JPH10509456A

JPH10509456A - 化学発光ジアルキル基置換１，２−ジオキセタン化合物、その製造方法およびその使用方法

Info

Publication number: JPH10509456A
Application number: JP8516892A
Authority: JP
Inventors: ポールシャープアーサー; アクハヴァン−タフティハシェム
Original assignee: ルミゲンインコーポレイテッド
Priority date: 1994-11-23
Filing date: 1995-11-02
Publication date: 1998-09-14
Also published as: EP0794987A4; WO1996016137A1; US5886238A; EP0794987A1; US6284899B1; US5578253A; AU684409B2; ATE224938T1; CA2203160A1; US5892064A; DE69528375T2; DE69528375D1; EP0794987B1; AU4141996A

Abstract

(57)【要約】保護基を除去して化学発光反応をトリガーする、ジアルキル置換のジオキセタンを用いる、化学発光分析方法と組成物が記載されている。ジオキセタン環に２つのスピロ縮合のないアルキル基で置換し、試薬によってトリガーされて発光し得る、化学発光１，２−ジオキセタンが開示されている。ジアルキル置換のジオキセタンは、酵素を含むトリガー剤の検出に有用である。イムノアッセイ、ＤＮＡプローブアッセイ、又は酵素がリポーター分子に結合している他のアッセイにおいて、酵素は単独で存在するか、又は特別な結合組のメンバーに結合して存在する。

Description

【発明の詳細な説明】化学発光ジアルキル基置換1,2−ジオキセタン化合物、その製造方法およびその使用方法技術分野本発明は、酵素および他の化学物質を含む薬剤によってトリガーされて光を発生することができる化学発光1,2−ジオキセタン化合物に関する。特に、本発明は、アリール基の置換基であるトリガー可能なＸ−オキシ基(ＯＸ)を有する安定なアリール基置換1,2−ジオキセタンに関し、この安定な1,2−ジオキセタンはＸの除去により不安定なジオキセタン化合物を形成し、これは分解して光と２つのカルボニル化合物を生成する。背景技術a.1,2 −ジオキセタンの調製コペッキーとマンホールドはジオキセタン（相当するアルケンから順に調製されたβ−ブロモハイドロパーオキサイドの塩基−触媒環化による3,3,4−トリ− メチル−1,2ジオキセタン(K．R．Kopecky and C．Mumford，Can．J．Chem.，47 ，709(1969))の最初の合成方法を報告した。しかし、この方法は種々のアルキル及びアリール置換1,2−ジオキセタンの生成に用いられているが、ビニルエーテル、ビニルサルファイド、及びエナミンから誘導されたジオキセタンの調製には使用されていない。 1,2−ジオキセタンへの代わりの合成経路、特にビニルエーテル、ビニルサルファイド及びエナミンからの誘導体はハートレット及びシャープ(P．D．Bartlet t and A．P．Schaap，J．Am．Chem．Soc.，92，3223(1970))そしてマツァー及びフート(S．Mazur and C．S．Foote，J．Am．Chem．Soc.，92，3225(1970))によってそれぞれ報告されている。光増感剤存在下での酸素分子の適当なアルケン化合物への光化学的な付加は、高い収率で1,2−ジオキセタンを生成する。この方法は多数のジオキセタン化合物を生成するのに使用されている。(K．R．Kopecky in Chemical and Biological Generation of Excited States，W．Adam and G．Cil ento，(Eds.)，Academic Press，New York，P.85，1982)。この方法の２つの限界が報告されている。芳香族置換基を有するある種のアルケンは光酸素化で、エンドパーオキサイドとして知られている六員環過酸化物を生成することがわかっている(A．P．Schaap，P．A．Burns and K．A．Zaklika， J．Am．Chem．Soc.，99，1270(1977))。反応性に富んだアリル水素を有するアルケンはしばしば"エン"反応と呼ばれる他の反応を行い、ジオキセタンの代わりにアリルハイドロパーオキサイドを生成する(A．Baumstark in Advances In Oxyge netated Process,JAI Presses,Greenwich,CT,1988;Vol.1,pp 31-84)。b. 立体障害アルケンからの熱安定ジオキセタンワインバーグ(J．H．Wieringa，J．Starting，H．Wyberg andW．Adam，Tetrah edron Lett.，169(1972))によって発見されたヒンダードアルケンアダマンチリデンアダマンタンから誘導されたジオキサンは、分解に対して37kcal／molの活性化エネルギーを持ち、25℃において数年の半減期（t_1/2）を持つ(N．J．Turro ，G．Schuster，H．C．Steinmetzer，G．R．Faler and A.P.Schaap，J．Am．Che m．Soc.，97，7110(1975))ことが示された。他には、スピロ−縮合された多環基、例えば、アダマンチル基が、アミノ置換アルケン(F．McCapra，I．Beheshti， A．Burford，R．A．Hann and K．A．Zaklika，J．Chem．Soc.，Chem．Comm.，94 4(1977))、ビニルエーテル(W．Adam，L．A．Encarnacion and K．Zinner，Chem ．Ber.，116，839(1983))及びビニルサルファイド(G．G．Geller，C．S．Foote and D.B.Pechman，Tetrahedron Lett.，673(1983);W．Adam，L．A．Arias and D ．Schuetzow,Tetrahedron Lett.，2835(1982))から誘導されたジオキセタンの安定性を増加を助け、この基がない場合には不安定になることが示されている。c. ジオキセタンの化学的トリガー文献の最初の例は、2,3−ジアリール−1,4ジオキセンから誘導された水酸基置換ジオキセタンに関して記述されている(A．P．Schaap and S．Gagnon，J．Amer ． Chem．Soc.，104，3504(1982))。しかしながら、水酸基置換ジオキセタンとジアリール−1,4−ジオキセンから誘導されたジオキセタンの任意の他の例も25℃で数時間の半減期しか持たず、相対的に不安定である。さらに、これら安定化されていないジオキセタンは少量のアミン(T．Wilson，Int．Rev．Sci.: Chem.，Ser ．Two，9，265(1976))及び金属イオン(T．Wilson，M．E．Landies，A．L．Baums tark，and P．D．Bartlett，J．Amer．Chem．Soc.，95，4765(1973); P．D．Bar tlett，A．L．Baumstark，and M．E．Landies，J．Amer．Chem．Soc.，96，5557 (1974))によって破壊されてしまうが、両成分は生化学分析の緩衝液に用いられている。アダマンチル安定化ジオキセタンの化学的トリガーの例は最初に米国特許出願(A．P．Schaap，patent application serial No．887，139，filed July ，17，1986)及び論文(A．P．Schaap，T．S．Chen，R．S．Handley，R．DeSilva ，and B．P．Giri，Tetrahedron Lett.，1155(1987))に発表された。これらのジオキセタンは数年の熱的半減期を示し、必要に応じて有効な化学発光を生じさせるためにトリガーさせることができる。弱い化学発光を生ずるトリアルキルシリル及びアセチル−保護フェニル基で置換された中程度に安定なベンゾフラニルジオキセタンもまた報告されている(W．Adam，R．Fell，M．H．Schulz，Tetrahedr on，49(11)，2227-38(1993); W．Adam，M．H．Schulz，Chem．Ber.，125，2455- 61(1992))。他の剛直多環基の安定化効果もまた報告されている(P．D．Bartlett and M．Ho，J．Am．Chem．Soc.，96，627(1975); P．Lechtken，Chem．Ber.，1 09，2862(1976))。国際出願（ＷＯ94／10258）には、様々な剛直多環置換基を有するジオキセタンの化学的トリガーが開示されている。d. アダマンチルジオキセタンの酵素トリガー酵素によって化学発光分解がトリガーされ得るジオキセタンは米国特許出願(A ．P．Schaap，patent application serial No．887，139)及び一連の論文(A．P ．Schaap，R．S．Handley，and B．P．Giri，Tetrahedron Lett.，935(1987); A ．P．Schaap，M．D．Sandison，and R．S．Handley，Tetrahedron Lett.，1159( 1987)and A．P．Schaap，Photochem．Photobiol.，47s，50S(1988))で開示されている。保護されたアリールオキサイド置換体を持つ非常に安定なアダマンチル置換されたジオキセタンは緩衝液中の酵素の作用により、発光を伴う分解がトリガーされ、ジオキセタンの分解速度を飛躍的に増加させる強電子供与アリールオキサイド陰イオンを生ずる。結果として、その化学発光は、保護された形のジオキセタンの穏やかな熱分解から生ずる化学発光の数オーダー高い強度で放射される。シャープの米国特許第 5，068，339号明細書は、蛍光を発する基を共有結合で有し、酵素でトリガー可能なジオキセタンを開示している。これらジオキセタンの分解は蛍光体への分子内エネルギー転移を通して増強及びレッドシフトされた化学発光を生ずる。エドワードの米国特許第 4，952，707号明細書には、アダマンチル基及び2,5−又は2,7−二置換されたナフチル基を有し酵素でトリガー可能なジオキセタンを開示している。ブロンシュタインの米国特許第5，112，960 、第5，220，005号、5，326，882号明細書及び国際出願（8800695）は、塩素原子、臭化カルボキシ基、水酸基、メトキシ基及びメチレン基を含む様々な基で置換されたアダマンチル基を有するトリガー可能なジオキセタンを開示している。刊行物(M．Ryan，J．