JPH10500978A

JPH10500978A - ｐ５３タンパク質の調節による腫瘍の治療方法

Info

Publication number: JPH10500978A
Application number: JP8500420A
Authority: JP
Inventors: ジヤン−マリーブランシヤール，; セルジユカリヨ，; マルクピエシヤクジク，
Original assignee: ローン−プーラン・ロレ・ソシエテ・アノニム
Priority date: 1994-05-31
Filing date: 1995-05-22
Publication date: 1998-01-27
Also published as: FI120501B; FI964783A0; FR2720277A1; EP0763121A1; CA2190293C; AU714209B2; WO1995033060A1; CA2190293A1; NO321411B1; FI964783L; FR2720277B1; NO964772L; NO964772D0; AU2620695A

Abstract

(57)【要約】細胞のp53タンパク質濃度を調節することによる腫瘍の治療法。特に、本発明はカルパイン活性を調節できる化合物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 p53タンパク質の調節による腫瘍の治療方法本発明は、腫瘍の治療のための新規の方法に関する。さらに具体的には、p53 タンパク質の細胞内濃度を調節することにより腫瘍を治療する方法に関する。また、p53タンパク質を調節することを可能にする遺伝子治療のためのベクター、ならびにそれらを含有する製薬組成物に関する。過去15年の間、腫瘍遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の分子的特徴づけは、発腫瘍の過程を新たな観点で見ることを可能にした。こうして、これらの遺伝子の制御および呼応するタンパク質の機能に関するますます詳細な知識は、新規の治療上のアプローチの着想を可能にした。さらに具体的には、腫瘍形成性および抗腫瘍形成性のタンパク質の分解の解明は、腫瘍との戦いに関する主要な挑戦を意味する。なぜなら、その解明は、腫瘍形成性タンパク質の場合には、それらの分解の促進がそれらの作用を無効にする可能性を予兆し、癌抑制物質の場合には、それらの分解の阻害が、それらの抗増殖作用もしくは抗腫瘍作用を増強する可能性を予兆し、変異タンパク質の場合には、主要組織適合性遺伝子複合体の分子によるそれらタンパク質の抗原提示の増強が、腫瘍特異的免疫応答を刺激する可能性を予兆し、さらに、腫瘍遺伝子もしくは抗腫瘍遺伝子が高発現プログラムされた細胞死を誘導することのできる場合には、アポトーシスの過程の引き金となるようにこれらのタンパク質を安定化させる可能性を予兆するからである。元来、p53タンパク質は、核腫瘍遺伝子に分類されていた。それは、トランスフェクション実験において、活性化されたrasなどの腫瘍遺伝子と協働して一次培養細胞を形質転換させるのみならず、培養系のげっ歯類の細胞の寿命を延ばすことが可能であったためである。実際、これらの最初の実験に用いられた遺伝子は変異しており、ある機能の獲得で特徴づけられたる変種p53 タンパク質類を発現するようになっていた。今では、p53タンパク質は、少なくとも野性型の場合、なお発見され得る機能を排除することなく、成長および細胞の分割を負の方向に調節する転写因子であり、また、ある状況下では、アポトーシスを誘発できることが知られている（ヨーニッシュ・ルーアッハ(Yonish-Roua ch)ら、ネイチャー(Nature)，352，345-347，1991）。これらの性質が、細胞DNA の保全性が脅かされるようなストレスのある一定状況下で現れることから、p53 は「ゲノムの保護者」であると示唆されてきた。ヒトの全てのタイプの腫瘍をひとまとめにして考えると、その約40％に変異型p53タンパク質が存在することがこの仮説を補強しており、また、この遺伝子の変異が腫瘍の亢進において演じているおそらく決定的と思われる役割を明示するものである（総説としては、モンテナール(Montenarh)、オンコジーン(Oncogene)，7，1673-1680，1992; オーレン(Oren)，FASEB J.，6，3169-3176，1992; ザンベッティ(Zambetti)とレヴァイン(Levine)，FASEBJ.，7，855-865，1993を参照）。野性型p53タンパク質は、その細胞内での位置およびその翻訳後の修飾の調節のみならず、その合成および分解の調節に関る複雑な調節を受ける（上記で引用した総説を参照）。野生型p53タンパク質は非常に不安定で、その半減期は数分である。対照的に、腫瘍に高濃度に蓄積するいくつかの変異タンパク質は、かなり長い半減期を有する。p53の分解に関してはほとんどはっきりと確立されていない。実際、分解が細胞内のどこで起こるのかについても、その異化作用経路の数およびその性質についても、また、p53の分解の際その標識となるペプチド単位についても、知られていない。われわれの知る限り、利用できる唯一の情報は、ある実験条件下でのユビキチン回路の酵素E1の関与に関する（シエシャノヴァ(Ciechanover)ら、プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンスＵＳＡ(Pro c．Natl．Acad．Sci．USA)88，139-143,1991; チョウダリー(Chowdary)ら、モレキュラーアンドセルラーバイオロジー(Molec．Cell．Biol.) 14，1997-2003 ，1994)。