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JPH10295385A - レチノインレセプターの構成および方法 - Google Patents

レチノインレセプターの構成および方法

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Publication number
JPH10295385A
JPH10295385A JP9299299A JP29929997A JPH10295385A JP H10295385 A JPH10295385 A JP H10295385A JP 9299299 A JP9299299 A JP 9299299A JP 29929997 A JP29929997 A JP 29929997A JP H10295385 A JPH10295385 A JP H10295385A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
receptor
dna
retinoic acid
ligand
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP9299299A
Other languages
English (en)
Inventor
Ronald M Evans
エヴァンス，ロナルド・マーク
Vincent Giguere
ジギュール，ヴィンセント
Estelita Sebastian Ong
オング，エステリタ・セバスチャン
Prudimar Serrano Segui
セギュイ，プルディマー・セラーノ
Kazuhiko Umesono
ウメソノ，カズヒコ
Catherine C Thompson
トンプソン，キャサリン・キャロライン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Salk Institute for Biological Studies
Original Assignee
Salk Institute for Biological Studies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26826487&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH10295385(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Salk Institute for Biological Studies filed Critical Salk Institute for Biological Studies
Publication of JPH10295385A publication Critical patent/JPH10295385A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 受容体タンパク質に対する機能的リガンドを
同定する方法を提供すること。 【解決手段】 新規レセプターの推定上のＤＮＡ結合ド
メイン領域を、既知のリガンド応答性受容体タンパク質
からのＤＮＡ結合ドメイン領域で置き換えることにより
キメラ遺伝子を構築し；受容体欠損宿主細胞を、キメラ
遺伝子およびホルモン応答性要素と機能的に連結された
レポーター遺伝子によりトランスフェクトし；トランス
フェクトされた宿主細胞を検定し；レポーター遺伝子の
誘導をモニターし；レポーター遺伝子のタンパク質産物
の産生を誘導しうるリガンドを機能的リガンドとして選
択する；の各工程を含む、受容体タンパク質に対する機
能的リガンドを同定する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は国立衛生研究所の研
究助成金のもとで政府の援助によってなされたものであ
る（助成金番号ＧＭ２６４４４）。本発明は、一般的に
は、リガンド反応性調節タンパク質およびそれらをコー