C．Huang，O．H．Griffith，J．F．Keana，J．J．Volwerk ，Anal．Biochem.，214(2)，548-56(1993))は、ホスホリパーゼによってトリガー可能なホスホジエステル置換されたジオキセタンを開示している。ウルデアによる米国特許第5，132，204号明細書は、化学発光分解をトリガーするために結合した２つの保護基を連続的に除去するために異なった２つの酵素を必要とするジキセタンを開示している。ヘイスの米国特許5，248，618号明細書は、中間体を生成する第１保護基を脱離することを酵素的もしくは化学的にトリガーするジオキセタンを開示している。この中間体は化学発光分解をトリガーするために、速やかに分子内反応を行い第２保護基を脱離する。e. 界面活性剤存在下のジオキセタンの化学発光の増強アンモニウム界面活性剤及び蛍光物質を含む水溶性物質の存在下における、安定な1,2−ジオキセタンの酵素でトリガーされた分解による化学発光の増強も報告されている(A．P．Schaap，H．Akhavan，and L．J．Romano，Clin．Chem.，35 (9)，1863(1989))。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）及び５−（Ｎ−テトラデカノイル）アミノ−フルオレセインからなる蛍光ミセルは、中間のヒドロキシ置換されたジオキセタンを捕捉し、疎水性環境内の励起状態のアニオン系エステルからミセルへのフルオレセイン化合物への効率的なエネルギー移転によって化学発光量子収量を400倍も増加させる。シャープの米国特許第4，959，182号及び5，004，565号明細書は、化学的にまた酵素でトリガーされて生ずる安定なジオキセタンの化学発光の、第４級アンモニウム界面活性剤ＣＴＡＢ及び蛍光物質によって形成されるミセルの存在下での増強の他の例を記載している。ＣＴＡＢと前述した蛍光界面活性剤もしくは１−ヘキサデシル−６−ヒドロキシベンゾチアザマイドとで形成された蛍光ミセルは、ヒドロキシ及びアセトキシ置換されたジオキセタンの塩基でトリガーされた分解により発光を増強する。ＣＴＡＢ自体がホスフェート置換されたジオキセタンの発光を増強することもまた報告されている。ヴォイタ（Ｖoyta）の米国特許第5145772号明細書は、酵素で生じる1,2−ジオキセタンの化学発光の、第四級アンモニウム基のペンダントのみまたはフルオレセイン（fluorescein）が付加されたポリマーの存在下での増強を開示している。化学発光を高めるものとして報告されている他の物質には、ウシのアルブミン等の球状タンパク質や第四級アンモニウム界面活性剤などがある。他のカチオン系ポリマー化合物は、化学発光エンハンサー（enhancer）として限界的効果を示す。非イオン系ポリマー化合物は、通常、効果がなく、アニオン系ポリマーのみが発光を有意に減少させる。国際出願ＷＯ94／21821は、高分子のアンモニウム塩界面活性剤と増強添加剤の組み合わせによる増強を開示している。1993年９月22 日に発行されたアクハブン−タフティ（ＡＫhaven−Ｔafti）の欧州特許出願第9 2113448.2号明細書は、蛍光エネルギー受容体が共有結合で結合されたポリビニルホスホニウム塩、及びポリビニルホスホニウム塩の存在下、1,2−ジオキサンから酵素的に生じた化学発光の増強を開示している。1993年６月24日に出願されたアクハブン−タフティの係属中の米国特許出願Ｎo.08／082091は、二陽イオンホスホニウム塩の存在下、1,2−ジオキセタンから酵素的に生じた化学発光の増強を開示している。当業者に知られているトリガー可能な安定化されたジオキセタンは、剛直なスピロ−縮合された多環式置換基又は置換されたスピロアダマンチル置換基を取り込んでいる。ジオキセタンを調製する出発物質のケトンは比較的高価で入手が困難か、あるいは高価な前駆体から調製しなければならない。剛直なスピロ−縮合された多環の有機基の代わりに２つのアルキル基を有する安定なトリガー可能なジオキセタンの例は知られていない。このようなトリガー可能な安定化ジオキセタンは、安価で容易に入手可能な出発物質から調製でき、それゆえ、商業化を容易にするコスト有利性を提供するだろう。発明の開示本発明の目的は、長期にわたり室温で安定な、ジアルキル及びアリールＯＸ− 置換されたトリガー可能な新規1,2−ジオキセタン化合物を提供することにある。また、本発明の目的は化学発光を伴う分解をトリガーできる、かかる安定な1, 2−ジオキセタン化合物を提供することにある。さらに、本発明の目的は、安価で容易に入手が可能な出発物質から調製できるかかる安定1,2−ジオキセタン化合物を提供することにある。更にまた本発明の目的は、酵素及び他の化学物質を含む試薬により、化学発光をトリガーできる安定なジオキセタンを含む方法及び組成物を提供することにある。更にまた本発明の目的は、エンハンサー物質の使用を通して化学発光を更に増大させるための方法及び組成物を提供することにある。更にまた本発明は、酵素の検出、およびイムノアッセイにおける使用、並びに当業者に一般に既知であるような、酵素に結合された核酸、抗体および抗原の検出のための方法および組成物に関する。更にまた本発明の目的は、化学発光の応用に対する方法及び組成物を提供することにある。図面の簡単な説明第１図は、メタノールとジメチルスルフオキサイドとの混合物中の水酸化カリウム溶液の添加によってトリガーした際の、ジメチルスルフオキサイド（ＤＭＳＯ）中のジオキセタン２ｃ溶液から生じた化学発光のスペクトルである。スペクトルは、スキャンしている間に生じた化学発光強度についての減衰に対して補正してある。第２図は、ＤＭＳＯ中１Ｍのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオライド５０μＬで、ジオキセタン２ｇの１０^-6Ｍ溶液の１０μＬアリコートをトリガーすることによって発生した化学発光強度の、時間の関数としてのグラフである。第３図は、ＡＰ１．１２×１０^-17モルの添加によって３７℃でトリガーした本発明のジオキセタン２ｆ又は２ｋ(LUMIGEN PPD,Lumigen,Inc.,Southfield,MI) を含有する溶液１００μＬによって生じた化学発光の強度の経時特性の比較を示すグラフである。試薬は、１）０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨ９．６の緩衝液中に、ジオキセタン２ｆを０．３３ｍＭ溶解する溶液と、２）０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨ９．６の緩衝液中に、ジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭ溶解する溶液とで構成されている。本発明のジオキセタン２ｆを使用することが、ジオキセタン２ｋに比してより高い最高強度を得る上で有利である。第４図は、ＡＰ１．１２×１０^-17モルの添加によって３７℃でトリガーしたジオキセタン２ｆ又は２ｋを含有する溶液１００μＬによって生じた化学発光の強度の経時特性の比較を示すグラフである。試薬は、１）１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）ベンゼンジクロリド（エンハンサーＡ）１．０ｍｇ／ｍＬを含有する、０．２Ｍの２ −アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨ９．６の緩衝液中に、ジオキセタン２ｆを０．３３ｍＭ溶解する溶液と、２）同じエンハンサー１．０ｍｇ／ｍＬを含有する、０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨ９６の緩衝液中に、ジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭ溶解する溶液とで構成されている。本発明のジオキセタン２ｆを使用することが、ジオキセタン２ｋに比してより全ての時点でより高い光強度を得る上で有利である。第５図は、ＡＰ１．１２×１０-¹⁷モルの添加によって３７℃でトリガーしたジオキセタン２ｆ又は２ｋを含有する別の一組の溶液１００μＬによって生じた化学発光の強度の経時特性の比較を示すグラフである。試薬は、１）ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリド（エンハンサーＢ）０．５ｍｇ／ｍＬを含有する、０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨ９．６の緩衝液中に、ジオキセタン２ｆを０．３３ｍＭ溶解する溶液と、２）同じエンハンサー０．５ｍｇ／ｍＬを含有する、０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル− １−プロパノールでｐＨ９．６の緩衝液中に、ジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭ溶解する溶液とで構成されている。エンハンサーＢの調製は、１９９３年９月２２日発行の欧州特許第５６１，０３３号公報に記載されている。本発明のジオキセタン２ｆを使用することが、ジオキセタン２ｋに比して全ての時点でより高い光強度を得る上で有利である。第６図は、ＡＰ１．１２×１０^-17モルの添加によって３７℃でトリガーしたジオキセタン２ｆ又は２ｋを含有する別の一組の溶液１００μＬによって生じた化学発光の強度の経時特性の比較を示すグラフである。試薬は、１）ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリドとポリビニルベンジルトリオクチルホスホニウムクロリドとのコポリマー（トリブチル基：トリオクチル基は３：１の比で含有）（エンハンサーＣ）０．５ｍｇ／ｍＬを含有する、０．２Ｍの２ −アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨ９．６の緩衝液中に、ジオキセタン２ｆを０．３３ｍＭ溶解する溶液と、２）同じエンハンサー０．５ｍｇ／ｍＬを含有する、０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨ９．６の緩衝液中に、ジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭ溶解する溶液とで構成されている。エンハンサーＣの調製は欧州特許第５６１，０３３号公報に記載されている。本発明のジオキセタン２ｆを使用することが、ジオキセタン２ｋに比して全ての時点でより高い光強度を得る上で有利である。第７図は、ＡＰの量に対する、３７℃でトリガーしたジオキセタン２ｆを含有する試薬１００μＬによって発せられた最大の化学発光強度の関係を示すグラフである。