JPH10500978A - Methods of treating tumors by modulating p53 protein - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 細胞のp53タンパク質濃度を調節することによる腫瘍の治療法。特に、本発明はカルパイン活性を調節できる化合物の使用に関する。 (57) [Summary] A method of treating tumors by regulating the concentration of p53 protein in cells. In particular, the invention relates to the use of compounds that can modulate calpain activity.
Description
【発明の詳細な説明】 p53タンパク質の調節による腫瘍の治療方法 本発明は、腫瘍の治療のための新規の方法に関する。さらに具体的には、p53 タンパク質の細胞内濃度を調節することにより腫瘍を治療する方法に関する。ま た、p53タンパク質を調節することを可能にする遺伝子治療のためのベクター、 ならびにそれらを含有する製薬組成物に関する。 過去15年の間、腫瘍遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の分子的特徴づけは、発腫瘍 の過程を新たな観点で見ることを可能にした。こうして、これらの遺伝子の制御 および呼応するタンパク質の機能に関するますます詳細な知識は、新規の治療上 のアプローチの着想を可能にした。 さらに具体的には、腫瘍形成性および抗腫瘍形成性のタンパク質の分解の解明 は、腫瘍との戦いに関する主要な挑戦を意味する。なぜなら、その解明は、腫瘍 形成性タンパク質の場合には、それらの分解の促進がそれらの作用を無効にする 可能性を予兆し、癌抑制物質の場合には、それらの分解の阻害が、それらの抗増 殖作用もしくは抗腫瘍作用を増強する可能性を予兆し、変異タンパク質の場合に は、主要組織適合性遺伝子複合体の分子によるそれらタンパク質の抗原提示の増 強が、腫瘍特異的免疫応答を刺激する可能性を予兆し、さらに、腫瘍遺伝子もし くは抗腫瘍遺伝子が高発現プログラムされた細胞死を誘導することのできる場合 には、アポトーシスの過程の引き金となるようにこれらのタンパク質を安定化さ せる可能性を予兆するからである。 元来、p53タンパク質は、核腫瘍遺伝子に分類されていた。それは、トランス フェクション実験において、活性化されたrasなどの腫瘍遺伝 子と協働して一次培養細胞を形質転換させるのみならず、培養系のげっ歯類の細 胞の寿命を延ばすことが可能であったためである。実際、これらの最初の実験に 用いられた遺伝子は変異しており、ある機能の獲得で特徴づけられたる変種p53 タンパク質類を発現するようになっていた。今では、p53タンパク質は、少なく とも野性型の場合、なお発見され得る機能を排除することなく、成長および細胞 の分割を負の方向に調節する転写因子であり、また、ある状況下では、アポトー シスを誘発できることが知られている（ヨーニッシュ・ルーアッハ(Yonish-Roua ch)ら、ネイチャー(Nature)，352，345-347，1991）。これらの性質が、細胞DNA の保全性が脅かされるようなストレスのある一定状況下で現れることから、p53 は「ゲノムの保護者」であると示唆されてきた。ヒトの全てのタイプの腫瘍をひ とまとめにして考えると、その約40％に変異型p53タンパク質が存在することが この仮説を補強しており、また、この遺伝子の変異が腫瘍の亢進において演じて いるおそらく決定的と思われる役割を明示するものである（総説としては、モン テナール(Montenarh)、オンコジーン(Oncogene)，7，1673-1680，1992; オーレ ン(Oren)，FASEB J.，6，3169-3176，1992; ザンベッティ(Zambetti)とレヴァイ ン(Levine)，FASEBJ.，7，855-865，1993を参照）。 野性型p53タンパク質は、その細胞内での位置およびその翻訳後の修飾の調節 のみならず、その合成および分解の調節に関る複雑な調節を受ける（上記で引用 した総説を参照）。野生型p53タンパク質は非常に不安定で、その半減期は数分 である。対照的に、腫瘍に高濃度に蓄積するいくつかの変異タンパク質は、かな り長い半減期を有する。p53の分解に関してはほとんどはっきりと確立されてい ない。実際、分解が細胞内 のどこで起こるのかについても、その異化作用経路の数およびその性質について も、また、p53の分解の際その標識となるペプチド単位についても、知られてい ない。われわれの知る限り、利用できる唯一の情報は、ある実験条件下でのユビ キチン回路の酵素E1の関与に関する（シエシャノヴァ(Ciechanover)ら、プロシ ーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Pro c．Natl．Acad．Sci．USA)88，139-143,1991; チョウダリー(Chowdary)ら、モレ キュラー アンドセルラー バイオロジー(Molec．Cell．Biol.) 14，1997-2003 ，1994)。さらには、p53由来のある種のタンパク質分解生成物は抗原と同様の様 式で提示される可能性があることが示されている。 本発明は、部分的に、p53タンパク質がカルシウム依存性タンパク質分解酵素 カルパインの基質であることの実証に由来する。さらに具体的には、p53タンパ ク質がm-カルパインまたはμ-カルパインで特異的に分解されることの実証に由 来する。本発明は、p53タンパク質の細胞内濃度を調節する機構を初めて構成要 件とするものであり、その結果とりわけある種の腫瘍のような病理的症状におけ るこのタンパク質の濃度を調節するための、とくに新規の効果的かつ特異的なア プローチを提供するものである。 とりわけ、本発明は、p53タンパク質に対するカルパイン類の活性を調節する 化合物の使用に基づく腫瘍の治療への新規のアプローチについて記述する。カル パイン類の活性調節により、変異型p53タンパク質の腫瘍形成作用の阻害および ／または免疫原性ペプチドの提示の促進のために変異型p53タンパク質の分解を 促進するか、もしくは、腫瘍において発現されている変異タンパク質の腫瘍形成 作用の相殺および／または 腫瘍細胞のアポトーシスの誘導のために野性型p53タンパク質を安定化するか、 のいずれかが可能となる。 したがって、本発明の第一の主題は、腫瘍の治療用の製薬組成物の調製のため にカルパインの活性を調節できる化合物を使用することにある。 カルパイン類はほとんどの哺乳動物細胞に存在する普遍的な酵素である（総説 としては、クロール(Croall)とデマルティノ(deMartino)、フィジオロジカル レビュー(Physiol．Rev.)，71，813-847，1991を参照）。 これらの酵素は本質的に細胞質に存在するが、有糸分裂の際あるいはある種の刺 激後には、核膜の崩壊によって核内に侵入することができる。上述したように、 カルパイン類のタンパク質分解活性はカルシウムの存在に依存する。 本発明の目的のためにカルパイン活性を調節することができる化合物は、いく つかのタイプから成ることができる。 それらは、p53タンパク質に対するカルパインの活性を阻害できる化合物であ ることができる。これらの化合物は、少なくとも部分的に、野生型p53タンパク 質の分解を阻害するために用いることができるため、とりわけ有利である。した がって、これらの化合物は、細胞内で野性型p53タンパク質を安定化させ、変異 型の作用を相殺することが可能となる。本発明の範囲内で用いられる阻害性の化 合物のなかでも、タンパク質分解酵素阻害剤（ロイペプチン、アプロチニン、PM SF（フェニルメタンスルホニルフルオリド）、など）、カルシウムキレート剤（ EGTA（エチレングルコールビス（2-アミノエチルエーテル）四酢酸）、EDTA（エ チレンジアミン四酢酸）、など）、あるいは、カルパスタチンもしくはそのいず れかの断片または誘導体などの、より特異的な阻害剤を挙げる ことができる。カルパスタチンはカルパイン類の既知の阻害剤である。その配列 は先行技術文献に記載されている（配列番号(SEQ ID No.)1）。本発明の、とり わけ有利な様態は、カルパスタチンをコードする配列全体もしくはその一部を有 するベクターを腫瘍内に移送することにある。このアプローチは、例えば大腸腫 瘍や肺腫瘍などの、野性型p53タンパク質の対立遺伝子を必ず有している腫瘍の 治療にとりわけ適合する。本発明の範囲内では、カルパスタチンの様々な断片あ るいは誘導体を使用することができる。こうした断片あるいは誘導体は、カルパ インの活性を阻害する能力を少なくとも部分的に保存しつつ、配列番号(SEQ ID No.)1）の配列の遺伝子的および／または化学的性質を修飾（１つまたはそれ以 上）して得られるいかなる分子であってもよい。遺伝子的および／または化学的 性質の修飾とは、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドのいずれかの変異、欠失 、置換、付加、および／または修飾と理解される。こうした修飾は様々な目的の ために行われるが、とりわけ、特別なタイプのベクターもしくは宿主における発 現に適合させた配列を調製する目的、細胞内への浸透を促進するように配列の大 きさを減少させる目的、阻害活性を上昇させる目的、あるいは、とりわけ有利な 意味においては、野性型p53タンパク質の分解に対するカルパイン類の活性の阻 害剤の選択性を増強する目的で、行われる。 こうした修飾は、例えばイン ビトロ（in vitro）での突然変異誘発または付 加的構成要素や合成配列の導入、あるいは生来の構成要素の欠失や置換により行 うことができる。上記で定義された誘導体が調製される場合、p53タンパク質に 対するカルパイン類の活性の阻害剤としてのその活性は、いくつかの方法で実証 されるが、とりわけ、前述の阻害剤 と多様な形態のp53タンパク質とを接触させることおよびその後に得られた分解 生成物を検出することで、実証される（実施例１から３を参照）。当業者に知ら れている他のいかなる技術は、明らかに、この効果のために用いられている。 本発明に特定の様態において、カルパスタチン全体または一部、またはカルパ スタチン全体あるいは一部をコードする核酸が阻害剤として用いられる。さらに 具体的には、配列番号１(SEQ ID NO.1)の配列全体もしくは一部を含むペプチド またはその誘導体が用いられる。 誘導体に関しさらに具体的には、例えば、配列番号２(SEQ ID No.2)の配列の 化合物を挙げることができる。これはカルパスタチンの断片に対応する。カルパ インによる野性型p53タンパク質の分解を特異的または優先的に阻害することの できる、配列番号１(SEQ ID No.1)または２(No.2)の配列から成るいずれの誘導 体も有利に用いられる。 本発明の目的においてp53タンパク質に対するカルパインの活性を調節するこ とのできる化合物はまた、変異型p53タンパク質を特異的または優先的に分解す ることのできるカルパインの誘導体であることもできる。このような誘導体はま た、細胞内の野性型p53タンパク質濃度に著しい影響を与えることなく、その腫 瘍形成作用の阻害および／または免疫原性ペプチドの提示を増強するために、変 異型p53タンパク質の分解を活性化できるようにするため、非常に有利である。 このような誘導体は、遺伝子的および／または化学的性質の構造的修飾（１つも しくはそれ以上）により、カルパインから得ることができる。次いで、こうして 得られた誘導体の、変異型p53タンパク質を特異的または優先的に分解する能力 は、実施例１ないし３に記載される如く実証されうる。 好ましくは、本発明の範囲内で用いられる調節物質はタンパク質もしくはポリ ペプチド、またはこれらのポリペプチドあるいはタンパク質をコードする核酸配 列である。さらに好ましくは、調節作用を有する化合物は、野性型p53タンパク 質に対するカルパインの活性の特異的阻害剤か、もしくは、変異型p53タンパク 質を特異的に分解するよう修飾されたか他のカルパイン類の形態の、タンパク質 もしくはポリペプチドである。 とりわけ有利な態様においては、本発明は、野生型p53の対立遺伝子および変 異型p53の対立遺伝子の双方を有する腫瘍細胞内で、カルパスタチンあるいはそ の一部のようなカルパイン阻害剤をコードする核酸配列、あるいは変異型p53タ ンパク質を特異的に分解するよう修飾されたか他のカルパイン類の形態の発現を もたらす可能性に存する。 本発明の範囲内で用いられている核酸配列は、WO 90/11092明細書に記載され た技術に従って、DNAをむき出しの(naked)形で投与することができる。また、複 雑な方法、例えば、DEAE-デキストラン（パガノ(Pagano)ら、ジャーナル オブ ヴァイロロジー(J．Virol.)1（1967）891）、核タンパク質（カネダ(kaneda) ら、サイエンス(Science) 243（1989）375）、脂質（フェルグナー(Felgner)ら 、プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス Ｕ ＳＡ(PNAS)84（1987）7413）などと共に、あるいはリポソームの形態（フレイリ ー(Fraley)ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー(J．Biol．Ch em．）255（1980）10431）、などの方法で行うことができる。好ましくは、本発 明の範囲内で用いられる配列はベクターの一部を形成する。こうしたベクターの 使用は、実際、治療されるべき細胞への核酸の適用の改善 を可能にし、また、前述の細胞内での安定性の増加も可能にする。安定性の増加 は、持続性の治療効果を得ることを可能にする。さらに、いくつかの核酸配列を 同一ベクターへ導入することも可能である。このことも治療効率を増強する。 使用するベクターの起源は、動物細胞、好ましくはヒトの腫瘍細胞を形質転換 させ得る限りは多様であることができる。本発明の好ましい様態においては、ア デノウイルス類、レトロウイルス類、アデノ関連ウイルス(AAV)類またはヘルペ スウイルスから選択されてもよいウイルス由来のベクターが用いられる。 この点に関して、本発明の主題は、カルパインの活性を調節し得る化合物をコ ードする核酸をその遺伝子内に挿入されて含むあらゆる組み換えウイルスである 。好ましくは、本発明の範囲内で用いられるウイルス類は、欠損した、すなわち 感染した細胞内で自律的に複製を行うことのできないものである。したがって、 本発明の範囲内で用いられる欠損ウイルスのゲノムは、一般には、少なくとも、 感染した細胞内で前述のウイルスの複製に必要な配列を欠く。これらの領域は除 去（完全にもしくは部分的に）されているか、機能をもたないようにされている か、あるいは他の配列、およびとくにカルパイン類の調節物質をコードする配列 で置換されていることができる。好ましくは、欠損ウイルスは、それでもなお、 ウイルス粒子の脱被殻(encapcidation)に必要な自身のゲノム配列を保持してい る。 さらに具体的には、アデノウイルス類に関して、その構造および性質が幾分異 なる様々な血清型が特徴づけられてきている。本発明の範囲内では、これらの血 清型のうち、ヒトアデノウイルス２型または５型（Ad 2またはAd 5）、もしくは動物起源のアデノウイルス類（FR 93 05954明細書を参 照）の使用が好ましい。本発明の範囲内で使用される動物起源のアデノウイルス のうち、イヌ、ウシ、マウス（例：MVA1．ベアード(Beard)ら、ヴァイロロジー( Virology)75（1990）81）、ヒツジ、ブタ、トリ、または代替としてサル（例：S AV）のアデノウイルスを挙げることができる。