さらには、p53由来のある種のタンパク質分解生成物は抗原と同様の様式で提示される可能性があることが示されている。本発明は、部分的に、p53タンパク質がカルシウム依存性タンパク質分解酵素カルパインの基質であることの実証に由来する。さらに具体的には、p53タンパク質がm-カルパインまたはμ-カルパインで特異的に分解されることの実証に由来する。本発明は、p53タンパク質の細胞内濃度を調節する機構を初めて構成要件とするものであり、その結果とりわけある種の腫瘍のような病理的症状におけるこのタンパク質の濃度を調節するための、とくに新規の効果的かつ特異的なアプローチを提供するものである。とりわけ、本発明は、p53タンパク質に対するカルパイン類の活性を調節する化合物の使用に基づく腫瘍の治療への新規のアプローチについて記述する。カルパイン類の活性調節により、変異型p53タンパク質の腫瘍形成作用の阻害および／または免疫原性ペプチドの提示の促進のために変異型p53タンパク質の分解を促進するか、もしくは、腫瘍において発現されている変異タンパク質の腫瘍形成作用の相殺および／または腫瘍細胞のアポトーシスの誘導のために野性型p53タンパク質を安定化するか、のいずれかが可能となる。したがって、本発明の第一の主題は、腫瘍の治療用の製薬組成物の調製のためにカルパインの活性を調節できる化合物を使用することにある。カルパイン類はほとんどの哺乳動物細胞に存在する普遍的な酵素である（総説としては、クロール(Croall)とデマルティノ(deMartino)、フィジオロジカルレビュー(Physiol．Rev.)，71，813-847，1991を参照）。これらの酵素は本質的に細胞質に存在するが、有糸分裂の際あるいはある種の刺激後には、核膜の崩壊によって核内に侵入することができる。上述したように、カルパイン類のタンパク質分解活性はカルシウムの存在に依存する。本発明の目的のためにカルパイン活性を調節することができる化合物は、いくつかのタイプから成ることができる。それらは、p53タンパク質に対するカルパインの活性を阻害できる化合物であることができる。これらの化合物は、少なくとも部分的に、野生型p53タンパク質の分解を阻害するために用いることができるため、とりわけ有利である。したがって、これらの化合物は、細胞内で野性型p53タンパク質を安定化させ、変異型の作用を相殺することが可能となる。本発明の範囲内で用いられる阻害性の化合物のなかでも、タンパク質分解酵素阻害剤（ロイペプチン、アプロチニン、PM SF（フェニルメタンスルホニルフルオリド）、など）、カルシウムキレート剤（ EGTA（エチレングルコールビス（2-アミノエチルエーテル）四酢酸）、EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、など）、あるいは、カルパスタチンもしくはそのいずれかの断片または誘導体などの、より特異的な阻害剤を挙げることができる。カルパスタチンはカルパイン類の既知の阻害剤である。その配列は先行技術文献に記載されている（配列番号(SEQ ID No.)1）。本発明の、とりわけ有利な様態は、カルパスタチンをコードする配列全体もしくはその一部を有するベクターを腫瘍内に移送することにある。このアプローチは、例えば大腸腫瘍や肺腫瘍などの、野性型p53タンパク質の対立遺伝子を必ず有している腫瘍の治療にとりわけ適合する。本発明の範囲内では、カルパスタチンの様々な断片あるいは誘導体を使用することができる。こうした断片あるいは誘導体は、カルパインの活性を阻害する能力を少なくとも部分的に保存しつつ、配列番号(SEQ ID No.)1）の配列の遺伝子的および／または化学的性質を修飾（１つまたはそれ以上）して得られるいかなる分子であってもよい。遺伝子的および／または化学的性質の修飾とは、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドのいずれかの変異、欠失、置換、付加、および／または修飾と理解される。こうした修飾は様々な目的のために行われるが、とりわけ、特別なタイプのベクターもしくは宿主における発現に適合させた配列を調製する目的、細胞内への浸透を促進するように配列の大きさを減少させる目的、阻害活性を上昇させる目的、あるいは、とりわけ有利な意味においては、野性型p53タンパク質の分解に対するカルパイン類の活性の阻害剤の選択性を増強する目的で、行われる。こうした修飾は、例えばインビトロ（in vitro）での突然変異誘発または付加的構成要素や合成配列の導入、あるいは生来の構成要素の欠失や置換により行うことができる。上記で定義された誘導体が調製される場合、p53タンパク質に対するカルパイン類の活性の阻害剤としてのその活性は、いくつかの方法で実証されるが、とりわけ、前述の阻害剤と多様な形態のp53タンパク質とを接触させることおよびその後に得られた分解生成物を検出することで、実証される（実施例１から３を参照）。当業者に知られている他のいかなる技術は、明らかに、この効果のために用いられている。本発明に特定の様態において、カルパスタチン全体または一部、またはカルパスタチン全体あるいは一部をコードする核酸が阻害剤として用いられる。さらに具体的には、配列番号１(SEQ ID NO.1)の配列全体もしくは一部を含むペプチドまたはその誘導体が用いられる。誘導体に関しさらに具体的には、例えば、配列番号２(SEQ ID No.2)の配列の化合物を挙げることができる。これはカルパスタチンの断片に対応する。カルパインによる野性型p53タンパク質の分解を特異的または優先的に阻害することのできる、配列番号１(SEQ ID No.1)または２(No.2)の配列から成るいずれの誘導体も有利に用いられる。