化学発光は、１．０ｍｇ／ｍＬのエンハンサーＡを含有する０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールの緩衝液（ｐＨ９．６）中にジオキセタン２ｆを０．３３ｍＭ溶解する溶液１００μＬに対して、３．３６×１０^-1 ⁶ モル〜３．３６×１０^-22モルの酵素を含有するＡＰ溶液３μＬを添加することによって３７℃で引き起こされた。用語のＳ−Ｂとは、ＡＰの存在下での相対光度単位（ＲＬＵ）における化学発光シグナル（Ｓ）を、ＡＰ不存在下でのバックグランドの化学発光（Ｂ）に対して補正したものである。グラフは、アルカリホスファターゼの直線的な検出について示している。計算した検出限界（バックグランドの標準偏差の２倍）は、この条件ではアルカリホスファターゼ１．４×１０^-22 モル、即ち１００分子以下であった。第８図は、化学発光を用いて膜上でアルカリホスファターゼを検出した実験から得た、Ｘ線フィルムのデジタルスキャン画像である。１．１×１０^-15から１．１×１０^-18モルまでを含有する、アルカリホスファターゼの水溶液を同一のナイロン膜(Micron Separations Inc.,Westboro,MA)に適用した。膜を５分間風乾し、０．８８ｍＭのＭｇＣｌと０．３３ｍＭのジオキセタン２ｆか又は０．３３ｍＭのジオキセタン２ｋかのいずれかとを含有する、０．２Ｍの２−アミノ− ２−メチル−１−プロパノールのｐＨ９．６の緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬのエンハンサーＡを含有する試薬に、短時間浸漬した。膜を透明なプラスチックのシートの間に置き、Ｘ線フィルム(Kodak X-OMAT AR,Rochester,NY)に暴露した。両試薬の比較において、本発明のジオキセタン２ｆを用いた発光は、同等の画像と検出感度であった。これらの結果は、ジオキセタン２ｆがウエスタンブロッテイング、サザンブロッテイング、ＤＮＡフィンガープリンテイングや他のブロッテイングへの応用に期待されるべき性能を有することを示している。発明を実施するための最良の形態本発明は、酵素及び他の化学物質を含む試薬によってトリガーされて化学発光を生ずることができる安定な1,2−ジオキサンを有する組成物に関する。本発明を実施するのに有用な安定なジオキセタンは化学式、（式中Ｒ₃とＲ₄はスピロ−縮合されていない有機基で、Ｒ₁はＲ₂と結合できる有機基であり、Ｒ₂はＸ−オキシ基で置換されたアリール基を示し、Ｘ−オキシ基は、酵素及び他の化学物質を含む試薬によってトリガーされ化学的に不安定な基Ｘが除去されると、不安定な酸化物中間体ジオキセタン化合物を形成する。）で表わすことができる。不安定な酸化物中間体ジオキセタンは分解して電気的エネルギーを放出し、光及び化学式、で表される２つのカルボニル基を含有する化合物を生成する。本発明を実施するのに望ましい方法は化学式、 (式中、Ｒ₁は１〜12の炭素原子を有するアルキル基、シクロアルキル基及びアリール基から選択され、更にヘテロ原子を有してもよい基であり、Ｒ₃及びＲ₄は３〜８の炭素原子を有する分枝状鎖のアルキル基及びシクロアルキル基から選択される基で、更にヘテロ原子を有していてもよく、熱安定性を付与する基であり、Ｒ₂は置換または無置換のアリール基、ビアリール基、ヘテロアリール基、縮合環の多環アリール基およびヘテロアリール基から選択される基であり、ＯＸは、酵素及び他の化学物質を含む試薬によって化学的に不安定な基Ｘの除去がトリガーされると、不安定な酸化物中間体ジオキセタン化合物を生成するＸ−オキシ基である)で表される安定ジオキセタンを用いる。安定な1,2−ジオキセタン化合物は化学試薬によってトリガー可能であるが、室温（20〜30℃）で比較的長い半減期を持つ。安定でトリガー可能な1,2−ジオキセタンの従来の例は全て、熱安定性を与えるためにアダマンチル基や置換されたアダマンチル基のような剛直なスピロ−縮合された多環アルキル基を使用していた。今回、上記構造におけるＲ₃及びＲ₄に対応する、より広い範囲の置換基を持つ1,2−ジオキセタンが、室温で実質的な熱安定性をも示すことが見出された。わずか３つの炭素原子を含むアルキル基で置換された（上記構造における置換基Ｒ₃及びＲ₄として）ジオキセタン化合物でさえ、室温で約１年の半減期をもち、４℃で数年の半減期を持つ。ジオキセタン環の炭素原子に結合した炭素原子が０又は１つの水素原子で置換されているＲ₃及びＲ₄(例えば、イソプロピル、sec −ブチル、ｔ−ブチル、シクロアルキル)はジオキセタン化合物に十分な熱安定性を与え実際の用途に対して有用なものにする。Ｒ₃及びＲ₄はＣＨ₂基を介してジオキセタン環に結合しているが、嵩高い基、例えば、ネオ−ペンチル基も本発明の範囲内にあると考えられる。さらに、これらジオキセタンはＸ基の除去によりトリガーされ、光の発生を伴って分解する。トリガーによる速度増加の度合いはＸ基の不安定性、トリガー試薬の量、溶剤の選択、ｐＨ及び温度のような要因に依存する。適当な条件を選択することにより、10⁶の倍（factor）又はより大きい速度増加が達成される。本発明は、化学式、（式中、Ｒ₃及びＲ₄は、スピロ−縮合されていない有機基であり、Ｒ₁は有機基で、Ｒ₂と結合できる有機基であり、Ｒ₂は適当なアルケンに酸素を付加することによりＸ−オキシ基で置換されたアリール基を示す）で表される安定な1,2−ジオキセタンの調製に対して容易に入手でき、あるいは安価な出発物質を使用する方法に関する。本発明の予期できなかった発見は、ここで報告されているアルケンが容易に酸素分子（１重項酸素¹Ｏ₂として）の光化学的付加を起こし、相当する1,2−ジオキセタンを生成することである。アリル水素原子を有するアルケンが異なった反応経路により１重項酸素の付加を優先的に行いアリルハイドロパーオキサイドを生成し、ジオキセタンの形成はほとんどの場合マイナー過程であることが文献でよく知られている。所要のアルケン化合物は、ハロゲン化遷移金属塩、好ましくは塩化チタニウム化合物及び第三アミン塩基とともにリチウムアルミニウム水素化物、他の金属水素化物、極性非プロトン性有機溶媒、好ましくはテトラヒドロフラン中の亜鉛金属又は亜鉛−銅カップル存在下、Ｘ−オキシ基で置換されたアリルカルボキシレートエステルと化学式、で表されるジアリルケトンとのカップリングを通じて合成される。反応は一般に還流しているテトラヒドロフラン中で行われ、普通２から24時間で終了する。この方法の有意な点は、ケトン出発物質を大量に入手可能なために、反応を大規模に行うことができることである。商業的に使用されているトリガー可能なジオキセタンはアダマンタノンもしくは置換されたアダマンタノン化合物から調製される。アダマンタノンは比較的高価である。置換されたアダマンタノンですら高価で入手が困難である。危険な酸化物を大量に伴う実験室的操作を含むアダマンタノンの調製と比較して、アルキル及びシクロアルキルケトンは、容易に一般的な方法でしかも大量に調製できる。他の利点は、ある種のケトン出発物質のコスト削減である。例えばジイソプロピルケトンはモル当たりアダマンタノンより15から20倍安価である。トリガー試薬は、１当量（Ｆ^-）を必要とする化学物質、または少量しか使用されない酵素のような触媒であり得る。電子供与体、有機及び無機塩基、求核性試薬及び還元試薬はＸを除去するのに使用することができる。トリガー試薬は、ホスファターゼ酵素、エステラーゼ酵素、コリンエステラーゼ酵素、加水分解酵素、例えばα−及びβ−ガラクトシターゼ、α−及びβ−グルコシターゼ、グルクロニターゼ、トリプシン及びキモトリプシンから選択される酵素であるが、これらに制限されない。ＯＸ基には、水酸基、ＯＯＣＲ₆基(ここでＲ₆はヘテロ原子を含んでいてもよい２〜20の炭素原子を含むアルキル基又はアリール基)、トリアルキルシリルオキシ基、トリアリールシリルオキシ基、アリールジアルキルシリルオキシ基、ＯＰＯ₃ ^-2塩、ＯＳＯ₃ ^-塩、β−Ｄ−ガラクトシドオキシ基及びβ−Ｄ−グルクロニディルオキシ基が含まれるが、これらに制限されない。本発明は、化学試薬及び化学式、 (式中、Ｒ₃及びＲ₄は３〜８の炭素原子を含む低級アルキル基及びシクロアルキル基から選択され、熱安定性を付与する有機基であり、Ｒ₁はＲ₂と結合できる有機基であり、Ｒ₂は、酵素及び他の化学物質を含む試薬により化学的に不安定な基Ｘの除去がトリガーされる際、不安定な酸化物中間体ジオキセタン化合物を形成するＸ−オキシ基で置換されたアリール基を示す)で表される安定な1,2−ジオキセタンの提供を含む発光方法に関する。ここで、不安定な酸化物中間体ジオキセタンは分解し、電気的エネルギーを放出し、光及び化学式、で表される化合物を含む２つのカルボニルを形成する。本発明はまた、酵素を含む化学試薬から選択されるトリガー試薬の検出方法に関する。この場合、ジオキセタンが試薬として使用される。さらに、本発明はイムノアッセイにおける酵素の検出、例えば、酵素免疫検定法、及び酵素が結合したＤＮＡ又はＲＮＡプローブの検出の方法及び組成物に関する。発光の検出は、ルミノメーター、Ｘ線フィルム又はカメラと光学フィルムを用いて容易に行える。実施例核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、ＧＥＱＥ300もしくはバリアンジェミニ 300を用い、内部標準物質としてテトラメチルシランを用いたＣＤＣl₃溶液、もしくはＣＤ₃ＯＤもしくはＤ₂Ｏ溶液で得られた。マススペクトルはＡＥＩＭＳ −90^TMスペクトロメーターを用いて得られた。実施例１１−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−フェニル）−2,2−ジイソプロピル−１−メトキシエテン（19）の合成三口フラスコがアルゴンで置換され100mlの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）が投入された。実施例核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを、内部標準としてテトラメチルシランを用い、CDCl₃中の溶液として、又はCD₃OD若しくはD₂O中の溶液として、ＧＥＱＥ３００か、或はＶａｒｉａｎＧｅｍｉｎｉ３００スペクトロメーターで得た。マススペクトルはＡＥＩＭＳ−９０^TMスペクトルメーターで得た。実施例１．１−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−２，２− ジイソプロピル−１−メトキシエテン（１ａ）の合成．三頸フラスコをアルゴンでパージし、無水のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１００ｍＬを仕込んだ。