ドする遺伝子に関するものである。より詳細には、本発
明はレチノイド関連調節タンパク質およびそれらをコー
ドする遺伝子、組み換えＤＮＡなどの遺伝子工学技術に
よって上記およびその他の調節タンパク質および遺伝子
を修飾したもの、および修飾されていないものと修飾さ
れたものの双方を含むレチノイド関連調節タンパク質お
よび遺伝子の使用に関するものである。さらに、本発明
は、リガンド反応性タンパク質に対する機能的リガンド
を同定するための新しい方法に関するものである。本方
法は、新しく発見された受容体タンパク質に対する機能
的リガンドを同定する場合に特に有用である。ビタミン
Ａ関連モルフォゲン、レチノイン酸が、新しく発見され
たレチノイン酸受容体タンパク質に対する機能的リガン
ドであることを示すことによって本方法は一部例示され
る。
【０００２】
【従来の技術】真核生物における中心的な問題は、ホル
モンや成長因子などの外来性誘導因子に反応して特異的
な遺伝子制御を媒介する分子および機構の説明を行うこ
とであり続けている。各機構の特異性に関してはまた学
ばねばならないことが多く残されてはいるものの、ホル
モンなどの外来性因子は細胞内受容体およびホルモン反
応性エレメントすなわちＨＲＥとして知られる個々のＤ
ＮＡを含む細胞内要素と協調して働くことによって遺伝
子の転写を調節することが知られている。さらに具体的
には、グルココルチコイドおよびチロイドホルモンのよ
うなホルモンは促進された拡散によって細胞に入ること
が知られている。ホルモンが次に特異的な受容体タンパ
ク質に結合し、それによってホルモン／受容体複合体を
作ることも知られている。ホルモンの受容体への結合に
より、受容体タンパク質のアロステリック変化が開始さ
れると考えられている。この変化の結果として、ホルモ
ン／受容体複合体がクロマチンのＤＮＡ上の特異的部位
に高親和性で結合できると考えられている。ホルモン反
応性エレメントすなわちＨＲＥを含むこのような部位
は、本分野では様々な名前で呼ばれているが、近くの標
的遺伝子のプロモーターの発現（ＲＮＡの転写）を調節
している。ホルモンなどの外来性誘導因子による遺伝子
制御の特異性をさらに理解するための主要な障害は、タ
ンパク質の適切な解析を行うために十分な量および純度
の受容体タンパク質が入手できないことであった。この
欠乏のために、多様な体液や組織中の外来性誘導因子
（例えばホルモン）の存在を決定するための診断用アッ
セイにおける受容体の使用、およびキメラ受容体タンパ
ク質アナログを操作するための“プロトタイプ”として
の受容体の使用が妨げられて来た。受容体タンパク質が
入手困難であることを克服する努力がなされ、本出願の
譲受人であるソーク生物学研究所（ｔｈｅ Ｓａｌｋ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｓｔｕｄｉｅｓ）が受託された、共に審査中の出願Ｕ．
Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０８，４７１号により、グルココルチコ
イド−、チロイド−、ミネラロコルチコイド−、および
新しいステロイド関連受容体を含む多様な受容体タンパ
ク質のクローン化された遺伝子が開示されている。Ｕ．
Ｓ．Ｓ．Ｎ１０８，４７１号はさらに、これらの分子の
詳細な生化学的解析を行い、別々のＤＮＡ結合領域およ
びリガンド結合領域を受容体タンパク質が含むことを示
した。（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ１０８，４７１号の一部は出版
されている；グルココルチコイド受容体のクローニング
とこの分子の各領域に分ける解析に関する部分について
は、ホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）他、（１９
８５）、およびギゲレ（Ｇｉｇｕｅｒｅ）他、（１９８
６）；受容体に関するその他の研究に関しては、ホレン
バーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）他、（１９８７）、グ