本発明の目的においてp53タンパク質に対するカルパインの活性を調節することのできる化合物はまた、変異型p53タンパク質を特異的または優先的に分解することのできるカルパインの誘導体であることもできる。このような誘導体はまた、細胞内の野性型p53タンパク質濃度に著しい影響を与えることなく、その腫瘍形成作用の阻害および／または免疫原性ペプチドの提示を増強するために、変異型p53タンパク質の分解を活性化できるようにするため、非常に有利である。このような誘導体は、遺伝子的および／または化学的性質の構造的修飾（１つもしくはそれ以上）により、カルパインから得ることができる。次いで、こうして得られた誘導体の、変異型p53タンパク質を特異的または優先的に分解する能力は、実施例１ないし３に記載される如く実証されうる。好ましくは、本発明の範囲内で用いられる調節物質はタンパク質もしくはポリペプチド、またはこれらのポリペプチドあるいはタンパク質をコードする核酸配列である。さらに好ましくは、調節作用を有する化合物は、野性型p53タンパク質に対するカルパインの活性の特異的阻害剤か、もしくは、変異型p53タンパク質を特異的に分解するよう修飾されたか他のカルパイン類の形態の、タンパク質もしくはポリペプチドである。とりわけ有利な態様においては、本発明は、野生型p53の対立遺伝子および変異型p53の対立遺伝子の双方を有する腫瘍細胞内で、カルパスタチンあるいはその一部のようなカルパイン阻害剤をコードする核酸配列、あるいは変異型p53タンパク質を特異的に分解するよう修飾されたか他のカルパイン類の形態の発現をもたらす可能性に存する。本発明の範囲内で用いられている核酸配列は、WO 90/11092明細書に記載された技術に従って、DNAをむき出しの(naked)形で投与することができる。また、複雑な方法、例えば、DEAE-デキストラン（パガノ(Pagano)ら、ジャーナルオブヴァイロロジー(J．Virol.)1（1967）891）、核タンパク質（カネダ(kaneda) ら、サイエンス(Science) 243（1989）375）、脂質（フェルグナー(Felgner)ら、プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンスＵＳＡ(PNAS)84（1987）7413）などと共に、あるいはリポソームの形態（フレイリー(Fraley)ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(J．Biol．Ch em．）255（1980）10431）、などの方法で行うことができる。好ましくは、本発明の範囲内で用いられる配列はベクターの一部を形成する。こうしたベクターの使用は、実際、治療されるべき細胞への核酸の適用の改善を可能にし、また、前述の細胞内での安定性の増加も可能にする。安定性の増加は、持続性の治療効果を得ることを可能にする。さらに、いくつかの核酸配列を同一ベクターへ導入することも可能である。このことも治療効率を増強する。使用するベクターの起源は、動物細胞、好ましくはヒトの腫瘍細胞を形質転換させ得る限りは多様であることができる。本発明の好ましい様態においては、アデノウイルス類、レトロウイルス類、アデノ関連ウイルス(AAV)類またはヘルペスウイルスから選択されてもよいウイルス由来のベクターが用いられる。この点に関して、本発明の主題は、カルパインの活性を調節し得る化合物をコードする核酸をその遺伝子内に挿入されて含むあらゆる組み換えウイルスである。好ましくは、本発明の範囲内で用いられるウイルス類は、欠損した、すなわち感染した細胞内で自律的に複製を行うことのできないものである。したがって、本発明の範囲内で用いられる欠損ウイルスのゲノムは、一般には、少なくとも、感染した細胞内で前述のウイルスの複製に必要な配列を欠く。これらの領域は除去（完全にもしくは部分的に）されているか、機能をもたないようにされているか、あるいは他の配列、およびとくにカルパイン類の調節物質をコードする配列で置換されていることができる。好ましくは、欠損ウイルスは、それでもなお、ウイルス粒子の脱被殻(encapcidation)に必要な自身のゲノム配列を保持している。さらに具体的には、アデノウイルス類に関して、その構造および性質が幾分異なる様々な血清型が特徴づけられてきている。本発明の範囲内では、これらの血清型のうち、ヒトアデノウイルス２型または５型（Ad 2またはAd 5）、もしくは動物起源のアデノウイルス類（FR 93 05954明細書を参照）の使用が好ましい。本発明の範囲内で使用される動物起源のアデノウイルスのうち、イヌ、ウシ、マウス（例：MVA1．ベアード(Beard)ら、ヴァイロロジー( Virology)75（1990）81）、ヒツジ、ブタ、トリ、または代替としてサル（例：S AV）のアデノウイルスを挙げることができる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスはイヌのアデノウイルスであり、あるいは、さらに好ましくはCAV2アデノウイルス［例えば、マンハッタン株(Manhattan strain)もしくはA26/21(ATCC VR -800)］である。好ましくは、本発明の範囲内ではヒトまたはイヌまたは混合起源のアデノウイルス類が使用される。好ましくは、本発明の欠損アデノウイルス類は、包膜化(encapsidation)をおこさせる配列であるITR、およびカルパイン類の調節物質をコードする配列を含む．さらに好ましくは、本発明のアデノウイルス類のゲノムにおいては、E1遺伝子、および、E2，E4，L1-L5の各遺伝子うち最低１個は機能を有しない．当該ウイルス遺伝子は、当業者に知られているいかなる技術、および、とくに、完全抑制、あるいは置換または部分的欠失、もしくは当該遺伝子（単数または複数）への１個またはそれ以上の塩基の付加によって、機能を失わせることができる。