DE69528375T2

DE69528375T2 - Chemilumineszente dialkylsubstituierte 1,2-dioxetanverbindungen, synthesemethode und anwendung

Info

Publication number: DE69528375T2
Application number: DE69528375T
Authority: DE
Inventors: Hashem Akhavan-Tafti; Paul Schaap
Original assignee: Lumigen Inc
Current assignee: Lumigen Inc
Priority date: 1994-11-23
Filing date: 1995-11-02
Publication date: 2003-04-30
Anticipated expiration: 2015-11-03
Also published as: EP0794987A4; WO1996016137A1; US5886238A; EP0794987A1; US6284899B1; US5578253A; AU684409B2; ATE224938T1; CA2203160A1; US5892064A; DE69528375D1; JPH10509456A; EP0794987B1; AU4141996A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft chemilumineszierende 1,2-Dioxetan-Verbindungen, die mit Reagenzien, einschließlich Enzymen und anderen Chemikalien, ausgelöst werden können, wodurch Licht erzeugt wird. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung stabile, mit einer Arylgruppe substituierte 1,2-Dioxetane, die eine auslösbare X-Oxygruppe (OX) enthalten, die ein Substituent der Arylgruppe ist, wobei das stabile 1,2-Dioxetan durch das Entfernen von X eine instabile Dioxetanverbindung bildet, die sich zersetzt, wodurch Licht und zwei Carbonylgruppen erzeugt werden.

a. Herstellen von 1,2-Dioxetanen.

Kopecky und Mumford berichteten von der ersten Synthese eines Dioxetans (3,3,4- Trimethyl-1,2-dioxetan durch den von einer Base katalysierten Ringschluß eines β- Bromhydroperoxids, das wiederum aus dem entsprechenden Alken hergestellt wird (K. R. Kopecky und C. Mumford, Can. 3. Chem., 47, 709 (1969)). Obwohl dieses Verfahren dazu diente, um eine Vielzahl von mit Alkyl und Aryl substituierten 1,2-Dioxetanen herzustellen, kann es nicht für die Herstellung von Dioxetanen angewendet werden, die von Vinylethern, Vinylsulfiden und Enaminen abgeleitet sind.
Unabhängig davon wurde von Bartlett und Schaap von einem anderen Syntheseweg für 1,2-Dioxetane, insbesondere jene, die von Vinylethern, Vinylsulfiden und Enaminen abgeleitet sind, berichtet (P. D. Bartlett und A. P. Schaap, J. Am. Chem. Soc., 92, 3223 (1970)) und Mazur und Foote (S. Mazur und C. S. Foote, 3. Am. Chem. Soc., 92, 3225 (1970)). Die photochemische Addition eines Sauerstoffmoleküls an eine geeignete Alkenverbindung in Gegenwart eines Photosensibilisierungsmittels erzeugt 1,2-Dioxetane in einer hohen Ausbeute. Dieses Verfahren diente dazu, eine große Anzahl von Dioxetanverbindungen herzustellen (K. R. Kopecky in Chemical and Biological Generation of Excited States, W. Adam und G. Cilento, (Herausgeber), Academic Press, New York, S. 85, 1982).
Bei diesem Verfahren wurde von zwei Einschränkungen berichtet. Es wurde festgestellt, daß bestimmte Alkene mit aromatischen Substituenten bei der Photooxidation Peroxide mit einem 6-gliedrigen Ring erzeugen, die als Endoperoxide bekannt sind (A. P. Schaap, P. A. Burns und K. A. Zaklika, J. Am. Chem. Soc., 99, 1270 (1977)). Alkene mit reaktiven Allyl-Wasserstoffatomen unterliegen häufig einer anderen Reaktion, der "En"-Reaktion, wodurch anstelle eines Doxetans ein Allylhydroperoxid erzeugt wird (A. Baumstark in Advances In Oxygenated Processes, JAI Press, Greenwich, CT, 1988; Bd. 1, S. 31-84).

b. Thermisch stabile Dioxetane aus sterisch gehinderten Alkenen.

Es wurde nachgewiesen, daß das Dioxetan, das vom gehinderten Alkenadamantylidenadamantan abgeleitet ist, das von Wynberg entdeckt wurde (J. H. Wieringa, J. Strating, H. Wynberg und W. Adam, Tetrahedron Lett., 169 (1972)) eine Aktivierungsenergie für die Zersetzung von 37 kcal/mol und eine Halbwertszeit (t1/2) bei 25ºC von einigen Jahren hat (N. J. Turro, G. Schuster, H. C. Steinmetzer, G. R. Faler und A. P. Schaap, J. Amer. Chem. Soc., 97, 7110 (1975)). Andere haben aufgezeigt, daß eine spirokondensierte polycyclische Gruppe, wie die Adamantylgruppe, dazu beitragen kann, die Stabilität von Dioxetanen zu verbessern, die von aminosubstituierten Alkenen (F. McCapra, I. Beheshti, A. Burford, R. A. Hann und K. A. Zaklika, J. Chem. Soc., Chem. Comm., 944 (1977)), Vinylethern (W. Adam, L. A. Encarnacion und K. Zinner, Chem. Ber., 116, 839 (1983)) und Vinylsulfiden (G. G. Geller, C. S. Foote und D. B. Pechman, Tetrahedron Lett., 673 (1983); W. Adam, L. A. Arias und D. Schuetzow, Tetrahedron Lett., 2835 (1982)) abgeleitet sind, die ohne diese Gruppe instabil wären.

c. Chemisches Auslösen von Dioxetanen.

Das erste Beispiel in der Literatur ist im Zusammenhang mit dem mit einer Hydroxylgruppe substituierten Dioxetan beschrieben, das von 2,3-Diaryl-1,4-dioxen abgeleitet ist (A. P. Schaap und S. Gagnon, J. Amer. Chem. Soc., 104, 3504 (1982)). Das mit einer Hydroxylgruppe substituierte Dioxetan und irgendwelche anderen Beispiele von von Diaryl-1,4-Dioxenen abgeleiteten Dioxetanen sind jedoch relativ instabil, sie haben Halbwertszeiten bei 25ºC von nur wenigen Stunden. Außerdem werden diese nicht stabilisierten Dioxetane durch geringe Mengen von Aminen (T. Wilson, Int. Rev. Sci.: Chem., Ser. 2, 9, 265 (1976)) und Metallionen zerstört (T. Wilson, M. E. Landis, A. L. Baumstark und P. D. Bartlett, J. Amer. Chem. Soc., 95, 4765 (1973); P. D. Bartlett, A. L. Baumstark und M. E. Landis, J. Amer. Chem. Soc., 96, 5557 (1974)), wobei diese beiden Komponenten in wäßrigen Puffern für biologische Assays verwendet werden. Beispiele für das chemische Auslösen von mit Adamantyl stabilisierten Dioxetanen wurden zuerst in einer US-Patentanmeldung (A. P. Schaap, Patentanmeldung, Serien-Nr. 887,139, am 17. Juli 1986 eingereicht) und einem Dokument (A. P. Schaap, T. S. Chen, R. S. Handley, R. DeSilva und B. P. Gin, Tetrahedron Lett., 1155 (1987)) aufgeführt. Diese Dioxetane zeigen thermische Halbwertszeiten von Jahren, können jedoch bei Bedarf ausgelöst werden, wodurch eine wirksame Chemilumineszenz erzeugt wird. Es wurden auch mäßig stabile Benzofuranyldioxetane genannt, die mit mit Trialkylsilyl und Acetyl geschützten Phenolgruppen substituiert sind und eine schwache Chemilumineszenz erzeugen (W. Adam, R. Fell, M. H. Schulz, Tetrahedron, 49(11), 2227-38 (1993); W. Adam, M. H. Schulz, Chem. Ber., 125, 2455-61 (1992)). Es wurde auch von der stabilisierenden Wirkung anderer starrer polycyclischer Gruppen berichtet (P. D. Bartlett und M. Ho, J. Am. Chem. Soc., 96, 627 (1975); P. Lechtken, Chem. Ber., 109, 2862 (1976)). Eine PCT-Anmeldung, WO 94/10258, offenbart das chemische Auslösen von Dioxetanen, die verschiedene starre polycyclische Substituenten tragen.

d. Enzymatisches Auslösen von Adamantyldioxetanen

Dioxetane, die mit einem Enzym ausgelöst werden können, wodurch sie eine chemilumineszierende Zersetzung erfahren, sind in einer US-Patentanmeldung (A. P. Schaap, Patentanmeldung, Serien-Nr. 887,139) und einer Reihe von Dokumenten (A. P. Schaap, R. S. Handley und 59. Gin, Tetrahedron Lett., 935 (1987); A. P. Schaap, M. D. Sandison und R. S. Handley, Tetrahedron Lett., 1159 (1987) und A. P. Schaap, Photochem. Photobiol., 47S, 50S (1988)) beschrieben. Die sehr stabilen, mit Adamantyl substituierten Dioxetane, die einen geschützten Aryloxid-Substituenten aufweisen, werden durch die Wirkung eines Enzyms in einem wäßrigen Puffer ausgelöst, wodurch sie sich unter Lichtemission zersetzen und ein stark Elektronen spendendes Aryloxidanion erhalten wird, das die Zersetzungsrate des Dioxetans deutlich erhöht. Dadurch wird eine Chemilumineszenz mit Intensitäten emittiert, die einige Größenordnungen über der liegen, die durch die langsame thermische Zersetzung der geschützten Form des Dioxetans entsteht. US-Patent Nr. 5,068,339 von Schaap offenbart enzymatisch auslösbare Dioxetane mit kovalent gebundenen Fluoreszenzverstärker-Gruppen. Die Zersetzung dieser Dioxetane führt durch eine intramolekulare Energieübertragung auf den Fluoreszenzverstärker zu einer verstärkten und nach Rot verschobenen Chemilumineszenz. US-Patent Nr. 4,952,707 von Edwards offenbart enzymatisch auslösbare Dioxetane, die eine Adamantylgruppe und 2,5- oder 2,7-disubstituierte Naphthylgruppen aufweisen. US-Patente Nr. 5,112,960, 5,220,005, 5,326,882 und die PCI-Anmeldung (88 00695) von Bronstein offenbaren auslösbare Dioxetane, die Adamantylgruppen aufweisen, die mit verschiedenen Gruppen, einschließlich Chlor, Brom, einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Methoxy- und Methylengruppe, substituiert sind. Eine Veröffentlichung (M. Ryan, J. C. Huang, O. H. Griffith, J. F. Keana, J. J. Volwerk, Anal. Biochem., 214(2), 548-56 (1993)) offenbart ein mit einem Phosphodiester substituiertes Dioxetan, das durch das Enzym Phospholipase ausgelöst wird. US-Patent 5,132,204 von Urdea offenbart Dioxetane, die zwei unterschiedliche Enzyme erfordern, um nacheinander zwei gebundene Schutzgruppen zu entfernen, wodurch die chemilumineszierende Zersetzung ausgelöst wird. US-Patent 5,248,618 von Haces offenbart Dioxetane, die enzymatisch oder chemisch ausgelöst werden können, wodurch eine erste Schutzgruppe freigelegt wird, womit ein Zwischenprodukt erzeugt wird, das spontan einer intramolekularen Reaktion unterliegt, wodurch eine zweite Schutzgruppe abgespalten wird, damit die chemilumineszierende Zersetzung ausgelöst wird.

e. Verstärkte Chemilumineszenz von Dioxetanen in Geaenwart von oberflächenaktiven Mitteln

