JPH10505418A

JPH10505418A - 空気伝達性粒子に係る分子の検出

Info

Publication number: JPH10505418A
Application number: JP8508347A
Authority: JP
Inventors: ユアンロジャートヴィ，
Original assignee: ザユニバーシティオブシドニー
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1995-08-25
Publication date: 1998-05-26
Also published as: EP0777858A1; AUPM765894A0; WO1996007099A1; EP0777858A4; US5955376A

Abstract

(57)【要約】空気伝達性粒子と関連した抗原性もしくはアレルギー性分子の検出方法。粒子（１０）を膜（１１）上に回収し、関連した分子を粒子から溶出し、粒子（１０）の近くに固定する。分子が抗原性もしくはアレルゲン性であることを同定してもよく、抗原性もしくはアレルゲン性分子を保有する関連粒子を同定してもよい。膜（１１）はニトロセルロースもしくは他のタンパク結合物質から形成することができる。この場合、膜（１１）上の粒子（１０）は、粒子を表面に保持し、粒子から可溶性タンパク質（１３）を溶出させるために、水和アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル（１２）の薄層で保持されてもよい。

Description

【発明の詳細な説明】空気伝達性粒子に係る分子の検出発明の分野本願発明は、関心の向けられた高分子の検出方法、およびこれらの高分子と関連する粒子の同定方法に関する。特に、本発明は、粒子が特定のクラスに属することを同定できるように、粒子から高分子を拡散することと、それらの高分子を粒子の近くに結合することに基づいている。従来技術流体中の粒子が、疾患、環境的ダメージを引き起こしたり、もしくは他の何らかの理由に関与する状況は多い。ある場合には、流体は大量の種々の粒子を含むことがある。この場合、どの粒子が、研究されるべき影響を引き起こすのかを決定することは困難である。特定の例としては、喘息は、空気伝達性アレルゲンと関係すると信じられている。しかしながら、空気中には多くの空気伝達性アレルゲンが存在し得るが、一つもしくはいくつかのみが喘息を引き起こす。喘息は、公衆の全ての年齢層が罹患する慢性疾患である。喘息の研究は、疾患に関与するアレルゲン暴露の特徴を同定および測定するのに適した方法が不足しているために妨げられてきた。これらの特徴は、（１）アレルゲンの同定；（２）アレルゲンの定量；並びに（３）アレルゲン源である粒子のサイズ、を含む。患者の環境に存在するどの粒子が、観察された症状の原因となっているのかを知ることが望ましい。これによってアレルゲン源を同定することができ、コンディションを予防処置するためのメカニズムを示唆する。粘着表面上に花粉粒子を回収し、形態学的基準でこれらを同定し、個々にそれらを数えることによって花粉アレルゲンに対する暴露を評価することが長く慣例的である。カビ暴露も、生物学的および／または形態学適方法で同様に観察されている。これらのいずれの場合でも、同定されうる生物学的粒子が、サンプルの環境に存在するアレルゲンの量の代理として用いられる。これらの方法は、高度に熟練した操作が必要であり、大変な労力を必要とする。また、特定の粒子が存在するからといって、その粒子が関心の向けられたアレルゲンの源であるとは示唆されないという問題がある。適切な特異的抗血清が利用できる場合には、フィルターに回収され捕獲された材料の水性抽出物に基づく多くの源（花粉、ダニ、菌類、動物のフケ(animal da nder)等）からのアレルゲンのイムノアッセイが、速さと単純さにおいて優れている。これらの方法により、特定のアレルゲンへの暴露を定量することもできる。しかしながら、アレルゲンは回収された粒子の全体的なサンプルから抽出されるので、特定のアレルゲンと各粒子との間に上記方法によって確立された一対一の関係はない。しかして、観察された症状と一般に関連する方法で、特定の種類の粒子と患者の感作とを関連づけることは不可能である。粒子検出および分析の既知の方法では、アレルゲン暴露を特徴づけることに関する最も基本的な問い、すなわち“患者がアレルギー性を示すのはどの空気伝達性アレルゲンか”という問いに、容易に答えられない。