こうした修飾はインビトロ(in vitro)（単離したDNA上で）でもインサイチューでも、例えば遺伝子工学の技術や、代替として突然変異原性物質での処理などで得ることができる。本発明に関る欠損組み換えアデノウイルス類は、当業者に知られているいずれの技術によっても調製できる（レヴレロ(Levrero)ら、ジーン(Gene)101（1991） 195，EP 185 573，グレアム(Graham)、エンボジャーナル(EMBO J.)3（1984）2917）。とりわけ、１個のアデノウイルスと、なかんずく、カルパイン類の調節物質をコードするDNA配列を有するプラスミドとの間の相同的組み換えにより調製できる。相同的組み換えは、適当な培養細胞系に前述のアデノウイルス類とプラスミドとをコトランスフェクション（共感染）させた後に起こる。用いられる培養細胞系は、好ましくは、(1)前述の要素で形質転換することができ、さらに(2)アデノウイルスゲノムの欠損部分を補い得る配列を、組み換えの危険性を避けるため好ましくは組み込まれた形で包含しているべきである。培養細胞系の１例としては、とくにそのゲノム中にAd5アデノウイルスゲノムの左側部分（12％）が組み込まれて包含されているヒト胎児腎細胞系29 3（グレアム(Greham)ら、ジャーナルJ．Gen．Virol．36（1977）59）を挙げることができる。アデノウイルス類由来のベクター構築のための戦略も、FR 93 0595 4およびFR 93 08596明細書に記載されている。次に、実施例に示されるように、従来からの分子生物学的技術により、増殖したアデノウイルス類は回収され精製される。アデノ関連ウイルス(AAV)類に関しては、これらは、感染した細胞のゲノム中に安定かつ部位特異的な方法で組み込まれる比較的小さなDNAウイルスである。これらは、細胞の成長、形態あるいは分化に何らの作用を引き起こすことなく、幅広い範囲の細胞に感染することができる。さらには、これらはヒトでは病理に関与するようにはみられない．AAV類のゲノムはクローン化され、配列決定および特徴づけがなされている。このゲノムは約4700塩基から成り、両端に、ウイルスの複製の起点となる約145塩基の逆方向反復塩基配列(ITR)を包含する。ゲノムの残りの部分は、包膜化の機能を有する２つの不可欠な領域に分けられる。すなわち、ゲノムの左側部分はウイルスの複製およびウイルス遺伝子の発現に関るrep遺伝子を包含し、ゲノムの右側部分は、ウイルスキャプシドタンパク質類をコードするca p遺伝子を包含する。 AAV類由来のベクターをインビトロ(in vitro)およびインビボ(in vivo)での遺伝子移送に用いることについては、文献に記載されている（とくに、WO 91/ 18088; WO 93/09239; US 4,797,368，US 5,139,941，EP 485 528を参照）。これらの明細書には、repおよび／またはcap遺伝子が除去され目的の遺伝子で置換されたAAV由来の様々な（遺伝子）構築およびインビトロ（in vitro）（培養細胞に対して）もしくはインビボ（in vivo）（ある器官内へ直接）における前述の目的の遺伝子の移送に対するこれら構築の使用が記載されている。本発明に関る欠損組み換えAAV類は、ヒトヘルパーウイルス（例えばあるアデノウイルス）で感染させたある細胞株に、２つのAAVの逆方向反復塩基配列（ITR）により境界がもうけられるカルパイン類の調節物質をコードする配列を包含するプラスミドと、AAVの包膜化遺伝子（repおよびcap遺伝子）を有するプラスミドとをコトランスフェクション（共感染）させることにより調製することができる。その後、得られた組み換えAAV類は従来の技術により精製される。ヘルペスウイルス類およびレトロウイルス類に関しては、その組み換えベクターの構築は広く文献に記載されている。とくに、ブレイクフィールド(Breakfiel d)ら、ニューバイオロジスト(New Biologist)3（1991）203; EP 453242，EP 1 78220，バーンスタイン(Bernstein)ら、ジェネティックエンジニアリング(Gen et．Eng.)7（1985）235; マコーミック(McCormick)、バイオテクノロジー(BioTechnology)3（1985）689，などを参照。本発明を実施するにあたっては、欠損組み換えレトロウイルスもしくは同アデノウイルスを使用することがとりわけ最も有利である、これらのベクターは、実際、腫瘍細胞内への遺伝子移送にとりわけ有利な性質を有している。都合のよいことには、本発明のベクターにおいては、カルパイン類の調節物質をコードする配列は、腫瘍細胞内でのその発現をもたらすシグナルの調節下におかれている。好ましくは、これらは、異種性の発現シグナルであり、いわば、自然にその調製物質の発現を司るものとは異なるシグナルである。それらは、とりわけ他のタンパク質あるいは合成配列の発現を司ることができる。とりわけ、真核生物またはウイルスの遺伝子のプロモーター配列であることができる。例えば、感染させようと思う細胞のゲノム由来のプロモーター配列であることができる。同様に、用いたウイルスを含むあるウイルスのゲノム由来のプロモーター配列であることができる。この点に関しては、E1A，MLP，CMV，RSV-LTRなどのプロモーターなどを例として挙げることができる。加えて、これらの発現配列は、活性化または調節を行う配列、あるいは組織特異的発現をもたらす配列を加えることにより修飾されることもできる。実際、腫瘍細胞内で特異的にまたは優先的に活性をもつ発現シグナルを用いることはとくに有利であり、そのため、そのDNA配列は、ウイルスが効果的に腫瘍細胞に感染したときにのみ発現されるかまたはその作用を発揮する。