Es wurde von einer Verstärkung der Chemilumineszenz bei der von einem Enzym ausgelösten Zersetzung eines stabilen 1,2-Dioxetans in Gegenwart wasserlöslicher Substanzen berichtet, die ein oberflächenaktives Mittel in Form von Ammonium und einen Fluoreszenzverstärker einschließen (A. P. Schaap, H. Akhavan und L. J. Romano, Clin. Chem., 35(9), 1863 (1989)). Fluoreszierende Micelle, die aus Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) und 5-(N-Tetradecanoyl)aminofluorescein bestehen, fangen das Zwischenprodukt in Form des mit einer Hydroxylgruppe substituierten Dioxetans ein und führen aufgrund einer wirksamen Energieübertragung von der anionischen Form des Esters im angeregten Zustand auf die Fluoresceinverbindung innerhalb der hydrophoben Umgebung des Micells zu einer 400- fachen Verstärkung der Quantenausbeute bei der Chemilumineszenz.
US-Patente 4,959,182 und 5,004,565 von Schaap beschreiben weitere Beispiele für das Verstärken der Chemilumineszenz durch das chemische und enzymatische Auslösen von stabilen Dioxetanen in Gegenwart des oberflächenaktiven Mittels in Form einer quaternären Ammoniumverbindung, CTAB, und von Fluoreszenzverstärkern. Fluoreszierende Micelle, die aus CTAB und entweder dem vorstehend beschriebenen oberflächenaktiven Mittel in Form von Fluorescein oder 1-Hexadecyl-6- hydroxybenzothiazamid bestehen, verstärken die Chemilumineszenz bei der von einer Base ausgelösten Zersetzung von mit einer Hydroxylgruppe und einer Acetoxygruppe substituierten Dioxetanen. Es wurde auch berichtet, daß CTAB selbst die Chemilumineszenz eines mit Phosphat substituierten Dioxetans verstärken kann.
US-Patent Nr. 5,145,772 von Voyta offenbart das Verstärken einer enzymatisch erzeugten Chemilumineszenz von 1,2-Dioxetanen in Gegenwart von Polymeren mit gebundenen quaternären Ammoniumgruppen allein oder in Mischung mit Fluorescein. Andere Substanzen, von denen berichtet wurde, daß sie die Chemilumineszenz verstärken, schließen kugelförmige Proteine, wie Rinderalbumin und oberflächenaktive Mittel in Form von quaternärem Ammonium ein. Andere kationische Polymerverbindungen zeigten eine bescheidene Effektivität als Chemilumineszenzverstärker; nichtionische Polymerverbindungen waren im allgemeinen ineffektiv und das einzige anionische Polymer verbesserte die Lichtemission signifikant. Die PCT-Anmeldung WO 94/21821 offenbart das Verstärken durch eine Kombination aus einem oberflächenaktiven Mittel in Form eines polymeren Ammoniumsalzes und einem verstärkenden Zusatz. Die Europäische Patentanmeldung Nr. 92113448.2 von Akhavan-Tafti, die am 22. September 1993 veröffentlicht wurde, offenbart das Verstärken der enrymatisch erzeugten Chemilumineszenz von 1,2-Dioxetanen in Gegenwart von Polyvinylphosphoniumsalzen und Polyvinylphosphoniumsalzen, an die Fluoreszenzenergieakzeptoren kovalent gebunden sind. Die gleichzeitig anhängige US-Anmeldung, Serien-Nr. 08/082,091 von Akhavan-Tafti, die am 24. Juni 1993 eingereicht wurde, offenbart das Verstärken der enzymatisch erzeugten Chemilumineszenz von 1,2-Dioxetanen in Gegenwart dikationischer Phosphoniumsalze.
Die auf diesem Fachgebiet bekannten auslösbaren, stabilisierten Dioxetane enthalten einen starren, spirokondensierten, polycyclischen Substituenten oder einen substituierten Spiroadamantyl-Substituenten. Die Ausgangsmaterialien in Form eines Ketons, aus denen diese Dioxetane hergestellt werden, sind relativ teuer und stehen nur begrenzt zur Verfügung oder müssen aus teuren Vorstufen hergestellt werden. Es sind keine Beispiele von stabilen auslösbaren Dioxetanen bekannt, die anstelle der starren spirokondensierten polycyclischen organischen Gruppen zwei Alkylgruppen enthalten. Solche auslösbaren stabilisierten Dioxetane können aus kostengünstigen, leicht verfügbaren Ausgangsmaterialien hergestellt werden und bieten deshalb Kostenvorteile, wodurch ihre kommerzielle Möglichkeit verbessert wird.
EP-A-671 395 von Matsumoto, deren Einreichungsdatum nach dem Prioritätsdatum dieser Anmeldung liegt, offenbart 1,2-Dioxetane, die als stabilisierende Einheiten organische Gruppen enthält, die nicht spirokondensiert sind. Die in EP-A-671 395 erläuterten Verbindungen schließen verzweigte und mit Cycloalkyl substituierte 1,2-Dioxetane ein, die auch Alkoxy- und (3-substituierte) Phenylsubstituenten enthalten. Beispiele schließen in der Position 3,3 doppelt verzweigte Alkyl-4-(3-trialkylsilyloxy)phenyl-1,2-dioxetane und in der Position 3,3 doppelt verzweigte Alkyl-4-(3-phosphoryl)phenyl-1,2-dioxetane ein, und als Beispiel wird insbesondere die Verwendung von 3-(t-Butyl)-3-(3- neopentyloxymethyl)-4-methoxy-4-(3-phosphat)phenyl-1,2-dioxetan mit einem Salz eines Poly(vinylbenryl(benryldimethyl)ammoniumions beschrieben.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue mit Dialkyl und Aryl-OX substituierte auslösbare 1,2-Dioxetan-Verbindungen bereitzustellen, die bei Raumtemperatur über längere Zeit stabil sind. Es ist auch Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche stabilen 1,2-Dioxetan-Verbindungen bereitzustellen, die ausgelöst werden können, so daß sie sich unter Erzeugung einer Chemilumineszenz zersetzen. Es ist ebenfalls Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche stabilen 1,2-Dioxetan-Verbindungen bereitzustellen, die aus kostengünstigen, leicht verfügbaren Ausgangsmaterialien hergestellt werden können. Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und Zusammensetzungen bereitzustellen, die ein stabiles 1,2-Dioxetan enthalten, das durch Reagenzien, einschließlich Enzyme und andere Chemikalien, ausgelöst werden kann, so daß eine Chemilumineszenz erzeugt wird. Außerdem ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und Zusammensetzungen zur weiteren Verstärkung der Chemilumineszenz unter Verwendung von Verstärkersubstanzen bereitzustellen. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweis von Enzymen und für die Verwendung bei Immunoassays und den Nachweis von enzymgebundenen Nucleinsäuren, Antikörpern und Antigenen, wie sie auf diesem Fachgebiet allgemein bekannt sind. Es ist weiterhin Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und Zusammensetzungen für chemische Leuchtzwecke bereitzustellen.
Fig. 1 ist ein Spektrum der Chemilumineszenz, die aus einer Lösung des Dioxetans 2c in Dimethylsulfoxid (DMSO) emittiert wird, wenn sie durch den Zusatz einer Lösung von Kaliumhydroxid in einem Gemisch aus Methanol und Dimethylsulfoxid ausgelöst wird. Das Spektrum ist in bezug auf die beim Erfassen auftretende Abnahme der Intensität der Chemilumineszenz korrigiert.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Intensität der Chemilumineszenz als Funktion der Zeit, die durch das Auslösen einer aliquoten Menge von 10 ul einer 10&supmin;&sup6; m Lösung des Dioxetans 2g mit 50 ul 1 m Tetra-n-butylammoniumfluorid in DMSO ausgelöst wurde.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, die einen Vergleich der Zeitkurve der Intensität der Chemilumineszenz zeigt, die von 100 ul Lösungen emittiert wurde, die entweder das Dioxetan 2f der vorliegenden Erfindung oder 2k (LUMIGEN PPD®, Lumigen, Inc., Soutrifield, MI) enthalten, die bei 37ºC durch den Zusatz von 1,12 · 10&supmin;¹&sup7; mol alkalische Phosphatase (AP) ausgelöst wurden. Die Reagenzien bestehen aus 1) einer 0,33 mM Lösung des Dioxetans 2f im Puffer 0,2 m 2-Amino-2-methyl-1-propanol, pH = 9,6 und 2) einer 0,33 mM Lösung des Dioxetans 2k im Puffer 0,2 m 2-Amino-2-methyl-1-propanol, pH = 9,6. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Dioxetans 2f erreicht im Vergleich mit dem Dioxetan 2k auf vorteilhafte Weise eine höhere maximale Intensität.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, die einen Vergleich der Zeitkurve der Intensität der Chemilumineszenz zeigt, die von 100 ul Lösungen emittiert wird, die entweder das Dioxetan 2f oder 2k enthalten, die bei 37ºC durch den Zusatz von 1,12 · 10&supmin;¹&sup7; mol AP ausgelöst wurden. Die Reagenzien bestehen aus 1) einer 0,33 mM Lösung des Dioxetans 2f im Puffer 0,2 m 2-Amino-2-methyl-1-propanol, pH = 9,6, der 1,0 mg/ml des Verstärkers 1-(Tri-n-octylphosphoniummethyl)-4-(tri-n- butylphosphoniummethyl)benzoldichlorid (Verstärker A) enthält, und 2) einer 0,33 mM Lösung des Dioxetans 2k im Puffer 0,2 m 2-Amino-2-methyl-1-propanol, pH = 9,6, der 1,0 mg/ml des gleichen Verstärkers enthält. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Dioxetans 2f erreicht im Vergleich mit dem Dioxetan 2k zu allen Zeitpunkten auf vorteilhafte Weise höhere Lichtintensitäten.
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, die einen Vergleich des Zeitkurve der Intensität der Chemilumineszenz zeigt, die von 100 ul eines anderen Paars von Lösungen emittiert wird, die entweder das Dioxetan 2f oder 2k enthalten, das bei 37ºC durch den Zusatz von 1,12 · 10&supmin;¹&sup7; mol AP ausgelöst wurde. Die Reagenzien bestehen aus 1) einer 0,33 mM Lösung des Dioxetans 2f im Puffer 0,2 m 2-Amino-2-methyl-1-propanol, pH = 9,6, der 0,5 mg/ml Polyvinylbenzyltributylphosphoniumchlorid (Verstärker B) enthält, und 2) einer 0,33 mM Lösung des Dioxetans 2k im Puffer 0,2 m 2-Amino-2-methyl-1-propanol, pH = 9,6, der 0,5 mg/m) des gleichen Verstärkers enthält. Die Herstellung des Verstärkers B ist in der Europäischen Patentanmeldung 561,033 beschrieben, die am 22. September 1993 veröffentlicht worden ist. Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Dioxetans 2f werden im Vergleich mit dem Dioxetan 2k zu allen Zeitpunkten auf vorteilhafte Weise höhere Lichtintensitäten erreicht.
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, die einen Vergleich der Zeitkurve der Intensität der Chemilumineszenz zeigt, die von 100 ml eines anderen Paars von Lösungen emittiert wird, die entweder das Dioxetan 2f oder 2k enthalten, das bei 37ºC durch den Zusatz von 1,12 · 10&supmin;¹&sup7; mol AP ausgelöst wurde. Die Reagenzien bestehen aus 1) einer 0,33 mM Lösung des Dioxetans 2f im Puffer 0,2 m 2-Amino-2-methyl-1-propanol, pH = 9,6, der 0,5 mg/ml Polyvinylbenzyltributylphosphoniumchlorid enthält, das mit Polyvinylbenzyltrioctylphosphoniumchlorid copolymerisiert ist (weist ein Verhältnis der Gruppen Tributyl : Trioctyl von 3 : 1 auf) (Verstärker C), und 2) einer 0,33 mM Lösung des Dioxetans 2k im Puffer 0,2 m 2-Amino-2-methyl-1-propanol, pH = 9,6, der 0,5 mg/ml des gleichen Verstärkers enthält. Die Herstellung des Verstärkers C ist in der Europäischen Patentanmeldung 561,033 beschrieben. Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Dioxetans 2f werden im Vergleich mit dem Dioxetan 2k zu allen Zeitpunkten auf vorteilhafte Weise höhere Lichtintensitäten erreicht.
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung der maximalen Intensität der Chemilumineszenz, die von 100 ul eines Reagenz emittiert wird, das das Dioxetan 2f enthält, das bei 37ºC ausgelöst wurde, in bezug auf die Menge an AP. Die Emission der Chemilumineszenz wurde bei 37ºC durch den Zusatz von 3 ul AP-Lösungen, die 3,36 · 10&supmin;¹&sup6; bis 3,36 · 10&supmin; ²² mol eines Enzyms enthielten, zu 100 ul einer 0,33 mM Lösung des Dioxetans 2f im Puffer 2-Amino-2-methyl-1-propanol, 0,2 m (pH = 9,6), die 1,0 mg/ml des Verstärkers A enthielt, eingeleitet. Der Begriff S-B bezeichnet das Chemilumineszenzsignal (S) in relativen Lichteinheiten (RLU) in Gegenwart von AP, das in bezug auf die Hintergrund- Chemilumineszenz (B) ohne AP korrigiert ist. Die Graphik zeigt den linearen Nachweis von alkalischer Phosphatase. Die berechnete Nachweisgrenze (doppelte Standardabweichung des Hintergrunds) wurde unter diesen Bedingungen mit 1,4 · 10&supmin;²² mol oder weniger als 100 Moleküle alkalische Phosphatase bestimmt.
Fig. 8 ist ein digital erfaßtes Bild eines Röntgenfilms von einem Versuch, bei dem alkalische Phosphatase mittels Chemilumineszenz auf einer Membran nachgewiesen wird. Lösungen von alkalischer Phosphatase in Wasser, die 1,1 · 10&supmin;¹&sup5; bis 1,1 · 10&supmin;¹&sup8; mol enthalten, wurden auf identische Membranen aus Nylon® (Micron Separations Inc., Westboro, MA) aufgebracht. Die Membranen wurden 5 Minuten luftgetrocknet und kurz in ein Reagenz eingeweicht, das 1 mg/ml des Verstärkers A im Puffer 0,2 m 2-Amino-2- methyl-1-propanol, pH = 9,6, der 0,88 mM MgCl enthielt, und entweder 0,33 mM des Dioxetans 2f oder 0,33 mM des Dioxetans 2k enthielt. Die Membran wurde zwischen durchsichtigen Kunststoffolien angeordnet und einem Röntgenfilm (Kodak X-OMAT AR, Rochester, NY) ausgesetzt. Beim Vergleich dieser beiden Reagenzien führte das mit dem erfindungsgemäßen Dioxetan 2f erzeugte Licht zu äquivalenten Bildern und einer äquivalenten Empfindlichkeit beim Nachweis. Diese Ergebnisse zeigen die Leistung des Dioxetans 2f, die beim Western Blotting, Southern Blotting, DNA-Fingerprint und anderen Anwendungszwecken des Blottings zu erwarten sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die ein stabiles 1,2-Dioxetan enthalten, das durch Reagenzien, einschließlich Enzymen und anderen Chemikalien, ausgelöst werden kann, wodurch eine Chemilumineszenz erzeugt wird. Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung vorteilhafte stabile Dioxetane können die Formel haben:
worin R&sub3; und R&sub4; organische Reste sind, die nicht spirokondensiert sind, R&sub1; ein organischer Rest ist, der mit R&sub2; kombiniert sein kann, und R&sub2; eine Arylgruppe darstellt, die mit einer X-Oxygruppe substituiert ist, die ein Zwischenprodukt der Dioxetanverbindung in Form eines instabilen Oxids bildet, wenn sie mit einem Reagenz, einschließlich Enzyme und andere Chemikalien, ausgelöst wird, um die chemisch instabile Gruppe X zu entfernen. Das instabile Zwischenprodukt des Dioxetans in Form eines instabilen Oxids zersetzt sich und setzt elektrische Energie frei, wodurch Licht und zwei Carbonylgruppen enthaltende Verbindungen der Formel
erzeugt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet ein stabiles Dioxetan der Formel:
worin R&sub1; aus einer Alkyl-, Cycloalkyl- und Arylgruppe ausgewählt ist, die 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub3; und R&sub4; aus verzweigten Alkyl- und Cycloalkylgruppen ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können und Wärmebeständigkeit verleihen, und R&sub2; aus einer Aryl-, Biaryl-, Heteroaryl-, kondensierten polycyclischen Aryl- oder Heteroarylgruppe ausgewählt ist, die außerdem Substituenten aufweisen kann, und OX eine X-Oxygruppe ist, die ein Zwischenprodukt des Dioxetans in Form eines instabilen Oxids bildet, wenn sie mit einem Reagenz, einschließlich Enzyme und andere Chemikalien, ausgelöst wird, wodurch die chemisch instabile Gruppe X entfernt wird.
Die stabilen 1,2-Dioxetan-Verbindungen haben bei Raumtemperatur (20 bis 30ºC) relativ lange Halbwertszeiten, obwohl sie mit chemischen Reagenzien ausgelöst werden können. Bisherige Beispiele von stabilen, auslösbaren 1,2-Dioxetanen nutzen alle die starren spirokondensierten polycyclischen Alkylgruppen, wie Adamantyl und substituiertes Adamantyl, aus, um ein Wärmebeständigkeit zu verleihen. Es wurde nunmehr festgestellt, daß 1,2-Dioxetane, die einen größeren Bereich von Substituenten aufweisen, die in der vorstehenden Struktur R&sub3; und R&sub4; entsprechen, bei Raumtemperatur ebenfalls eine beträchtliche Wärmebeständigkeit zeigen. Dioxetanverbindungen, die mit Alkylgruppen substituiert sind, die nur 3 Kohlenstoffatome enthalten (wie die Substituenten R&sub3; und R&sub4; in der vorstehenden Struktur), haben Halbwertszeiten bei Raumtemperatur von etwa 1 Jahr und bei 4ºC von einigen Jahren. Die Gruppen R&sub3; und R&sub4;, deren Kohlenstoffatom, das an das Kohlenstoffatom des Dioxetan-Rings gebunden ist, mit 0 oder 1 Wasserstoffatomen substituiert ist (z. B. Isopropyl, sek.-Butyl, t-Butyl, Cycloalkyl), bieten eine ausreichende Wärmebeständigkeit der Dioxetanverbindungen, so daß sie für praktische Zwecke vorteilhaft werden. Die Gruppen R&sub3; und R&sub4;, die über die Gruppe CH&sub2; an den Dioxetan-Ring gebunden sind, die jedoch ansonsten voluminös sind, zum Beispiel eine Neopentylgruppe, werden als im Umfang dieser Erfindung liegend angesehen. Diese Dioxetane können außerdem durch das Entfernen der Gruppe X ausgelöst werden, wodurch sie sich unter Lichtemission zersetren. Das Ausmaß der Verstärkungsrate beim Auslösen hängt von Faktoren, wie der Instabilität der Gruppe X, der Menge des auslösenden Reagenz, der Wahl des Lösungsmittels, dem pH-Wert und der Temperatur, ab. Durch Auswahl geeigneter Bedingungen läßt sich ein Faktor der Verstärkungsrate von 10&sup6; oder mehr erreichen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, das leicht erhältliche oder kostengünstige Ausgangsmaterialien verwendet, zum Herstellen eines stabilen 1,2-Dioxetans der Formel:
worin R&sub3; und R&sub4; organische Reste sind, die nicht spirokondensiert sind, R&sub1; ein organischer Rest ist, der mit R&sub2; kombiniert sein kann, und R&sub2; eine Arylgruppe darstellt, die mit einer X-Oxygruppe substituiert ist, durch die Addition von Sauerstoff an das geeignete Alken. Eine unerwartete Entdeckung der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die hier genannten Alkene leicht einer photochemischen Addition eines Sauerstoffmoleküls (wie das Sauerstoff-Singulett ¹O&sub2;) unterzogen werden können, wodurch das entsprechende 1,2-Dioxetan erzeugt wird. Aus der Literatur ist allgemein bekannt, daß Alkene, die Allyl-Wasserstoffatome aufweisen, auf einem anderen Reaktionsweg bevorzugt der Addition eines Sauerstoff-Singuletts unterzogen werden können, wodurch ein Allylhydroperoxid erzeugt wird, die Bildung von Dioxetan stellt höchstens ein unbedeutendes Verfahren dar.
Die erforderlichen Alkenverbindungen werden durch Koppeln von Arylcarboxylatestern, die mit einer X-Oxy-Gruppe substituiert sind, und Dialkylketonen der nachstehenden Formel
in Gegenwart von Lithiumaluminiumhydrid, eines anderen Metallhydrids, von metallischem Zink oder einem Zink-Kupfer-Paar in einem polaren aprotischen organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Tetrahydrofuran, mit einem Salz eines Übergangsmetallhalogenids, vorzugsweise eine Titanchloridverbindung, und einer Base in Form eines tertiären Amins, synthetisiert. Die Reaktion erfolgt im allgemeinen unter Rückfluß von Tetrahydrofuran und ist gewöhnlich in etwa 2 bis 24 Stunden beendet. Ein signifikanter Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Möglichkeit, daß die Reaktion in einem großen Umfang durchgeführt werden kann, da die Ausgangsmaterialien in Form des Ketons in großer Menge zur Verfügung stehen. Auslösbare Dioxetane mit kommerzieller Verwendung werden aus Adamantanon oder einer substituierten Adamantanonverbindung hergestellt. Adamantanon ist relativ teuer. Substituierte Adamantanone sind sogar noch teurer und stehen noch begrenzter zur Verfügung. Im Vergleich zur Herstellung von Adamantanon, die ein aufwendiges Verfahren mit großen Mengen gefährlicher oxidierender Materialien beinhaltet, werden Alkyl- und Cycloalkylketone nach Standardverfahren leicht in großen Mengen hergestellt. Ein weiterer Vorteil besteht in den geringeren Kosten bestimmter Ausgangsmaterialien in Form des Ketons. Diisopropylketon ist zum Beispiel auf molarer Basis 15 bis 20 mal billiger als Adamantanon.
Die Erfindung schließt neue Alkene, wie sie in den Ansprüchen 25 bis 30 definiert sind, neue Verfahren zum Synthetisieren von Dioxetanen, wie sie in den Ansprüchen 31 bis 34 definiert sind, und neue Verfahren zum Synthetisieren von Alkenen, wie sie in den Ansprüchen 35 bis 36 definiert sind, ein.
Das auslösende Reagenz kann eine Chemikalie sein, die 1 Äquivalent (F&supmin;) oder einen Katalysator, wie ein Enzym, erfordert, wobei nur eine geringe Menge benutzt wird. Elektronendonatoren, organische und anorganische Basen, nucleophile Reagenzien und Reduktionsmittel können verwendet werden, um X zu entfernen.
Das auslösende Reagenz kann auch ein Enzym sein, das aus Phosphatase-Enzymen, Esterase-Enzymen, Cholinesterase-Enzymen, hydrolytischen Enzymen, wie α- und β- Galactosidase, α- und β-Giucosidase, Giucuronidase, Trypsin und Chymotrypsin ausgewählt ist.
Die OX-Gruppe kann eine Hydroxylgruppe, OOCR&sub6;, wobei R&sub6; eine Alkyl- oder Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ist, von denen jede Heteroatome enthalten kann, eine Trialkylsilyloxy-, Triarylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OP&sub3;&supmin;²-Salze, ein OSO&sub3;&supmin;-Salz; eine β-D-Galactosidoxy- und β-D-Glucuronidyloxygruppe einschließen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Erzeugen von Licht, das die folgenden Schritte aufweist: Bereitstellen eines 1,2-Dioxetans mit der nachstehenden Formel in einer Einheit, in der Licht erzeugt werden soll:
worin R&sub1; aus einer Alkyl-, Cycloalkyl- und Arylgruppe ausgewählt ist, die 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub2; aus einer Aryl-, Biaryl-, Heteroarylgruppe, einer kondensierten polycyclischen Aryl- oder Heteroarylgruppe ausgewählt ist, die außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer verzweigten Alkyl- und einer Cycloalkylgruppe ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, und OX aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OH, OOCR&sub6;, wobei R&sub6; aus einer Alkyl- und einer Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, einer Trialkylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OPOCl&sub2;, OPO(OR&sub7;)&sub2;, wobei R&sub7; ein organischer Rest ist, einer β-D-Galactosidoxy- und β-D-Glucuronidyloxygruppe besteht, und Auslösen des Dioxetans durch Entfernen der Gruppe X mit einem Reagenz, wodurch ein Zwischenprodukt der 1,2-Dioxetan-Verbindung in Form eines instabilen Oxids erzeugt wird, das sich zersetzt, wodurch Licht und 2 Carbonylverbindungen der Formel
erzeugt werden. Ein alternatives Verfahren zum Erzeugen von Licht weist die folgenden Schritte auf: Bereitstellen eines 1,2-Dioxetans mit der nachstehenden Formel in einer Einheit, in der Licht erzeugt werden soll:
worin R&sub1; aus einer Alkyl-, Cycloalkyl- und Arylgruppe ausgewählt ist, die 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub2; aus einer Aryl-, Biaryl-, Heteroarylgruppe, einer kondensierten polycyclischen Aryl- oder Heteroarylgruppe ausgewählt ist, die außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus Cycloalkylgruppen ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, und OX aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OH, OOCR&sub6;, wobei R&sub6; aus einer Alkyl- und einer Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, einer Trialkylsilyloxy-, Triarylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OPOCl&sub2;, OPO(OR&sub7;)&sub2;, wobei R&sub7; ein organischer Rest ist, OPO&sub3;²&supmin;-Salzen, einer β-D-Galactosidoxy- und β-D-Glucuronidyloxygruppe besteht, und Auslösen des Dioxetans durch Entfernen der Gruppe X mit einem Reagenz, wodurch ein Zwischenprodukt der 1,2-Dioxetan-Verbindung in Form eines instabilen Oxids erzeugt wird, das sich zersetzt, wodurch Licht und 2 Carbonylverbindungen der Formel
erzeugt werden. Ein weiteres alternatives Verfahren zum Erzeugen von Licht weist folgende Schritte auf:
Bereitstellen eines 1,2-Dioxetans der nachstehenden Formel in einer wäßrigen Lösung in einer Einheit, in der Licht erzeugt werden soll:
worin R&sub1; aus einer Alkyl-, Cycloalkyl- und Arylgruppe ausgewählt ist, die 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub2; aus einer Aryl-, Biaryl-, Heteroarylgruppe, einer kondensierten polycyclischen Aryl- oder Heteroarylgruppe, die außerdem Substituenten enthalten können, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer verzweigten Alkyl- und einer Cycloalkylgruppe ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, und OX aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OH, OOCR&sub6;, wobei R&sub6; aus einer Alkyl- und einer Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, einer Trialkylsilyloxy-, Triarylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OPOCl&sub2;, OPO(OR&sub7;)&sub2;, wobei R&sub7; ein organischer Rest ist, OPO&sub3;²-Salzen, einer β-D-Galactosidoxy- und β-D-Glucuronidyloxygruppe besteht, und in Gegenwart einer Verstärkersubstanz, die die Lichtmenge, die durch Umsetzen des Dioxetans mit dem Reagenz erzeugt wird, im Vergleich mit der Menge erhöht, die ohne diesen Verstärker erzeugt wird, mit der Maßgabe, daß der Verstärker vom quaternären Ammoniumsalz eines Poly(vinylbenzyl(benzyldimethyl)ammonium)-Ions (BDMQ) verschieden ist, wenn das Dioxetan eine Verbindung ist, bei der X PO&sub3;²&supmin; ist, R¹ eine Methylgruppe ist, R² eine m-Phenylengruppe ist, R³ eine t-Butylgruppe ist und R&sup4; eine 3-Neopentyloxymethylgruppe ist, Auslösen des Dioxetans durch Entfernen der Gruppe X mit einem Reagenz, wodurch ein Zwischenprodukt der 1,2-Dioxetan-Verbindung in Form eines instabilen Oxids erzeugt wird, das sich zersetzt, wodurch Licht und 2 Carbonylverbindungen der Formel:
erzeugt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis auslösender Reagenzien, die aus chemischen Reagenzien, einschließlich Enzymen, ausgewählt sind. In diesem Fall wird Dioxetan als Reagenz verwendet.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren und Zusammensetzungen für den Nachweis von Enzymen bei Immunoassays, zum Beispiel ELISA, und den Nachweis von Proben in Form von enzymgebundener DNA oder RNA. Der Nachweis des emittierten Lichtes kann leicht mit einem Luminometer, einem Röntgenfilm oder mit einer Kamera - und einem photographischen Film erfolgen.