好ましくは、動物起源のアデノウ イルスはイヌのアデノウイルスであり、あるいは、さらに好ましくはCAV2アデノ ウイルス［例えば、マンハッタン株(Manhattan strain)もしくはA26/21(ATCC VR -800)］である。好ましくは、本発明の範囲内ではヒトまたはイヌまたは混合起 源のアデノウイルス類が使用される。 好ましくは、本発明の欠損アデノウイルス類は、包膜化(encapsidation)をお こさせる配列であるITR、およびカルパイン類の調節物質をコードする配列を含 む．さらに好ましくは、本発明のアデノウイルス類のゲノムにおいては、E1遺伝 子、および、E2，E4，L1-L5の各遺伝子うち最低１個は機能を有しない．当該ウ イルス遺伝子は、当業者に知られているいかなる技術、および、とくに、完全抑 制、あるいは置換または部分的欠失、もしくは当該遺伝子（単数または複数）へ の１個またはそれ以上の塩基の付加によって、機能を失わせることができる。こ うした修飾はイン ビトロ(in vitro)（単離したDNA上で）でもイン サイチュ ーでも、例えば遺伝子工学の技術や、代替として突然変異原性物質での処理など で得ることができる。 本発明に関る欠損組み換えアデノウイルス類は、当業者に知られているいずれ の技術によっても調製できる（レヴレロ(Levrero)ら、ジーン(Gene)101（1991） 195，EP 185 573，グレアム(Graham)、エンボ ジャ ーナル(EMBO J.)3（1984）2917）。とりわけ、１個のアデノウイルスと、なかん ずく、カルパイン類の調節物質をコードするDNA配列を有するプラスミドとの間 の相同的組み換えにより調製できる。相同的組み換えは、適当な培養細胞系に前 述のアデノウイルス類とプラスミドとをコトランスフェクション（共感染）させ た後に起こる。用いられる培養細胞系は、好ましくは、(1)前述の要素で形質転 換することができ、さらに(2)アデノウイルスゲノムの欠損部分を補い得る配列 を、組み換えの危険性を避けるため好ましくは組み込まれた形で包含しているべ きである。培養細胞系の１例としては、とくにそのゲノム中にAd5アデノウイル スゲノムの左側部分（12％）が組み込まれて包含されているヒト胎児腎細胞系29 3（グレアム(Greham)ら、ジャーナルJ．Gen．Virol．36（1977）59）を挙げるこ とができる。アデノウイルス類由来のベクター構築のための戦略も、FR 93 0595 4およびFR 93 08596明細書に記載されている。 次に、実施例に示されるように、従来からの分子生物学的技術により、増殖し たアデノウイルス類は回収され精製される。 アデノ関連ウイルス(AAV)類に関しては、これらは、感染した細胞のゲノム中 に安定かつ部位特異的な方法で組み込まれる比較的小さなDNAウイルスである。 これらは、細胞の成長、形態あるいは分化に何らの作用を引き起こすことなく、 幅広い範囲の細胞に感染することができる。さらには、これらはヒトでは病理に 関与するようにはみられない．AAV類のゲノムはクローン化され、配列決定およ び特徴づけがなされている。このゲノムは約4700塩基から成り、両端に、ウイル スの複製の起点となる約145塩基の逆方向反復塩基配列(ITR)を包含する。ゲノム の残りの部 分は、包膜化の機能を有する２つの不可欠な領域に分けられる。すなわち、ゲノ ムの左側部分はウイルスの複製およびウイルス遺伝子の発現に関るrep遺伝子を 包含し、ゲノムの右側部分は、ウイルスキャプシドタンパク質類をコードするca p遺伝子を包含する。 AAV類由来のベクターをイン ビトロ(in vitro)およびイン ビボ(in vivo)で の遺伝子移送に用いることについては、文献に記載されている（とくに、WO 91/ 18088; WO 93/09239; US 4,797,368，US 5,139,941，EP 485 528を参照）。これ らの明細書には、repおよび／またはcap遺伝子が除去され目的の遺伝子で置換さ れたAAV由来の様々な（遺伝子）構築およびイン ビトロ（in vitro）（培養細 胞に対して）もしくはインビボ（in vivo）（ある器官内へ直接）における前述 の目的の遺伝子の移送に対するこれら構築の使用が記載されている。本発明に関 る欠損組み換えAAV類は、ヒトヘルパーウイルス（例えばあるアデノウイルス） で感染させたある細胞株に、２つのAAVの逆方向反復塩基配列（ITR）により境界 がもうけられるカルパイン類の調節物質をコードする配列を包含するプラスミド と、AAVの包膜化遺伝子（repおよびcap遺伝子）を有するプラスミドとをコトラ ンスフェクション（共感染）させることにより調製することができる。その後、 得られた組み換えAAV類は従来の技術により精製される。 ヘルペスウイルス類およびレトロウイルス類に関しては、その組み換えベクタ ーの構築は広く文献に記載されている。とくに、ブレイクフィールド(Breakfiel d)ら、ニュー バイオロジスト(New Biologist)3（1991）203; EP 453242，EP 1 78220，バーンスタイン(Bernstein)ら、ジェネティック エンジニアリング(Gen et．Eng.)7（1985）235; マコー ミック(McCormick)、バイオテクノロジー(BioTechnology)3（1985）689，などを 参照。 本発明を実施するにあたっては、欠損組み換えレトロウイルスもしくは同アデ ノウイルスを使用することがとりわけ最も有利である、これらのベクターは、実 際、腫瘍細胞内への遺伝子移送にとりわけ有利な性質を有している。 都合のよいことには、本発明のベクターにおいては、カルパイン類の調節物質 をコードする配列は、腫瘍細胞内でのその発現をもたらすシグナルの調節下にお かれている。好ましくは、これらは、異種性の発現シグナルであり、いわば、自 然にその調製物質の発現を司るものとは異なるシグナルである。それらは、とり わけ他のタンパク質あるいは合成配列の発現を司ることができる。とりわけ、真 核生物またはウイルスの遺伝子のプロモーター配列であることができる。例えば 、感染させようと思う細胞のゲノム由来のプロモーター配列であることができる 。同様に、用いたウイルスを含むあるウイルスのゲノム由来のプロモーター配列 であることができる。この点に関しては、E1A，MLP，CMV，RSV-LTRなどのプロモ ーターなどを例として挙げることができる。加えて、これらの発現配列は、活性 化または調節を行う配列、あるいは組織特異的発現をもたらす配列を加えること により修飾されることもできる。実際、腫瘍細胞内で特異的にまたは優先的に活 性をもつ発現シグナルを用いることはとくに有利であり、そのため、そのDNA配 列は、ウイルスが効果的に腫瘍細胞に感染したときにのみ発現されるかまたはそ の作用を発揮する。 特定の実施様態においては、本発明はウイルスのプロモーター、好ましくはRS V-LTRおよびCMVプロモーターから選択されたプロモーターの調 節下において、カルパイン類の調節物質をコードするcDNA配列を含む欠損組み換 えウイルスに関する。 さらに好ましい実施様態においては、本発明は、腫瘍細胞内で優位の発現をも たらすプロモーターの調節下において、カルパイン類の調節物質をコードするDN A配列を含む欠損組み換えウイルスに関する。 本発明の目的においては、その発現は、他のタイプの細胞内で残りの部分の発 現がみられたとしても、腫瘍細胞における発現レベルがより高い場合に、支配的 であると考えられる。 本発明はまた、上述したように、１個またはそれ以上の欠損組み換えウイルス を含むすべての薬剤組成にも関する。これらの薬剤組成は局所、経口、非経口、 経鼻、静脈内、筋肉内、皮下、眼球内もしくは経皮などの経路での投与のために 処方されることができる。好ましくは、本発明の薬剤組成には、製薬学的に注入 可能な処方、とくに患者の腫瘍への直接注入を許容し得るベヒクルを含有する。 これは、とりわけ、等張の滅菌水、あるいは場合によっては滅菌水もしくは生理 食塩水を加えて注入可能な溶液を調製できる組成物を乾燥、とくに凍結乾燥した ものであることができる。患者の腫瘍への直接の注入は、腫瘍に冒されている組 織のレベルでの治療効果の集結を可能にするため、有利である。 この注入に用いられる欠損組み換えウイルスの用量は、様々なパラメーター、 およびとくにウイルスベクター、用いられる投与様式、関連する病理もしくは代 替として望まれる治療期間に応じて適合させることができる。本発明に関る組み 換えアデノウイルスは、通常、104から1014pfu/ml、好ましくは106から1010pfu/ mlの間の量を投与する形で処方され投与される。pfu（「プラーク フォーミン グ ユニット」（“plaque fo rming unit”）；プラーク形成単位）という用語は、ウイルス溶液の感染力に相 当する用語であり、適切な細胞培養系を感染させ、通常は48時間後に感染された 細胞のプラーク数を測定することにより求められる。ウイルス溶液のpfu力価を 求める技術は文献に十分に報告されている。レトロウイルス類に関しては、本発 明に関る組成には直接、移植のための産生細胞を含むことができる。 本発明は、とりわけ、p53の変異形がみとめられる腫瘍の治療に適合されてい る。さらに具体的には、本発明はp53の野性型および変異型の対立遺伝子の存在 する腫瘍の治療においてとりわけ有利である。これらの腫瘍は、とくに、大腸・ 直腸腫瘍、乳腫瘍、肺腫瘍、胃腫瘍、食道腫瘍、Ｂリンパ細胞腫瘍、卵巣腫瘍、 膀胱の腫瘍など、である。 本発明は以下の実施例によりさらに詳細に記述されるが、これらに限定される ものではない。 （図面の説明） 第１図：カルパインによるp53タンパク質の調節に関する検討。 この反応は翻訳混合液を１μl用い、最終液量を30μlとして行った。第１列：T0 、第２列：１mMのカルシウムと20μg/mlのカルパインが存在する場合の30分後、 第４列：１mMのカルシウムと20μg/mlのカルパインと0.5μg/mlのカルパスタチ ンが存在する場合の30分後、第５列：１mMのカルシウムと20μg/mlのカルパイン と10mMのEGTAが存在する場合の30分後、第６列：PBS（リン酸-ホウ酸緩衝液）、 第７列：PBS＋カルシウム、第８列：PBS＋カルパスタチン。 一般的な分子生物学的技術 プラスミドDNAの分取的抽出、プラスミドDNAの塩化セシウム密度勾配 遠心、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるDNA断片 の精製、フェノールもしくはフェノール-クロロホルムによるタンパク質の抽出 、エタノールもしくはイソプロピルアルコールによる生理食塩水溶媒中のDNAの 沈殿化、Escherichia coli（大腸菌）の形質転換などの、従来から分子生物学で 用いられてきた手法は、当業者にはよく知られており、広く文献に記載されてい る［マニアティス(ManiatisT.)ら、「モレキュラー クローニング、ア ラボラ トリィ マニュアル(“Molecular Cloning，a Laboratory Manual”)，コールド スプリング ハーバーラボラトリィ(Cold Spring Harbor Laboratory)，コー ルド スプリング ハーバー(Cold Spring Harbor)，N.Y.,1982；オースベル(Au subel F.M.)ら編、「カレント プロトコールズ イン モレキュラー バイオ ロジー(“Current Protocols in Molecular Biology”)，ジョン ウィレイ ア ンドサンズ(John Wiley & Sons)、ニューヨーク(New York)、1987］。 pBR322およびpUCタイプのプラスミドおよび一連のM13ファージは市販のものを 用いた（ベセスダリサーチ ラボラトリィズ(Bethesda Research Laboratories) ）。 連結反応には、DNA断片をアガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動によ りその大きさに従って分離し、フェノールもしくはフェノール-クロロホルム混 液を用いて抽出し、エタノールで沈殿させた後、ファージT4DNAリガーゼ（バイ オラボ社(Biolabs)製）の存在下、供給元の推奨する方法に従いインキュベート する。 突出した5'末端の平滑化は、大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウ(Klenow)断 片（バイオラボ社(Biolabs)製）を用い、供給元の説明書に従っ て行うことができる。突出した3'末端の削除は、製造元の推奨する方法に従って ファージT4DNAポリメラーゼ（バイオラボ社(Biolabs)製）の存在下に行う。突出 した5'末端の削除は、S1ヌクレアーゼを調節下に作用させて行う。 合成オリゴヌクレオチドによるインビトロ(in vitro)での部位特異的変異誘発 は、テイラー(Taylor)らの開発した方法［ヌクレイック アシッズ リサーチ(N ucleic Acids Res.)13（1985）8749-8764］に従い、アマーシャム(Amersham)社 製のキットを用いて行うことができる。 いわゆるPCRの技術［ポリメラーゼ カタライズド チェイン リアクション( Polymerase-catalyzed Chain Reaction)、サイキ(Saiki)ら、サイエンス(Scienc e)230（1985）1350-1354；マリス(Mullis K.B.)およびファルーナ(Faloona F.A. )、メソッヅ イン エンチモロジー(Meth．Enzym.）155（1987）335-350］によ るDNA断片の酵素的増幅は、DNAサーマル サイクラー（パーキン エルマー シ ータス(Perkin Elmer Cetus)社製）を用い、製造元の説明書に従って行うことが できる。 ヌクレオチド配列の確認は、アマーシャム(Amersham)社製のキットを用い、サ ンガー(Sanger)らの開発した方法［プロシーディングス オブ ナショナル ア カデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)、74（1977 ）5463-5467］により行うことができる。 実施例 実施例１ 本実施例は、ウサギの網状赤血球ライセート(lysate)にm-カルパインを加える ことにより、ある種の変異型のみならず野性型p53タンパク質の分解が誘発され ることを示す。本実施例はまた、カルパイン類の阻害 剤がp53の分解を阻害することができ、その結果このタンパク質の活性を調節す ることができることを示す。 1.1.分解の提示。多様な変異型p53タンパク質（ヒトタンパク質C273、H273，H 175，I247）のみならず、マウスおよびヒトの野性型p53タンパク質を、ウサギ網 状赤血球ライセート中で翻訳させた。このようにして得られたタンパク質は、高 濃度のカルシウム（カルパイン類に必要な共因子）の存在下であっても、あらゆ る分解に抵抗性を示した。カルシウムの存在下、ウシm-カルパイン（シグマ(Sig ma)社製）を網状赤血球ライセートに添加することにより、新規に合成されたタ ンパク質が急速に消失し、電気泳動で分離可能なタンパク質分解断片が出現した 。同一実験条件下でのジヒドロフォレートリダクターゼあるいはグリセルアルデ ヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼなどのような他のタンパク質の分解に対する抵 抗性は、本反応に基質特異性のあることを示す。 1.2.p53タンパク質の濃度の調節のためのカルパイン阻害剤の使用。上記の実 施例1.1において、m-カルパインの添加でp53タンパク質の分解が誘発されること が示された。