フラスコを氷浴で冷却し、３塩化チタン（１８ｇ）を攪拌しながら加えた。水素化リチウムアルミニウム（２．２ｇ）を少量ずつ加えたところ、短時間の発熱反応を生じた。水素化リチウムアルミニウムを全部添加した後冷却浴を取り外し、トリエチルアミン（１６ｇ）を添加した。黒色の混合物を、アルゴン気流下で１時間還流した。２，４−ジメチル−３−プロパノン（３．８６ｇ）と、メチル３−ｔ−ブチル−ジメチルシリルオキシベンゾエート（３．００ｇ）との、乾燥ＴＨＦ１０ｍＬ中溶液を２時間に亘って滴下した。４％の酢酸エチル／ヘキサンで溶離しながら、シリカプレート上ＴＬＣで反応の進行をモニターした。粗製の反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンで希釈し、デカントした。残渣を、総量約７００ｍＬのヘキサンを用いて数回洗浄した。ヘキサン溶液の合量を濾過し、蒸発して、残ったオイルをシリカゲル上ヘキサンで溶離しながら、カラムクロマトグラフィで情製し、２．１２ｇ（収率５４％）の１ａを得た。¹H NMR(CDCl₃)δ 7.3-6.7(m,4H),3.18(s,3H),2.45(sept,1H,J=7.2 Hz), 2.31(sept,1H,J=7.2 Hz),1.24(d,6H,J=7.2 Hz),0.99(s,3H),0.91(d,6H,J=7.2 Hz ),0.19(s,3H);¹³C NMR(CDCl₃)δ128.76，122.84，121.46，119.28，56.06，30.3 2,26.54，25.56，21.91，20.86，-4.58;Mass spectrum(m z):348，333，306;exa ct mass,calc'd.348.2484，found348.2479．実施例２．２，２−ジイソプロピル−１−（３−ヒドロキシフェニル）−１−メトキシエテン（１ｂ）の合成．乾燥THF３０ｍｌ中アルケン１ａ、０．９７ｇ（２．７８ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラ−ｎ−ブチル−アンモニウムフルオライド０．８１ｇ（１，１ｅｑ．）を加えた。１時間攪拌した後、ＴＬＣ（シリカで、２０％酢酸エチル／ヘキサン使用）は、出発物質が新しい化合物に完全に転化したことを示した。ＴＨＦを蒸発し、残渣を酢酸エチルに溶解した。酢酸エチル溶液を４回水で抽出し、乾燥した。シリカゲル（２ｇ）を加え、溶剤を蒸発した。物質を、シリカゲル上１０〜２０％酢酸エチル／ヘキサンで溶離するカラムクロマトグラフィで精製し、１ｂ、０．５６８ｇ（収率８７％）を得た。¹H NMR(CDCl₃)δ 7.5-6.5(m,4H),4. 91(s,1H),3.20(s,3H),2.47(sept,1H),2.33(sept,1H),1.25(d,6H),0.92(d,6H);¹³ C NMR(CDCl₃)δ 129.25，124.98，124.98，122.60，116.54，114.98，114.56，5 6.38，30.52，26.80，22.11，21.08;Mass spectrum(m z):234，219，191;exact mass,calc'd.234.1620,found 234.1620．実施例３．１−（３−アセトキシフェニル）−２，２−ジイソプロピル−１−メトキシエテン（１ｃ）の合成．アルケン１ｂ（２００ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン０．３１ｍＬと、乾燥メチレンクロライド２０ｍＬに溶解した。フラスコをアルゴンでパージし、氷浴で冷却した。乾燥メチレンクロライド５ｍＬ中のアセチルクロライド（０．１１５ｇ，１．４７ｍｍｏｌ）を１時間に渡って滴下した。ＴＬＣ分析（シリカで、２０％酢酸エチル／ヘキサン使用）は、０℃で攪拌２．５時間後に反応が完結したことを示した。溶剤を蒸発し、残渣を酢酸エチルに溶解した。溶液を４回水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、蒸発した。残渣をシリカゲル上１０〜２０％酢酸エチル／ヘキサンで溶離するカラムクロマトグラフィで精製し、１ｃ、２２０ｍｇ（収率９３％）を得た。¹H NMR(CDCl₃)δ 7.37-6.99(m,4H),3.19 (s,3H),2.47(sept,1H,J=6.9 Hz),2.33(sept,1H,J=6.9 Hz),2.29(s,3H),1.24(d,6 H,J=6.9 Hz),0.93(d,6H,J=6.9 Hz);¹³C NMR(CDCl₃)δ 169.46，150.62，149.03 ，139.02，133.64，128.95，127.24，122.89，120.72，56.50，30.49，26.98，2 2 06，21.25，21.05．実施例４．１−（３−ベンゾイルオキシフェニル）−２，２−ジイソプロピル −１−メトキシエテン（１ｄ）の合成．アルケン１ｂ（４．５ｇ，１．９ｍｍｏｌ）を、無水トリエチルアミン５．３ｍＬと、乾燥したＣＨ₂Ｃｌ₂５０ｍＬに溶解した。フラスコをアルゴンでパージし、氷浴で冷却した。ベンゾイルクロリド（４．０５ｇ，２．９ｍｍｏｌ）を滴下した。冷却浴を取り外し、室温で１時間攪拌を続けた。混合物を濾過し、溶液を水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、蒸発した。残渣をヘキサンに懸濁し、固形分を濾別して溶液を蒸発した。残渣をシリカゲル上でヘキサン中１％の酢酸エチルで溶離しながらカラムクロマトグラフィで精製し、ジオキセタン１ｄ、３．７ｇを得た：¹H NMR(CDCl₃)δ 8.25-7.05(m,9H),3.25(s,1H),2.54(sept,1H,J=6. 9 Hz),2.40(sept,1H,J=6.9 Hz),2.29(s,3H),1.26(d,6H,J=6.9 Hz),0.95(d,6H,J= 6.9 Hz)．実施例５．１−（３−ピバロイルオキシフェニル）−２，２−ジイソプロピル −１−メトキシエテン（１ｅ）の合成．アルケン１ｂ（２ｇ，８．６ｍｍｏｌ）を、無水トリエチルアミン２．４ｍＬと、乾燥したＣＨ₂Ｃｌ₂５０ｍＬに溶解した。フラスコをアルゴンでパージし、氷浴で冷却した。ピバロイルクロリド（１．６ｇ，２ｅｑ．）を１時間に渡って滴下した。冷却浴を取り外し、室温で３時間攪拌を続けた。溶液をＫ₂ＣＯ₃の水溶液で、次いで水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し蒸発した。残渣をシリカゲル上で、ヘキサン中５％トリエチルアミンで溶離しながら、カラムクロマトグラフィで精製し、ジオキセタン１ｅ、１．９５ｇを得た。¹H NMR(CDCl₃)δ 7.34-6.9 8(m,4H),3.198(s,3H),2.47(sept,1H),2.33(sept,1H),1.36(s,9H),1.24(d,6H,J=6 .9Hz),0.92(d,6H,J=6.9 Hz)．実施例６．２，２−ジイソプロピル−１−メトキシ−１−（３−ホスホリルオキシフェニル）エテンジナトリウム塩（１ｆ）の合成．（ａ）乾燥したＣＨ₂Ｃl₂ ９ｍＬと、無水ピリジン０．７ｍＬ（８．７ｍｍｏｌ）との溶液をアルゴンでパージし、氷浴で冷却した。ホスホラスオキシクロライド（０．４０ｇ，２．６ｍｍｏｌ）を加え、５分後に、ピリジン０．４ｍＬ中アルケン１ｂ（２０９ｍｇ，０．８７ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で１時間攪拌した。ＴＬＣ分析（シリカで、３０％酢酸エチル／ヘキサン使用）は、反応が完結したことを示した。溶剤を蒸発し、残渣を次工程に利用した。（ｂ）工程（ａ）からの生成物をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、ピリジン０．７ｍＬを加えた。溶液を氷浴で冷却し、２−シアノエタノール６１８ｍｇ（８．７ｍｍｏｌ）で処理した。氷浴を取り外し、２時間室温で攪拌を続けた。次に混合物を濃縮し、残渣をシリカゲル上でヘキサン中５０％の酢酸エチルから１００％の酢酸エチルまで、なだらかに変えながら溶離して、カラムクロマトグラフィで精製しビス（シアノエチルホスフェート）を得た：¹H NMR(CDCl₃)δ0.934(d,6H,J=9 Hz),1.235(d,6H,J=9 Hz),2.38-2.45(m,2H),2.76-2.82(m,4H),3.18(s,1H),4.31-4 .47(m,4H),7.11-7.38(m,4H)．（ｃ）ビス（シアノエチルホスフェート）アルケン（４２０ｍｇ）をアセトン４ｍＬに溶解した。水酸化ナトリウム（６５ｍｇ）を水１ｍＬに溶解し、アセトン溶液に加え、次いで夜通し攪拌した。沈殿を集め、乾燥して白色粉末とした。¹H NMR(D₂O)δ 0.907(s,3H),0.929(s,3H)1.20(s,3H),1.22(s,3H),2.35 2.46(m ,2H),3.23(s,1H),6.96-7.37(m,4H);¹³C NMR(D₂O)δ 155.15(d),149,56，137.84, 136.08，129.71，124.55，122.33(d)，120.48，57.16，31.27，27.21，22.49，2 1.10;³¹P NMR(D₂O)(rel.To ext.H₃PO₄)δ 0.345 実施例７．１−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−２，２− ジシクロプロピル−１−メトキシエテン（１ｇ）の合成．三頸フラスコをアルゴンでパージし、無水ＴＨＦ５０ｍＬを仕込んだ。フラスコを氷浴で冷却し、３塩化チタン（１１．６ｇ）を攪拌しながら加えた。水素化リチウムアルミニウム（１．４ｇ）を少量ずつ加えて、短時間の発熱反応を生じさせた。水素化リチウムアルミニウムを添加する間、攪拌を助ける為、無水ＴＨＦ２０ｍＬ分を追加した。添加し終わった後冷却浴を取り外し、黒色の混合物を還流するようにした。トリエチルアミン（１０．５ｍＬ）を加え、黒色の混合物をアルゴン雰囲気下１時間還流した。ジシクロプロピルケトン（２．６１ｇ）と、メチル３−ｔ−ブチル−ジメチルシリルオキシベンゾエート（２．００ｇ）との、乾燥ＴＨＦ２０ｍＬ中溶液を７５分間に渡って滴下した。反応は、５％の酢酸エチル／ヘキサンで溶離しながら、シリカプレート上ＴＬＣでモニターして、更に１時間の還流後に、完結したと判断された。粗製の反応混合物を室温に冷却し、ヘキサン４００ｍＬずつで４回抽出した。ヘキサン溶液の合量を濾過し蒸発して、残った黄色オイル１．４２ｇを、生成物アルケン１ａを溶離するため、先ずヘキサンで、次いで２０％酢酸エチル／ヘキサンで溶離しながら、シリカゲル上カラムクロマトグラフィで精製した。シリカ上で５％酢酸エチル／ヘキサンで溶離しながら用意したＴＬＣで更に精製した。