特定の実施様態においては、本発明はウイルスのプロモーター、好ましくはRS V-LTRおよびCMVプロモーターから選択されたプロモーターの調節下において、カルパイン類の調節物質をコードするcDNA配列を含む欠損組み換えウイルスに関する。さらに好ましい実施様態においては、本発明は、腫瘍細胞内で優位の発現をもたらすプロモーターの調節下において、カルパイン類の調節物質をコードするDN A配列を含む欠損組み換えウイルスに関する。本発明の目的においては、その発現は、他のタイプの細胞内で残りの部分の発現がみられたとしても、腫瘍細胞における発現レベルがより高い場合に、支配的であると考えられる。本発明はまた、上述したように、１個またはそれ以上の欠損組み換えウイルスを含むすべての薬剤組成にも関する。これらの薬剤組成は局所、経口、非経口、経鼻、静脈内、筋肉内、皮下、眼球内もしくは経皮などの経路での投与のために処方されることができる。好ましくは、本発明の薬剤組成には、製薬学的に注入可能な処方、とくに患者の腫瘍への直接注入を許容し得るベヒクルを含有する。これは、とりわけ、等張の滅菌水、あるいは場合によっては滅菌水もしくは生理食塩水を加えて注入可能な溶液を調製できる組成物を乾燥、とくに凍結乾燥したものであることができる。患者の腫瘍への直接の注入は、腫瘍に冒されている組織のレベルでの治療効果の集結を可能にするため、有利である。この注入に用いられる欠損組み換えウイルスの用量は、様々なパラメーター、およびとくにウイルスベクター、用いられる投与様式、関連する病理もしくは代替として望まれる治療期間に応じて適合させることができる。本発明に関る組み換えアデノウイルスは、通常、10⁴から10¹⁴pfu/ml、好ましくは10⁶から10¹⁰pfu/ mlの間の量を投与する形で処方され投与される。pfu（「プラークフォーミングユニット」（“plaque fo rming unit”）；プラーク形成単位）という用語は、ウイルス溶液の感染力に相当する用語であり、適切な細胞培養系を感染させ、通常は48時間後に感染された細胞のプラーク数を測定することにより求められる。ウイルス溶液のpfu力価を求める技術は文献に十分に報告されている。レトロウイルス類に関しては、本発明に関る組成には直接、移植のための産生細胞を含むことができる。本発明は、とりわけ、p53の変異形がみとめられる腫瘍の治療に適合されている。さらに具体的には、本発明はp53の野性型および変異型の対立遺伝子の存在する腫瘍の治療においてとりわけ有利である。これらの腫瘍は、とくに、大腸・直腸腫瘍、乳腫瘍、肺腫瘍、胃腫瘍、食道腫瘍、Ｂリンパ細胞腫瘍、卵巣腫瘍、膀胱の腫瘍など、である。本発明は以下の実施例によりさらに詳細に記述されるが、これらに限定されるものではない。（図面の説明）第１図：カルパインによるp53タンパク質の調節に関する検討。この反応は翻訳混合液を１μl用い、最終液量を30μlとして行った。第１列：T0 、第２列：１mMのカルシウムと20μg/mlのカルパインが存在する場合の30分後、第４列：１mMのカルシウムと20μg/mlのカルパインと0.5μg/mlのカルパスタチンが存在する場合の30分後、第５列：１mMのカルシウムと20μg/mlのカルパインと10mMのEGTAが存在する場合の30分後、第６列：PBS（リン酸-ホウ酸緩衝液）、第７列：PBS＋カルシウム、第８列：PBS＋カルパスタチン。一般的な分子生物学的技術プラスミドDNAの分取的抽出、プラスミドDNAの塩化セシウム密度勾配遠心、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるDNA断片の精製、フェノールもしくはフェノール-クロロホルムによるタンパク質の抽出、エタノールもしくはイソプロピルアルコールによる生理食塩水溶媒中のDNAの沈殿化、Escherichia coli（大腸菌）の形質転換などの、従来から分子生物学で用いられてきた手法は、当業者にはよく知られており、広く文献に記載されている［マニアティス(ManiatisT.)ら、「モレキュラークローニング、アラボラトリィマニュアル(“Molecular Cloning，a Laboratory Manual”)，コールドスプリングハーバーラボラトリィ(Cold Spring Harbor Laboratory)，コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)，N.Y.,1982；オースベル(Au subel F.M.)ら編、「カレントプロトコールズインモレキュラーバイオロジー(“Current Protocols in Molecular Biology”)，ジョンウィレイアンドサンズ(John Wiley & Sons)、ニューヨーク(New York)、1987］。 pBR322およびpUCタイプのプラスミドおよび一連のM13ファージは市販のものを用いた（ベセスダリサーチラボラトリィズ(Bethesda Research Laboratories) ）。連結反応には、DNA断片をアガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動によりその大きさに従って分離し、フェノールもしくはフェノール-クロロホルム混液を用いて抽出し、エタノールで沈殿させた後、ファージT4DNAリガーゼ（バイオラボ社(Biolabs)製）の存在下、供給元の推奨する方法に従いインキュベートする。突出した5'末端の平滑化は、大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウ(Klenow)断片（バイオラボ社(Biolabs)製）を用い、供給元の説明書に従って行うことができる。