本実施例では、カルパインの活性を阻害する能力を調べる目的で、 m-カルパインに加え、様々の化合物が反応系に導入された。得られた結果は、カ ルパインの特異的阻害剤であるペプチド（生理学的阻害剤であるカルパスタチン の誘導体；マキ(Maki)ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー(J ．Biol．Chem.)、254，18866-18869，1989）のみならず、カルシウムキレート剤 （EGTA）の添加により、外因性カルパインにより誘発されるp53タンパク質の分 解を阻害することができることを示す。 実施例２ 前記実施例において、p53タンパク質溶液への外因性カルパインの添加は、そ の分解をもたらすことが示された。本実施例では、ある種の変異型p53タンパク 質のみならず、野性型p53タンパク質の分解が、細胞質抽出液中の内因性カルパ イン類により誘発され得ることを示す。本実施例はまた、カルパイン類の阻害剤 は、外因性カルパインの存在下においてp53の分解を阻害することができ、従っ てこのタンパク質の活性を調節できることを示す。 2.1.内因性カルパイン類による分解。ある種の変異型p53タンパク質（例１参 照）のみならずマウスおよびヒトの野性型p53タンパク質を、ウサギ網状赤血球 ライセート中で翻訳させ、その後、ダウディ(Daudi)もしくはジャーカット(Jurk at)ヒトリンパ芽球胞の細胞質抽出液の存在下でインキュベートした。細胞質抽 出液は以下の方法で調製した。すなわち、当該細胞（ATCCで入手可能）を10％ウ シ胎児血清を加えたDMEM培地で培養した。その後、細胞を集め、PBS緩衝液で洗 浄し、界面活性剤を含まない低張の分解用緩衝液（HEPES 20mM、pH 7.5；KOAc 1 0mM；MgOAc 1.5mM；細胞５×108個あたり２ml）中で５分間インキュベートした 。ダウンス(Dounce)のホモジナイザーを用いて分解を完全なものとした後、顕微 鏡下で確認した。その後、2000ｇで５分間遠心して核を除去し、上清を10000ｇ で１時間遠心した（ベックマン(Beckman)社製 SW60）。その後、５から12mg/ml の量で細胞質抽出液を等分した。 網状赤血球ライセートを、カルシウム非存在下で細胞質抽出液存在下にインキ ュベートした場合には分解はみとめられなかった。一方、カルシウム存在下では 、実施例１で得られたものと類似の、特徴的なタンパク質分解生成物プロフィル の出現をともなう、非常に急速なp53タンパ ク質の分解がみとめられた。本実験は、実際、p53タンパク質が内因性のカルパ イン類で分解されることを示す。 2.2.p53タンパク質の濃度調節のためのカルパイン阻害剤の使用。あらゆる範 囲のタンパク質分解酵素阻害剤（ロイペプチン、アプロチニン、大豆トリプシン インヒビター、およびPMSF）およびとりわけカルパスタチンというペプチドの使 用のみならず、EGTAによるカルシウムのキレートは、これらのタンパク質の分解 が細胞質抽出液中のカルパイン類に依存していること、および、カルパイン類の 活性を調節できる様々な化合物が、p53タンパク質の濃度の制御に用いられるこ とを示す。 実施例３ 本実施例は、マウスおよびヒトの野性型p53タンパク質が細胞質抽出液中のカ ルパイン類の直接の基質であることを提示する。 実施例１および実施例２は、カルパイン類が複雑な反応混合物溶液中でp53タ ンパク質の分解を誘発できることを示す。しかるに、これらの実験は、カルパイ ン類が実験に用いられた条件下において、実際にp53に作用する第二のタンパク 質分解酵素を活性化することを排除するものではない。本実施例では以下の実験 を行った。すなわち(1)ウサギ網状赤血球ライセート中で新規に合成されたマウ スおよびヒトの野性型p53タンパク質を、実施例２と同様に、カルパイン類を活 性化する目的で、カルシウムのみならずダウディ(Daudi)細胞の細胞質抽出液の 存在下で30分間インキュベートした。(2)その後、p53タンパク質を反応混合液に 添加し、カルパインに許容される条件（同じ反応条件）下もしくは他の条件（カ ルシウムをキレートするEGTAまたはカルパスタチンペプチドを添加）下で30分間 、反応を継続した。カルシウム存在下では、新たに添 加したp53タンパク質は完全に分解された。このことは、実験を通してタンパク 質分解活性が機能していたことを示す。一方で、EGTAの存在、もしくは、さらに 重大にはカルパスタチンペプチドの存在によりカルパイン類が阻害された場合に は、新たに添加されたp53タンパク質はそれ以上分解されなかった。従って、こ の後者の所見は、実験の最初の部分において、カルパイン類がp53の分解を司る( responsible)第二のタンパク質分解酵素を誘導した可能性を排除する（第１図） 。 実施例４ 本実施例はカルパスタチンをコードする核酸配列を含む組み換えアデノウイル スの構築について記載する。このアデノウイルスは、欠損アデノウイルスAd-dl1 324と、RSVプロモーターの調節下に配列同定番号１(SEQ ID No.1)の配列を有す るプラスミドとの間の相同遺伝子組み換えにより構築される。 4.1.配列同定番号１(SEQ ID No.1)のプラスミドの構築．配列同定番号１(SEQ ID No.1)のプラスミドは、相同遺伝子組み換えをもたらすアデノウイルスの領域 のみならず、RSV-LTRプロモーターの調節下にあるカルパスタチンをコードする 配列を含む．本プラスミドは、プラスミドpAd.RSVβGalに配列同定番号１(SEQ I D No.1)の配列を挿入することで構築される。プラスミドpAd.RSVβGalは、5'末 端から3'末端の順に、以下のものを包含する。 ・ITR配列、複製開始点、脱被殻(encapsidation)シグナルおよびエンハンサーE1 Aを含む、Ad5アデノウイルスの左側末端に対応するPvuII断片・RSV（ラウス サ ルコーマ ウイルス(Rous sarcoma virus)）プロモーターの調節下にある、βガ ラクトシダーゼをコードする遺伝子 ・プラスミドpAd.RSVβGalとアデノウイルスdl1324との間で相同遺伝子組み換え をおこさせる、Ad5アデノウイルスゲノムの２番目の断片、プラスミドpAd.RSVβ Galについては、ストラトフォード・ペリカウデット(Stratford-Perricaudet)ら により記載されている（ジャーナル オブクリニカル インヴェスティゲイショ ン(J．Clin．Invest．90（1992）626)。 4.2.組み換えアデノウイルスの構築。 4.1.に記載されたベクターを直鎖状とし、アデノウイルスE1領域 （E1AおよびE11B）によりコードされた機能をトランスに提供するヘルパー細胞 （293株）に、欠損アデノウイルスベクターとともにコトランスフェクション（ 共感染）させる。 さらに特定しては、組み換えアデノウイルスは、以下の手順に従い、変異アデ ノウイルスAd-dl1324（ティンマパヤ(Thimmappaya)ら、セル(Cell)31（1982）54 3）と、実施例4.1.に記載したベクターとの間のイン ビボ(in vivo)での相同遺 伝子組み換えにより得られる。すなわち、配列同定番号１(SEQ ID No.1)のプラ スミドおよび酵素ClaIで直鎖状としたアデノウイルスAd-dl1324を、相同遺伝子 組み換えを起こさせるように、リン酸カルシウムの存在下細胞株293にコトラン スフェクションする。こうにして創製された組み換えアデノウイルスを、その後 、プラーク精製により選択する。分離後、組み換えアデノウイルスのDNAは細胞 株293内で増殖され、約1010pfu/mlの力価をもつ未精製の組み換え欠損アデノウ イルスを包含する培養上清をもたらす。 ウイルス粒子は既知の技術に従い、塩化セシウム密度勾配遠心により精製され る（とくに、グレアム(Graham)ら、ヴァイロロジー(Virology) 52（1973）456を参照）。得られたアデノウイルスは20%グリセロール中、−80度 Ｃで保存することができる。 The present invention relates to a novel method for treating tumors by modulating p53 protein. More specifically, the present invention relates to a method for treating a tumor by regulating the intracellular concentration of p53 protein. The present invention also relates to a vector for gene therapy that enables regulation of p53 protein, and a pharmaceutical composition containing them. During the past 15 years, the molecular characterization of oncogenes and tumor suppressor genes has enabled a new perspective on the oncogenic process. Thus, increasingly detailed knowledge of the regulation of these genes and the function of the corresponding proteins has made it possible to conceive new therapeutic approaches. More specifically, elucidating the degradation of tumorigenic and antitumorigenic proteins represents a major challenge in fighting tumors. Because the elucidation predicts that, in the case of oncogenic proteins, the promotion of their degradation may counteract their effects, and in the case of tumor suppressors, the inhibition of their Predicts the potential of enhancing the anti-proliferative or anti-tumor effects of, and in the case of mutant proteins, enhancing the antigen presentation of those proteins by molecules of the major histocompatibility complex stimulates a tumor-specific immune response May stabilize these proteins to trigger the process of apoptosis if the oncogene or anti-oncogene is capable of inducing highly expressed programmed cell death. This is because it predicts gender. Originally, p53 protein was classified as a nuclear oncogene. This was because in transfection experiments, it was possible to not only transform primary cultured cells in cooperation with activated oncogenes such as ras, but also extend the lifespan of rodent cells in culture. It is. Indeed, the genes used in these first experiments were mutated, expressing variant p53 proteins that were characterized by gain of function. Now, the p53 protein is a transcription factor that negatively regulates growth and cell division, at least in the wild type, without excluding functions that may still be found, and in some circumstances, apoptosis. It is known to be able to trigger (Yonish-Roach, et al., Nature, 352, 345-347, 1991). These properties emerge under certain stressful conditions that threaten the integrity of cellular DNA, suggesting that p53 is a "genome guardian". When all types of human tumors are considered together, the presence of mutated p53 protein in about 40% reinforces this hypothesis, and mutations in this gene play a role in tumor progression Identifies a role that is likely to be crucial (for review, Montenarh, Oncogene, 7, 1673-1680, 1992; Oren, FASEB J., 6, 3169- 3176, 1992; see Zambetti and Levine, FASEBJ., 7, 855-865, 1993). Wild-type p53 protein is subject to complex regulation not only of its location in the cell and its post-translational modifications, but also of its synthesis and degradation (see review cited above). Wild-type p53 protein is very unstable, with a half-life of several minutes. In contrast, some muteins that accumulate at high concentrations in tumors have a significantly longer half-life. Little is clearly established regarding the degradation of p53. Indeed, it is unknown where in the cell degradation occurs, the number and nature of its catabolic pathways, and the peptide units that label it during p53 degradation. To our knowledge, the only information available is related to