¹HMR(CDCl₃)δ 7.3-6.7(m,4H ),3.36(s,3H),1.80(m,1H),1.13(m,1H),0.988(s,9H),0.78-0.67(m,4H),0.43-0.37 (m,2H),0.19(s,6H),0.11-0.05(m,2H)．実施例８．１−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−２，２−ジシクロヘキシル−１−メトキシエテン（１ｈ）の合成．乾燥したＴＨＦ中メチル３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシベンゾエート４．３ｇと、ジシクロヘキシルケトン９．５ｇとの混合物を、乾燥したＴＨＦ１５０ｍＬ中ＴｉＣｌ₃ ２５ｇ、ＬｉＡｌＨ₄ ３．０ｇ及びトリエチルアミン１６．４ｇで作ったチタン試薬を用い、実施例５の操作に従って結合させた。ヘキサン抽出後得た粗製生成混合物（１０ｇ）を、先ずヘキサンで次いで１％の酢酸エチル／ヘキサンで溶離しながらシリカゲル上でカラムクロマトグラフィで精製した。アルケン１ｅの収量は３．５ｇ（収率５１％）であった。¹H NMR (CDCl₃)δ 7.22-7.16(m,1H),6.85-6.72(m,3H),3.155(s,3H),2.05-0.86(m,22H),0 .995(s,9H),0.21(s,6H)．実施例９．２，２−ジシクロヘキシル−１−（３−ヒドロキシフェニル）−１− メトキシエテン（１ｉ）の合成．アルケン１ｆ０．７ｇの乾燥ＴＨＦ溶液に、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオライド０．６２ｇ（１．２ｅｑ．）を滴下した。１時間攪拌の後、ＴＬＣ（シリカで２０％酢酸エチル／ヘキサン使用）により出発物質が完全に新化合物に転化したことが示された。ＴＨＦを蒸発し、残渣を酢酸エチルに溶解した。酢酸エチル溶液を水で抽出し、ＭｇＳＯ₄で乾燥した。該物質をヘキサン中０〜１０％の酢酸エチルで溶離しながらシリカゲル上でカラムクロマトグラフィで精製し、１ｆ、０．４６ｇ（収率９２％）を得た。アルケンをベンゼン／ヘキサン（１：６）中で４℃にて結晶化により、更に精製した。¹H NMR(CDCl₃)δ 7.20 -6.72(m,4H),4.72(s,1H),3.174(s,3H),2.06-1.04(m,22H);¹³C NMR(CDCl₃)δ 155 .19，138,20，131.97，129.05，122.50，116.36，114.39，56.48，41.51，39.34 ，31.40，30.92，27.50，26.37，26.25，25.99;Mass spectrum(m z):314,231,12 1;exact mass,calc'd.314.2246,found314.2246．実施例１０．１，２−ジオキセタンの合成．光酸素添加工程。方法Ａ。標準的には、アルケンのサンプル１００ｍｇを、光酸素添加チューブ中でメタノールとメチレンクロリドとの１：１混合物２０ｍＬに、溶解した。ポリスチレンに結合したローズベンガル(Rose Bengal)約２００ｍｇを加え、酸素バブラーに接続した。ドライアイス／２−プロパノール又は氷水を含有する、半銀メッキしたデュアーびんに浸漬しながら、該装置を通してゆっくりと酸素を通気した。連続的に酸素をバブルしながら、紫外線防止フィルターとして５ミル(mil)のカプトン(Kapton)(DuPont,Wilmington,DE)のフィルムを通して、サンプルに４００Ｗのナトリウムランプ(GE Lucalox)を照射した。反応の進行をＴＬＣ又は¹H NMRでモニターした。ポリマーと結合した増感剤を濾別し、溶剤を室温で蒸発することにより、ジオキセタン化合物を単離した。更なる精製は、シリカゲル上カラムクロマトグラフィか又は必要ならば適当な溶剤からの結晶化によって行うことができた。方法Ｂ。上記と異なり、多くの場合、光増感剤として、メチレンブルーを使用した。約１００ｍｇを反応溶剤１０ｍＬ中に溶解し、上記の如く照射を行った。この方法で調製したジオキセタンを、シリカゲル上でカラムクロマトグラフィによって精製した。実施例11.４−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−3,3−ジイソプロピル−４−メトキシ−1,2−ジオキセタン（2a）の合成．アルケンのサンプル102.8ｍｇを、−78℃で方法Ｂにより合計９時間光酸素添加した。溶剤を蒸発し、プレートを溶離するのに４％酢酸エチル／ヘキサンを用いて、分散ＴＬＣにより混合物を精製した。ジオキセタン2aの収量は55.9ｍｇ（収率50％）であった。¹H NMR(CDCl₃)δ 7.6-6.7(m,4H),3.14(s,3H),2.61(sept ,1H),2.46(sept,1H),1.30(d,1H),1.18(d,1H),1.00(s,3H),0.92(d,1H),0.46(d,1H ),0.20(s,3H);¹³C NMR(CDCl₃)δ 155.88，137.07，129.41，114.526，98.57，49 .46，33.51，29.24，25.79，19.43，18.51，17.29，16.69，-4.32．実施例１２．３，３−ジイソプロピル−４−（３−ヒドロキシフェニル）−４ −メトキシ−1,2−ジオキセタン（2b）の合成．アルケン1b（83.2ｍｇ）を、−78℃で方法Ｂにより合計３時間光酸素添加した。溶剤を蒸発し、残渣を酢酸エチルに溶解し、プレートを溶離するのに20％酢酸エチル／ヘキサンを用いて、分散ＴＬＣにより混合物を精製した。ジオキセタン2bの収量は79ｍｇ（収率84％）であった。¹H NMR(CDCl₃)δ 7.4-6.8(m,4H),3. 2(s,3H),2.62(sept,1H),2.48(sept,1H),2.08(s,1H),1.30(d,3H),1.17(d,3H),0.9 0(d,3H),0.47(d,3H);¹³C NMR(CDCl₃)δ 156.00，137.21，129.70，116.41，114. 61，98.97，49.58，33.55，29.35，19.46，18.56，17.31，16.65．実施例１３．４−（３−アセトキシフェニル）−3,3−ジイソプロピル−４− メトキシ−1,2−ジオキセタン（2c）の合成．アルケンのサンプル6３ｍｇを、−78℃で方法Ｂにより合計6.5時間光酸素添加した。溶剤を蒸発し、残渣を酢酸エチルに溶解し、プレートを溶離するのに20 ％酢酸エチル／ヘキサンを用いて、分散ＴＬＣにより混合物を精製した。ジオキセタン2cの収量は56ｍｇ（収率80％）であった。¹H NMR(CDCl₃)δ 7.37-6.99(m, 4H),3.14(s,3H),2.59-2.42(m,2H),2.32(s,3H),1.30(d,3H,J=7.2 Hz),1.17(d,3H, J=7.2 Hz),0.91(d,3H,J=7.2 Hz),0.46(d,3H,J=7.2 Hz);¹³C NMR(CDCl₃)δ150.89 ，137.34，129.39，122.73，114.07，98.34，49.60，33.54，29.31，21.22，19. 44，18.53，17.17，16.59．実施例１４．４−（３−ベンゾイルオキシフェニル）−3,3−ジイソプロピル −４−メトキシ−1,2−ジオキセタン（2d）の合成．アルケンのサンプル3.7ｇを、アセトンとＣＨ₂Ｃl₂との１:１混合物500ｍＬと、メチレンブルー100ｍｇとを用いて、−78℃で方法Ｂにより合計19時間光酸素添加した。反応の進行を¹H NMRでモニターした。溶剤を蒸発し、残渣を酢酸エチルに溶解し、溶離剤としてヘキサンを用い、カラムクロマトグラフィにより混合物を精製した。¹H NMR(CDCl₃)δ8.22-7.0(m,9H),3.184(s,3H),2.62-2.46(m,2H ),1.30(d,3H,J=7.2 Hz),1.20(d,3H,J=7.2 Hz),0.94(d,3H,J=7.2 Hz),0.52(d,3H, J=7.2 Hz);¹³C NMR(CDCl₃)δ151.09，137.32,133.72，130.18，129.33，128.61 ，122.66，98.24，49.48，33.44，29.22，19.32，18.42，17.11，16.48．実施例１５．４−（３−ピバロイルオキシフェニル）−3,3−ジイソプロピル −４−メトキシ−1,2−ジオキセタン（2e）の合成．アルケンのサンプル1.95ｇを、アセトンとＣＨ₂Ｃｌ₂との１:１混合物300ｍＬを用いて、４℃で方法Ｂにより合計2.5時間光酸素添加した。反応の進行を¹H NMRでモニターした。溶剤を蒸発し、残渣を酢酸エチルに溶解し、溶離剤としてヘキサンを用い、カラムクロマトグラフィにより混合物を精製した。¹H NMR(CDC l₃)δ 7.43-7.07(m,4H),3.14(s,3H),2.59-2.42(m,2H),1.37(s,9H),1.31(d,3H,J= 6.9 Hz),1.17(d,3H,J=6.9 Hz),0.92(d,3H,J=6.9 Hz),0.47(d,3H,J=6.9 Hz)．実施例１６．４−（３−ホスホリルオキシフェニル）−３，３−ジイソプロピル−４−メトキシ−１，２−ジオキセタン，ジナトリウム塩（２ｆ）の合成．アルケンのサンプル６４ｍｇを、方法Ｂに従い、０℃でＤ₂Ｏの３ｍＬ中にて合計１．５時間光酸素添加した。結晶化を誘導するため、溶液を４℃にて貯蔵した。白色結晶を濾過し、アセトンで洗浄し、乾燥した。¹H NMR(D₂O)δ 7.43-7 .14(m,4H),3.132(s,3H),2.63-2.53(m,2H),1.225(d,3H,J=7.5 Hz),1.123(d,3H,J= 7.5 Hz),0.892(d,3H,J=6.6 Hz),0.475(d,3H,J=6.6 Hz);³¹P NMR(D₂O)(rel.To ex t.H₃PO₄)δ 0.248．Ｄ₂Ｏ／ｐ−ジオキサン、メタノール、メタノール／ＣＨ₂Ｃｌ₂を含め、用いられる全ての他の溶剤系は数時間の反応時間を要し、かなりの量の分解生成物を生じることは、注目すべきことである。実施例１７．４−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−３，３− ジシクロプロピル−４−メトキシ−１，２−ジオキセタン（２ｇ）の合成．アルケンのサンプル２５ｍｇを、−７８℃で方法Ａにより、合計１時間光酸素添加した。¹H NMRは、溶液がジオキセタン対アルケン３：１の混合物と、エステル分解生成物少量を含有することを示した。照射をこの時点で止め、増感剤を濾別した。溶剤を蒸発し、混合物をキシレン溶液として速度論的測定に用いた。