スキンプリック試験(ski n-prick test)、ＲＡＳＴアッセイおよび医師による問診は、どのアレルゲンが観察された症状を引き起こすのか、はっきりさせることができない。患者がいつ感作性アレルゲンに曝されたかを調べることができず、また、試験パネルに含まれていないアレルゲンに対する感作を検出することができないので、場合によっては、このような試験を用いることはかなりの誤解を生じることがある。特異的な原因アレルゲンを同定することは、多くの臨床的な状況で重要であるだけでなく、より一般的な意味において、存在するかもしれない種々のアレルゲンの組成を理解するために、暴露状況の横断的研究(a cross sectional study) をすることも不可能である。アレルゲン源そのものを同定することに特異的に焦点を絞った方法はない。これは、アレルギー性疾患が増加していると言われる時代ではさらに重要であるが、新規の、未同定の、存在しうるアレルゲンがあるかどうか知るために環境をプローブすることは未だ不可能である。各空気伝達性ダニ糞便粒子が、アレルゲン特異的抗体を含むアガロースのベッド上にそれらを埋伏させた後にその周りにできた免疫沈降のリングによって同定されることが、Tovey ERら，Am．Rev．Resp．Dis．1981; 124:630-635に示されている。粒子の同定を、顕微鏡で行うことができる。このシステムに係る問題は、アガロースベッドの暴露時間が大変短いことと、所定の抗原に特異的な特異的ポリクローナルハイタイター（ハイパーイムノ）抗血清のみしか用いられないことである。このようなハイタイター血清は、普通は、関心の向けられたアレルゲンまたは抗原とアジュバントとを繰り返し注射された、ウサギ等の動物からのみ利用される。この方法は、アレルギー患者の血清中のＩｇＥ抗体もしくはモノクローナル抗体と直接作用しない。これらのいずれの場合でも、視覚的な免疫沈降は形成されない。個々の粒子からの抗原をプレスブロットするためにニトロセルロース膜を使用する可能性が、Schumackerら．J．Al．Clin．Imm．1988; 82:608-16に記載されている。この方法では、免疫染色された抗原が、それらが由来する特異的粒子と関連づけることができないように、回収された粒子とニトロセルロースアレルゲンブロットとが分離されている。発明の開示本発明は、粒子と関連した高分子種の検出および同定方法からなり、以下の工程ａ）表面上に粒子を回収する工程、ｂ）もし存在すれば、高分子種を粒子の外に拡散させる工程、ｃ）粒子の近くに拡散された高分子を固定する工程、およびｄ）高分子がもしあれば、結合された高分子とこれらの高分子を拡散した粒子とを近くに維持しながら、高分子の存在もしくは非存在を検出する工程、を含む。本発明の方法は、患者のアレルギー反応の源の同定に特に適用できる。患者の近くの空気を採取し、採取された空気中の粒子を回収してもよい。これらの粒子中の抗原が粒子の外に拡散し、粒子の近くに結合した後に、患者がアレルギーを示す抗原とアレルギーを示さない抗原とを区別するために、患者の血清を用いてもよい。アレルゲンがその元となる粒子の近くに結合しているので、視覚的もしくは別の方法で粒子を同定することができる。他の態様では、患者にとって抗原性もしくはアレルギー性の高分子を検出する方法、およびこれらの高分子と関連する粒子を同定する方法からなり、この方法は、ａ）表面上に粒子を回収する工程、ｂ）前記粒子に関連する可溶性高分子を粒子の外に拡散させる工程、ｃ）粒子の近くに粒子から拡散された、少なくともいくつかの抗原性もしくはアレルギー性高分子を固定する工程、ｄ）患者にとって抗原性もしくはアレルギー性の固定された高分子を検出する工程、およびｅ）高分子と関連する、高分子が拡散された粒子を同定する工程、を含む。好ましい実施態様では、本発明は、多くのアレルゲンが、それらを保有する粒子内に濃縮された高度に可溶性のタンパタ質として天然に存在するという知見を利用する。しかして、全体的な抗原暴露は非常に小さいかもしれないが、粒子、しかして単位体積当たりの抗原濃度は非常に高いことがわかった。粒子から拡散する大量のアレルゲン分子は容易に視覚化されるので、この発見により抗原保有粒子の検出が可能になる。この方法は、他の目的にも用いることができる。水流もしくは気流等の液体流から、細菌、ウイルスもしくは他の生物学的材料の粒子を回収するために用いられる。また、症状の診断を援助するために、排気中の粒子を特徴づけるためにも用いることができる。