the involvement of the enzyme E1 in the ubiquitin cycle under certain experimental conditions (Ciechanover et al., Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. Sci.). USA) 88, 139-143, 1991; Chowdary et al., Molecular and Cellular Biology (Molec. Cell. Biol.) 14, 1997-2003, 1994). Furthermore, it has been shown that certain proteolytic products from p53 may be presented in a manner similar to antigens. The present invention stems, in part, from the demonstration that the p53 protein is a substrate for the calcium-dependent proteolytic enzyme calpain. More specifically, it comes from the demonstration that the p53 protein is specifically degraded by m-calpain or μ-calpain. The present invention comprises for the first time a mechanism for regulating the intracellular concentration of the p53 protein, and as a result it is particularly novel for regulating the concentration of this protein in pathological conditions such as certain tumors. To provide an effective and specific approach. In particular, the present invention describes a novel approach to the treatment of tumors based on the use of compounds that modulate the activity of calpains on the p53 protein. Modulation of calpain activity promotes degradation of mutant p53 protein to inhibit tumorigenic effect of mutant p53 protein and / or promote presentation of immunogenic peptide, or is expressed in tumor Stabilizing the wild-type p53 protein to offset the oncogenic effects of the mutein and / or induce apoptosis of the tumor cells. Accordingly, a first subject of the present invention is the use of compounds capable of modulating the activity of calpain for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of tumors. Calpains are universal enzymes present in most mammalian cells (for review, see Croall and deMartino, Physiol. Rev., 71, 813-847, 1991). reference). These enzymes are inherently cytoplasmic, but can enter the nucleus during mitosis or after some type of stimulation by disruption of the nuclear envelope. As mentioned above, the proteolytic activity of calpains depends on the presence of calcium. Compounds capable of modulating calpain activity for the purposes of the present invention can be of several types. They can be compounds that can inhibit the activity of calpain on the p53 protein. These compounds are particularly advantageous because they can be used, at least in part, to inhibit the degradation of wild-type p53 protein. Therefore, these compounds can stabilize the wild-type p53 protein in cells and cancel the effect of the mutant. Among the inhibitory compounds used within the scope of the present invention, proteolytic enzyme inhibitors (leupeptin, aprotinin, PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride), etc.), calcium chelators (EGTA (ethylene glycol bis (2 -Aminoethyl ether) tetraacetic acid), EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), etc.), or more specific inhibitors such as calpastatin or any fragment or derivative thereof. Calpastatin is a known inhibitor of calpains. The sequence is described in the prior art literature (SEQ ID No. 1). A particularly advantageous aspect of the invention consists in transferring a vector having the entire or a part of the sequence encoding calpastatin into a tumor. This approach is particularly suited for the treatment of tumors that necessarily carry the wild-type p53 protein allele, such as, for example, colon and lung tumors. Various fragments or derivatives of calpastatin can be used within the scope of the present invention. Such fragments or derivatives modify the genetic and / or chemical properties of the sequence of SEQ ID No. 1) (one or more) while at least partially conserving the ability to inhibit the activity of calpain. Any of the molecules obtained above. Modification of a genetic and / or chemical property is understood as a mutation, deletion, substitution, addition, and / or modification of any one or more nucleotides. These modifications can be made for a variety of purposes, but especially to prepare sequences adapted for expression in a particular type of vector or host, reducing the size of the sequence to facilitate penetration into cells. In order to increase the inhibitory activity, or in a particularly advantageous manner, to enhance the selectivity of an inhibitor of the activity of calpains against the degradation of wild-type p53 protein. Such modifications can be made, for example, by in vitro mutagenesis or by the introduction of additional components or synthetic sequences, or by deletion or replacement of native components. When a derivative as defined above is prepared, its activity as an inhibitor of the activity of calpains on the p53 protein is demonstrated in several ways, inter alia, among other things, the inhibitor described above and various forms of p53 Demonstration is achieved by contacting with the protein and subsequently detecting the degradation products obtained (see Examples 1 to 3). Any other techniques known to those skilled in the art are obviously used for this effect. In certain embodiments of the invention, calpastatin in whole or in part, or a nucleic acid encoding all or part of calpastatin is used as an inhibitor. More specifically, a peptide containing the whole or a part of the sequence of SEQ ID NO: 1 or a derivative thereof is used. More specifically, examples of the derivative include a compound having a sequence of SEQ ID No. 2 (SEQ ID No. 2). This corresponds to a fragment of calpastatin. Any derivative consisting of the sequence of SEQ ID No. 1 (SEQ ID No. 1) or 2 (No. 2) which can specifically or preferentially inhibit the degradation of the wild-type p53 protein by calpain is used advantageously. . A compound capable of regulating the activity of calpain on p53 protein for the purpose of the present invention can also be a derivative of calpain capable of specifically or preferentially degrading mutant p53 protein. Such derivatives may also degrade the mutant p53 protein in order to inhibit its oncogenic effect and / or enhance the presentation of immunogenic peptides without significantly affecting intracellular wild-type p53 protein levels. Is very advantageous because it can be activated. Such derivatives can be obtained from calpain by structural modification (one or more) of genetic and / or chemical properties. The ability of the derivative thus obtained to specifically or preferentially degrade the mutant p53 protein can be demonstrated as described in Examples 1-3. Preferably, the modulator used within the scope of the present invention is a protein or polypeptide, or a nucleic acid sequence encoding these polypeptides or proteins. More preferably, the compound having a modulating effect is a specific inhibitor of the activity of calpain on wild-type p53 protein, or in the form of other calpains that have been modified to specifically degrade the mutant p53 protein. It is a protein or polypeptide. In a particularly advantageous embodiment, the present invention relates to a nucleic acid sequence encoding a calpain inhibitor, such as calpastatin or a part thereof, in a tumor cell having both wild-type and mutant p53 alleles. Alternatively, it may result in the expression of modified or other forms of calpains that are modified to specifically degrade the mutant p53 protein. The nucleic acid sequences used within the scope of the present invention can be administered in the form of naked DNA, according to the techniques described in WO 90/11092. Also, complex methods such as DEAE-dextran (Pagano et al., Journal of Virol. (J. Virol.) 