リーン（Ｇｒｅｅｎ）他、（１９８６）、グリーンとシ
ャンボン（Ｃｈａｍｂｏｎ）、（１９８７）、クマー
（Ｋｕｍａｒ）他、（１９８７）、ミースフェルド（Ｍ
ｉｅｓｆｅｌｄ）他、（１９８７）、およびエバンス
（１９８８）を参照のこと）。受容体の生化学的解析に
関してはさらに、ヒトグルココルチコイド受容体遺伝子
の配列解析により、トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）の
ガン遺伝子であるｖ−ｅｒｂ−Ａの産物と相同性がある
ことが示された（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅ
ｒ）他、（１９８５）参照）。このグループおよび別の
グループは続いて、ｖ−ｅｒｂ−Ａの細胞内相同体がβ
チロイドホルモン受容体であることを示した（ワインバ
ーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）他、（１９８６）、お
よびサップ（Ｓａｐ）他、（１９８６）参照）。ステロ
イドホルモン受容体とチロイドホルモン受容体のＤＮＡ
結合領域が非常によく保存されていることから、関連し
ているリガンド誘導性転写制御因子に関してこの領域が
特徴的なのだろうかという疑問が出された。また、これ
らの領域をコードするＤＮＡ配列を、関連しているが新
しいリガンド反応性受容体に関してゲノムを検索するハ
イブリダイゼーション用プローブとして使用可能だろう
かという疑問も出された。この手法により、ソーク研究
所の我々のグループは、幾つかの新しい遺伝子産物を同
定した。Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ１０８，４７１号に示されてい
るように、一つはヒトアルドステロン受容体（ｈＭＲ，
ＡＴＣＣ第６７２０１号）（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０８，
４７１号のこの部分の出版物としては、アリザ（Ａｒｒ
ｉｚａ）他、（１９８７）参照）；二番目は、ラット中
枢神経系で高レベルで発現されている新しいチロイドホ
ルモン受容体である（ｒＴＲ α，ＡＴＣＣ第６７２８
１号）（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０８，４７１号のこの部分
の出版物としては、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）
他、（１９８７）参照）。本開示は、ステロイドおよび
チロイドホルモン受容体のＤＮＡ結合領域およびリガン
ド結合領域と相同性のある新しいレチノイド受容体タン
パク質をコードする、クローニングされた全長のｃＤＮ
Ａの分離と解析を示している。さらに、グルココルチコ
イド、ミネラロコルチコイド、チロイド、エストロゲン
関連、およびレチノイン酸受容体の間の機能領域を交換
（“ｓｗａｐｐｉｎｇ”）することによって作成された
キメラ受容体の構築と解析についても述べている。これ
らのキメラ受容体は、キメラ中に取り込まれた“親の”
ＤＮＡ結合領域およびリガンド結合領域の“起源”に基
づいたハイブリッド機能特性を有する。例えば、キメラ
受容体のＤＮＡ結合領域がレチノイン酸受容体のＤＮＡ
結合領域であれば（すなわち野生型レチノイン酸受容体
から得られたものであるか、レチノイン酸ＤＮＡ結合領
域の機能的要素を含む変異体である場合）、キメラはレ
チノイン酸受容体のＤＮＡ結合特性を有することにな
る。リガンド結合領域に関しても同様である。キメラ受
容体中のリガンド結合領域がチロイドホルモンに結合す
る場合には、、キメラはチロイドホルモン受容体の持つ
リガンド結合特性を有することになる。本開示はまた、
リガンド反応性受容体タンパク質に対する機能的リガン
ドを同定するための新しい方法を示すものである。本方
法は、（１）レチノイド、レチノイン酸およびその代謝
前駆体、レチノールが新しく発見された受容体タンパク
質に対する機能的リガンドであること、（２）ＤＮＡ結
合領域およびリガンド結合領域がキメラ受容体の機能特