必要であれば、検出可能な高分子を拡散させるために、細菌もしくは他の粒子を溶解した後に、細菌もしくは他の粒子の性質を確かめてもよい。粒子は、典型的には、１００μ未満であり、多くの場合２０μ未満である。アレルゲン保有粒子のサイズは、アレルゲン源、および同じ源であっても種々の時間により異なる。臨床的関連性は、約１０μより大きい直径の粒子は、呼吸管の下方に入り、急性症状を直接引き起こす機会が非常に低いということである。猫アレルゲン(cat allergens)は、例えば、大きい粒子と、典型的に３μより小さい直径の小さい粒子の両方に関係し、小さい粒子は実質的、連続的に空気伝達性である。対称的に、ダニアレルゲンは、主に７〜４０μの直径の糞便粒子に関係する。ライグラス(Rye grass)の場合は、アレルゲンは、花粉粒子である巨大粒子、および花粉によって放出されたデンプン顆粒である小さな“サブミクロニック (sub-micronic)”粒子に生じる。本明細書で用いられているように、用語“近くに”とは、拡散された高分子の結合に関して、結合が十分に近く、拡散された高分子もしくは高分子群と特定の粒子とを独自に結びつける堅固な可能性があることを意味する。実際の最大距離は、表面上で粒子が離れる範囲、溶出された物質を結合する表面および／またはあらゆる積層の能力および結合力；粒子から溶出された高分子の量、および拡散高分子を検出するために用いられたアッセイ技術の感度に関係する。この最後の点で、拡散された高分子の濃度は、視覚化もしくは拡散された高分子の他の検出に重要である。もし高分子がそれらが関連する粒子からあまりに遠くに拡散したら、その濃度が低くなって検出できなくなるかもしれない。本発明の好ましい実施態様では、高分子の拡散および結合により、粒子サイズおよび他の理由に依存して、高分子が由来する粒子の外延から１０〜２００ミクロン、より好ましくは５０〜１００ミクロンの間に高分子の大半が結合されるようにする。相対的に、この結合は、粒子の直径の１〜１０倍の距離の範囲内であって、９０％より多くの高分子が、粒子の直径の５倍に相当する半径内に結合しているべきである。粒子から放出される高分子種は、タンパク質、核酸、糖タンパク質、ポリサッカリドもしくは他の類似分子とすることができる。典型的には、高分子種は水溶性であって、単に粒子を回収した表面の湿気を保つことによって、もしくは粒子の回収の前に表面を湿らせることによって、粒子の外側に拡散を引き起こすものである。別の場合では、可溶化するか、粒子を処理して高分子種を放出させる必要がある。粒子から拡散されうる、あるいは放出されうるあらゆる高分子は、その粒子と関連していると見なされる。濾過、埋伏(impaction)、もしくは回収した別の表面からの転写によって、粒子を表面上に回収してもよい。この表面は、ジェット状の空気もしくは水の流れ等の流体の流れに粒子が含まれることによって、粒子が埋伏した表面であってもよい。流体の流れは横にそれるが、流体の流れの中の粒子は、その慣性によって表面に埋伏する。濾過は、例えばニトロセルロースでできた安定な膜、もしくは細穴が粒子より小さいヌクレオポア膜(a nucleopore membrane)を用いて行うことができる。所望であれば、表面における粒子の保持力を増大させるため、および／または粒子もしくは高分子の生物学的活性の必要な面の保存を助けるために、表面を粘着物質で被覆してもよい。粒子から拡散された分子は、適切なあらゆる方法で粒子の近くに結合されてもよい。可溶性分子は、疎水性相互作用、親水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス力、静電的相互作用もしくは共有結合の一つ以上の機構によって溶出した物質を結合しうる膜上に、粒子から溶出されてもよい。例えば、タンパク質、糖タンパク質および核酸を結合するために、ニトロセルロース、ナイロンおよびポリビニリジンフルオリド(polyvinylidine)膜を用いてもよい。本発明の好ましい実施態様の一つでは、粒子はニトロセルロース等の膜、すなわち溶出されたタンパク質を結合することができる膜に捕獲される。粒子は、例えば１０〜５０μｍの厚みの緩衝水性ゲル（例えばアガロースもしくはポリアクリルアミドの一方）の薄層、もしくは多孔性の、水性の、親水性膜で積層される。このような層もしくはゲルは、粒子から可溶性タンパク質を溶出するために湿気を提供することができ、タンパク質が膜と平行に広く分散し、かつ粒子の側近くに結合するような厚みのものである。