突出した3'末端の削除は、製造元の推奨する方法に従ってファージT4DNAポリメラーゼ（バイオラボ社(Biolabs)製）の存在下に行う。突出した5'末端の削除は、S1ヌクレアーゼを調節下に作用させて行う。合成オリゴヌクレオチドによるインビトロ(in vitro)での部位特異的変異誘発は、テイラー(Taylor)らの開発した方法［ヌクレイックアシッズリサーチ(N ucleic Acids Res.)13（1985）8749-8764］に従い、アマーシャム(Amersham)社製のキットを用いて行うことができる。いわゆるPCRの技術［ポリメラーゼカタライズドチェインリアクション( Polymerase-catalyzed Chain Reaction)、サイキ(Saiki)ら、サイエンス(Scienc e)230（1985）1350-1354；マリス(Mullis K.B.)およびファルーナ(Faloona F.A. )、メソッヅインエンチモロジー(Meth．Enzym.）155（1987）335-350］によるDNA断片の酵素的増幅は、DNAサーマルサイクラー（パーキンエルマーシータス(Perkin Elmer Cetus)社製）を用い、製造元の説明書に従って行うことができる。ヌクレオチド配列の確認は、アマーシャム(Amersham)社製のキットを用い、サンガー(Sanger)らの開発した方法［プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンスＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)、74（1977 ）5463-5467］により行うことができる。実施例実施例１本実施例は、ウサギの網状赤血球ライセート(lysate)にm-カルパインを加えることにより、ある種の変異型のみならず野性型p53タンパク質の分解が誘発されることを示す。本実施例はまた、カルパイン類の阻害剤がp53の分解を阻害することができ、その結果このタンパク質の活性を調節することができることを示す。 1.1.分解の提示。多様な変異型p53タンパク質（ヒトタンパク質C273、H273，H 175，I247）のみならず、マウスおよびヒトの野性型p53タンパク質を、ウサギ網状赤血球ライセート中で翻訳させた。このようにして得られたタンパク質は、高濃度のカルシウム（カルパイン類に必要な共因子）の存在下であっても、あらゆる分解に抵抗性を示した。カルシウムの存在下、ウシm-カルパイン（シグマ(Sig ma)社製）を網状赤血球ライセートに添加することにより、新規に合成されたタンパク質が急速に消失し、電気泳動で分離可能なタンパク質分解断片が出現した。同一実験条件下でのジヒドロフォレートリダクターゼあるいはグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼなどのような他のタンパク質の分解に対する抵抗性は、本反応に基質特異性のあることを示す。 1.2.p53タンパク質の濃度の調節のためのカルパイン阻害剤の使用。上記の実施例1.1において、m-カルパインの添加でp53タンパク質の分解が誘発されることが示された。本実施例では、カルパインの活性を阻害する能力を調べる目的で、 m-カルパインに加え、様々の化合物が反応系に導入された。得られた結果は、カルパインの特異的阻害剤であるペプチド（生理学的阻害剤であるカルパスタチンの誘導体；マキ(Maki)ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(J ．Biol．Chem.)、254，18866-18869，1989）のみならず、カルシウムキレート剤（EGTA）の添加により、外因性カルパインにより誘発されるp53タンパク質の分解を阻害することができることを示す。実施例２前記実施例において、p53タンパク質溶液への外因性カルパインの添加は、その分解をもたらすことが示された。本実施例では、ある種の変異型p53タンパク質のみならず、野性型p53タンパク質の分解が、細胞質抽出液中の内因性カルパイン類により誘発され得ることを示す。本実施例はまた、カルパイン類の阻害剤は、外因性カルパインの存在下においてp53の分解を阻害することができ、従ってこのタンパク質の活性を調節できることを示す。 2.1.内因性カルパイン類による分解。ある種の変異型p53タンパク質（例１参照）のみならずマウスおよびヒトの野性型p53タンパク質を、ウサギ網状赤血球ライセート中で翻訳させ、その後、ダウディ(Daudi)もしくはジャーカット(Jurk at)ヒトリンパ芽球胞の細胞質抽出液の存在下でインキュベートした。細胞質抽出液は以下の方法で調製した。すなわち、当該細胞（ATCCで入手可能）を10％ウシ胎児血清を加えたDMEM培地で培養した。その後、細胞を集め、PBS緩衝液で洗浄し、界面活性剤を含まない低張の分解用緩衝液（HEPES 20mM、pH 7.5；KOAc 1 0mM；MgOAc 1.5mM；細胞５×108個あたり２ml）中で５分間インキュベートした。ダウンス(Dounce)のホモジナイザーを用いて分解を完全なものとした後、顕微鏡下で確認した。その後、2000ｇで５分間遠心して核を除去し、上清を10000ｇで１時間遠心した（ベックマン(Beckman)社製 SW60）。その後、５から12mg/ml の量で細胞質抽出液を等分した。網状赤血球ライセートを、カルシウム非存在下で細胞質抽出液存在下にインキュベートした場合には分解はみとめられなかった。一方、カルシウム存在下では、実施例１で得られたものと類似の、特徴的なタンパク質分解生成物プロフィルの出現をともなう、非常に急速なp53タンパク質の分解がみとめられた。