BEISPIELE

Die Spektren der magnetischen Kernresonanz (NMR) wurden mit einem Spektrometer GE QE300® oder Varian Gemini 300® von Lösungen in CDCl&sub3; mit Tetramethylsilan als internem Standard oder von Lösungen in CD&sub3;OD oder D&sub2;O erhalten. Die Massenspektren wurden mit einem Spektrometer AEI MS-90® erhalten. Beispiel 1. Synthese von 1-(3-t-Butyldimethylsilyloxyphenyl)-2,2-diisooropyl-1- methoxyethen (1a)
Ein 3-Hals-Kolben wurde mit Argon gespült und mit 100 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) gefüllt. Der Kolben wurde in einem Eisbad gekühlt, und unter Rühren wurde Titantrichlorid (18 g) zugegeben. Lithiumaluminiumhydrid (2,2 g) wurde in kleinen Portionen zugesetzt, wodurch es zu einer kurzen exothermen Reaktion kam. Nachdem das gesamte Lithiumaluminiumhydrid zugesetzt worden war, wurde das Kühlbad entfernt, und es wurde Triethylamin (16 ml) zugegeben. Das schwarze Gemisch wurde 1 Stunde unter Argon unter Rückfluß erhitzt. Innerhalb von 2 Stunden wurde tropfenweise eine Lösung von 2,4-Dimethyl-3-propanon (3,86 g) und Methyl-3-t-butyldimethylsilyloxybenzoat (3,00 g) in 10 ml trockenem THF zugegeben. Der Reaktionsverlauf wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Silicamaterialplatten überwacht, wobei mit 4% Ethylacetat/Hexan eluiert wurde. Das rohe Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Hexan verdünnt und dekantiert. Der Rückstand wurde einige Male mit ingesamt etwa 100 ml Hexan gewaschen. Die gemischten Hexanlösungen wurden filtriert und verdampft, wobei ein Öl zurückblieb, das durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt wurde, wobei mit Hexan eluiert wurde, wodurch 2,12 g (54%) der Verbindung 1a erhalten wurden:
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,3-6,7 (m, 4H), 3,18 (s, 3H), 2,45 (Sept., 1H, J = 7,2 Hz), 2,31 (Sept., 1H, J = 7,2 Hz), 1,24 (d, 6H, J = 7,2 Hz), 0,99 (s, 3H), 0,91 (d, 6H, J = 7,2 Hz), 0,19 (s, 3H);
¹³C NMR (CDCl&sub3;) δ 128,76, 122,84, 121,46, 119,28, 56,06, 30,32, 26,54, 25,56, 21,91, 20,86, -4,58;
Massenspektrum (m/z): 348, 333, 306; exakte Masse, berechnet: 348,2484, gefunden: 348,2479. Beispiel 2. Synthese von 2,2-Diisopropyl-1-(3-hydroxyphenyl)-1-methoxyethen (1b)
Zu einer Lösung von 0,97 g (2,78 mmol) des Alkens 1a in 30 ml trockenem THF wurde 0,81 g (1,1 Äqu.) Tetra-n-butylammoniumfluorid gegeben. Nachdem 1 Stunde gerührt worden war, zeigte die TLC (Silicamaterial, 20% Ethylacetat/Hexan) die vollständige Umwandlung des Ausgangsmaterials in eine neue Verbindung. Das THF wurde verdampft und der Rückstand in Ethylacetat gelöst. Die Ethylacetatlösung wurde viermal mit Wasser extrahiert und getrocknet. Kieselgel (2 g) wurde zugesetzt, und das Lösungsmittel wurde verdampft. Das Material wurde durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt, wobei mit 10 bis 20% Ethylacetat/Hexan eluiert wurde, wodurch 0,568 g (87%) der Verbindung 1b erhalten wurden.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,5-6,5 (m, 4H), 4,91 (s, 1H), 3,20 (s, 3H), 2,47 (Sept., 1H), 2,33 (Sept., 1H), 1,25 (d, 6H), 0,92 (d, 6H);
¹³C NMR (CDCl&sub3;) δ 129,25, 124,98, 122,60, 116,54, 114,98, 114,56, 56,38, 30,52, 26,80, 22,11, 21,08;
Massenspektrum (m/z): 234, 219, 191; exakte Masse, berechnet: 234,1620, gefunden: 234,1620. Beispiel 3. Synthese von 1-(3-Acetoxyphenyl)-2,2-diisoopyl-1-methoxyethen (1c)
Das Alken 1b (200 mg, 0,85 mmol) wurde in 20 ml trockenem Methylenchlorid mit 0,31 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Der Kolben wurde mit Argon gespült und in einem Eisbad gekühlt. Innerhalb von 1 Stunde wurde tropfenweise Acetylchorid (0,115 g, 1,47 mmol) in 5 ml trockenem Methylenchlorid zugesetzt. Die TLC-Analyse (Silicamaterial, 20% Ethylacetat/Hexan) zeigte, daß die Reaktion nach 2,5-stündigem Rühren bei ºC abgeschlossen war. Die Lösungsmittel wurden verdampft, und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde viermal mit Wasser gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und verdampft. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt, wobei mit 10 bis 20% Ethylacetat/Hexan eluiert wurde, wodurch 220 mg (93%) der Verbindung 1c erhalten wurden.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,37-6,99 (m, 4H), 3,19 (s, 3H), 2,47 (Sept., 1H, J = 6,9 Hz), 2,33 (Sept., 1H, J = 6,9 Hz), 2,29 (s, 3H), 1,24 (d, 6H, J = 6,9 Hz), 0,93 (d, 6H, J = 6,9 Hz);
¹³C NMR (CDCl&sub3;) δ 169,46, 150,62, 149,03, 139,02, 133,64, 128,95, 127,24, 122,89, 120,72, 56,50, 30,49, 26,98, 22,06, 21,25, 21,05; Beispiel 4. Synthese von 1-(3-Benzoyloxyphenyl)-2,2-diisopropyl-1-methoxyethen (1d)
Das Alken 1b (4,5 g, 1,9 mmol) wurde m 50 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; mit 5,3 ml wasserfreiem Triethylamin gelöst. Der Kolben wurde mit Argon gespült und in einem Eisbad gekühlt Es wurde tropfenweise Benzoylchlorid (4,05 g, 2,9 mmol) zugesetzt. Das Kühlbad wurde entfernt und es wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur weitergerührt. Das Gemisch wurde filtriert, und die Lösung wurde mit Wasser gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und verdampft. Der Rückstand wurde in Hexan suspendiert, der Feststoff wurde abfiltriert, und die Lösung wurde verdampft. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt, wobei mit 1% Ethylacetat in Hexan eluiert wurde, wodurch 3,7 g des Dioxetans 1d erhalten wurden.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 8,25-7,05 (m, 9H), 3,25 (s, 1H), 2,54 (Sept., 1H, J = 6,9 Hz), 2,40 (Sept., 1H, J = 6,9 Hz), 2,29 (s, 3H), 1,26 (d, 6H, J = 6,9 Hz), 0,95 (d, 6H, J = 6,9 Hz). Beispiel 5. Synthese von 1-(3-Pivaloyloxyphenyl)-2,2-diisopropyl-1-methoxyethen (1e)
Das Alken 1b (2 g, 8,6 mmol) wurde in 50 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; mit 2,4 ml wasserfreiem Triethylamin gelöst. Der Kolben wurde mit Argon gespült und in einem Eisbad gekühlt. Innerhalb von 1 Stunde wurde tropfenweise Pivaloylchlorid (1,6 g, 2 Äqu.) zugesetzt. Das Kühlbad wurde entfernt, und es wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur weitergerührt. Die Lösung wurde mit wäßrigem K&sub2;CO&sub3; und danach mit Wasser gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und verdampft. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt, wobei mit 5% Triethylamin in Hexan eluiert wurde, wodurch 1,95 g des Dioxetans 1e erhalten wurden.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,34-6,98 (m, 4H), 3,198 (s, 3H), 2,47 (Sept., 1H), 2,33 (Sept., 1H), 1,36 (s, 9H), 1,24 (d, 6H, J = 6,9 Hz), 0,92 (d, 6H, J = 6,9 Hz). Beispiel 6. Synthese des Natriumsalzes von 2,2-Diisopropyl-1-methoxy-1(3- phosphoryloxyphenyl)ethen (1f)
(a) Eine Lösung von 9 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; und 0,7 ml wasserfreiem Pyridin (8,7 mmol) wurde mit Argon gespült und in einem Eisbad gekühlt. Es wurde Phosphoroxychlorid (0,40 g, 2,6 mmol) zugesetzt, dem folgte nach 5 Minuten eine Lösung des Alkens 1b (209 mg, 0,87 mmol) in 0,4 ml Pyridin. Die Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die TLC-Analyse (Silicamaterial, 30% Ethylacetat/Hexan) zeigte den Abschluß der Reaktion. Die Lösungsmittel wurden verdampft, und der Rückstand wurde für den nächsten Schritt übernommen.
(b) Das Produkt vom Schritt (a) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst, und es wurde 0,7 ml Pyridin zugesetzt. Die Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt und mit 618 mg 2-Cyanoethanol (8,7 mmol) behandelt. Das Eisbad wurde entfernt, und es wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur weitergerührt. Dann wurde das Gemisch eingeengt, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie über Kieselgel eingeengt, wobei bei einem Gradienten von 50% Ethylacetat in Hexan bis auf 100% Ethylacetat eluiert wurde, wodurch das Bis(cyanoethylphosphat) erhalten wurde.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 0,934 (d, 6H, J = 9 Hz), 1,235 (d, 6H, J = 9 Hz), 2,28-2,45 (m, 2H), 2,76-2,82 (m, 4H), 3,18 (s, 1H), 4,31-4,47 (m, 4H), 7,11-7,38 (m, 4H).
(c) Dieses Bis(cyanoethylphosphat)alken (420 mg) wurde in 4 ml Aceton gelöst. Natriumhydroxid (65 mg) wurde in 1 ml Wasser gelöst und zu der Acetonlösung gegeben, die dann über Nacht gerührt wurde. Der Niederschlag wurde aufgefangen und bis zu einem weißen Pulver getrocknet.
¹H NMR (D&sub2;O) δ 0,907 (s, 3H), 0,929 (s, 3H), 1,20 (s, 3H), 1,22 (s, 3H), 2,35-2,46 (m, 2H), 3,23 (s, 1H), 6,96-7,37 (m, 4H);
¹³C NMR (D&sub2;O) δ 155,15 (d), 149,56, 137,84, 136,08, 129,71, 124,55, 122,33 (d), 120,48, 57,16, 31,27, 27,21, 22,59, 21,10;
³¹P NMR (D&sub2;O) (der Wert der chemischen Verschiebung für ³¹P ist im Verhältnis zum Wert eines externen Phosphorsäurestandards aufgeführt (im Verhältnis zur externen H&sub3;PO&sub4;)) δ 0,345. Beispiel 7. Synthese von 1-(3-t-Butyldimethylsilylphenyl)-2,2-dicyclopropyl-1- methoxyethen (1g)
Ein 3-Hals-Kolben wurde mit Argon gespült und mit 50 ml wasserfreiem THF gefüllt. Der Kolben wurde in einem Eisbad gekühlt, und unter Rühren wurde Titantrichlorid (11,6 g) zugesetzt. Lithiumaluminiumhydrid (1,4 g) wurde in kleinen Portionen zugesetzt, wodurch es zu einer kurzen exothermen Reaktion kam. Während der Zugabe des Lithiumaluminiumhydrids wurde eine weitere Portion von 20 ml wasserfreiem THF zugegeben, um das Rühren zu erleichtern. Das Kühlbad wurde entfernt, als die Zugabe beendet war, und das schwarze Gemisch wurde zum Rückfluß gebracht. Es wurde Triethylamin (10,5 ml) zugesetzt, und das schwarze Gemisch wurde 1 Stunde unter Argon unter Rückfluß erhitzt. Innerhalb von 75 Minuten wurde tropfenweise eine Lösung von Dicyclopropylketon (2,61 g) und Methyl-3-t-butyldimethylsilyloxybenzoat (2,00 g) in 20 ml trockenem THF zugegeben. Laut Überwachung durch TLC auf Silicamaterialplatten, wobei mit 5% Ethylacetat/Hexan eluiert wurde, wurde die Umsetzung nach einem weiteren 1- stündigen Rückflußzeitraum als beendet angesehen. Das rohe Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit vier 400 ml Portionen Hexan extrahiert. Die gemischten Hexanlösungen wurden filtriert und verdampft, wodurch 1,42 g eines gelben Öls zurückblieben, das durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt wurde, wobei zuerst mit Hexan und dann mit 20% Ethylacetat/Hexan eluiert wurde, wodurch das Alkenprodukt 1a eluierte. Eine weitere Reinigung wurde durch präparative TLC über Silicamaterial erreicht, wobei mit 5% Ethylacetat/Hexan eluiert wurde.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,3-6,7 (m, 4H), 3,36 (s, 3H), 1,80 (m, 1H), 1,13 (m, 1H), 0,988 (s, 9H), 0,78-0,67 (m, 4H), 0,43-0,37 (m, 2H), 0,19 (s, 6H), 0,11-0,05 (m, 2H). Beispiel 8. Synthese von 1-(3-t-Butyldimethylsilyloxyphenyl)-dicyclohexyl-1- methoxyethen (1h)
Ein Gemisch von 4,3 g Methyl-3-t-butyldimethylsilyloxybenzoat und 9,5 g Dicyclohexylketon in trockenem THF wurden nach dem Verfahren von Beispiel 5 gekoppelt, wobei ein Ti-Reagenz verwendet wurde, das aus 25 g TiCl&sub3;, 3,0 g LiAlH&sub4; und 16,4 g Triethylamin in 150 ml trockenem THF hergestellt worden war. Das nach der Extraktion mit Hexan erhaltene rohe Produktgemisch (10 g) wurde durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt, wobei zuerst mit Hexan, dann mit 1% Ethylacetat/Hexan und danach mit 3% Ethylacetat/Hexan eluiert wurde. Die Ausbeute betrug 3,5 g (51%) des Alkens 1e.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,22-7,16 (m, 1H), 6,85-6,72 (m, 3H), 3,155 (s, 3H), 2,05-0,86 (m, 22H), 0,0995 (s, 9H), 0,21 (s, 6H); Beispiel 9. Synthese von 2,2-Dicyclohexyl-1-(3-hydroxyphenyl)-1-methoxyethen (1i)
Zu einer Lösung von 0,7 g des Alkens 1f in trockenem THF wurde tropfenweise 0,62 g (1,2 Äqu.) Tetra-n-butylammoniumfluorid gegeben. Nachdem 1 Stunde gerührt worden war, zeigte die TLC (Silicamaterial, 20% Ethylacetat/Hexan) die vollständige Umwandlung des Ausgangsmaterials in eine neue Verbindung. Das THF wurde verdampft, und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst. Die Ethylacetatlösung wurde mit Wasser extrahiert und über MgSO&sub4; getrocknet. Das Material wurde durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt, wobei mit 0 bis 10% Ethylacetat/Hexan eluiert wurde, wodurch 0,46 g (92%) der Verbindung 1f erhalten wurde. Das Alken wurde durch Kristallisieren in Benzol/Hexan (1 : 6) bei 4ºC weiter gereinigt.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,20-6,72 (m, 4H), 4,72 (s, 1H), 3,174 (s, 3H), 2,06-1,04 (m, 22H);
¹³C NMR (CDCl&sub3;) δ 155,19, 138,20, 131,97, 129,05, 122,50, 116,36, 114,39, 56,48, 41,51, 39,34, 31,40, 30,92, 27,50, 26,37, 26,25, 25,99;
Massenspektrum (m/z): 314, 231, 121; exakte Masse, berechnet: 314,2246, gefunden: 314,2246. Tabelle 1. Dioxetan-Verbindungen