1 (1967) 891), nuclear proteins (kaneda et al., Science 243 (1989) 375), lipids (Felgner et al., Proceedings of National Academy of Sciences, USA (PNAS) 84 (1987) 7413), or in the form of liposomes (Fraley et al., Journal of Biological Chemistry ( J. Biol. Chem.) 255 (1980) 10431). Preferably, the sequences used within the scope of the present invention form part of a vector. The use of such vectors indeed allows for improved application of the nucleic acid to the cells to be treated and also allows for increased stability in said cells. Increased stability allows for obtaining a sustained therapeutic effect. Furthermore, several nucleic acid sequences can be introduced into the same vector. This also enhances treatment efficiency. The origin of the vector used can vary as long as it can transform animal cells, preferably human tumor cells. In a preferred embodiment of the present invention, a virus-derived vector, which may be selected from adenoviruses, retroviruses, adeno-associated virus (AAV) or herpes virus, is used. In this regard, the subject of the present invention is any recombinant virus comprising a nucleic acid encoding a compound capable of modulating the activity of calpain, inserted into its gene. Preferably, the viruses used within the scope of the present invention are deficient, that is, unable to replicate autonomously in infected cells. Thus, the genome of the defective virus used within the scope of the present invention generally lacks at least the sequences necessary for the replication of said virus in infected cells. These regions have been removed (fully or partially), rendered nonfunctional, or replaced with other sequences, especially those encoding calpain modulators. Can be. Preferably, the defective virus still retains its own genomic sequence necessary for encapsidation of the virion. More specifically, for adenoviruses, various serotypes have been characterized which differ somewhat in their structure and properties. Within the scope of the present invention, of these serotypes, the use of human adenovirus type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see FR 93 05954) is preferred. . Among the adenoviruses of animal origin used within the scope of the present invention, dogs, cattle, mice (eg MVA1. Beard et al., Virology 75 (1990) 81), sheep, pigs, birds, Alternatively, monkey (eg, SAV) adenovirus may be mentioned. Preferably, the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, or, more preferably, a CAV2 adenovirus [eg, a Manhattan strain or A26 / 21 (ATCC VR-800)]. Preferably, human or dog or adenoviruses of mixed origin are used within the scope of the present invention. Preferably, the defective adenoviruses of the present invention comprise a sequence that causes encapsidation, ITR, and a sequence that encodes a modulator of calpains. More preferably, in the genome of the adenoviruses of the present invention, at least one of the E1 gene and each of E2, E4, and L1-L5 has no function. The viral gene may be prepared by any technique known to those skilled in the art and, in particular, by complete suppression, or substitution or partial deletion, or the addition of one or more bases to the gene (s). , Can lose functionality. Such modifications can be obtained in vitro (on isolated DNA) or in situ, for example by genetic engineering techniques or, alternatively, treatment with mutagenic substances. The defective recombinant adenoviruses according to the present invention can be prepared by any technique known to the person skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham. ), Embo Journal (EMBO J.) 3 (1984) 2917). In particular, it can be prepared by homologous recombination between one adenovirus and, inter alia, a plasmid having a DNA sequence coding for a regulator of calpains. Homologous recombination occurs after co-transfection (co-infection) of the adenoviruses and plasmids described above into a suitable cultured cell line. The cultured cell line used is preferably (1) transformed with the above-described elements, and (2) a sequence capable of complementing the defective portion of the adenovirus genome, preferably incorporated to avoid the risk of recombination. Should be included in a separate form. One example of a cultured cell line is the human fetal kidney cell line 293 (Greham et al., Journal J. Am., 1993), particularly including the left part (12%) of the Ad5 adenovirus genome integrated in its genome. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Strategies for the construction of vectors from adenoviruses are also described in FR 93 05954 and FR 93 08596. Next, as shown in the Examples, grown adenoviruses are recovered and purified by conventional molecular biology techniques. With respect to adeno-associated viruses (AAVs), these are relatively small DNA viruses that integrate in a stable and site-specific manner into the genome of infected cells. They can infect a wide range of cells without causing any effects on cell growth, morphology or differentiation. Furthermore, they do not appear to be involved in pathology in humans. The genome of AAVs has been cloned, sequenced and characterized. This genome is composed of about 4700 bases, and includes, at both ends, an inverted repeat base sequence (ITR) of about 145 bases that serves as an origin of viral replication. The rest of the genome is divided into two essential regions with the function of encapsulation. That is, the left portion of the genome contains the rep genes involved in viral replication and viral gene expression, and the right portion of the genome contains the cap gene encoding viral capsid proteins. The use of AAV-derived vectors for in vitro and in vivo gene transfer has been described in the literature (especially WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368). , US 5,139,941, EP 485 528). These specifications include various (gene) constructs derived from AAV in which the rep and / or cap genes have been removed and replaced with the gene of interest and in vitro (on cultured cells) or in vivo (in cultured cells). The use of these constructs for the transfer of the gene of interest in vivo (directly into an organ) has been described. The defective recombinant AAVs according to the present invention may be used to regulate calpains that are bounded by two inverted repeats (ITRs) of AAV in a cell line infected with a human helper virus (eg, an adenovirus). It can be prepared by co-transfection (co-infection) of a plasmid containing a sequence encoding a substance and a plasmid having AAV envelope genes (rep and cap genes). Thereafter, the resulting recombinant AAVs are purified by conventional techniques. For herpesviruses and retroviruses, the construction of their recombinant vectors has been widely described in the literature. In particular, Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 1 78220, Bernstein et al., Genetic Engineering (Gen et. Eng.) 7 (1985). 