この層もしくはフィルムは、粒子を特徴決定および同定する次の反応を行えるような多孔性および性質を備えているべきである。より好ましい実施態様では、粒子の回収の前に水性ゲルの薄層もしくは親水性膜が表面に適用され、第２の層もしくはフィルムが回収後に適用される。他の好ましい実施態様では、それ自身では溶出された分子を結合しない表面に粒子が回収される。この場合では、粒子が、溶出された分子を結合しうる薄層もしくはフィルムで積層される。このような層もしくはフィルムが溶出された分子を結合できる多数の方法がある。これらの一つは、タンパク結合基を用いた活性化によるものである。所望であれば、粒子が回収される表面と、積層された層もしくはフィルムの両方が、溶出されたタンパク質もしくは他の分子と結合してもよい。本発明のさらなる実施態様では、下側の表面と積層された層もしくはフィルムのどちらも、溶出された分子を結合する能力を持たない。この場合には、拡散する溶出分子をその源である粒子の近くに局在化するために、結合もしくは架橋結合試薬が用いられる。タンパク質であれば、適切な架橋結合試薬はグルタルアルデヒド(glutera ldehyde)である。表面もしくは、表面に適用される層もしくはフィルムに、分散した高分子に結合して粒子の近くに保持するリガンドを付着させることもできる。このようなリガンドは、抗体、レクチン等である。結合した高分子は、既に記載されているように、別々に検出される。本発明のさらなる実施態様は、粒子回収の前に部分的もしくは完全に乾燥された膜に水和ゲル層を適用することを含む。このようなシステムでは、回収表面および／または積層されたゲル層は、タンパク結合性であっても非結合性であってもよい。この場合には、粒子が回収された後に、粒子から可溶性分子を溶出するためにケル層を再水和(re-hydrated)する。溶出された分子は、用いられたシステムの性質に基づいて、回収表面、積層ゲル層、もしくは添加された架橋結合試薬によって結合される。いずれの場合も、溶出された分子は、溶出される粒子の近くに結合される。乾燥した積層の外側表面は、拡散分子と検出システムに透過性の接着剤で被覆されてもよいが、回収された粒子を乾燥した積層に保持することを助けるものである。先のいずれの場合でも、積層もしくはフィルムは、分子の溶出もしくは可溶化を増大させ、保存を助け、および／または、その免疫原性を増大させる基質を含んでもよい。このような試薬は、洗剤、溶解試薬を含むか、洗剤、溶解もしくはポリビニルピロリドン等の沈降試薬を含むことができる。溶出された抗原もしくは粒子の特徴を決定付ける他の分子の生成を増大させる基質を加えることもできる。ある例では、真菌に酵素等のアレルギー性分子を排泄させる栄養剤、もしくは真菌を特徴付けることを助けるアフター分子(after molecules)を排泄させる栄養剤を添加する。粒子および／または積層された層もしくはフィルムが載せられる基質表面は、好ましくはそれ自身がフィルムもしくは膜である。このように、基質の回収と検出は、より扱いやすくする。基質の円盤、切片もしくはロールは、あらゆる適切な設計の粒子回収装置に簡単に挿入、および取り外すことができる。溶出された分子の検出および粒子の同定でも簡単に扱うことができる。粒子および溶出されたタンパク質がそれぞれ局在化され、互いに関連づけられて固定されたら、特徴決定および同定に利用できる。最初の段階は、関心の向けられた溶出された分子種を局在化することである。これは、アレルギー疾患の患者のＩｇＥを用いて有利に行われる。このような抗体の使用は、“何が患者の環境に存在し、アレルギー疾患や症状を引き起こすのか”という基本的な問いに直接答える。あるいは、固定された溶出分子を、抗体もしくはレクチンである、アレルゲン特異的、抗原特異的もしくは炭水化物特異的プローブで免疫染色することもできる。第一プローブの局在化は、第一プローブに対抗する蛍光ラベル抗体等のレポーター基でラベルされた第二プローブを用いて行ってもよい。他のレポーター基は、不溶性着色産物を産生するか、もしくは可溶性基質と反応とすることができる酵素である。所望であれば、本発明の他の実施態様では、第一プローブそのものをラベルしてもよい。これには、既知の広い技術を利用することができる。関心の向けられた分子がラベルもしくは同定されれば、その分子を拡散した粒子を特徴付け及び同定することができる。このような特徴付けおよび同定は、源もしくはタイプ特異的染色もしくは粒子自身のラベリングによって視覚的に行われる。