Beispiel 10. Synthese von 1,2-Dioxetanen

Photooxidationsverfahren - Verfahren A

Typischerweise wurden 100 mg einer Probe des Alkens in einem Photooxidationsröhrchen in 20 ml eines Gemischs aus Methanol und Methylenchlorid mit 1 : 1 gelöst. Etwa 200 mg mit Polystyrol gebundenes Diodeosin wurden zugesetzt, und ein Sauerstoffgasspüler wurde angeschlossen. Sauerstoff wurde langsam durch die Vorrichtung geleitet, wobei diese in einem zur Hälfte versilberten Dewar-Kolben eingetaucht war, der entweder Trockeneis/2-Propanol oder Eiswasser enthielt. Die Probe wurde mit einer 400 W Natriumlampe (GE Lucalox) durch eine 5 mil Folie aus Kapton® (DuPont, Wilmington, DE) als UV-Trennfilter bestrahlt, wobei kontinuierlich Sauerstoff hindurchgeblasen wurde. Der Reaktionsverlauf wurde durch TLC oder ¹H NMR überwacht. Die Dioxetanverbindung wurde abgetrennt, indem das an das Polymer gebundene Sensibilisierungsmittel abfiltriert und das Lösungsmittel bei Raumtemperatur verdampft wurde. Eine weitere Reinigung konnte falls erforderlich durch Säulenchromatographie über Kieselgel oder durch Kristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel erreicht werden.

Verfahren B

In einer anderen Ausführungsform wurde in einigen Fällen Methylenblau als Photosensibilisierungsmittel verwendet. Etwa 100 mg wurden in 10 ml des Reaktionslösungsmittels gelöst, und das Bestrahlen erfolgte wie vorstehend beschrieben. Die auf diese Weise hergestellten Dioxetane wurden durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt. Beispiel 11. Synthese von 4-(3-t-Butyldimethylsilyloxyphenyl)-3,3-diisopropyl-4-methoxy- 1,2-dioxetan (2a)
Eine Probe des Alkens mit 102,8 mg wurde bei -78ºC insgesamt 9 Stunden nach dem Verfahren B photooxidiert. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und das Gemisch wurde durch präparative TLC gereinigt, wobei zum Eluieren der Platte 4% Ethylacetat/Hexan verwendet wurde. Die Ausbeute des Dioxetans 2a betrug 55,9 mg (50%).
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,6-6,7 (m, 4H), 3,14 (s, 3H), 2,61 (Sept., 1H), 2,46 (Sept., 1H), 1,30 (d, 1H), 1,18 (d, 1H), 1,00 (s, 3H), 0,92 (d, 1H), 0,46 (d, 1H), 0,20 (s, 3H);
¹³C NMR (CDCl&sub3;) δ 155,88, 137,07, 129,41, 114,526, 98,57, 49,46, 33,51, 29,24, 25,79, 19,43, 18,51, 17,29, 16,69, -4,32. Beispiel 12 Synthese von 3,3-Diisopropyl-4-(3-hydroxyphenyl)-4-methoxy-1,2-dioxetan (2b)
Das Alken 1b (83,2 mg) wurde insgesamt 3 Stunden bei -78ºC nach dem Verfahren B photooxidiert. Das Lösungsmittel wurde verdampft, der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst, und das Gemisch wurde durch präparative TLC gereinigt, wobei zum Eluieren der Platte 20% Ethylacetat/Hexan verwendet wurde. Die Ausbeute des Dioxetans 2b betrug 79 mg (84%).
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,4-6,8 (m, 4H), 3,2 (s, 3H), 2,62 (Sept., 1H), 2,48 (Sept., 1H), 2,08 (s, 1H), 1,30 (d, 3H), 1,17 (d, 3H), 0,90 (d, 3H), 0,47 (d, 3H);
¹³C NMR (CDCl&sub3;) δ 156,00, 137,21, 129,70, 116,41, 114,61, 98,97, 49,58, 33,55, 29,35, 19,46, 18,56, 17,31, 16,65. Beispiel 13. Synthese von 4-(3-Acetoxyphenyl)-3,3-diisopropyl-4-methoxy-1,2-dioxetan (2c)
Eine Probe des Alkens mit 63 mg wurde insgesamt 6,5 Stunden bei -78ºC nach dem Verfahren B photooxidiert. Das Lösungsmittel wurde verdampft, der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst, und das Gemisch wurde durch präparative TLC gereinigt, wobei zum Eluieren der Platte 20% Ethylacetat/Hexan verwendet wurde. Die Ausbeute des Dioxetans 2c betrug 56 mg (80%).
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,37-6,99 (m, 4H), 3,14 (s, 3H), 2,59-2,42 (m, 2H), 2,32 (s, 3H), 1,30 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,17 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 0,91 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 0,46 (d, 3H, J = 7,2 Hz);
¹³C NMR (CDCl&sub3;) δ 150,89, 137,34, 129,39, 122,73, 114,07, 98,34, 49,60, 33,54, 29,31, 21,22, 19,44, 18,53, 17,17, 16,59. Beispiel 14. Synthese von 4-(3-Benzoyloxyphenyl)-3,3-diisooropyl-4-methoxy-1,2-dioxetan (2d)
Eine Probe des Alkens mit 3,7 g wurde insgesamt 19 Stunden bei -78ºC nach dem Verfahren B photooxidiert, wobei 500 ml eines Gemischs von Aceton und CH&sub2;Cl&sub2; mit 1 : 1 und 100 mg Methylenblau verwendet wurden. Der Reaktionsverlauf wurde durch ¹H NMR überwacht. Das Lösungsmittel wurde verdampft, der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst, und das Gemisch wurde durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei Hexan als Elutionsmittel verwendet wurde.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 8,22-7,0 (m, 9H), 3,184 (s, 3H), 2,62-2,46 (m, 2H), 1,30 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,20 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 0,94 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 0,52 (d, 3H, J = 7,2 Hz);
¹³C NMR (CDCl&sub3;) δ 151,09, 137,32, 133,72, 130,18, 129,33, 128,61, 122,66, 98,24, 49,48, 33,44, 29,22, 19,32, 18,42, 17,11, 16,48. Beispiel 15. Synthese von 4-(3-Pivaloyloxyphenyl)-3,3-diisopropyl-4-methoxy-1,2-dioxetan (2e)
Eine Probe des Alkens mit 1,95 g wurde insgesamt 2,5 Stunden bei 4ºC nach dem Verfahren B photooxidiert, wobei 300 ml eines Gemischs von Aceton und CH&sub2;Cl&sub2; mit 1 : 1 verwendet wurden. Der Reaktionsverlauf wurde durch ¹H NMR überwacht. Das Lösungsmittel wurde verdampft, der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst, und das Gemisch wurde durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei Hexan als Elutionsmittel verwendet wurde.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,43-7,07 (m, 4H), 3,14 (s, 3H), 2,59-2,42 (m, 2H), 1,37 (s, 9H), 1,31 (d, 3H, J = 6,9 Hz), 1,17 (d, 3H, J = 6,9 Hz), 0,92 (d, 3H, J = 6,9 Hz), 0,47 (d, 3H, J = 6,9 Hz); Beispiel 16. Synthese des Dinatriumsalzes von 4-(3-Phosphoryloxyphenyl)-3,3-diisopropyl- 4-methoxy-1,2-dioxetan (2f)
Eine Probe des Alkens mit 64 mg wurde insgesamt 1,5 Stunden bei 0ºC nach dem Verfahren B in 3 ml D&sub2;O photooxidiert. Die Lösung wurde bei 4ºC aufbewahrt, damit es zu einer Kristallisation kommt. Die weißen Kristalle wurden filtriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet.
¹H NMR (D&sub2;O) δ 7,43-7,14 (m, 4H), 3,132 (s, 3H), 2,63-2,53 (m, 2H), 1,225 (d, 3H, J = 7,5 Hz), 1,123 (d, 3H, J = 7,5 Hz), 0,892 (d, 3H, J = 6,6 Hz), 0,475 (d, 3H, J = 6,6 Hz);
³¹P NMR (D&sub2;O) (im Verhältnis zur externen H&sub3;PO&sub4;) δ 0,248.
Es sollte daraufhingewiesen werden, daß alle anderen verwendeten Lösungsmittelsysteme, einschließlich D&sub2;O/p-Dioxan, Methanol, Methanol/CH&sub2;Cl&sub2;, Reaktionszeiten von einigen Stunden erforderten und zu deutlichen Mengen von Zerstungsprodukten führten. Beispiel 17. Synthese von 4-(3-t-Butyldimethylsilyloxyphenyl-3,3-dicyclopropyl-4- methoxy-1,2-dioxetan (2g)
Eine Probe des Alkens mit 25 mg wurde insgesamt 1 Stunde bei -78ºC nach dem Verfahren A photooxidiert. Die ¹H NMR zeigte, daß die Lösung ein Gemisch von Dioxetan und Alken mit 3 : 1 und eine geringe Menge eines Zersetzungsproduktes aus einem Ester enthielt. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Bestrahlung unterbrochen und das Sensibilisierungsmittel wurde abfiltriert. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und das Gemisch wurde für kinetische Messungen als Lösung in Xylol verwendet.
Peaks bei der ¹H NMR (CDCl&sub3;) aufgrund von Dioxetan: δ 7,6-6,7 (m, 4H), 3,14 (s, 3H), 1,80 (m, 1H), 1,2-1,0 (m, 9H), 0,991 (s, 9H), 0,221 (s, 6H). Beispiel 18. Synthese von 4-(3-t-Butyldimethylsilyloxyphenyl)-3,3-dicyclohexyl-4-methoxy- 1,2-dioxetan (2h)
Eine Probe des Alkens 1f mit 2,0 g wurde insgesamt 8,5 Stunden bei -78ºC nach dem Verfahren B photooxidiert. Das Lösungsmittel wurde verdampft, der Rückstand wurde in Hexan gelöst und filtriert. Die organische Lösung wurde verdampft, und der feste Rückstand wurde durch Säulenchromatographie gereinigt. Die Ausbeute des Produktes betrug 2,0 g (93%).
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,26-6,85 (m, 4H), 3,143 (s, 3H), 2,3-0,5 (m, 22H), 0,995 (s, 9H), 0,205 (s, 6H);
¹³C NMR (CDCl&sub3;) δ 155,57, 136,82, 129,10, 122-121 (einige waren nicht aufgelöst), 114,56, 104,39, 97,31, 49, 49, 45,18, 41,79, 28,71, 28,07, 27,80, 27,17, 26,95, 26,83, 26,74, 26,30, 25,68, 18,24, -4,38. Beispiel 19. Synthese von 3,3-Dicyclohexyl-4-(3-hydroxyphenyl)-4-methoxy-1,2-dioxetan (2i)
Eine Probe des Alkens 1g mit 150 mg wurde insgesamt 1,5 Stunden bei -78ºC nach dem Verfahren B photooxidiert. Das Lösungsmittel wurde verdampft, der Rückstand wurde in Hexan gelöst und filtriert. Der Niederschlag wurde mit 10 ml 20% Ethylacetat/Hexan gewaschen, und die organische Lösung wurde verdampft. Der feste Rückstand wurde durch präparative TLC gereinigt, wobei zum Eluieren der Platte 20% Ethylacetat/Hexan verwendet wurde. Die Ausbeute des Produktes betrug 120 mg (72%).
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,34-6,93 (m, 4H), 5,30 (s, 1H), 3,163 (s, 3H), 2,23-0,56 (m, 22H);
¹³C NMR (CDCl&sub3;) δ 155,55, 137,02, 129,42, 116,23, 116,12, 114,62, 104,36, 97,88, 49,60, 45,28, 41,78, 28,70, 28,09, 27,75, 27,14, 26,90, 26,86, 26,72, 26,37. Beispiel 20. Synthese von 1-(Tri-n-octylphosphoniummethyl)-4-(tri-n- butylphosphoniummethyl)benzoldichlorid. Verstärker A
(a) Ein Gemisch von Tri-n-butylphosphin (7 g, 34,6 mmol) in Toluol (50 ml) wurde unter Argon tropfenweise zu einem Gemisch von α,α'-Dichlor-p-xylol (12,1 g, 69,2 mmol, 2 Äqu.) in Toluol (200 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 12 Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt, nach dieser Zeit war das 4-(Chlormethyl)benzyl-tri- n-butylphosphoniumchlorid aus der Lösung kristallisiert. Die Kristalle wurden filtriert und mit Toluol und Hexan gewaschen und luftgetrocknet.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 0,92 (t, 9H), 1,44 (m, 12H), 2,39 (m, 6H), 4,35-4,40 (d, 2H), 4,56 (s, 2H), 7,36-7,39 (d, 2H), 7,47-7,51 (dd, 2H).
(b) Zu einem Gemisch von 4-(Chlormethyl)benzyl-tri-n-butylphosphoniumchlorid (3 g, 7,9 mmol) und DMF wurde unter Argon bei Raumtemperatur Tri-n-octylphosphin (4,39 g, 12 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde einige Tage gerührt, danach zeigte die Prüfung durch TLC, daß die Umsetzung beendet war. Das DMF wurde bei reduziertem Druck entfernt, der Rückstand wurde einige Male mit Hexan und Toluol gewaschen und dann getrocknet, wodurch 1-(Tri-n-octylphosphoniummethyl)-4-(tri-n- butylphosphoniummethyl)benzoldichlorid als weiße Kristalle erhalten wurde.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 0,84 (t, 9H), 0,89 (t, 9H), 1,22 (br s, 24H), 1,41 (m, 24H), 2,34 (m, 12H), 4,35-4,40 (d, 4H), 7,58 (s, 4H);
¹³C NMR (CDCl&sub3;) δ 13,34, 13,94, 18,33, 18,62, 18,92, 19,21, 21,76, 21,81, 23,58, 23,64, 23,78, 23,98, 26,10, 26,65, 28,86, 30,68, 30,88, 31,53, 129,22, 131,22;
³¹P NMR (D&sub2;O) δ 31,10, 31,94.