性を決定すること、を示すことにより例示される。
【０００３】
【課題を解決するための手段】定義 明細書および請求の範囲において、ここで用いるために
以下のように特に定義される技術用語が参照される。こ
こで用いる場合、一般的な語“レチノイド”はレチノイ
ン酸、ビタミンＡ（レチノール）および、多様な系で発
生と分化に重要な影響を及ぼすことのできる一連の天然
および合成誘導体を含む化合物群を意味する。ここで用
いる場合、生物種は以下のように同定される：ｈ，ヒ
ト；ｒ，ラット；ｍ，マウス；ｃ，ニワトリ；および
ｄ，ドロソフィラ（ショウジョウバエ）。ここで用いる
場合、“ステロイドホルモン受容体スーパーファミリ
ー”とは、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイ
ド、プロゲステロン、エステロゲン、エステロゲン関
連、ビタミンＤ３、チロイド、Ｖ−ｅｒｂ−Ａ、レチノ
イン酸、およびＥ７５（ショウジョウバエ）受容体から
なる関連した受容体群を意味するものである。エバンス
（１９８８）、およびそこで引用されている参考文献参
照。ここで用いる場合、ＲＲおよびＲＡＲはともにレチ
ノイン酸受容体を意味する。かしら文字、ｈＲＲおよび
ｈＲＡＲは、ヒトレチノイン酸受容体を意味する。ｐｈ
ＲＡＲαと呼ばれるＤＮＡはヒトレチノイン酸受容体α
をコードする。ｈＲＡＲαはＡＴＣＣ第４０３９２号と
して寄託されているｐｈＲＡＲ１によってコードされて
いる。ｈＲＡＲβと呼ばれるＤＮＡはヒトレチノイン酸
受容体βをコードする。ブランド（Ｂｒａｎｄ）他（１
９８８）参照。ここで用いる場合、ＧＲはグルココルチ
コイド受容体を意味する。ｈＧＲと呼ばれるＤＮＡはヒ
トグルココルチコイド受容体ＧＲをコードする。ｈＧＲ
はＡＴＣＣ第６７２００号として寄託されているｐＲＳ
ｈＧＲによってコードされている。ここで用いる場合、
ＭＲはミネラロコルチコイド受容体を意味する。ｈＨＲ
と呼ばれるＤＮＡはヒトミネラロコルチコイト受容体Ｍ
Ｒをコードする。ｈＭＲはＡＴＣＣ第６７２０１号とし
て寄託されているｐＲＳｈＭＲによってコードされてい
る。ここで用いる場合、ＴＲはチロイド受容体を意味す
る。ＴＲαおよびＴＲβはチロイド受容体のα型および
β型を意味する。ｃ−ｅｒｂ−Ａ，ｈｅｒｂ−Ａ８．
７、ｐｅＡ１０１，ｒｂｅＡ１２、およびｈＦＡ８と呼
ばれるＤＮＡはすべてチロイド受容体をコードするもの
である。プラスミドｐｈｅｒｂ−Ａ８．７はｈＴＲαを
コードする；これは特許目的のために寄託され、ＡＴＣ
Ｃ第４０３７４号として登録されている。プラスミドｐ
ｅＡ１０１はｈＴＲβをコードしている；これは特許目
的のために寄託され、ＡＴＣＣ第６７２４４号として登
録されている。プラスミドｒｂｅＡ１２はｒＴＲαをコ
ードする；これは特許目的のために寄託され、ＡＴＣＣ
第６７２８１号として登録されている。プラスミドｐｈ
ＦＡ８はクローンの”リガンド結合”領域に欠失をも
つ、ｈＴＲαの部分的クローン（すなわち、受容体タン
パク質のカルボキシ末端をコードするＤＮＡ）をコード
している。プラスミドｐｈＦＡ８はＡＴＣＣ第４０３７
２号として登録されている。ここで用いる場合、ＥＲＲ
はエストロゲン関連受容体を意味する。ｈＥＲＲ１およ
びｈＥＲＲ２の頭文字は、ヒトエストロゲン関連受容体
１および２であることを意味する。これらの受容体はチ
ロイド受容体よりもステロイド受容体により近いが、既
知のステロイドホルモンのどの主要なクラスにも結合し
ない（ギゲレ（Ｇｉｇｕｅｒｅ）他、１９８８）。ｈＥ
ＲＲ１はプラスミドｐＥ４およびｐＨＫＡにコードされ
ており、これはそれぞれＡＴＣＣ第６７３０９号および
第６７３１０号として寄託されている。（ｐＥ４もｐＨ
ＫＡも完全なクローンではない；ｈＥＲＲ１は両方のク
ローン由来の断片を結合して構築された）。ｈＥＲＲ２
はプラスミドｐｈＨ３にコードされており、ＡＴＣＣ第
４０３７３号として寄託されている。ここで用いる場
合、ＶＤＲはビタミンＤ３受容体を意味する。ここで用
いる場合、ＭＴＶは乳癌ウイルスを意味する；ＭＭＴＶ
はマウス乳癌ウイルスを意味する。ここで用いる場合、
