grippal après un traitement approprié. Malheureusement, ce type de lignée cellulaire cultivée sans sérum rend la dissociation des cellules extrêmement difficile. La procédure habituelle est un traitement par un tampon PBS EDTA pendant 30 minutes, suivi d'une dissociation très énergique à la trypsine. Cette difficulté à dissocier les cellules est un frein important à l'utilisation industrielle de ce type de culture cellulaire pourtant indispensable à la fabrication du vaccin grippal. Avec le procédé de l'invention, l'étape de pré¬ incubation avec le PBS EDTA a été remplacée par l'adjonction d'héparine à haute dose (1200 Ul/ml) dans le milieu de culture. Dans la plupart des cas, il a été observé une très importante augmentation de la dissociation ultérieure en présence de trypsine et, dans certains cas, les cellules ont pu être dissociées sans l'adjonction de trypsine.
Exemple n° 6 : Détachement de monocouches de cellules épithéliales. La reconstitution de l'épiderme des grands brûlés est obtenue par culture in vivo de kératinocytes qui se disposent en couches monocellulaires sur les boîtes de culture. La procédure habituellement utilisée pour récupérer ces monocouches est une digestion énergique à la trypsine suivie d'un décollement physique. L'utilisation d'héparine remplace avantageusement l'utilisation de la trypsine, d'une part, car l'héparine altère moins les protéines à la surface de ces cellules, d'autre part, l'héparine est beaucoup moins chère et d'usage humain (il existe une AMM) alors que la trypsine doit, pour pouvoir être utilisée nécessiter de nombreux contrôles bactériens et viraux qui en font un produit extrêmement cher.
En conclusion l'addition d'une quantité de polysaccharides sulfatés telle l'héparine à une concentration de 50 à 500 unités par ml et de préférence une centaine d'unités par ml dans les milieux de manipulation des cellules adhérentes utilisés lors de leur recueil, de la congélation, ou de la décongélation, ou d'une quantité de 500 à 5000 Ul/ml dans le milieu de culture permet d'augmenter la viabilité et le nombre absolu de cellules vivantes obtenues ; de façon concomitante il est observé une diminution des agrégats et un comportement physiologique des cellules plus vigoureux puisqu'il est observé une augmentation de l'infectiosité des cellules transformées par un retrovirus.
Enfin ces conditions expérimentales permettent de faire les opérations de collecte des cellules à une température de 4°, ce qui permet d'envisager un traitement homogène de quantité importante de cellules ce qui est nécessaire lors de la préparation de lots thérapeutiques.
Il est particulièrement intéressant de noter que l'utilisation de substances telles l'héparine ou l'hydroxy-éthyl-amidon ont déjà reçu des AMM pour des utilisations thérapeutiques et notamment comme anti-agrégant pour le premier ou comme substitut plasmatique pour l'autre, ce qui laisse penser que l'utilisation des milieux les contenant ne poserait pas de problème majeur au niveau de la constitution de dossier d'enregistrement clinique de nouveaux produits thérapeutiques à base soit des cellules dans le cas d'une thérapie génique soit de substances excrétées par la cellule dans le cas de protéines recombinantes.

Claims

96/1415Revendications
1. Procédé de préparation des cellules eucaryotes adhérentes ou de tissus cultivés comprenant au moins une étape de recueil des cellules après leur croissance complétée le cas échéant par des étapes de congélation et de décongélation desdites cellules, caractérisé en ce que l'un des milieux de préparation contiennent au moins un dérivé d'un polymère polyosidique.
2. Procédé selon la revendications 1 caractérisé en ce que le polymère est ajouté au milieu au moins dans l'une des étapes suivantes : la culture, la dissociation et le recueil des cellules, leur congélation, leur décongélation.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le polymère est un dérivé de polysaccharide.
4. Procédé selon la revendication 1 à 3 caractérisé en ce que le polymère est une polysaccharide sulfaté dont le poids moléculaire est compris entre 5000 et 500 000.
5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que le polymère est choisi de préférence parmi l'héparine, le dextran sulfate ou la sulfate d'hydroxyéthyl amidon.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le polymère est l'héparine.
7. Procédé selon des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le polymère est ajouté au milieu de culture à une concentration comprise entre 500 et 5000 Ul/ml, et de préférence entre 800 et 1600 Ul/ml.
8. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le polymère est ajouté au milieu de dissociation contenant un autre agent dissociant, à une concentration comprise entre 75 et 150 Ul/ml.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que les étapes intermédiaires entre celle de dissociation, de congélation et de décongélation sont réalisées à 4°C.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que le système de culture est un système en circuit fermé dans lequel les cellules sont dissociées puis récupérées, notamment un système de type Cell Cube, ou des fibres creuses, ou des microporteurs.
11. procédé selon d'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que les cellules adhérentes sont des cellules de type fibroblastiques ou.épithéliales.
12. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que les cellules sont des cellules recombinees susceptibles de produire une protéine recombinante ou un récepteur.
13. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que les cellules sont des cellules hôtes comprenant un retrovirus recombinant utilisable en thérapie génique.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que les tissus en culture sont des monocouches de kératinocytes.
15. Cellules eucaryotes obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 14.
16. Produits issus des cellules eucaryotes de la revendication 15, notamment des virus, des protéines recombinantes ou des récepteurs.
17. Utilisation d'un dérivé des polymères polyosidiques dans les milieux de culture, de recueil, congélation ou décongélation de cellules eucaryotes adhérentes comme agent de dissociation de désagrégation desdites cellules.
18. Utilisation selon la revendication 17, caractérisé en ce que le polymère est un polysaccharide polysulfaté.
19. Utilisation selon la revendication 18 caractérisé en ce que le polymère est l'héparine.
20. Utilisation selon l'une des revendications 17 à 19 caractérisée en ce que le polymère polyosidique est ajouté au milieu de culture des cellules ou des tissus à la concentration de 500 à 5000 Ul/ml, et de préférence de 800 à 1600 Ul/ml.
21. Utilisation selon l'une des revendications 17 à 19 caractérisée en ce que le polymère polyosidique est ajouté au milieu de dissociation contenant un autre agent dissociant à la concentration de 75 à 150 Ul/ml.
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