Beispiel 21. Messung der Kinetik der Chemilumineszenz

Die Messungen der Intensitäten und der Rate der Chemilumineszenz erfolgten entweder mit einem Luminometer Modell TD-20e von Turner Designs (Sunnyvale, CA) oder einem im Haus gebauten Luminometer (Black Box), das einen Photonen zählenden Photoelektronenvervielfacher verwendet. Die Regelung der Temperatur der in den Luminometern analysierten Proben wurde durch ein zirkulierendes Bad erreicht, das mit dem Gerät verbunden war. Die quantitative Messung der Intensitäten des Lichtes mit dem Turner-Luminometer wurden durch einen Neutralfilter über den linearen Bereich des Detektors von 104 hinaus erweitert. Die Datenerfassung wurde mit einem Computer Apple MacIntosh SE/30 unter Verwendung des Datenreduzierungsprogramms LUMISOFT® (Lumigen, Inc., Soutrifield, MI) gesteuert.
Die Aktivierungsenergie für die thermische Zersetzung der Dioxetane 2c, h und i wurde gemessen, indem die Geschwindigkeitskonstante 1. Ordnung k für die Abnahme der Chemilumineszenz verdünnter Lösungen in Xylol bei unterschiedlichen Temperaturen gemessen wurde. Tabelle 2. Thermische Beständigkeit stabilisierter Dioxetane

Beispiel 21. Messung der Kinetik der Chemilumineszenz

Beispiel 22. Chemilumineszenz- und Fluoreszenz-Soektren

Die Chemilumineszenz- und Fluoreszenzspektren wurden mit einem Fluorometer Fluorolog II® (Spex Ind., Edison, NJ) mit 1 cm Quartzküvetten gemessen. Alle Messungen erfolgten bei Umgebungstemperatur. Das Spektrum wurde entweder erfaßt, wenn die Intensität des Lichtes einen konstanten Wert erreicht hatte, oder es wurde die Abnahme der Intensität des Lichtes während der Erfassung korrigiert. Fig. 1 zeigt ein typisches Chemilumineszenzspektrum von der Zersetzung des Dioxetans 2c in DMSO, die durch die Zugabe einer kleinen Menge einer Lösung von KOH in Methanol/DMSO mit 1 : 1 ausgelöst worden war. Die Emission entsteht durch den angeregten Zustand des Anions des Methyl-3-hydroxybenzoats. Die ausgelöste Zersetzung jedes erfindungsgemäßen Dioxetans in DMSO erzeugt diesen angeregten Zustand.

Beispiel 23. Chemisches Auslösen der chemilumineszierenden Zersetzung der Dioxetane 2c, g, i

Es wurden Stammlösungen der Dioxetane 2c, 2e, 2g und zum Vergleich von 4-(3-t- Butyldimethylsilyloxyphenyl)-4-methoxy-spiro[1,2-dioxetan-3,2'-tricyclo[3,3,1,13,7]decan] (2j) (Herstellung wie in US-Patent Nr. 4,962,192 beschrieben) mit Konzentrationen von 10&supmin;&sup6; m in DMSO hergestellt. Falls erforderlich, wurden sequentielle Verdünnungen in DMSO hergestellt. Aliquote Mengen von 10 ul wurden in 7 · 50 mm Polypropylenröhrchen in einem Luminometer TD-20e von Turner Designs ausgelöst, indem 50 ul einer Lösung von Tetra-n-butylammoniumfluorid (TBAF) in DMSO (1 m-10&supmin;&sup4; m) in einem geeigneten Lösungsmittel, typischerweise DMSO, eingespritzt wurden. Falls erforderlich wurde die Intensität des Lichtes mit einem Neutralfilter abgeschwächt. Alle Versuche erfolgten beim Umgebungstemperatur. Der Peak der Intensität des Lichtes und die Rate der Abnahme sanken mit abnehmender Fluoridkonzentration. Bei der niedrigsten Fluoridkonzentration war die Kinetik der Abnahme nicht mehr exakt 1. Ordnung. Es wurde festgestellt, daß andere auslösende Reagenzien, die bei den Dioxetanen 2a-e und 2g-i in DMSO oder DMF eine Chemilumineszenz erzeugen, Hydrazin, Kalium- und Tetraalkylammoniumhydroxid, Alkalimetall- und Tetraalkylammoniumalkoxid und Natriumazid einschließen. Kleine Mengen (< 5%) eines protischen Co-Lösungsmittels, wie Methanol, Ethanol oder Wasser, konnten verwendet werden, um das auslösende Mittel in DMSO zu lösen.
Die Dauer und die Intensität der Chemilumineszenz können durch die Wahl des Lösungsmittels, des auslösenden Mittels und des Verhältnisses von Dioxetan/auslösendem Mittel geändert werden. Für die Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignete Lösungsmittel schließen irgendein aprotisches Lösungsmittel, in dem die Reaktanten löslich sind, insbesondere molare Lösungsmittel, wie DMSO, Dimethylformamid, Acetonitril, p-Dioxan und dergleichen, ein. Die Reaktion kann zum Beispiel auch in einem Kohlenwasserstofflösungsmittel erfolgen, in dem nur einer der Reaktanten gelöst wird, und der anders wird nicht im Medium gelöst zugeführt. In diesem Fall wird das Licht von der Oberfläche des nicht gelösten Reaktanten emittiert.

Beispiel 24. Raten der ausgelösten Zersetzung der Dioxetane 2c, h, i

Fig. 2 zeigt eine typische Kurve der Intensität der Chemilumineszenz nach dem Auslösen einer aliquoten Menge von 10 ul einer 10&supmin;&sup6; m Lösung des Dioxetans 2h mit 50 ul 1 m TBAF in DMSO. Das Auslösen von sequentiellen 10-fachen Verdünnungen der Dioxetanlösung zeigte, daß eine 10&supmin;&sup9; m Lösung ein Signal lieferte, daß das 1,5-fache von dem des Hintergrunds betrug. Alle Kurven der Abnahme der Chemilumineszenz zeigten eine Kinetik, die scheinbar 1. Ordnung war. Die Halbwertszeiten der Abnahme waren von der Dioxetankonzentration im wesentlichen unabhängig. Tabelle 3. Raten und Intensität der Chemilumineszenz bei der von Fluorid ausgelösten Zersetzung des Dioxetans 2h als Funktion der Konzentration
Die Raten der von Fluorid ausgelösten Zersetzung der Dioxetane 2c, h, i und j wurden unter identischen Bedingungen in DMSO, d. h. aliquote Mengen von 10 ul einer 10&supmin;&sup6; m Lösung des Dioxetans mit 50 ul 1 m TBAF in DMSO, verglichen. Es wurde festgestellt, daß alle vier Dioxetane unter diesen Bedingungen einer Umsetzung mit im wesentlichen der gleichen Rate unterliegen. Tabelle 4. Vergleich der Raten der thermischen und der von Fluorid ausgelösten Zersetzung

Beispiel 25. Messung der relativen Quantenausbeuten der Chemilumineszenz

Die gesamte Intensität der Chemilumineszenz, die durch das Auslösen der Dioxetane 2c, g, h und i mit Fluorid erzeugt wurde, wurde unter identischen Bedingungen in DMSO, d. h. aliquote Mengen von 10 ul einer 10&supmin;&sup6; m Lösung des Dioxetans mit 50 ul 1 m TBAF in DMSO, verglichen. Die exakten Werte ließen sich schwer reproduzieren; es wurde jedoch festgestellt, daß alle vier Dioxetane unter diesen Bedingungen das gleiche Ausgangssignal der Chemilumineszenz innerhalb eines Faktors von 2 erzeugten. Bezogen auf die für das Dioxetan 2h aufgeführte Wirksamkeit der Chemilumineszenz von 25% (A. P. Schaap, T.-S. Chen, R. S. Handley, R. DeSilva und B. P. Gin, Tetrahedron Lett., 1155 (1987)) wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Dioxetane beim Auslösen in DMSO eine Chemilumineszenz mit einer höheren Wirksamkeit erzeugen.

Beispiel 26. Vergleich der Intensitäten der Chemilumineszenz-kinetisches Profil von Lösungen, die das Dioxetan 2f oder 2k enthalten

Um den unerwarteten Vorteil des erfindungsgemäßen Phosphatdioxetans 2f nachzuweisen, erfolgte ein Vergleich des zeitlichen Verlaufs der Chemilumineszenz von diesem Dioxetan, die in alkalischen Pufferlösungen von alkalischer Phosphatase (AP) hervorgerufen wurde, mit dem handelsüblichen Dioxetan 4-Methoxy-4-(3- phosphoryloxyphenyl)spiro[1,2-dioxetan-3,2'-tricyclo[3.3.1.13,7]decan], Dinatriumsalz, (LUMIGEN PPD, Lumigen, Inc., Soutrifield, MI), dem Dioxetan 2k. Fig. 3 zeigt die Zeitkurve und die relativen Intensitäten der Chemilumineszenz bei 37ºC von zwei Zusammensetzungen, wobei die eine 0,33 mM des erfindungsgemäßen Dioxetans 2f und die andere 0,33 mM des Dioxetans 2k im gleichen Puffer enthielt. Die Lichtemission wurde durch den Zusatz von 1,12 · 10&supmin;¹&sup7; mol AP zu 100 ul der Dioxetanlösung eingeleitet. Das Reagenz, das das erfindungsgemäße Dioxetan 2f enthält, erreicht eine deutlich höhere maximale Intensität.