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, and the like. In practicing the present invention, it is particularly advantageous to use defective recombinant retroviruses or adenoviruses. These vectors, in fact, have properties which are particularly advantageous for gene transfer into tumor cells. I have. Conveniently, in the vectors of the present invention, the sequence encoding a modulator of the calpains is under the control of a signal that results in its expression in tumor cells. Preferably, these are heterologous expression signals, so to speak so different from those which naturally govern the expression of the preparation. They can in particular control the expression of other proteins or synthetic sequences. In particular, it can be a promoter sequence of a eukaryotic or viral gene. For example, it can be a promoter sequence from the genome of the cell to be infected. Similarly, it can be a promoter sequence from the genome of a virus, including the virus used. In this regard, promoters such as E1A, MLP, CMV, and RSV-LTR can be mentioned as examples. In addition, these expression sequences can be modified by adding sequences that activate or regulate, or that result in tissue-specific expression. In fact, it is particularly advantageous to use an expression signal that is specifically or preferentially active in tumor cells, so that its DNA sequence is only expressed when the virus effectively infects tumor cells Or exert its action. In a particular embodiment, the present invention relates to a defective recombinant virus comprising a cDNA sequence encoding a calpain class of regulators under the control of a viral promoter, preferably a promoter selected from the RSV-LTR and CMV promoters. In a further preferred embodiment, the present invention relates to a defective recombinant virus comprising a DNA sequence encoding a regulator of the calpains under the control of a promoter that results in a predominant expression in tumor cells. For the purposes of the present invention, its expression is considered to be predominant if the level of expression in tumor cells is higher, even if the rest of the expression is found in other types of cells. The present invention also relates to any pharmaceutical composition comprising one or more defective recombinant viruses, as described above. These pharmaceutical compositions can be formulated for administration by such routes as topical, oral, parenteral, nasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular or transdermal. Preferably, the pharmaceutical compositions of the present invention contain a pharmaceutically injectable formulation, particularly a vehicle that allows for direct infusion into a patient's tumor. This can be, inter alia, dried, in particular lyophilized, isotonic sterile water or a composition from which sterile water or saline can be added to prepare an injectable solution. Injection directly into the patient's tumor is advantageous because it allows for the concentration of therapeutic effects at the level of the tissue affected by the tumor. The dosage of the defective recombinant virus used for this injection can be adapted according to various parameters and in particular the viral vector, the mode of administration used, the relevant pathology or alternatively the desired duration of treatment. The recombinant adenovirus according to the present invention usually contains 10 Four From 10 14 pfu / ml, preferably 10 6 From 10 Ten It is formulated and administered in doses of between pfu / ml. The term ppla (“plaque forming unit”) is a term corresponding to the infectivity of a virus solution and is used to infect a suitable cell culture system, usually after 48 hours. It is determined by measuring the number of plaques on infected cells. Techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature. With respect to retroviruses, the compositions according to the present invention can directly include producer cells for transplantation. The invention is particularly adapted for the treatment of tumors in which a variant of p53 is found. More specifically, the present invention is particularly advantageous in treating tumors in which wild-type and mutant alleles of p53 are present. These tumors are, in particular, colon and rectum tumors, breast tumors, lung tumors, gastric tumors, esophageal tumors, B lymphocyte tumors, ovarian tumors, and bladder tumors. The present invention is described in more detail by the following examples, but is not limited thereto. (Description of the drawings) FIG. 1: Study on regulation of p53 protein by calpain. This reaction was performed using 1 μl of the translation mixture and a final volume of 30 μl. First row: T0, second row: 30 minutes after the presence of 1 mM calcium and 20 μg / ml calpain. Fourth row: 1 mM calcium, 20 μg / ml calpain and 0.5 μg / ml calpastatin. 30 minutes after presence, column 5: 30 minutes after the presence of 1 mM calcium, 20 μg / ml calpain and 10 mM EGTA, column 6: PBS (phosphate-borate buffer), Row 7: PBS + calcium, Row 8: PBS + calpastatin. General molecular biology techniques Preparative extraction of plasmid DNA, cesium chloride density gradient centrifugation of plasmid DNA, agarose or acrylamide gel electrophoresis, purification of DNA fragments by electroelution, protein extraction with phenol or phenol-chloroform, Techniques conventionally used in molecular biology, such as precipitation of DNA in a saline solution with ethanol or isopropyl alcohol and transformation of Escherichia coli (Escherichia coli), are well known to those skilled in the art. Widely described in the literature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory. (Cold Spring Harbor), NY, 1982; Oath Au subel FM et al., Eds., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987] pBR322 and pUC For the ligation reaction, DNA fragments were separated according to their size by agarose or acrylamide gel electrophoresis and the phenol or phenol or M13 phage were commercially available (Bethesda Research Laboratories). After extraction using a phenol-chloroform mixed solution and precipitation with ethanol, the mixture is incubated in the presence of phage T4 DNA ligase (manufactured by Biolabs) according to the method recommended by the supplier. Is the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I (Biola The protruding 3 'end can be removed in the presence of phage T4 DNA polymerase (Biolabs) according to the manufacturer's recommendations, using the manufacturer's instructions (Biolabs). Deletion of the protruding 5 'end is performed under the control of S1 nuclease. In vitro site-directed mutagenesis with synthetic oligonucleotides was performed according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764]. Amersham). So-called PCR technology [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Maris (Mullis KB) and Falluna (Faloona FA), Methodin Enzymology (Meth. Enzym.) 