適切に蛍光ラベルされた抗体が用いられた場合には、例えばネコのフケ等の特定の源からの粒子が、関心の向けられた疾患または症状に関係する溶出された分子と結びつけられているか否か、またそのような粒子がいくつあるのか、調べることができる。高分子は、他の方法で検出してもよい。例えば、観察される特徴的な反応を行ってもよい。固定された酵素は、例えば、色原体基質(a chromogenic substrate )で検出してもよい。本発明に係る方法は、アレルギー性を示す未知のアレルゲンの源を同定するため、環境に存在する種々の空気伝達性アレルゲン／抗原の横断的な観察を行うため、微生物学的材料もしくは植物もしくは動物由来の粒子を含む特異的抗原もしくは抗原源の存在および／または量を観察するために用いられてもよい。他の多くの粒子材料を特徴付けもしくは同定することができ、より一般的な目的は、同定可能、検出可能な特徴を備えた存在する全ての粒子の横断的な観察を得ることである。このような特徴の例は、細菌もしくは他の微生物の族の特異的マーカーもしくは特異的抗原の存在である。サンプル材料の源は、空気伝達材料に限定されず、水伝達材料にも適用できる。この方法の特徴は、検出するのに局在化濃度が十分高く、粒子源と溶出されたタンパク質との結びつきが維持されるように、可溶性タンパク質が、起源の粒子の近くに検出可能もしくは特徴付けできる形態で結合されていることである。しかして、この粒子は、別のアッセイ系用のフリー溶液に溶出されると、濃度が低すぎて測定が困難な分子を含んでもよい。さらに、粒子源と溶出されたタンパク質との結びつきが失われるであろう。図面の簡単な説明図１は、本発明に係る粒子の検出および同定方法の第一の実施態様の４つの工程を図式的に示すものである。図２は、本発明に係る粒子の検出および同定方法の第二の実施態様の３つの工程を図式的に示すものである。発明を実施する最良の方法図１（i）に示されているように、種々の粒子１０を、タンパク質を結合および固定することができるニトロセルロース膜１１の表面上に回収する。膜１１に粒子１０を維持しながら、多孔性水和ゲルもしくはフィルム１２の層を膜１１に積層する（図１（i））。粒子中に存在する可溶性分子１３は、水和ゲルもしくはフィルムに含まれる水によって溶出される（図１（iii））。粒子から溶出されたあらゆる可溶性タンパク質１３は、膜に結合される（図１（iv））。これらの分子は、溶出された粒子の近くに関連づけて固定化され、多数の同定方法に利用される。分子は、溶出された粒子の近くに関連づけられて膜に結合されているので、関心の向けられた分子の存在のみならずそれらを誘導した粒子をも、明確に同定することができる。図２は、本発明の別の実施態様を示す。この方法では、粒子１０は、タンパク質を結合しない膜１４土に回収される（図２（i））。水和タンパク質結合フィルムを、粒子１０上に積層する。膜の水分が、粒子１０から可溶性タンパク質１３を溶出し、膜１５に結合させる。この分子は固定され、同定および／または特徴付けに利用される。分子１３は、溶出された粒子の近くに再び固定される。これは、関心の向けられた分子の源の決定を容易にする。実施例ニトロセルロース膜（０．２２μｍ細穴サイズ）の断片（１０ｘ１０ｍｍ）を、超音波ネブライザー（FISONeb）を用いて、０．３％アガロース（ＰＢＳ（リン酸バッファー生理食塩水）中）で前処理した。アウトプットを下方に向け、狭いスロット（約１０ｘ１ｍｍ）を通すために、屈曲したチューブでネブライザーを変更した。アガロース温度は約５０℃であった。約１０μｍの厚みのフィルムができるまでアガロースエアゾールを適用した。３％までの、より高い濃度のアガロースを使用することができる。エアゾール化されたアガロースの使用は、アガロースフィルムの前処理された紙片を直接適用するより、フィルムとアガロースとの結合をより安定にする。続いて、抗原源を適用した。例えば、ダニの糞便粒子もしくはライグラスの花粉を、アガロース層にまくか埋伏させることができる。次いで、粒子から可溶性タンパク質を溶出し、これらのタンパク質を膜に結合させるために、フィルムと粒子を湿気のあるコンテナー内に夜通し貯蔵した。この結合は、粒子の近くに局在化される。第二の、０．３％アガロースフィルムの類似した層を、上述したように適用した。この層は、より厚くてもよい（〜３０μ深さ）。新規の層が液層を形成して粒子を流さないように、あるいは、粒子が最初の位置から乱されないように、フィルムをゆっくりと適用することが重要である。