Beispiel 27. Vergleich der Intensitäten der Chemilumineszenz-kinetisches Profil von Lösungen die das Dioxetan 2f oder 2k enthalten

Fig. 4 zeigt die Zeitkurve und die relativen Intensitäten der Chemilumineszenz bei 37ºC von zwei Zusammensetzungen, wobei die eine 0,33 mM des erfindungsgemäßen Dioxetans 2f und 1,0 mg/ml 1-(Tri-n-octylphosphoniummethyl)-4-(tri-n- butylphosphoniummethyl)benzoldichlorid (Verstärker A) und die andere 0,33 mM des Dioxetans 2k und 1,0 mg/ml des gleichen Verstärkers enthielt. Die Lichtemission wurde durch die Zugabe von 1,12 · 10&supmin;¹&sup7; mol AP zu 100 ul der Dioxetanlösung eingeleitet. Das Reagenz, das das erfindungsgemäße Dioxetan 2f enthält, erreicht zu allen Zeitpunkten höhere Lichtintensitäten.

Beispiel 28. Vergleich der Intensitäten der Chemilumineszenz - kinetisches Profil von Lösungen, die das Dioxetan 2f oder 2k enthalten

Fig. 5 zeigt die Zeitkurve und die relativen Intensitäten der Chemilumineszenz bei 37ºC von zwei Zusammensetzungen, wobei die eine 0,33 mM des erfindungsgemäßen Dioxetans 2f und 0,5 mg/ml Polyvinylbenzyltributylphosphoniumchlorid (Verstärker B) und die andere 0,33 mM des Dioxetans 2k und 1,0 mg/ml des gleichen Verstärkers enthielt. Die Lichtemission wurde durch die Zugabe von 1,12 · 10&supmin;¹&sup7; mol AP zu 100 ul der Dioxetanlösung eingeleitet. Das Reagenz, das das erfindungsgemäße Dioxetan 2f enthält, erreicht zu allen Zeitpunkten höhere Lichtintensitäten.

Beispiel 29. Vergleich der Intensitäten der Chemilumineszenz - kinetisches Profil von Lösungen, die das Dioxetan 2f oder 2k enthalten

Fig. 6 zeigt die Zeitkurve und die relativen Intensitäten der Chemilumineszenz bei 37ºC von zwei Zusammensetzungen, wobei die eine 0,33 mM des erfindungsgemäßen Dioxetans 2f und 0,5 mg/ml Polyvinylbenzyltributylphosphoniumchlorid, copolymerisiert mit Polyvinylbenzyltrioctylphosphoniumchlorid (weist ein Verhältnis der Gruppen Tributyl : Trioctyl von 3 : 1 auf) (Verstärker C) und die andere 0,33 mM des Dioxetans 2k und 0,5 mg/ml des gleichen Verstärkers enthielt. Die Lichtemission wurde durch die Zugabe von 1,12 · 10&supmin;¹&sup7; mol AP zu 100 ul der Dioxetanlösung eingeleitet. Das Reagenz, das das erfindungsgemäße Dioxetan 2f enthält, erreicht zu allen Zeitpunkten höhere Lichtintensitäten.

Beispiel 30. Linearität und Empfindlichkeit des Nachweises von alkalischer Phosphatase mit dem Dioxetan 2f

Es wurde die Linearität des Nachweises von AP unter Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenz bestimmt, das das Dioxetan 2f enthielt. In 48 Vertiefungen einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen wurden jeweils 100 ul einer 0,33 mM Lösung der Verbindung 2f im Puffer 0,2 m 2-Methyl-2-amino-1-propanol, pH = 9,6, der 0,88 mM Mg&spplus;² enthielt, und 1,0 mg/ml des Verstärkers A gegeben. Die Platte wurde bei 37ºC inkubiert, und die Emission der Chemilumineszenz wurde durch die Zugabe von 3 ul AP- Lösungen eingeleitet, die 3,36 · 10&supmin;¹&sup6; mol bis 3,36 · 10&supmin;²² mol Enzym enthalten. Die Lichtintensitäten wurden bei 10 Minuten gemessen. Fig. 7 zeigt den linearen Nachweis von alkalischer Phosphatase. Der Betriff S-B betrifft das Chemilumineszenzsignal (S) in RLE in Gegenwart von alkalischer Phosphatase (AP), das in bezug auf die Hintergrund- Chemilumineszenz (8) ohne AP korrigiert worden ist. Die berechnete Nachweisgrenze (doppelte Standardabweichung des Hintergrundes) wurde unter diesen Bedingungen mit 2,0 · 10&supmin;²² mol oder 120 Molekülen AP bestimmt.

Beispiel 31. Vergleich der Quantenausbeuten der Chemilumineszenz

Die relativen Quantenausbeuten der Chemilumineszenz der Dioxetane 2f und 2k wurden in Lösungen bestimmt, die 1 mg/ml des Verstärkers C im Puffer 0,2 m 2-Amino-2-methyl- 1-propanol, pH = 9,6, der 0,88 mM Mg&spplus;² enthielt, und ausgewählte Verstärker enthielten, wie es in Tabelle 4 aufgeführt ist. Aliquote Mengen jedes Reagenz mit 100 ul wurden durch die Zugabe von 3,36 · 10&supmin;¹³ mol alkalische Phosphatase vollständig dephosphoryliert. Die Gesamtmenge des emittierten Lichtes in relativen Lichteinheiten (RLE) wurde integriert, bis die Lichtemission aufhörte. Ein ähnlicher Vergleich wurde auch mit 500 ul Portionen der Formulierungen ohne irgendeinen Verstärker durchgeführt, wobei der Puffer 2-Amino-2-methyl-1-propanol entweder mit 0,2 m oder mit 0,75 m, pH = 9,6, verwendet wurde, der 0,88 mM Mg&spplus;² enthielt. Im Puffer allein und in Gegenwart der Verstärker A und C erzeugt das Dioxetan 2f mehr Licht als das Dioxetan 2k. Tabelle 5. Gasamte Lichtintensität von Phosphatdioxetanen

Beispiel 32. Stabilität des Dioxetans 2f in wäßrigen Lösungen

Die thermische und hydrolytische Beständigkeit einer 0,33 mM Lösung des Dioxetans 2f, die 1 mg/ml des Verstärkers A im Puffer 0,2 m 2-Amino-2-methyl-1-propanol, pH = 9,6, und 0,88 mM Mg&spplus;² enthielt, wurde bei 37ºC bestimmt. Die Lösungen des Dioxetans wurden bei Raumtemperatur und 5 Tage bei 37ºC gehalten. 12 Vertiefungen einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen wurden jeweils 100 ul jeder Lösung zugegeben. Die Platte wurde bei 37ºC inkubiert, und die Emission der Chemilumineszenz wurde durch die Zugabe von 10 ul von Lösungen eingeleitet, die 1,1 · 10¹&sup5; mol AP enthielten. Die Lichtintensitäten wurden 2,5 Stunden lang integriert. Die Stabilität des Dioxetans wurde festgestellt, indem die durchschnittliche Lichtausbeute der Probe, die bei 37ºC inkubiert worden war, mit der Lösung verglichen wurde, die bei Raumtemperatur gehalten worden war. Eine Verringerung der emittierten Lichtmenge weist auf eine Zersetzung des Dioxetans während des Inkubationszeitraums hin. Die bei 37ºC gehaltene Lösung war der Lösung mit Raumtemperatur identisch, was darauf hinweist, daß das Dioxetan unter diesen Bedingungen stabil war.

Beispiel 33. Chemilumineszenznachweis von alkalischer Phosphatase auf einer Membran

Die Eignung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung für den Chemilumineszenznachweis von Enzymen auf der Oberfläche von Blotting-Membranen wird im nachfolgenden Beispiel gezeigt. Lösungen von alkalischer Phosphatase in Wasser, die 1,1 fmol bis 1,1 amol enthalten, wurden auf identische Membranen aus Nylon® (Micron Separations Inc., Westboro, MA) aufgebracht. Die Membranen wurden 5 Minuten luftgetrocknet und kurz mit einem Reagenz eingeweicht, das 1 mg/ml des Verstärkers A im Puffer 0,2 m 2-Amino-2-methyl-1-propanol, pH = 9,6, der 0,88 mM MgCl enthielt, und entweder 0,33 mM des Dioxetans 2f oder 0,33 mM des Dioxetans 2k enthielt. Die Membranen wurden zwischen durchsichtigen Folien angeordnet und einem Röntgenfilm (Kodak X-OMAT AR, Rochester, NY) ausgesetzt. Fig. 8 zeigt, daß das mit den beiden Dioxetanen erzeugte Licht zu äquivalenten Bildern und einer äquivalenten Empfindlichkeit des Nachweises führte. Diese Ergebnisse zeigen die Leistung des Dioxetans 2f, die beim Western-Blotting, Southern-Blotting, DNA-Fingerprint und anderen Blotting- Anwendungszwecken zu erwarten ist.

Claims

1. 1,2-Dioxetan-Verbindung der Formel

worin

R&sub1; aus einer Alkyl-, Cycloalkyl- und Arylgruppe ausgewählt ist, die 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub2; aus einer Aryl-, Biaryl-, Heteroarylgruppe, einer kondensierten polycyclischen Aryl- oder Heteroarylgruppe ausgewählt ist, die außerdem Substituenten enthalten können, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer verzweigten Alkyl- und einer Cycloalkylgruppe ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, und OX aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OH, OOCR&sub6;, wobei R&sub6; aus einer Alkyl- und einer Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, einer Triarylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OPOCl&sub2;, OPO(OR&sub7;)&sub2;, wobei R&sub7; ein organischer Rest ist, OSO&sub3;&supmin;, einer β-D- Galactosidoxy- und β-D-Glucuronidyloxygruppe besteht.

2. Dioxetan nach Anspruch 1, wobei R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer verzweigten Alkyl- und einer Cycloalkylgruppe mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind.

3. Dioxetan nach Anspruch 2, wobei R&sub3; und R&sub4; gleich sind und jeweils eine Isopropyl-, Cyclohexyl- oder Cyclopropylgruppe sind.

4. 1,2-Dioxetan-Verbindung der Formel:

worin

R&sub1; aus einer Alkyl-, Cycloalkyl- und Arylgruppe ausgewählt ist, die 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub2; aus einer Aryl-, Biaryl-, Heteroarylgruppe, einer kondensierten polycyclischen Aryl- oder Heteroarylgruppe ausgewählt ist, die außerdem Substituenten enthalten können, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer Cycloalkylgruppe ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthält und außerdem Substituenten aufweisen kann, und OX aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OH, OOCR&sub6;, wobei R&sub6; aus einer Alkyl- und einer Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, einer Trialkylsilyloxy-, Triarylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OPOCl&sub2;, OPO(OR&sub7;)&sub2;, wobei R&sub7; ein organischer Rest ist, einem OPO&sub3;²&supmin;-Salz, OSO&sub3;-, einer β-D- Galactosidoxy- und β-D-Glucuronidyloxygruppe besteht.

5. Dioxetan nach Anspruch 4, wobei R&sub3; und R&sub4; gleich und jeweils eine Cyclohexyl- oder Cyclopropylgruppe sind.

6. Dioxetan nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei R&sub2; eine m-Phenylgruppe ist, die in der m-Position zum Dioxetanring mit der OX-Gruppe substituiert ist und an der Phenylgruppe außerdem Substituenten aufweisen kann.

7. Dioxetan nach Anspruch 6, wobei die Gruppe R&sub2; eine unsubstituierte m-Phenylgruppe ist.

8. Dioxetan nach einem der vorstehenden Ansprüche, die aus Verbindungen ausgewählt ist, die die Formel haben:

9. Verfahren zum Erzeugen von Licht aus einem Dioxetan, das die folgenden Schritte aufweist:

(a) Bereitstellen eines 1,2-Dioxetans mit der nachstehenden Formel in einer Einheit, in der Licht erzeugt werden soll:

worin

R&sub1; aus einer Alkyl-, Cycloalkyl- und Arylgruppe ausgewählt ist, die 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub2; aus einer Aryl-, Biaryl-, Heteroarylgruppe, einer kondensierten polycyclischen Aryl- oder Heteroarylgruppe ausgewählt ist, die außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer verzweigten Alkyl- und einer Cycloalkylgruppe ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, und OX aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OH, OOCR&sub6;, wobei R&sub6; aus einer Alkyl- und einer Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, einer Triarylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OPOCl&sub2;, OPO(OR&sub7;)&sub2;, wobei R&sub7; ein organischer Rest ist, OSO&sub3;&supmin;, einer β-D-Galactosidoxy- und β-D-Glucuronidyloxygruppe besteht, und

(b) Auslösen des Dioxetans durch Entfernen der Gruppe X mit einem Reagenz, wodurch ein Zwischenprodukt der 1,2- Dioxetan-Verbindung in Form eines instabilen Oxids erzeugt wird, das sich zersetzt, wodurch Licht und 2 Carbonylverbindungen der Formel

erzeugt werden.