155 (1987) 335-350] enzymatic amplification of a DNA fragment can be performed using a DNA thermal cycler (Perkin Elmer Cetus) according to the manufacturer's instructions. it can. The nucleotide sequence was confirmed using a kit manufactured by Amersham, Inc., using a method developed by Sanger et al. [Proceedings of National Academy of Science USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74 (1977)]. ) 5463-5467]. Examples Example 1 This example shows that the addition of m-calpain to rabbit reticulocyte lysate (lysate) induces the degradation of certain mutant as well as wild type p53 proteins. This example also shows that inhibitors of calpains can inhibit the degradation of p53, and thus modulate the activity of this protein. 1.1. Decomposition presentation. Various mutant p53 proteins (human proteins C273, H273, H175, I247) as well as mouse and human wild-type p53 proteins were translated in rabbit reticulocyte lysates. The protein thus obtained was resistant to any degradation, even in the presence of high concentrations of calcium (a cofactor required for calpains). By adding bovine m-calpain (Sigma) to reticulocyte lysate in the presence of calcium, newly synthesized proteins rapidly disappear, and proteolytic fragments that can be separated by electrophoresis are removed. Appeared. Resistance to degradation of other proteins such as dihydrofolate reductase or glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase under the same experimental conditions indicates that the reaction is substrate specific. 1.2. Use of calpain inhibitors for regulation of p53 protein concentration. In Example 1.1 above, it was shown that the addition of m-calpain induced the degradation of p53 protein. In this example, various compounds were introduced into the reaction system in addition to m-calpain in order to examine the ability to inhibit the activity of calpain. The results obtained indicate that the peptide is a specific inhibitor of calpain (a derivative of the physiological inhibitor calpastatin; Maki et al., Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 254, 18866). -18869, 1989) as well as the addition of a calcium chelator (EGTA) can inhibit exogenous calpain-induced degradation of p53 protein. Example 2 In the above example, the addition of exogenous calpain to the p53 protein solution was shown to result in its degradation. This example shows that degradation of wild-type p53 protein as well as certain mutant p53 proteins can be induced by endogenous calpains in cytoplasmic extracts. This example also shows that inhibitors of the calpains can inhibit the degradation of p53 in the presence of exogenous calpain and thus modulate the activity of this protein. 2.1. Degradation by endogenous calpains. Certain mutant p53 proteins (see Example 1) as well as mouse and human wild-type p53 proteins are translated in rabbit reticulocyte lysates, followed by Daudi or Jurkat at human lymphoblasts. The cells were incubated in the presence of cytoplasmic extracts. The cytoplasmic extract was prepared by the following method. That is, the cells (available at ATCC) were cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum. The cells are then collected, washed with PBS buffer, and in detergent-free hypotonic degradation buffer (HEPES 20 mM, pH 7.5; KOAc 10 mM; MgOAc 1.5 mM; 2 ml per 5 × 108 cells). For 5 minutes. The digestion was completed using a Dounce homogenizer and then confirmed under a microscope. Thereafter, the nucleus was removed by centrifugation at 2000 g for 5 minutes, and the supernatant was centrifuged at 10,000 g for 1 hour (Beckman SW60). Thereafter, the cytoplasmic extract was aliquoted in amounts of 5 to 12 mg / ml. No degradation was observed when reticulocyte lysate was incubated in the absence of calcium in the presence of cytoplasmic extract. On the other hand, in the presence of calcium, a very rapid degradation of the p53 protein was observed, with the appearance of a characteristic proteolytic product profile similar to that obtained in Example 1. This experiment shows that in fact the p53 protein is degraded by endogenous calpains. 2.2. Use of calpain inhibitors to regulate the concentration of p53 protein. The chelation of calcium by EGTA, as well as the use of a full range of proteolytic enzyme inhibitors (leupeptin, aprotinin, soybean trypsin inhibitor, and PMSF) and especially the peptide calpastatin, indicates that the degradation of these proteins We show that it is dependent on calpains and that various compounds that can regulate the activity of calpains are used to control the concentration of p53 protein. Example 3 This example demonstrates that mouse and human wild-type p53 proteins are direct substrates for calpains in cytoplasmic extracts. Examples 1 and 2 show that calpains can induce degradation of p53 protein in complex reaction mixture solutions. However, these experiments do not preclude calpains from actually activating a second protease that acts on p53 under the conditions used in the experiments. In this example, the following experiment was performed. That is, (1) mouse and human wild-type p53 proteins newly synthesized in rabbit reticulocyte lysate were used in the same manner as in Example 2 to activate not only calcium but also Daudi cells in order to activate calpains. Was incubated for 30 minutes in the presence of the cytoplasmic extract. (2) Then, p53 protein is added to the reaction mixture, and the mixture is allowed to react for 30 minutes under conditions permitted by calpain (same reaction conditions) or under other conditions (adding EGTA or calpastatin peptide that chelate calcium). Continued. In the presence of calcium, the newly added p53 protein was completely degraded. This indicates that the proteolytic activity was functioning throughout the experiment. On the other hand, when calpains were inhibited by the presence of EGTA, or more importantly, the presence of the calpastatin peptide, the newly added p53 protein was not further degraded. Thus, this latter finding excludes the possibility that calpains induced a second proteolytic enzyme responsible for p53 degradation in the first part of the experiment (FIG. 1). Example 4 This example describes the construction of a recombinant adenovirus containing a nucleic acid sequence encoding calpastatin. This adenovirus is constructed by homologous recombination between the defective adenovirus Ad-dl1 324 and a plasmid having the sequence of SEQ ID No. 1 under the control of the RSV promoter. 