被覆されたフィルムを、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）中に無関係のタンパク質（スキムミルクパウダー、３％）を含む溶液内で３７℃で１時間インキュベートすることによって、ニトロセルロース上の空いたタンパク質結合部位をブロックした。ブロックした膜を、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎですすいだ。ニトロセルロースに結合する抗原を、その抗原に特異的な一次抗血清で検出した。被覆されたニトロセルロース片の断片を、１：５００に希釈された一次抗体（ウサギの抗ダニもしくは抗ライグラス抗血清）と共にインキュベートした。抗ダニアレルゲンＤｅｒｐ１もしくはＤｅｒｐ２モノクローナル抗体（バージニア大学から入手）も、１μｇ／ｍｌの希釈で用いられる。ヒトのアトピー血清を用いる場合には、ここのポイントで適用されるが、濃度は１：２〜１：１０である。抗体を３％スキムミルク溶液に希釈し、静かに撹拌しながら室温で２時間インキュベートする。結合していない一次抗体を除くために、膜を１０ｍｌＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて撹拌しながら６回洗浄した。各洗浄は５分間である。結合した一次抗体を、ラベルされた第二抗体とインキュベートすることによって検出した。一次ウサギ抗体を検出するために、３％のスキムミルクおよびＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎに１：１００の希釈率でヒツジ抗ウサギイムノグロブリン親和性単離ＦＩＴＣ複合抗体（Silenus Brand，カタログ番号：RAF）を用いた。ヒトおよびマウス一次抗体の検出では、適切な特異性の第二抗体を用いることができる。インキュベーションは、少なくとも１時間である。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで夜通しインキュベーションした後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で優しく撹拌しながら５分間５回洗浄することによって膜を洗浄し、結合していない第二抗体を除去した。断片を９０％グリセロール／１０％ＰＢＳ中でスライドガラス上に載せ、蛍光顕微鏡（Leitz Orthlux II）下で観察した。花粉の場合には、粒子がニトロセルロース上の免疫染色のリングによって囲まれていることが観察された。花粉粒子でないものは染色されていなかった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年６月３日【補正内容】明細書本願発明は、粒子に関連する関心の向けられた高分子の検出および同定方法に関する。特に、本発明は、高分子が粒子の特定のクラスに属することを同定できるように、粒子から高分子を拡散することと、それらの高分子を粒子の近くに結合することに基づいている。この方法は、高分子を分散する粒子の同定を含んでもよい。（国際出願時明細書第４頁第４行目〜第５頁第２６行目（翻訳文明細書第３頁第１８行目〜第４頁第２３行目）が変更された）本発明は、粒子と関連した高分子種の検出および同定方法からなり、以下の工程ａ）表面上に粒子を回収する工程、ｂ）もし存在すれば、高分子種を粒子の外に拡散させる工程、ｃ）拡散された高分子を粒子の近くに非特異的に固定する工程、およびｄ）高分子がもしあれば、結合された高分子とこれらの高分子を拡散した粒子とを近くに維持しながら、高分子の存在もしくは非存在を検出する工程、を含む。本発明の方法は、患者のアレルギー反応の源の同定に特に適用できる。患者の近くの空気を採取し、採取された空気中の粒子を回収してもよい。これらの粒子中の抗原が粒子の外に拡散し、粒子の近くに結合した後に、患者がアレルギーを示す抗原とアレルギーを示さない抗原とを区別するために、患者の血清を用いてもよい。アレルゲンがその元となる粒子の近くに結合しているので、視覚的もしくは別の方法で粒子を同定することができる。他の態様では、患者にとって抗原性もしくはアレルギー性の高分子を検出する方法、およびこれらの高分子と関連する粒子を同定する方法からなり、この方法は、ａ）表面上に粒子を回収する工程、ｂ）前記粒子に関連する可溶性高分子を粒子の外に拡散させる工程、ｃ）粒子から拡散された少なくともいくつかの抗原性もしくはアレルギー性高分子を粒子の近くに非特異的に固定する工程、ｄ）患者にとって抗原性もしくはアレルギー性の固定された高分子を検出する工程、およびｅ）高分子と関連する、高分子が拡散された粒子を同定する工程、を含む。