¹ H NMR(CDCl₃)ジオキセタンによるピーク：δ 7.6-6.7(m,4H),3.14(s,3H),1.80( m,1H),1.2-1.0(m,9H),0.991(s,9H),0.221(s,6H)．実施例１８．４−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−3,3− ジシクロヘキシル−４−メトキシ−1,2−ジオキセタン（2h）の合成．アルケン1fのサンプル2.0ｇを、−78℃で方法Ｂにより合計8.5時間光酸素添加した。溶剤を蒸発し、残渣をヘキサンに溶解し濾過した。有機溶液を蒸発し、固体残渣をカラムクロマトグラフィにより精製した。生成物の収量は2.0ｇ（収率93％）であった。¹H NMR(CDCl₃)δ 7.26-6.85(m,4H),3.143(s,3H),2.3-0.5(m, 22H),0.995(s,9H),0.205(s,6H);¹³C NMR(CDCl₃)δ155.57，136.82，129.10，122 -121(several unresolved)，114.56，104.39，97.31，49.49，45.18，41.79，28 .71，28.07，27.80，27.17，26.95，26.83，26.74，26.30，25.68，18.24，-4.3 8．実施例19．3,3−ジシクロヘキシル−４−（３−ヒドロキシフェニル）−４− メトキシ−1,2−ジオキセタン（2i）の合成．アルケン1ｇのサンプル150ｍｇを、−78℃で方法Ｂにより合計1.5時間光酸素添加した。溶剤を蒸発し、残渣をヘキサンに溶解し、濾過した。沈澱を20％酢酸エチル／ヘキサン10ｍＬで洗浄し、有機溶液を蒸発した。プレートを溶離するのに20％酢酸エチル／ヘキサンを用いて、分散ＴＬＣにより固体残渣を精製した。生成物の収量は120ｍｇ（収率72％）であった。¹H NMR(CDCl₃)δ 7.34-6.93(m ,4H),5.30(s,1H),3.163(s,3H),2.23-0.56(m,22H);¹³C NMR(CDCl₃)δ155.55，137 . 02，129.42，116.23，116.12，114.62，104.36，97.88，49.60，45.28，41.78， 28.70，28.09，27.75，27.14，26.90，26.86，26.72，26.37．実施例２０．１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ− ｎ−ブチルホスホニウムメチル）ベンゼンジクロリドの合成．エンハンサーＡ．（ａ）トルエン（５０ｍＬ）中、トリ−ｎ−ブチルホスフィン（７ｇ，３４．６ｍｍｏｌ）の混合物を、アルゴン気流下トルエン（２００ｍＬ）中、α，α ’−ジクロロ−ｐ−キシレン（１２．１ｇ，６９．２ｍｍｏｌ，２ｅｑ．）の混合物に滴下した。反応混合物をアルゴン気流下室温で１２時間攪拌した後、４− （クロロメチル）ベンジル−トリ−ｎ−ブチルホスホニウムクロリドが溶液から晶出した。結晶を濾過し、トルエンとヘキサンで洗浄し風乾した。¹H NMR(CDCl₃ )δ 0.92(t,9H),1.44(m,12H),2.39(m,6H),4.35-4.40(d,2H),4.56(s,2H),7.36-7. 39(d,2H),7.47-7.51(dd,2H)．（ｂ）室温でＤＭＦ中、４−（クロロメチル）ベンジル−トリ−ｎ−ブチル −ホスホニウムクロリド（３ｇ，７．９ｍｍｏｌ）の混合物に、アルゴン気流下でトリ−ｎ−オクチルホスフィン（４．３９ｇ，１２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を数日間攪拌しておき、その後ＴＬＣ測定で、反応が完結していることが判った。ＤＭＦを減圧下に除去し、残渣をヘキサンとトルエンとで数回洗浄し、次いで乾燥して、１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ −ｎ−ブチルホスホニウムメチル）ベンゼンジクロリドを白色結晶として得た。¹H NMR(CDCl₃)δ 0.84(t,9H),0.89(t,9H),1.22(br s,24H),1.41(m,24H),2.34( m,12H),4.35-4.40(d,4H),7.58(s,4H);¹³C NMR(CDCl₃)δ 13.34，13.94，18.33， 18.62，18.92，19.21，21.76，21.81，23.58，23.64，23.78，23.98，26.10，26 .65，28.86，30.68，30.88，31.53，129.22，131.22;³¹P NMR(D₂O)δ 31.10，31 .94．実施例２１．化学発光速度(Kinetics)の測定．化学発光の強さと速度(rate)の測定は、ターナーデザインズ(Turner Desi gns)(Sunyvale,CA)型ＴＤ−２０ｅルミノメーターか、又は光子計数の光電子増倍管を用いた屋内固定式のルミノメーター(Black Box)を使用して行った。ルミノメーターで分析したサンプルの温度調節は、装置に接続した循環浴によって行った。ターナールミノメーターでの光強度の定量的測定は、濃度フィルターによって検出器の１０⁴の直線領域を超えて拡張された。データの収集はルミソフト・データリダクションプログラム(LUMISOFT data reduction program)(Lumige n,Inc.,Southfield,MI)を用いて、アップルマッキントッシュＳＥ／３０コンピューターでコントロールした。ジオキセタン２ｃ、ｈ及びｉの熱分解活性化エネルギーを、幾通りかの温度でキシレンの希釈溶液の化学発光の減衰についての１次速度定数ｋを測定することにより決定した。実施例２２．化学発光及び蛍光発光のスペクトル．化学発光及び蛍光発光のスペクトルを、１ｃｍの石英製キュベットでフルオロログ(Fluorolog)II蛍光計(Spex Ind.,Edison,NJ)を用いて測定した。全測定は周囲温度で行った。スペクトルは、光強度が恒常的水準に達した時にスキャンするか、又はスキャンの間光強度の減衰に対して補正をした。第１図は、１：１のメタノール／ＤＭＳＯ中のＫＯＨの溶液少量の添加によってトリガーされた、ＤＭＳＯ中のジオキセタン２ｃの分解からの典型的な化学発光スペクトルを示している。発光は、メチル３−ヒドロキシベンゾエートの陰イオンの励起状態から生じている。ＤＭＳＯ中の本発明の各ジオキセタンの、トリガーされた分解がこの励起状態を発生させる。実施例２３．ジオキセタン２ｃ、ｇ、ｉの化学発光的分解の化学的トリガー．ジオキセタン２ｃ、２ｅ、２ｇと、比較例として４−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−４−メトキシ−スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン］（２ｊ）、（調製は米国特許第４，９６２，１９２号明細書に記載）とを、ＤＭＳＯ中１０^-6Ｍの濃度にした。必要に応じて、ＤＭＳＯでの一連の希釈を行った。１０μＬのアリコートを、ターナーデザインズのＴＤ−２０ｅルミノメーターの中の７×５０ｍｍのポリプロピレン・チューブで、適当な溶剤、代表的にはＤＭＳＯ中で、テトラ−ｎ −ブチルアンモニウム・フルオライド（ＴＢＡＦ）のＤＭＳＯ溶液（１Ｍ〜１０^-4 Ｍ）５０μＬの注入によってトリガーした。全ての実験は周囲温度で行った。ピークの光強度と減衰率はフルオライド濃度が減少するに従って減少した。フルオライドの最小濃度では、減衰速度は明確な一次ではなかった。ＤＭＳＯ又はＤＭＦ中のジオキセタン２ａ−ｅ及び２ｇ−ｉから化学発光を生じることが見いだされた他のトリガー試薬には、ヒドラジン、水酸化カリウムとテトラアルキルアンモニウム・ヒドロキサイド、アルカリ金属のアルコキサイトとテトラアルキルアンモニウム・アルコキサイド、及びアジ化ナトリウムがある。少量の（＜５％）プロトン共通溶媒、例えばメタノール、エタノール又は水をＤＭＳＯ中のトリガー試薬を溶解するのに用いることができる。化学発光の持続時間と強度は、溶剤の選択、トリガー試薬及びジオキセタンとトリガー試薬との比によって変えることができる。本発明を実施するために適する溶媒には、反応物が溶解する任意非プロトン溶媒があり、特に極性溶媒、例えばＤＭＳＯ、ジメチルフォルムアミド、アセトニトリル、ｐ−ジオキサン等が好ましい。反応は、反応物の１つだけが溶解し、他は媒体中に未溶解で供給されるような、例えば炭化水素溶媒中で処理することもできる。この場合には、発光は未溶解の反応物の表面から起こる。実施例２４．ジオキセタン２ｃ、ｈ、ｉのトリガーされた分解の速度．第２図は、ＤＭＳＯ中１ＭのＴＢＡＦ・５０μＬで、ジオキセタン２ｈの１０^-6Ｍ溶液の１０μＬアリコートをトリガーする際の、代表的な化学発光強度の特性を示す。ジオキセタン溶液の、１０倍希釈系によるトリガーによって、１０^-9 Ｍ溶液が、バックグランドの１．５倍のシグナルを示すことが判った。化学発光の減衰曲線は全て、擬似１次の反応速度を示した。減衰に関する半減期は、ジオキセタンの濃度と本質的に無関係である。ジオキセタン２ｃ、ｈ、ｉ及びｊの、フルオライドでトリガーした分解の速度を、ＤＭＳＯ中で同一条件の下、即ちＤＭＳＯ中１ＭのＴＢＡＦ５０μＬとともにジオキセタン１０^-6Ｍ溶液の１０μＬアリコートで、比較をした。この条件では、４種のジオキセタンは全て本質的に同一の速度で反応することが判った。実施例２５．相対的化学発光の量子収率の測定．ジオキセタン２ｃ、ｇ、ｈ及びｉの、フルオライドでのトリガーによって発生した全化学発光強度を、ＤＭＳＯ中で同一条件の下、即ちＤＭＳＯ中１ＭのＴＢＡＦ５０μＬでのジオキセタン１０^-6Ｍ溶液の１０μＬアリコートについての条件の下で、比較をした。正確な値を再現するのは、困難であった。しかし、全ての４種のジオキセタンはこれらの条件の下で、２つのファクターの範囲内で同じ化学発光の出力を出すことが見いだされた。ジオキセタン２ｈに対して化学発光効率２５％という報告(A.P.Schaap,T.-S.Chen,R.S.Handley,R.DeSilva and B. P.Giri,Tetrahedron Lett.,1155(1987))に基づき、本発明のジオキセタンは、ＤＭＳＯ中でのトリガーに際して、高効率で化学発光を生じることが見いだされた。実施例２６．ジオキセタン２ｆ、又は２ｋを含有する溶液の化学発光強度−反応速度特性の比較．本発明のホスフェート・ジオキセタン２ｆの予期せぬ利点を示す為に、市場で購入し得るジオキセタン、４−メトキシ−４−（３−ホスホリルオキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１^3, ⁷ ］デカン］，ジナトリウム塩，(LUMIGENPPD,Lumigen,Inc.,Southfield,MI)、ジオキセタン２ｋに対して、アルカリ緩衝溶液中でアルカリホスファターゼ（ＡＰ）によって誘発される、ジオキセタン２ｆからの化学発光の経時的過程につき比較した。