本実験は、実際、p53タンパク質が内因性のカルパイン類で分解されることを示す。 2.2.p53タンパク質の濃度調節のためのカルパイン阻害剤の使用。あらゆる範囲のタンパク質分解酵素阻害剤（ロイペプチン、アプロチニン、大豆トリプシンインヒビター、およびPMSF）およびとりわけカルパスタチンというペプチドの使用のみならず、EGTAによるカルシウムのキレートは、これらのタンパク質の分解が細胞質抽出液中のカルパイン類に依存していること、および、カルパイン類の活性を調節できる様々な化合物が、p53タンパク質の濃度の制御に用いられることを示す。実施例３本実施例は、マウスおよびヒトの野性型p53タンパク質が細胞質抽出液中のカルパイン類の直接の基質であることを提示する。実施例１および実施例２は、カルパイン類が複雑な反応混合物溶液中でp53タンパク質の分解を誘発できることを示す。しかるに、これらの実験は、カルパイン類が実験に用いられた条件下において、実際にp53に作用する第二のタンパク質分解酵素を活性化することを排除するものではない。本実施例では以下の実験を行った。すなわち(1)ウサギ網状赤血球ライセート中で新規に合成されたマウスおよびヒトの野性型p53タンパク質を、実施例２と同様に、カルパイン類を活性化する目的で、カルシウムのみならずダウディ(Daudi)細胞の細胞質抽出液の存在下で30分間インキュベートした。(2)その後、p53タンパク質を反応混合液に添加し、カルパインに許容される条件（同じ反応条件）下もしくは他の条件（カルシウムをキレートするEGTAまたはカルパスタチンペプチドを添加）下で30分間、反応を継続した。カルシウム存在下では、新たに添加したp53タンパク質は完全に分解された。このことは、実験を通してタンパク質分解活性が機能していたことを示す。一方で、EGTAの存在、もしくは、さらに重大にはカルパスタチンペプチドの存在によりカルパイン類が阻害された場合には、新たに添加されたp53タンパク質はそれ以上分解されなかった。従って、この後者の所見は、実験の最初の部分において、カルパイン類がp53の分解を司る( responsible)第二のタンパク質分解酵素を誘導した可能性を排除する（第１図）。実施例４本実施例はカルパスタチンをコードする核酸配列を含む組み換えアデノウイルスの構築について記載する。このアデノウイルスは、欠損アデノウイルスAd-dl1 324と、RSVプロモーターの調節下に配列同定番号１(SEQ ID No.1)の配列を有するプラスミドとの間の相同遺伝子組み換えにより構築される。 4.1.配列同定番号１(SEQ ID No.1)のプラスミドの構築．配列同定番号１(SEQ ID No.1)のプラスミドは、相同遺伝子組み換えをもたらすアデノウイルスの領域のみならず、RSV-LTRプロモーターの調節下にあるカルパスタチンをコードする配列を含む．本プラスミドは、プラスミドpAd.RSVβGalに配列同定番号１(SEQ I D No.1)の配列を挿入することで構築される。プラスミドpAd.RSVβGalは、5'末端から3'末端の順に、以下のものを包含する。・ITR配列、複製開始点、脱被殻(encapsidation)シグナルおよびエンハンサーE1 Aを含む、Ad5アデノウイルスの左側末端に対応するPvuII断片・RSV（ラウスサルコーマウイルス(Rous sarcoma virus)）プロモーターの調節下にある、βガラクトシダーゼをコードする遺伝子・プラスミドpAd.RSVβGalとアデノウイルスdl1324との間で相同遺伝子組み換えをおこさせる、Ad5アデノウイルスゲノムの２番目の断片、プラスミドpAd.RSVβ Galについては、ストラトフォード・ペリカウデット(Stratford-Perricaudet)らにより記載されている（ジャーナルオブクリニカルインヴェスティゲイション(J．Clin．Invest．90（1992）626)。 4.2.組み換えアデノウイルスの構築。 4.1.に記載されたベクターを直鎖状とし、アデノウイルスE1領域（E1AおよびE11B）によりコードされた機能をトランスに提供するヘルパー細胞（293株）に、欠損アデノウイルスベクターとともにコトランスフェクション（共感染）させる。さらに特定しては、組み換えアデノウイルスは、以下の手順に従い、変異アデノウイルスAd-dl1324（ティンマパヤ(Thimmappaya)ら、セル(Cell)31（1982）54 3）と、実施例4.1.に記載したベクターとの間のインビボ(in vivo)での相同遺伝子組み換えにより得られる。すなわち、配列同定番号１(SEQ ID No.1)のプラスミドおよび酵素ClaIで直鎖状としたアデノウイルスAd-dl1324を、相同遺伝子組み換えを起こさせるように、リン酸カルシウムの存在下細胞株293にコトランスフェクションする。こうにして創製された組み換えアデノウイルスを、その後、プラーク精製により選択する。分離後、組み換えアデノウイルスのDNAは細胞株293内で増殖され、約1010pfu/mlの力価をもつ未精製の組み換え欠損アデノウイルスを包含する培養上清をもたらす。ウイルス粒子は既知の技術に従い、塩化セシウム密度勾配遠心により精製される（とくに、グレアム(Graham)ら、ヴァイロロジー(Virology) 52（1973）456を参照）。得られたアデノウイルスは20%グリセロール中、−80度Ｃで保存することができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年６月２４日【補正内容】請求の範囲１．細胞内のp53タンパク質濃度を調節する薬剤組成の調製のためのカルパインの活性の調節を可能にする化合物の使用。２．