4.1. Construction of plasmid of SEQ ID No. 1. The plasmid of SEQ ID No. 1 contains a sequence encoding calpastatin under the control of the RSV-LTR promoter, as well as the region of the adenovirus that results in homologous recombination. This plasmid is constructed by inserting the sequence of SEQ ID No. 1 into the plasmid pAd.RSVβGal. The plasmid pAd.RSVβGal includes the following from the 5 ′ end to the 3 ′ end in order. PvuII fragment corresponding to the left end of Ad5 adenovirus, including ITR sequence, origin of replication, encapsidation signal and enhancer E1A. Under the control of RSV (Rous sarcoma virus) promoter For the second fragment of the Ad5 adenovirus genome, plasmid pAd.RSVβ Gal, which causes homologous recombination between a gene / plasmid pAd.RSVβGal encoding β-galactosidase and adenovirus dl1324, Stratford-Pelicadet (Stratford-Perricaudet) et al. (Journal of Clinical Investigation (J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) 4.2. Construction of Recombinant Adenovirus Vectors described in 4.1. Stranded to provide in trans the functions encoded by the adenovirus E1 regions (E1A and E11B) Co-transfection (co-infection) with a defective adenovirus vector into the helper cells (strain 293.) More specifically, the recombinant adenovirus is mutated according to the following procedure using the mutant adenovirus Ad-dl1324 (Tinmapaya). Cell 31 (1982) 543) and homologous recombination in vivo between the vector described in Example 4.1. The adenovirus Ad-dl1324 linearized with the plasmid of ID No. 1) and the enzyme ClaI is co-transfected into the cell line 293 in the presence of calcium phosphate so as to cause homologous recombination. The recombinant adenovirus is then selected by plaque purification.After isolation, the recombinant adenovirus DNA is propagated in cell line 293 and This results in a culture supernatant containing the crude recombinant deficient adenovirus with a titer of 10 pfu / ml Virus particles are purified by cesium chloride density gradient centrifugation according to known techniques (in particular, Graham et al. See Virology 52 (1973) 456.) The resulting adenovirus can be stored at -80 ° C in 20% glycerol.
【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年６月２４日 【補正内容】 請求の範囲 １．細胞内のp53タンパク質濃度を調節する薬剤組成の調製のためのカルパイン の活性の調節を可能にする化合物の使用。 ２．当該化合物がカルパインの活性の阻害剤であるタンパク質もしくはポリペプ チドまたはそのようなポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸配列で あることを特徴とする請求の範囲１に記載された使用。 ３．当該化合物が野生型p53タンパク質に対するカルパインの活性の特異的阻害 剤であるタンパク質またはペプチド、あるいはそのようなポリペプチドまたはタ ンパク質をコードする核酸配列であることを特徴とする請求の範囲２に記載され た使用。 ４．当該核酸がベクターの一部であることを特徴とする請求の範囲２もしくは３ に記載された使用。 ５．当該核酸が、アデノウイルス、レトロウイルスおよびアデノ関連ウイルスか ら選ばれるウイルスベクターの一部であることを特徴とする請求の範囲４に記載 された使用。 ６．当該核酸が脂質リポソームベクターの一部であることを特徴とする請求の範 囲４に記載された使用。 ７．当該化合物が、カルパスタチン全体もしくはその一部をコードする核酸であ ることを特徴とする上述の請求の範囲のいずれかに記載された使用。 ８．当該核酸が配列番号(SEQ ID No.)１の配列全体もしくはその一部またはその 誘導体を含むことを特徴とする請求の範囲７に記載された使用。 ９．当該核酸が配列番号(SEQ ID No.)１および２の配列から選ばれることを特徴 とする請求の範囲８に記載された使用。 １０．当該核酸が、野生型p53タンパク質の分解の特異的阻害剤をコードする、 配列番号(SEQ ID No.)１または２の配列の誘導体から選ばれることを特徴とする 請求の範囲８に記載された使用。 １１．当該化合物が、変異型p53タンパク質を特異的に分解することができるカ ルパインの誘導体であることを特徴とする請求の範囲１から６までの一つに記載 された使用。 １２．カルパインの活性の阻害剤であるタンパク質またはポリペプチドをコード する核酸配列を含み、かつ、アデノウイルス、レトロウイルスおよびアデノ関連 ウイルスから選ばれることを特徴とするベクター。 １３．カルパスタチン全体もしくはその一部をコードする配列を含むことを特徴 とする請求の範囲１２に記載されたベクター。 １４．変異型p53タンパク質を特異的に分解することのできるカルパインの誘導 体をコードする配列を含んでなることを特徴とする請求の範囲１２に記載された ベクター。 １５．カルパスタチンの全体または一部、あるいは変異型p53タンパク質を特異 的に分解することのできるカルパインの誘導体をコードする核酸配列を含む薬剤 組成。 １６．腫瘍内へ投与するために処方された、請求の範囲１５に記載された組成。[Procedure of Amendment] Article 184-8 of the Patent Act [Submission date] June 24, 1996 [Correction contents] The scope of the claims 1. Calpain for the preparation of a pharmaceutical composition that regulates intracellular p53 protein concentration Use of a compound that allows for the modulation of the activity of a. 2. A protein or polypep, wherein the compound is an inhibitor of calpain activity Or a nucleic acid sequence encoding such a polypeptide or protein Use according to claim 1, characterized in that it is. 3. The compound specifically inhibits the activity of calpain on wild-type p53 protein Protein or peptide, or such a polypeptide or protein 3. The nucleic acid sequence according to claim 2, which is a nucleic acid sequence encoding a protein. Use. 4. 4. The method according to claim 2, wherein the nucleic acid is a part of a vector. Use as described in. 5. Whether the nucleic acid is an adenovirus, a retrovirus and an adeno-associated virus 5. The method according to claim 4, which is a part of a viral vector selected from the group consisting of: Made use. 6. Claims wherein said nucleic acid is part of a lipid liposome vector. Use as described in Box 4. 7. The compound is a nucleic acid that encodes all or part of calpastatin. Use according to any of the preceding claims, characterized in that: 8. The nucleic acid is the entire sequence of SEQ ID No. 1 or a part thereof or a part thereof; Use according to claim 7, characterized in that it comprises a derivative. 9. The nucleic acid is selected from the sequences of SEQ ID Nos. 1 and 2. The use according to claim 8, wherein: 10. The nucleic acid encodes a specific inhibitor of the degradation of wild-type p53 protein, Characterized by being selected from derivatives of the sequence of SEQ ID No. 1 or 2 Use according to claim 8. 11. The compound is capable of specifically degrading the mutant p53 protein. 7. A derivative of lupain according to claim 1, wherein the derivative is a derivative of lupain. Made use. 12. Encodes a protein or polypeptide that is an inhibitor of calpain activity And adenoviruses, retroviruses and adeno-associated A vector selected from viruses. 13. It contains a sequence encoding the whole or part of calpastatin The vector according to claim 12, wherein 14． Induction of calpain capable of specifically degrading mutant p53 protein 13. A method according to claim 12, comprising a sequence encoding a body. vector. 15. Specific for all or part of calpastatin or mutant p53 protein Comprising a nucleic acid sequence encoding a derivative of calpain that can be degraded composition. 16. 17. The composition according to claim 15, formulated for administration into a tumor.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ピエシヤクジク， マルク フランス・エフ−34980サン−ジユリ−デ ユ−フエス・リユデエラブル123──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Agency reference number FI C12N 15/09 ZNA 9051-4C A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK) , ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN , TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AM, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, EE, FI, GE, HU, IS, JP, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI, SK, TJ, TT, A, UG, US, UZ, VN (72) inventor Pieshiyakujiku, Marc France-F -34980 San - Jiyuri - de Yoo - Fuesu-Riyudeeraburu 123
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