第３図は、１つは本発明のジオキセタン２ｄを０．３３ｍＭ含有し、他は同じ緩衝液にジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭ含有する、２種の組成物からの、３７℃における経時特性と相対的化学発光強度とを示す。ジオキセタン溶液１００μＬに対して１．１２×１０^-17モルのＡＰの添加によって、発光を起こさせた。本発明のジオキセタン２ｆを含有する試薬は、有意に高い最高強度に到達した。実施例２７．ジオキセタン２ｆ、又は２ｋを含有する溶液の化学発光強度−反応速度特性の比較．第４図は、一つは本発明のジオキセタン２ｆを０．３３ｍＭと１−（トリ−ｎ −オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）ベンゼンジクロリド（エンハンサーＡ）１．０ｍｇ／ｍＬとを含有し、他はジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭと同じエンハンサー１．０ｍｇ／ｍＬとを含有する、２種の組成物からの、３７℃における経時特性と相対的化学発光強度とを示す。ジオキセタン溶液１００μＬに対して１．１２×１０^-17モルのＡＰの添加によって、発光を起こさせた。本発明のジオキセタン２ｆを含有する試薬は、全ての時点でより高い光強度を達成した。実施例２８．ジオキセタン２ｆ、又は２ｋを含有する溶液の化学発光強度−反応速度特性の比較．第５図は、一つは本発明のジオキセタン２ｆを０．３３ｍＭとポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリド（エンハンサーＢ）０．５ｍｇ／ｍＬとを含有し、他はジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭと同じエンハンサー１．０ｍｇ／ｍＬとを含有する、２種の組成物からの、３７℃における経時特性と相対的化学発光強度とを示す。ジオキセタン溶液１００μＬに対して１．１２×１０^-17 モルのＡＰの添加によって、発光を起こさせた。本発明のジオキセタン２ｆを含有する試薬は、全ての時点でより高い光強度を達成した。実施例２９．ジオキセタン２ｆ、又は２ｋを含有する溶液の化学発光強度−反応速度特性の比較．第６図は、一つは本発明のジオキセタン２ｆを０．３３ｍＭと、ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリドとポリビニルベンジルトリオクチルホスホニウムクロリドとのコポリマー（トリブチル基：トリオクチル基は３：１の比で含有）（エンハンサーＣ）０．５ｍｇ／ｍＬとを含有し、他はジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭと同じエンハンサー０．５ｍｇ／ｍＬとを含有する、２種の組成物からの、３７℃における経時特性と相対的化学発光強度とを示す。ジオキセタン溶液の１００μＬに対して１．１２×１０^-17モルのＡＰの添加によって、発光を起こさせた。本発明のジオキセタン２ｆを含有する試薬は、全ての時点でより高い光強度を達成した。実施例３０．ジオキセタン２ｆでのアルカリホスファターゼ検出の直線性と感度．ジオキセタン２ｆを含有する、本発明の試薬組成物を用いたＡＰ検出の直線性を測定した。９６ウエルのミクロプレートにおける４８ウエルの夫々に、０．８８ｍＭのＭｇ⁺²と１．０ｍｇ／ｍＬのエンハンサーＡとを含有する、０．２Ｍの２−メチル−２−アミノ−１−プロパノールのｐＨ９．６の緩衝液中に０．３３ｍＭの２ｆを溶解する溶液１００μＬを添加した。プレートを３７℃でインキュベートし、化学発光を、３．３６×１０^-16モル〜３．３６×１０^-22モルの酵素を含有するＡＰ溶液３μＬを添加することによって引き起こした。光強度を１０分で測定した。第７図は、アルカリホスファターゼの直線的な検出を示すものである。用語のＳ−Ｂは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の存在下でのＲＬＵにおける化学発光シグナル（Ｓ）を、ＡＰ不存在下でのバックグランドの化学発光（Ｂ）に対して補正したものである。計算した検出限界（バックグランドの標準偏差の２倍）は、この条件ではＡＰ２．０×１０^-22モル、即ち１２０分子であった。実施例３１．化学発光の量子収量の比較０．８８ｍＭのＭｇ⁺²と表４に記載した如き、選ばれたエンハンサーとを含有する、０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールのｐＨ９．６の緩衝液中に、１ｍｇ／ｍＬのエンハンサーＣを含有する溶液において、ジオキセタン２ｆと２ｋとの相対的な化学発光の量子収量を測定した。各試薬の１００μＬアリコートを、アルカリホスファターゼ３．３６×１０^-13モルの添加によって完全に脱りん酸化した。相対光度単位（ＲＬＵ）で、発する光の合計量を発光が終わるまで積算した。更に、０．８８ｍＭのＭｇ⁺²を含有する０．２Ｍ又は０．７５Ｍいずれかの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールのｐＨ９．６緩衝液を使用し、如何なるエンハンサーをも用いない処方５００μＬで、同じ比較を行った。ジオキセタン２ｆは、緩衝液だけでも、またエンハンサーＡ及びＣの存在下でもジオキセタン２ｋより多量の発光を生じた。実施例３２．水溶液中のジオキセタン２ｆの安定性．０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールのｐＨ９．６の緩衝液中１ｍｇ／ｍＬのエンハンサーＡと０．８８ｍＭＭｇ⁺²とを含有するジオキセタン２ｆの０．３３ｍＭ溶液の、熱的及び加水分解的安定性を３７℃で測定した。このジオキセタン溶液を５日間、室温及び３７℃に保持した。９６ウエルのミクロプレート中１２ウエル各々に、各溶液１００μＬを加えた。プレートを３７ ℃でインキュベートし、１．１×１０^-15モルのＡＰを含有する溶液１０μＬを加えることによって、化学発光を開始させた。光強度を２．５時間積算した。ジオキセタンの安定性を、３７℃でインキュベートしたサンプルの平均の光の収量を室温に保持した溶液と比較することによって、評価した。発光量の減少は、インキュベーションの間のジオキセタンの分解を示す。３７℃に保持した溶液は、室温の溶液と同一であって、この条件ではジオキセタンは安定であることを示した。実施例３３．膜でのアルカリホスファターゼの化学発光検出．ブロッテイング膜表面での酵素の化学発光検出に、本発明の組成物が有用であることを、次の実施例に示す。１．１ｆｍｏｌから１．１ａｍｏｌまでを含有する、アルカリホスファターゼの水溶液を同一のナイロン膜(Micron Separations Inc.,Westboro,MA)に適用した。膜を５分間風乾し、０．８８ｍＭのＭｇＣｌと０．３３ｍＭのジオキセタン２ｆか又は０．３３ｍＭのジオキセタン２ｋかのいずれかとを含有する、０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールのｐＨ９．６の緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬのエンハンサーＡを含有する試薬に、短時間浸漬した。この膜を透明シートの間に置き、Ｘ線フィルム(Kodak X-OMAT AR,R ochester,NY)に暴露した。第８図は、両ジオキセタンを用いた発光により、同等の画像と検出感度が得られることを示している。これらの結果は、ジオキセタン２ｆの性能がウエスタンブロッテイング、サザンブロッテイング、ＤＮＡフィンガープリント法や他のブロッテイング用途に期待されることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｆ 7/18 Ｃ０７Ｆ 7/18 9/655 9/655 Ｃ０９Ｋ 11/07 Ｃ０９Ｋ 11/07 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】１．化学式、（式中、Ｒ₁は１〜１２の炭素原子を有するアルキル基で、更に置換基を有していてもよい基であり、Ｒ₂はアリール基、ビアリール基、ヘテロアリール基、縮合環の多環アリール基及びヘテロアリール基から選択される基で、更に置換基を有してもよい基であり、Ｒ₃とＲ₄はそれぞれ、３〜１２の炭素原子を有する分枝状アルキル基及びシクロアルキル基から選択される基で、更に置換基を有してもよい基であり、Ｘは化学的に不安定な基であって、化学薬剤および酵素から成る群から選択される試薬によって除去されると、分解し発光して化学式、で表される２個のカルボニル化合物を生成する不安定な酸化物中間体１，２−ジオキセタン化合物を生じ得る基である）で表される安定な１，２−ジオキセタン。２．ＯＸが、ＯＨ基、ＯＯＣＲ₆基（ここでＲ₆は２〜２０の炭素原子を有するアルキル基及びアリール基から選択される基である）、トリアルキルシリルオキシ基、トリアリールシリルオキシ基、アリールジアルキルシリルオキシ基、ＯＰＯＣｌ₂基、ＯＰＯ（ＯＲ₇）₂基（ここでＲ₇は有機的基である）、ＯＰＯ₃ ^2-塩、 β−Ｄ−ガラクトシドオキシ基及びβ−Ｄ−グルクロニヂルオキシ基から成る群から選択される基である請求の範囲第１項記載のジオキセタン。３．Ｒ₃とＲ₄がそれぞれ、３〜８の炭素原子を有する分枝状アルキル基及びシクロアルキル基とから選択される基である請求の範囲第１項記載のジオキセタン。４．Ｒ₂が、ジオキセタン環に対しメタ位をＯＸ基によって置換され、フェニル基に更に置換基を有してもよいメタ−フェニル基である請求の範囲第１項記載のジオキセタン。５．Ｒ₃とＲ₄とが各々イソプロピル基である請求の範囲第３項記載のジオキセタン。６．Ｒ₃とＲ₄とが各々シクロヘキシル基である請求の範囲第３項記載のジオキセタン。７．Ｒ₃とＲ₄とが各々シクロプロピル基である請求の範囲第３項記載のジオキセタン。８．化学式、で表される請求の範囲第２項記載のジオキセタン。９．化学式、で表される請求の範囲第２項記載のジオキセタン。１０．化学式、で表される請求の範囲第２項記載のジオキセタン。１１．化学式、で表されるジオキセタン化合物。１２．化学式、で表されるジオキセタン化合物。１３．化学式、で表されるジオキセタン化合物。１４．化学式、で表されるジオキセタン化合物。１５．化学式、で表されるジオキセタン化合物。１６．化学式、で表されるジオキセタン化合物。１７．化学式、で表されるジオキセタン化合物。１８．化学式、で表されるジオキセタン化合物。１９．化学式、で表されるジオキセタン化合物。２０．化学式、で表されるジオキセタン化合物。２１．