当該化合物がカルパインの活性の阻害剤であるタンパク質もしくはポリペプチドまたはそのようなポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸配列であることを特徴とする請求の範囲１に記載された使用。３．当該化合物が野生型p53タンパク質に対するカルパインの活性の特異的阻害剤であるタンパク質またはペプチド、あるいはそのようなポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列であることを特徴とする請求の範囲２に記載された使用。４．当該核酸がベクターの一部であることを特徴とする請求の範囲２もしくは３に記載された使用。５．当該核酸が、アデノウイルス、レトロウイルスおよびアデノ関連ウイルスから選ばれるウイルスベクターの一部であることを特徴とする請求の範囲４に記載された使用。６．当該核酸が脂質リポソームベクターの一部であることを特徴とする請求の範囲４に記載された使用。７．当該化合物が、カルパスタチン全体もしくはその一部をコードする核酸であることを特徴とする上述の請求の範囲のいずれかに記載された使用。８．当該核酸が配列番号(SEQ ID No.)１の配列全体もしくはその一部またはその誘導体を含むことを特徴とする請求の範囲７に記載された使用。９．当該核酸が配列番号(SEQ ID No.)１および２の配列から選ばれることを特徴とする請求の範囲８に記載された使用。１０．当該核酸が、野生型p53タンパク質の分解の特異的阻害剤をコードする、配列番号(SEQ ID No.)１または２の配列の誘導体から選ばれることを特徴とする請求の範囲８に記載された使用。１１．当該化合物が、変異型p53タンパク質を特異的に分解することができるカルパインの誘導体であることを特徴とする請求の範囲１から６までの一つに記載された使用。１２．カルパインの活性の阻害剤であるタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列を含み、かつ、アデノウイルス、レトロウイルスおよびアデノ関連ウイルスから選ばれることを特徴とするベクター。１３．カルパスタチン全体もしくはその一部をコードする配列を含むことを特徴とする請求の範囲１２に記載されたベクター。１４．変異型p53タンパク質を特異的に分解することのできるカルパインの誘導体をコードする配列を含んでなることを特徴とする請求の範囲１２に記載されたベクター。１５．カルパスタチンの全体または一部、あるいは変異型p53タンパク質を特異的に分解することのできるカルパインの誘導体をコードする核酸配列を含む薬剤組成。１６．腫瘍内へ投与するために処方された、請求の範囲１５に記載された組成。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ピエシヤクジク，マルクフランス・エフ−34980サン−ジユリ−デユ−フエス・リユデエラブル123

Claims

【特許請求の範囲】１．腫瘍の治療に用いる薬剤組成の調製のためのカルパインの活性の調節を可能にする化合物の使用。２．当該化合物がカルパインの活性の阻害剤であるタンパク質もしくはポリペプチドまたはそのようなポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸配列であることを特徴とする請求の範囲１に記載された使用。３．当該化合物が野生型p53タンパク質に対するカルパインの活性の特異的阻害剤であるタンパク質もしくはペプチド、またはそのようなポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸配列であることを特徴とする請求の範囲２に記載された使用。４．当該核酸がベクターの一部であることを特徴とする請求の範囲２もしくは３に記載された使用。５．当該核酸が、アデノウイルス、レトロウイルスおよびアデノ関連ウイルスから選ばれたウイルスベクターの一部であることを特徴とする請求の範囲４に記載された使用。６．当該核酸が脂質リポソームベクターの一部であることを特徴とする請求の範囲４に記載された使用。７．当該化合物が、カルパスタチン全体もしくはその一部をコードする核酸であることを特徴とする上述の請求の範囲のいずれかに記載された使用。８．当該核酸が配列番号(SEQ ID No.)１の配列全体もしくはその一部またはその誘導体を含むことを特徴とする請求の範囲７に記載された使用。９．当該核酸が配列番号(SEQ ID No.)１および２の配列から選ばれることを特徴とする請求の範囲８に記載された使用。１０．当該核酸が、野生型p53タンパク質の分解の特異的阻害剤をコードする、配列番号(SEQ ID No.)１または２の配列の誘導体から選ばれることを特徴とする請求の範囲８に記載された使用。１１．当該化合物が、変異型p53タンパク質を特異的に分解することができるカルパインの誘導体であることを特徴とする請求の範囲１から６までの一つに記載された使用。１２．カルパインの活性の阻害剤であるタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列を含むウイルスベクター。１３．アデノウイルス、レトロウイルスおよびアデノ関連ウイルスから選ばれることを特徴とする請求の範囲１２に記載されたベクター。１４．カルパスタチン全体もしくはその一部をコードする配列を含むことを特徴とする請求の範囲１２または１３のいずれかに記載されたベクター。１５．変異型p53タンパク質を特異的に分解することのできるカルパインの誘導体をコードする配列を含むことを特徴とする請求の範囲１２に記載されたベクター。１６．カルパスタチンの全体または一部、あるいは変異型p53タンパク質を特異的に分解することのできるカルパインの誘導体をコードする核酸配列を含んでなる薬剤組成。１７．腫瘍内へ投与するために処方された、請求の範囲１６に記載された組成。