10. Verfahren zum Erzeugen von Licht aus einem Dioxetan, das die folgenden Schritte aufweist:

worin

R&sub1; aus einer Alkyl-, Cycloalkyl- und Arylgruppe ausgewählt ist, die 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub2; aus einer Aryl-, Biaryl-, Heteroarylgruppe, einer kondensierten polycyclischen Aryl- oder Heteroarylgruppe ausgewählt ist, die außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer Cycloalkylgruppe ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthält und außerdem Substituenten aufweisen kann, und OX aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OH, OOCR&sub6;, wobei R&sub6; aus einer Alkyl- und einer Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, einer Trialkylsilyloxy-, Triarylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OPOCl&sub2;, OPO(OR&sub7;)&sub2;, wobei R&sub7; ein organischer Rest ist, OPO&sub3;²&supmin;-Salzen, OSO&sub3;&supmin;, einer β-D- Galactosidoxy- und β-D-Glucuronidyloxygruppe besteht, und

(b) Auslösen des Dioxetans durch Entfernen der Gruppe X mit einem Reagenz, wodurch ein Zwischenprodukt der 1,2- Dioxetan-Verbindung in Form eines instabilen Oxids erzeugt wird, das sich zersetzt, wodurch Lieht und 2 Carbonylverbindungen der Formel

erzeugt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei das Dioxetan in einer wäßrigen Lösung bereitgestellt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die wäßrige Lösung eine Verstärkersubstanz aufweist, die die Lichtmenge, die durch Umsetzen des Dioxetans mit dem Reagenz erzeugt wird, im Vergleich mit der Menge erhöht, die ohne diesen Verstärker erzeugt wird.

13. Verfahren zum Erzeugen von Licht aus einem Dioxetan, das die folgenden Schritte aufweist:

(a) Bereitstellen eines 1,2-Dioxetans mit der nachstehenden Formel in einer Einheit, in der Licht erzeugt werden soll, und in einer wäßrigen Lösung:

worin

R&sub1; aus einer Alkyl-, Cycloalkyl- und Arylgruppe ausgewählt ist, die 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub2; aus einer Aryl-, Biaryl-, Heteroarylgruppe, einer kondensierten polycyclischen Aryl- oder Heteroarylgruppe ausgewählt ist, die außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer verzweigten Alkyl- und einer Cycloalkylgruppe ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, und OX aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OH, OOCR&sub6;, wobei R&sub6; aus einer Alkyl- und einer Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, einer Trialkylsilyloxy-, Triarylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OPOCl&sub2;, OPO(OR&sub7;)&sub2;, wobei R&sub7; ein organischer Rest ist, OPO&sub3;²&supmin;-Salzen, OSO&sub3;&supmin;, einer β-D- Galactosidoxy- und β-D-Glucuronidyloxygruppe besteht, und

erzeugt werden, in Gegenwart einer Verstärkersubstanz die die Lichtmenge, die durch Umsetzen des Dioxetans mit dem Reagenz erzeugt wird, im Vergleich mit der Menge erhöht, die ohne diesen Verstärker erzeugt wird, mit der Maßgabe, daß der Verstärker von einem Salz des quaternären Ammoniumions Poly(vinylbenzyl(benzyldimethyl)ammonium (BDMQ) verschieden ist, wenn das Dioxetan eine Verbindung ist, bei der X PO&sub3;²&supmin; ist, R&sub1; eine Methylgruppe ist, R&sub2; eine m- Phenylengruppe ist, R&sub3; eine t-Butylgruppe ist und R&sub4; eine Neopentyloxymethylgruppe ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, wobei der Verstärker aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus oberflächenaktiven Mitteln in Form eines polymeren quaternären Ammoniumsalzes, eine Polyvinylbenzyltrialkylphosphonium-Gruppe enthaltenden Polymeren und dikationischen oberflächenaktiven Mitteln der Formel

Y&supmin; R&sub3;A&spplus;CH&sub2;-Link-CH&sub2;A&spplus;R&sub3; Y&supmin;

besteht, wobei A jeweils aus einem P- und einem N-Atom ausgewählt sein kann und Link ein organischer Brückenrest ist, der mindestens 2 Kohlenstoffatome enthält und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer substituierten und unsubstituierten Aryl-, Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppe besteht, und Link Heteroatome enthalten kann, und R aus einer Niederalkyl- und Aralkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, und Y ein Anion ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, das ein Assay ist, bei dem das erzeugte Licht dazu dient, das Vorhandensein oder die Menge einer Substanz in einer Probe zu bestimmen.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, wobei die in dem Assay zu bestimmende Substanz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Enzymen, enzymverbundenen Haptenen, enzymverbundenen Antigenen, enzymverbundenen Antikörpern und enzymverbundenen Oligonucleotiden besteht.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei das Licht in einer Lösung oder auf einem festen Träger erzeugt wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 18, wobei das Dioxetan eine Verbindung nach einem der Ansprüche 2, 5, 6 oder 8 ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 18, wobei das Reagenz, das die Gruppe X entfernt, ein Enzym ist.

20. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Reagenz, das Gruppe X entfernt, alkalische Phosphatase ist, und die Gruppe X eine PO&sub3;²&supmin;-Gruppe ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Dioxetan die Formel hat:

22. Zusammensetzung, die in einer wäßrigen Lösung folgendes aufweist:

(a) ein 1,2-Dioxetan der Formel:

worin

R&sub1; aus einer Alkyl-, Cycloalkyl- und Arylgruppe ausgewählt ist, die 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub2; aus einer Aryl-, Biaryl-, Heteroarylgruppe, einer kondensierten polycyclischen Aryl- oder Heteroarylgruppe ausgewählt ist, die substituiert oder unsubstituiert sein können, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer verzweigten Alkyl- oder einer Cycloalkylgruppe ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, und X eine Gruppe ist, die durch ein Reagenz entfernt werden kann, und

(b) eine Verstärkersubstanz die die Lichtmenge, die durch Umsetzen des Dioxetans mit dem Reagenz erzeugt wird, im Vergleich mit der Menge erhöht, die ohne diesen Verstärker erzeugt wird, wobei der Verstärker von der quaternären Ammoniumverbindung BDMQ verschieden ist, wenn das Dioxetan eine Verbindung ist, in der R&sub1; eine Methylgruppe ist, X PO&sub3;²&supmin; ist, R&sub2; eine m-Phenylengruppe ist, R&sub3; eine t- Butylgruppe ist und R&sub4; eine 3-Neopentyloxymethylgruppe ist.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei der Verstärker aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus oberflächenaktiven Mitteln in Form eines polymeren quaternären Ammoniumsalzes, eine Polyvinylbenzyltrialkylphosphonium-Gruppe enthaltenden Polymeren und dikationischen oberflächenaktiven Mitteln der Formel

Y&supmin; R&sub3;A&spplus;CH&sub2;-Link-CH&sub2;A&spplus;R&sub3; Y&supmin;

24. Zusammensetzung nach Anspruch 22 oder Anspruch 23, wobei das Dioxetan eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 ist.

25. Verbindung mit der Formel:

worin R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer verzweigten Alkyl- und einer Cycloalkylgruppe, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, ausgewählt sind, R&sub5; eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist und OX aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OOCR&sub6;, wobei R&sub6; aus einer Alkyl- und einer Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, einer Triarylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OPOCl&sub2;, OPO(OR&sub7;)&sub2;, wobei R&sub7; ein organischer Rest ist, OSO&sub3;&supmin;, einer β-D-Galactosidoxy- und β-D- Glucuronidyloxygruppe besteht.

26. Verbindung nach Anspruch 25, wobei R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer verzweigten Alkyl- und einer Cycloalkylgruppe mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind und R&sub5; eine Methylgruppe ist.

27. Verbindung nach Anspruch 23, wobei R&sub3; und R&sub4; gleich sind und jeweils eine Isopropyl-, Cyclohexyl- oder Cyclopropylgruppe sind.

28. Verbindung mit der Formel:

worin R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer Cycloalkylgruppe ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthält und außerdem Substituenten aufweisen kann, R&sub5; eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist und OX aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OOCR&sub6;, wobei R&sub6; aus einer Alkyl- und einer Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, einer Trialkylsilyloxy-, Triarylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OPOCl&sub2;, OPO(OR&sub7;)&sub2;, wobei R&sub7; ein organischer Rest ist, OPO&sub3;²&supmin;-Salzen, OSO&sub3;&supmin;, einer β-D- Galactosidoxy- und β-D-Glucuronidyloxygruppe besteht.

29. Verbindung nach Anspruch 28, wobei die Gruppen R&sub3; und R&sub4; gleich sind und jeweils eine Cyclohexyl- oder Cyclopropylgruppe sind.

30. Verbindung nach Anspruch 25 oder 26, wobei X aus einer Acetylgruppe, einer Benzoylgruppe und einer Pivaloylgruppe ausgewählt ist.

31. Verfahren zum Synthetisieren einer 1,2-Dioxetan-Verbindung der Formel:

worin

R&sub1; eine Alkylgruppe ist, die 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthält und außerdem Substituenten aufweisen kann, R&sub2; aus einer Aryl-, Biaryl-, Heteroarylgruppe, einer kondensierten polycyclischen Aryl- oder Heteroarylgruppe ausgewählt ist, die außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer verzweigten Alkyl- und einer Cycloalkylgruppe ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, und OX aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OH, OOCR&sub6;, wobei R&sub6; aus einer Alkyl- und einer Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, einer Triarylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OPOCl&sub2;, OPO(OR&sub7;)&sub2;, wobei R&sub7; ein organischer Rest ist, OSO&sub3;&supmin;, einer β-D-Galactosidoxy- und β-D-Glucuronidyloxygruppe besteht,

wobei eine Alkenverbindung der Formel:

worin R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer verzweigten Alkyl- und einer Cycloalkylgruppe ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub5; eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist und OX wie in der Dioxetanverbindung ist, in Gegenwart von Licht und eines Sensibilisierungsmittels mit Sauerstoff umgesetzt wird, wodurch das entsprechende Dioxetan erzeugt wird.

32. Verfahren zum Synthetisieren einer 1,2-Dioxetan-Verbindung der Formel:

worin

R&sub1; eine Alkylgruppe ist, die 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthält und außerdem Substituenten aufweisen kann, R&sub2; aus einer Aryl-, Biaryl-, Heteroarylgruppe, einer kondensierten polycyclischen Aryl- oder Heteroarylgruppe ausgewählt ist, die außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer Cycloalkylgruppe ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthält und außerdem Substituenten aufweisen kann, und OX aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OH, OOCR&sub6;, wobei R&sub6; aus einer Alkyl- und einer Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, einer Triarylsilyloxy-, Trialkylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OPOCl&sub2;, OPO(OR&sub7;)&sub2;, wobei R&sub7; ein organischer Rest ist, OPO&sub3;²&supmin;-Salzen, OSO&sub3;&supmin;, einer β-D-Galactosidoxy- und β-D-Glucuronidyloxygruppe besteht,

wobei eine Alkenverbindung der Formel:

worin R&sub3; und R&sub4; wie in der Dioxetanverbindung sind, R&sub5; eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist und OX wie in der Dioxetanverbindung ist,

in Gegenwart von Licht und eines Sensibilisierungsmittels mit Sauerstoff umgesetzt wird, wodurch das entsprechende Dioxetan erzeugt wird.

33. Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Alkenverbindung eine Verbindung nach Anspruch 26 oder 30 ist.

34. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Alken eine Verbindung nach Anspruch 29 ist.

35. Verfahren zum Synthetisieren einer Alkenverbindung der Formel

worin

R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer verzweigten Alkyl- und einer Cycloalkylgruppe ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten und außerdem Substituenten aufweisen können, R&sub5; eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist und OX aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OOCR&sub6;, wobei R&sub6; aus einer Alkyl- und einer Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, einer Triarylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OPOCl&sub2;, OPO(OR&sub7;)&sub2;, wobei R&sub7; ein organischer Rest ist, OSO&sub3;&supmin;, einer β-D-Galactosidoxy- und β-D- Glucuronidyloxygruppe besteht,

durch Koppeln eines Dialkylketons der Formel R&sub3;COR&sub4;, worin R&sub3; und R&sub4; wie bei der Alkenverbindung definiert sind, und eines Arylcarboxylatesters der Formel R¹OCOR²OX, worin R¹, R² und X wie für die Alkenverbindung definiert sind, in Gegenwart von Lithiumaluminiumhydrid oder eines anderen Metallhydrids, von metallischem Zink oder eines Zink-Kupfer-Paars in einem polaren aprotischen Lösungsmittel mit einem Salz eines Übergangsmetallhalogenids und einer Base aus einem tertiären Amin.

36. Verfahren zum Synthetisieren einer Alkenverbindung der Formel

worin

R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus einer Cycloalkylgruppe ausgewählt sind, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome enthält und außerdem Substituenten aufweisen kann, R&sub5; eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist und OX aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OOCR&sub6;, wobei R&sub6; aus einer Alkyl- und einer Arylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, einer Trialkylsilyloxy-, Triarylsilyloxy-, Aryldialkylsilyloxygruppe, OPOCl&sub2;, OPO(OR&sub7;)&sub2;, wobei R&sub7; ein organischer Rest ist, OPO&sub3;²&supmin;- Salzen, OSO&sub3;&supmin;, einer β-D-Galactosidoxy- und β-D- Glucuronidyloxygruppe besteht,

durch Koppeln eines Dialkylketons der Formel R³COR&sup4;, worin R&sub3; und R&sub4; wie bei der Alkenverbindung definiert sind, und eines Arylcarboxylatesters der Formel R&sub1;OCOR&sub2;OX, worin R&sub1;, R&sub2; und X wie für die Alkenverbindung definiert sind, in Gegenwart von Lithiumaluminiumhydrid oder eines anderen Metallhydrids, von metallischem Zink oder eines Zink-Kupfer-Paars in einem polaren aprotischen Lösungsmittel mit einem Salz eines Übergangsmetallhalogenids und einer Base aus einem tertiären Amin.