ＲＳＶはラウス肉腫ウイルスを意味する；ＳＶはサルウ
イルスを意味する。ここで用いる場合、ＣＡＴはクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを意味す
る。ここで用いる場合、ルシフェラーゼはホタルのルシ
フェラーゼを意味する。Ｉ．Ｒ．デ・ウェット（ｄｅ
Ｗｅｔ）、Ｋ．Ｖ．ウッド（Ｗｏｏｄ）、Ｍ．デルカ
（ＤｅＬｕｃａ）、Ｄ．Ｒ．ヘリンスキ（Ｈｅｌｉｎｓ
ｋｉ）、およびＳ．スブラマニ（Ｓｕｂｒａｍａｎ
ｉ）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３
７（１９８７）参照。ここで用いる場合、ＣＯＳはＴ抗
原（Ｔａｇ）を発現しているサル腎臓細胞を意味する。
グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）、Ｃｅｌｌ，２３：１７
５（１９８１）参照。ＣＯＳ細胞は受容体欠損細胞であ
り、本発明の機能的リガンド同定アッセイに有用なもの
である。ここで用いる場合、ＣＶ−１は“ＣＶ−１”と
呼ばれる細胞系由来のマウス腎臓細胞を意味する。ＣＶ
−１はＣＯＳの親系である。ＳＶ４０Ｔ抗原（Ｔａｇ）
を発現するように形質転換されているＣＯＳ細胞とは異
なり、ＣＶ−１細胞はＴ抗原を発現しない。ＣＶ−１細
胞は、本発明の機能的リガンド同定アッセイにも有用な
受容体欠損細胞である。ここで用いる場合、“ホルモン
反応性要素”または“ＨＲＥ”、“転写調節ユニッ
ト”、“ホルモン反応性プロモーター／エンハンサー要
素”、“エンハンサー様ＤＮＡ配列”、および“転写刺
激を媒介するＤＮＡ配列”などの一般的な技術用語は、
すべて同一物を意味しており、すなわち、転写のホルモ
ン（またはリガンド）による活性化に必要なｃｉｓに働
く配列（約２０塩基対）である。これらの要素をホルモ
ン非反応性遺伝子に接続することにより、その遺伝子が
ホルモン反応性となる。これらの配列はホルモン反応性
要素またはＨＲＥとして最もよく呼ばれており、位置お
よび向きに関係無く機能する。他のエンハンサーとは異
なり、ＨＲＥの活性はリガンドの存在の有無に依存す
る。（エバンス（１９８８）およびそこで引用されてい
る参考文献参照。）本明細書および請求の範囲において
は、“ホルモン反応性要素”という語を、これらの配列
を記述するために本分野で用いられるすべての語によっ
て示唆される機能的特性を意味し、具体化するために一
般的な意味で用いられる。ここで用いる場合、合成ＨＲ
Ｅとは、自動ヌクレオチド合成機を用いてｉｎｖｉｔｒ
ｏで合成されたＨＲＥを意味する。ＨＲＥはわずか約２
０ｂｐなので、この方法で容易に合成することができ
る。操作された、あるいは合成の野生型ＨＲＥがホルモ
ン非反応性プロモーターに連結されると、これらのプロ
モーターはホルモン反応性となる。エバンス（１９８
８）およびそこで引用されている文献参照。ここで用い
る場合、頭文字ＧＲＥはグルココルチコイド受容体反応
性要素を、ＴＲＥはチロイド受容体反応性要素を意味す
る。ＧＲＥはＧＲとの相互作用によるグルココルチコイ
ド反応性を与えるホルモン反応性要素である。ペイバー
（Ｐａｙｖａｒ）他、Ｃｅｌｌ，３５：３８１（１９８
３）、およびシーデライト（Ｓｃｈｉｅｄｅｒｅｉｔ）
他、Ｎａｔｕｒｅ，３０４：７４９（１９８３）参照。
ＧＲＥは、ＤＮＡ結合領域がＧＲＥと機能的に結合でき
る（すなわち、活性化できる）ものであるいかなる野生
型またはキメラ受容体とも使用可能である。例えば、Ｇ
Ｒ、ＭＲ、およびＰＲ受容体は全てＧＲＥを活性化する
ことができ、ＧＲ、ＭＲ、またはＰＲ型のＤＮＡ結合領
域を有するいかなる野生型またはキメラ受容体ともＧＲ
Ｅを使用することができる。ＴＲＥは、ＴＲとの相互作
用によるチロイドホルモン反応性を与えることを除いて
は、ＧＲＥと同様である。ＴＲＥは、ＤＮＡ結合領域が
機能的にＴＲＥと結合できる（すなわち活性化できる）
ようないかなる野生型またはキメラ受容体とも使用可能
である。ＴＲおよびＲＲ受容体はＴＲＥを活性化するこ
とができ、したがって、ＴＲまたはＲＲ型のＤＮＡ結合