好ましい実施態様では、本発明は、多くのアレルゲンが、それらを保有する粒子内に濃縮された高度に可溶性のタンパク質として天然に存在するという知見を利用する。しかして、全体的な抗原暴露は非常に小さいかもしれないか、粒子、しかして単位体積当たりの抗原濃度は非常に高いことがわかった。粒子から拡散する大量のアレルゲン分子は容易に視覚化されるので、この発見により抗原保有粒子の検出が可能になる。この方法は、水流もしくは気流等の液体流から、細菌、ウイルスもしくは他の生物学的材料の粒子を回収することを含む他の目的に用いることができる。また、症状の診断を援助するために、排気中の粒子を特徴づけるためにも用いることができる。必要であれば、検出可能な高分子を拡散させるために、細菌もしくは他の粒子を溶解した後に、細菌もしくは他の粒子の性質を確かめてもよい。請求の範囲１．ａ）表面上に粒子を回収する工程、ｂ）もし存在するなら、高分子種を粒子の外に拡散させる工程、ｃ）粒子の近くに拡散された高分子を非特異的に固定する工程、およびｄ）高分子がもしあれば、結合した高分子と該高分子を拡散した粒子とを近くに維持しながら、高分子の存在もしくは非存在を検出する工程、からなる、粒子に関連した高分子種の検出および同定方法。２．表面が、膜の表面、薄層、フィルム、ゲル、これらの多層もしくは合成物である、請求項１記載の方法。３．膜の表面が、ニトロセルロース、ナイロンおよびポリビニリデンジフルオリドからなる群から選択された物質からなる、請求項２記載の方法。４．薄層もしくはフィルムが、アガロース、セルロース、ポリビニルアルコールおよびポリアクリルアミドからなる群から選択された物質からなる、請求項２記載の方法。５．表面が、拡散した高分子を結合するように調節され、非特異的に固定に影響を与える、請求項１記載の方法。６．高分子が、水溶性であり、粒子を湿らせることによって粒子の外に拡散される、請求項１記載の方法。７．粒子が、溶解されて高分子を拡散する、請求項１記載の方法。８．粒子が、濾過もしくは埋伏によって表面に回収される、請求項１記載の方法。９．表面が、粘着物質で被覆され、表面における粒子の保持を増大する、請求項１記載の方法。１０．粒子が、表面上に回収された後に、薄層もしくはフィルム、これらの多層もしくは合成層で積層される、請求項１記載の方法。１１．薄層もしくはフィルムが水和され、粒子に湿気を与え、粒子から高分子の拡散を引き起こす、請求項１０記載の方法。１２．層もしくはフィルムが、粒子から拡散された高分子を非特異的に結合することができる、請求項１０記載の方法。１３．薄層もしくはフィルムが、アガロース、セルロース、ポリビニルアルコールおよびポリアクリルアミドからなる群から選択された材料からなる、請求項１０記載の方法。１４．フィルムもしくは層が、１０〜５０μｍの平均の厚みを備える、請求項１０記載の方法。１５．表面および薄層もしくはフィルムのいずれも、溶出された高分子と結合することができず、層もしくはフィルムを粒子に適用した後に、拡散された高分子を、該高分子を拡散した粒子の近くに非特異的に固定することができる結合もしくは架橋結合試薬が薄層もしくはフィルムの外側表面に適用される、請求項１０記載の方法。１６．架橋結合試薬がグルタルアルデヒドである、請求項１５記載の方法。１７．水和し得る物質の薄層もしくはフィルムが、粒子の回収の前に表面に適用される、請求項１記載の方法。１８．高分子が、粒子の回収後に薄層もしくはフィルムを水和することによって粒子から分散される、請求項１７記載の方法。１９．薄層もしくはフィルムが、高分子の溶出もしくは可溶化、高分子の保存、および／または免疫原性を増大する基質を含む、請求項１０記載の方法。２０．基質が、洗剤、溶解試薬、沈降試薬およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１９記載の方法。２１．高分子に結合し、レポーター基で直接ラベルされているか、あるいはラベルされた第二のプローブに結合しうるプローブを添加することによって高分子を検出する、請求項１記載の方法。２２．プローブが、アレルギー性もしくは抗原性疾患に罹患している患者のＩｇＥを含む、請求項２１記載の方法。２３．検出された高分子と関連した粒子が同定される、請求項１記載の方法。