安定なジオキセタンからの発光方法において、（ａ）化学式、（式中、Ｒ₁は１〜１２の炭素原子を有するアルキル基で、更に置換基を有していてもよい基であり、Ｒ₂はアリール基、ビアリール基、ヘテロアリール基、縮合環の多環アリール基及びヘテロアリール基から選択される基で、更に置換基を有してもよい基であり、Ｒ₃とＲ₄はそれぞれ、３〜１２の炭素原子を有する分枝状アルキル基及びシクロアルキル基から選択される基で、更に置換基を有してもよい基であり、Ｘは化学的に不安定な基であって、化学薬剤および酵素から成る群から選択される試薬によって除去され得る基である）で表される安定な１，２−ジオキセタンを、光を生じる場(setting)に提供することと、（ｂ）発光させるために、試薬でＸ基を除去することによって、安定な１，２− ジオキセタンをトリガーすることと、を含むことを特徴とする発光方法。２２．発光を、アッセイ法において物質の有無または量を測定するために利用する請求の範囲第２１項記載の方法。２３．アッセイ法において測定する物質が、酵素、酵素と結合したハプテン、酵素と結合した抗原、酵素と結合した抗体及び酵素と結合したオリゴヌクレオチッドからなる群から選択される請求の範囲第２２項記載の方法。２４．溶液中で又は固体の支持体の上で発光が行われる請求の範囲第２１項記載の方法。２５．ＯＸが、ＯＨ基、ＯＯＣＲ₆基（ここでＲ₆は２〜２０の炭素原子を有するアルキル基及びアリール基から選択される基である）、トリアルキルシリルオキシ基、トリアリールシリルオキシ基、アリールシアルキルシリルオキシ基、ＯＰＯＣｌ₂基、ＯＰＯ（ＯＲ₇）₂基（ここでＲ₇は有機的基である）、ＯＰＯ₃ ^2-塩、β−Ｄ−ガラクトシドオキシ基及びβ−Ｄ−グルクロニヂルオキシ基から成る群から選択される基である請求の範囲第２１項記載の方法。２６．Ｒ₃とＲ₄がそれぞれ、３〜８の炭素原子を有する分枝状アルキル基及びチクロアルキル基とから選択される基である請求の範囲第２１項記載の方法。２７．Ｒ₂が、ジオキセタン環に対しメタ位をＯＸ基によって置換され、フェニル基に更に置換基を有してもよいメタ−フェニル基である請求の範囲第２１項記載の方法。２８．Ｒ₃とＲ₄とが各々イソプロピル基である請求の範囲第２６項記載の方法。２９．Ｒ₃とＲ₄とが各々シクロヘキシル基である請求の範囲第２６項記載の方法。３０．Ｒ₃とＲ₄とが各々シクロプロピル基である請求の範囲第２６項記載の方法。３１．ジオキセタンが、化学式、で表される請求の範囲第２５項記載の方法。３２．ジオキセタンが、化学式、で表される請求の範囲第２５項記載の方法。３３．ジオキセタンが、化学式、で表される請求の範囲第２５項記載の方法。３４．Ｘ基を除去する試薬が酵素である請求の範囲第２１項記載の方法。３５．酵素がアルカリフォスファターゼであり、Ｘ基がＰＯ₃ ^2-基である請求の範囲第３４項記載の方法。３６．ジオキセタンが、化学式、で表される請求の範囲第３５項記載の方法。３７．水溶液中に、（ａ）化学式、（式中、Ｒ₁は１〜１２の炭素原子を有するアルキル基で、更に置換基を有していてもよい基であり、Ｒ₂はアリール基、ビアリール基、ヘテロアリール基、縮合環の多環アリール基及びヘテロアリール基から選択される基で、置換又は無置換の基であり、Ｒ₃とＲ₄はそれぞれ、３〜１２の炭素原子を有する分枝状アルキル基及びシクロアルキル基から選択される基で、更に置換基を有してもよい基であり、Ｘは化学的に不安定な基であって、化学薬剤および酵素から成る群から選択される試薬によって除去され得る基である）で表される安定な１，２ジオキセタンと、（ｂ）ジオキセタンと試薬とを反応させることにより生ずる光量をエンハンサー不存在のときに比して増加するエンハンサー物質と、を含有する発光組成物。３８．ＯＸが、ＯＨ基、ＯＯＣＲ₆基（ここでＲ₆は２〜２０の炭素原子を有するアルキル基及びアリール基から選択される基である）、トリアルキルシリルオキシ基、トリアリールシリルオキシ基、アリールジアルキルシリルオキシ基、ＯＰＯ（ＯＲ₇）₂基（ここでＲ₇は有機的基である）、ＯＰＯ₃ ^2-塩、β−Ｄ−ガラクトシドオキシ基及びβ−Ｄ−グルクロニヂルオキシ基から成る群から選択される基である請求の範囲第３７項記載の組成物。３９．Ｒ₃とＲ₄がそれぞれ、３〜８の炭素原子を有する分枝状アルキル基及びシクロアルキル基とから選択される基である請求の範囲第３７項記載の組成物。４０．Ｒ₂が、ジオキセタン環に対しメタ位をＯＸ基によって置換され、フェニル基に更に置換基を有してもよいメタ−フェニル基である請求の範囲第３７項記載の組成物。４１．Ｒ₃とＲ₄とがイソプロピル基である請求の範囲第３７項記載の組成物。４２．Ｒ₃とＲ₄とがシクロヘキシル基である請求の範囲第３７項記載の組成物。４３．ジオキセタンが、化学式、で表される請求の範囲第４１項記載の組成物。４４．エンハンサーが、高分子４級アンモニウム塩界面活性剤、ポリビニルベンジルトリアルキルフォスフォニウム基含有高分子物及び化学式、Ｙ^- Ｒ₃Ａ⁺ＣＨ₂−Ｌｉｎｋ−ＣＨ₂Ａ⁺Ｒ₃ Ｙ^- （式中、Ａは各々Ｐ原子及びＮ原子から選択される原子であり、Ｌｉｎｋは、置換及び無置換のアリール基、アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基から成る群から選択される少なくとも２個の炭素原子を有する有機結合基であり、又Ｌｉｎｋはヘテロ原子を有していてもよく、Ｒは１〜２０の炭素原子を有する低級なアルキル基及びアラルキル基から選択される基であり、Ｙは陰イオンである）で表されるジカチオン界面活性剤から成る群から選択される請求の範囲第３７項、第３８項、第３９項、第４０項、第４１項、第４２項又は第４３項のいずれか一項記載の組成物。４５．安定なジオキセタンから発光させる方法において、（ａ）化学式、（式中、Ｒ₁は１〜１２の炭素原子を有するアルキル基で、更に置換基を有していてもよい基であり、Ｒ₂はアリール基、ビアリール基、ヘテロアリール基、縮合環の多環アリール基及びヘテロアリール基から選択される基で、置換又は無置換の基であり、Ｒ₃とＲ₄はそれぞれ、３〜１２の炭素原子を有する分枝状アルキル基及びシクロアルキル基から選択される基で、更に置換基を有してもよい基であり、Ｘは化学的に不安定な基であって、化学薬剤および酵素から成る群から選択される試薬によって除去され得る基である）で表される安定な１，２ジオキセタンと、ジオキセタンと試薬とを反応させることにより生ずる光量をエンハンサー不存在のときに比して増加するエンハンサー物質と、を水溶液中に含有する試薬組成物を、光を生ずる場に提供することと、（ｂ）ジオキセタンとの反応のために、酵素と他の化学薬剤とから成る群から選択される試薬を提供することと、（ｃ）ジオキセタンからＸ基を除去して発光させるために、安定な１，２−ジオキセタンを試薬と反応させることと、を含むことを特徴とする発光方法。４６．エンハンサーが、高分子４級アンモニウム塩界面活性剤、ポリビニルベンジルトリアルキルフォスフォニウム基含有のホモポリマーとコポリマー、及び化学式、Ｙ^- Ｒ₃Ａ⁺ＣＨ₂−Ｌｉｎｋ−ＣＨ₂Ａ⁺Ｒ₃ Ｙ^- （式中、Ａは各々Ｐ原子及びＮ原子から選択される原子であり、Ｌｉｎｋは、置換及び無置換のアリール基、アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基から成る群から選択される少なくとも２個の炭素原子を有する有機結合基であり、又Ｌｉｎｋはヘテロ原子を有していてもよく、Ｒは１〜２０の炭素原子を有する低級なアルキル基及びアラルキル基から選択される基であり、Ｙは陰イオンである）で表されるジカチオン界面活性剤から成る群から選択される請求の範囲第４５項記載の方法。４７．発光が、アッセイ法において物質の有無又は量を測定するのに用いられる請求の範囲第４５項記載の方法。４８．アッセイ法において測定される物質が、酵素、酵素と結合したハプテン、酵素と結合した抗原、酵素と結合した抗体及び酵素と結合したオリゴヌクレオチドから成る群から選択される請求の範囲第４７項記載の方法。４９．発光が、溶液中か又は固体の支持体上で行われる請求の範囲第４５項記載の方法。５０．Ｒ₃とＲ₄はそれぞれ、３〜８の炭素原子を有する分枝鎖アルキル基及びシクロアルキル基とから選択される基であり、Ｒ₂は、ジオキセタン環に対しメタ位をＯＸ基によって置換され、フェニル基に更に置換基を有してもよいメタ−フェニル基であり、ＯＸが、ＯＨ基、ＯＯＣＲ₆基（ここでＲ₆は２〜２０の炭素原子を有するアルキル基及びアリール基から選択される基である）、トリアルキルシリルオキシ基、トリアリールシリルオキシ基、アリールジアルキルシリルオキシ基、ＯＰＯ（ＯＲ₇）₂基（ここでＲ₇は有機的基である）、ＯＰＯ₃ ^2-塩、β− Ｄ−ガラクトシドオキシ基及びβ−Ｄ−グルクロニヂルオキシ基から成る群から選択される基である請求の範囲第４５項記載の方法。５１．化学式、（式中、Ｒ₃とＲ₄はそれぞれ、３〜１２の炭素原子を有する分枝状アルキル基及びシクロアルキル基から選択される基で、更に置換基を有してもよい基であり、Ｒ₅は１〜８の炭素原子を有するアルキル基であり、ＯＸは水酸基、Ｏ^-Ｍ⁺（ここでＭはアルカリ金属イオン、４級アンモニウムイオン及び４級ホスホニウムイオンから選択される）、ＯＯＣＲ₆基（ここでＲ₆は２〜２０の炭素原子を有するアルキル基及びアリール基から選択される基である）、トリアルキルシリルオキシ基、トリアリールシリルオキシ基、アリールジアルキルシリルオキシ基、ＯＰＯＣｌ₂基、ＯＰＯ（ＯＲ₇）₂基（ここでＲ₇は有機基である）、ＯＰＯ₃ ^2-塩、β−Ｄ−ガラクトシドオキシ基及びβ−Ｄ−グルクロニヂルオキシ基から成る群から選択される基である）で表される化合物。５２．Ｒ₃とＲ₄はそれぞれ、３〜８の炭素原子を有する分枝鎖アルキル基及びシクロアルキル基とから選択される基であり、Ｒ₅はメチル基である請求の範囲第５１項記載の化合物。５３．Ｒ₃とＲ₄とが各々イソプロピル基である請求の範囲第５１項記載の化合物。５４．Ｒ₃とＲ₄とが各々シクロヘキシル基である請求の範囲第５１項記載の化合物。５５．Ｒ₃とＲ₄とが各々シクロプロピル基である請求の範囲第５１項記載の化合物。５６．Ｘ基が水素原子である請求の範囲第５３項記載の化合物。５７．Ｘ基がｔ−ブチルジメチルシリル基である請求の範囲第５３項記載の化合物。５８．Ｘ基がアセチル基である請求の範囲第５３項記載の化合物。５９．Ｘ基がベンゾイル基である請求の範囲第５３項記載の化合物。６０．Ｘ基がピバロイル基である請求の範囲第５３項記載の化合物。６１．Ｘ基がＰＯ３Ｎａ２基である請求の範囲第５３項記載の化合物。６２．Ｘ基がアセチル基である請求の範囲第５３項記載の化合物。６３．Ｘ基がｔ−ブチルジメチルシリル基である請求の範囲第５４項記載の化合物。６４．Ｘ基が水素原子である請求の範囲第５４項記載の化合物。６５．Ｘ基がｔ−ブチルジメチルシリル基である請求の範囲第５５項記載の化合物。