領域を有するいかなる受容体ともＴＲＥを使用可能であ
る。ここで用いる場合、リガンドとはホルモンまたは成
長物質などの誘導因子を意味する。細胞内で、リガンド
は受容体タンパク質に結合し、それによってリガンド／
受容体複合体を形成し、それが適当なホルモン反応性要
素に結合することができる。単一のリガンドが複数の受
容体を持つこともある。Ｔ３ＲαおよびＴ３Ｒβはいず
れもＴ３などのチロイドホルモンと結合する。ここで用
いる場合、“リガンド反応性プロモーターおよび有効な
レポーター遺伝子に機能的に連結している有効なホルモ
ン反応性要素”という語句中の“有効な”という語は、
それぞれのＤＮＡ配列（“ホルモン反応性要素”、“リ
ガンド反応性プロモーター”、および“レポーター遺伝
子”という語で表される）が作用可能である、すなわ
ち、ホルモン反応性要素が受容体タンパク質（野生型ま
たはキメラ）のＤＮＡ結合領域と結合可能であること、
リガンド反応性プロモーターがレポーター遺伝子の転写
調節を行えること（ＨＲＥ／受容体タンパク質／リガン
ド複合体による適当な活性化による）、およびレポータ
ー遺伝子が宿主細胞で発現され得ることを意味する。
“機能的に連結する”という語句は、ＤＮＡ断片が連結
された場合に適当な活性化によってレポーター遺伝子
（例えばＣＡＴまたはルシフェラーゼ）が発現されるこ
とを意味する。この発現は、“リガンド反応性プロモー
ター”（ホルモン反応性要素の下流であり、適当なリガ
ンド／受容体タンパク質複合体にＨＲＥが結合すると
“活性化”され、その結果レポーター遺伝子の転写を
“調節”する）が“オンの状態となる”、あるいは、ホ
ルモン反応性要素にリガンド／受容体タンパク質複合体
が結合した結果として活性化されたものである。ここで
用いる場合、受容体の“ＤＮＡ結合領域”という語句
は、クロマチンＤＮＡ上のＨＲＥ部位に結合する受容体
タンパク質（グルココルチコイド受容体、チロイド受容
体、ミネラロコルチコイド受容体、エステロゲン関連受
容体、およびレチノイン酸受容体）のその部分を呼ぶも
のである。これらのＤＮＡ結合領域に対する結合は、ス
テロイドホルモンスーパーファミリーに関して同定さ
れ、解析された。第８図、およびギゲレ他（１９８
６）；ホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）他、（１
９８７）；グリーンとシャンボン（１９８７）；および
ミースフィールド（Ｍｉｅｓｆｉｅｌｄ）他（１９８
７）、エバンス（１９８８）参照。多様なステロイドホ
ルモンスーパーファミリー受容体に関するＤＮＡ結合領
域に対する結合を第８図に示す；結合は以下に示すもの
である： −ｈＧＲ（ｐＲＳｈＧＲ）： ヌクレオチト１３９３〜１５９０ アミノ酸４２１〜４８６ （ＡＴＣＣ ＃６７２００参照） −ｈＴＲｂ（ｐｅＡ１０１）：ヌクレオチド６０４〜８０７ アミノ酸１０２〜１６９ （ＡＴＣＣ ＃６７２４４参照） −ｈＴＲａ（ｐｈｅｒｂ−Ａ８．７）：ヌクレオチド１６８〜３７２ アミノ酸５０〜１１７ （ＡＴＣＣ ＃４０３７４参照） アミノ酸２９１〜３５８ （ＡＴＣＣ ＃６７２８１参照） −ＥＲＲ１（ｐＥ４ ＆ ｐＨＫＡ）：アミノ酸１７６〜２４１ （ＡＴＣＣ ＃６７３０９ ＆ ＃６７３１ ０参照） −ＥＲＲ２（ｐｈＨ３）： アミノ酸１０３〜１６８ （ＡＴＣＣ ＃４０３７３参照） −ｈＭＲ（ｐＲＳｈＭＲ）： ヌクレオチド２０２９〜２２２６ アミノ酸６０３〜６６８ （ＡＴＣＣ ＃６７２０１参照） −ｈＲＡＲａ（ｐｈＲＡＲ１）：ヌクレオチド３６４〜５６１ アミノ酸８８〜１５３ （ＡＴＣＣ ＃４０３９２参照） 受容体のステロイドホルモンスーパーファミリーのＤＮ
Ａ結合領域は６６から６８アミノ酸のアミノ断片からな
る。この断片は９個のシステイン残基を含み、そのうち
の一つが断片の最初のアミノ酸である。この最初のＣｙ
ｓ残基からＣｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ１３−１５−Ｃｙ
ｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ（ここでＸはいかなるアミノ酸残基で