２４．粒子が視覚的試験で同定される、請求項２３記載の方法。２５．粒子が特異的結合プローブの使用によって同定される、請求項２３記載の方法。２６．（ａ）表面上に粒子を回収する工程、（ｂ）前記粒子と関連する可溶性高分子を粒子の外に拡散させる工程、（ｃ）粒子の近くに粒子から拡散された少なくともいくつかの抗原性もしくはアレルギー性高分子を固定する工程、（ｄ）患者にとって抗原性もしくはアレルギー性の固定された高分子を検出する工程、およびｅ）高分子と関連する、高分子を拡散した粒子を同定する工程、からなる、患者にとって抗原性もしくはアレルギー性の高分子の検出および高分子が関連する粒子の同定方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）表面上に粒子を回収する工程、ｂ）もし存在するなら、高分子種を粒子の外に拡散させる工程、ｃ）粒子の近くに拡散された高分子を固定する工程、およびｄ）高分子がもしあれば、結合した高分子と該高分子を拡散した粒子とを近くに維持しながら、高分子の存在もしくは非存在を検出する工程、を含む、粒子と結びついた高分子種の検出および同定方法。２．表面が膜の表面である、請求項１記載の方法。３．表面が、固定に影響するように、拡散された高分子を結合するように調節される、請求項１記載の方法。４．表面が、ニトロセルロース、ナイロンおよびポリビニリジンフルオリドからなる群から選択された物質からなる、請求項３記載の方法。５．高分子が、水溶性であり、粒子を湿らせることによって粒子の外に拡散される、請求項１記載の方法。６．粒子が、溶解されて高分子を拡散する、請求項１記載の方法。７．粒子が、濾過もしくは埋伏によって表面に回収される、請求項１記載の方法。８．表面が、粘着物質で被覆され、表面における粒子の保持を増大する、請求項１記載の方法。９．粒子が、表面上に回収された後に、薄層もしくはフィルムで積層される、請求項１記載の方法。１０．薄層もしくはフィルムが水和され、粒子に湿気を与え、粒子から高分子の拡散を引き起こす、請求項９記載の方法。１１．層もしくはフィルムが、粒子から拡散された高分子に結合することができる、請求項９記載の方法。１２．薄層もしくはフィルムが、アガロースおよびポリアクリルアミドからなる群から選択された材料からなる、請求項９記載の方法。１３．フィルムもしくは層が、１０〜５０μｍの平均の厚みを備える、請求項９記載の方法。１４．表面および薄層もしくはフィルムのいずれも、溶出された高分子と結合することができず、層もしくはフィルムを粒子に適用した後に、拡散された高分子を、該高分子を拡散した粒子の近くに固定することができる結合もしくは架橋結合試薬が薄層もしくはフィルムの外側表面に適用される、請求項９記載の方法。１５．架橋結合試薬がグルタルアルデヒドである、請求項１４記載の方法。１６．水和し得る物質の薄層もしくはフィルムが、粒子の回収の前に表面に適用される、請求項１記載の方法。１７．高分子が、粒子の回収後に薄層もしくはフィルムを水和することによって粒子から分散される、請求項１６記載の方法。１８．薄層もしくはフィルムが、高分子の可溶化における溶出、高分子の保存、および／または免疫原性を増大する基質を含む、請求項９記載の方法。１９．基質が、洗剤、溶解試薬、沈降試薬およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１８記載の方法。２０．高分子に結合し、レポーター基で直接ラベルされているか、あるいはラベルされた第二のプローブに結合しうるプローブを添加することによって高分子を検出する、請求項１記載の方法。２１．プローブが、アレルギー性もしくは抗原性疾患に罹患している患者のＩｇＥを含む、請求項１記載の方法。２２．検出された高分子と結びつけられた粒子が同定される、請求項１記載の方法。２３．粒子が視覚的試験で同定される、請求項２２記載の方法。２４．粒子が特異的結合プローブの使用によって同定される、請求項２２記載の方法。２５．（ａ）表面上に粒子を回収する工程、（ｂ）前記粒子と結びついた可溶性高分子を粒子の外に拡散させる工程、（ｃ）粒子の近くに粒子から拡散された少なくともいくつかの抗原性もしくはアレルギー性高分子を固定する工程、（ｄ）患者にとって抗原性もしくはアレルギー性の固定された高分子を検出する工程、およびｅ）高分子と結びついた、高分子が拡散された粒子を同定する工程、を含む、患者にとって抗原性もしくはアレルギー性の高分子の検出および高分子が結びついた粒子の同定方法。