もよい）と記述されるモチーフが開始される。ＤＮＡ結
合領域は常にアミノ酸Ｇｌｙ−Ｍｅｔで終わる。クロー
ニング法の簡便のために、ＤＮＡ結合領域の前および／
または後の１〜６アミノ酸をＤＮＡ結合領域とともに転
換することも可能である。ここで用いる場合、受容体の
“リガンド結合領域”という語句は成長因子またはホル
モンなどのリガンドに結合する、受容体タンパク質の部
分に関するものである。ステロイド受容体スーパーファ
ミリーに対するリガンド結合領域のこれらの結合が同定
され、解析された。第８図およびエバンス（１９８８）
参照。多様な受容体のリガンド結合領域が第８図に示さ
れている；該領域の幾つかを以下に示す： −ｈＧＲ（ｐＲＳｈＧＲ）： アミノ酸５２８〜７７７
（ＡＴＣＣ ＃６７２００参照） −ｈＴＲｂ（ｐｅＡ１０１）：アミノ酸２３２〜４５６
（ＡＴＣＣ ＃６７２４４参照） −ｈＴＲａ（ｐｈｅｒｂ−Ａ８．７）：アミノ酸１８３
〜４１０（ＡＴＣＣ ＃４０３７４参照） −ｒＴＲ（ｒｂｅＡ１２）： アミノ酸４２１〜６３９
（ＡＴＣＣ ＃６７２８１参照） −ＥＲＲ１（ｐＥ４ ＆ ｐＨＫＡ）：アミノ酸２９５
〜５２１（ＡＴＣＣ ＃６７３０９参照） −ＥＲＲ２（ｐｈＨ３）： アミノ酸２１２〜４３３
（ＡＴＣＣ ＃４０３７３参照） −ｈＭＲ（ｐＲＳｈＭＲ）： アミノ酸７３４〜９８４
（ＡＴＣＣ ＃６７２０１参照） −ｈＲＡＲａ（ｐｈＲＡＲ１）：アミノ酸１９８〜４６
２（ＡＴＣＣ ＃４０３９２参照） 受容体間の機能的領域の交換を可能にするために、受容
体ｃＤＮＡクローンに共通の制限エンドヌクレアーゼ部
位を導入しなければならない。第８図に示した多様な受
容体のいずれにおいても、ＤＮＡ結合領域の直前に第一
の共通部位を導入し、直後に第二の共通部位を導入する
ことが可能である。（例えば、第８図に示した受容体の
ステロイドホルモンスーパーファミリーのいずれにおい
ても、ＤＮＡ結合領域の直前に単独のＮｏｔＩ部位を導
入し、直後に単独のＸｈｏＩ部位を導入することが出来
る。これにより受容体は３つの機能的領域または“カセ
ット”に分割される；（１）Ｎ末端カセット、（２）Ｄ
ＮＡ結合領域カセット、（３）リガンド結合領域カセッ
ト。どの受容体由来の３つの領域またはカセットは別の
受容体由来のカセットと組み合わせて多様なキメラ受容
体を作成することができる。ここで用いる場合、キメラ
受容体を同定するために用いた命名法は以下のようであ
る：可変性機能領域（Ｎ末端、ＤＮＡ結合領域、および
リガンド結合領域）は、それらの元となった“親”受容
体によって同定される。例えば、ＧＲ由来の領域は
“Ｇ”領域である；ＴＲ領域は“Ｔ”領域である（そう
でなければさらに“Ｔａ”または“Ｔｂ”領域として特
定される）；ＭＲ領域は“Ｍ”領域である；ＲＡＲ領域
は“Ｒ”領域である（もしくは、さらに“Ｒａ”または
“Ｒｂ”として特定される）；また、ＥＲＲ領域は
“Ｅ”領域である（もしくは、さらに“Ｅ１”または
“Ｅ２”領域として特定される）。この表記法によれ
ば、特定しない限り、“Ｔ”は一般的にＴ３Ｒαまたは
Ｔ３Ｒβ受容体のどちらかを意味する；“Ｅ”はｈＥＲ
Ｒ１またはｈＥＲＲ２のどちらかを意味する；また、
“Ｒ”はＲＡＲαまたはＲＡＲβ受容体のどちらかを意
味する。野生型受容体はいかなる交換領域も含まないの
で、この表記系にしたがうと、Ｇ−Ｇ−Ｇ（またはＧＧ
Ｇ）、Ｔａ−Ｔａ−Ｔａ（またはＴａＴａＴａ）、Ｔｂ
−Ｔｂ−Ｔｂ（またはＴｂＴｂＴｂ）、Ｍ−Ｍ−Ｍ（ま
たはＭＭＭ）、Ｒａ−Ｒａ−Ｒａ（またはＲａＲ
ａＲａ）、Ｒｂ−Ｒｂ−Ｒｂ（またはＲｂＲｂＲｂ）、
Ｅ１−Ｅ１−Ｅ１またはＥ２−Ｅ２−Ｅ２として同定さ
れ、ここで最初に示される領域はＮ末端領域、中央の領
域はＤＮＡ結合領域、および最後の領域はリガンド結合
領域である。いかなるキメラ受容体も少なくとも二つの
野生型または親受容体由来の機能領域を持つことにな
る。例えば、キメラ受容体ＧＧＲａはグルココルチコイ
ド受容体由来のＮ末端およびＤＮＡ結合領域を持ち、グ
ルココルチコイド受容体由来のＤＮＡ結合領域、および
αレチノイン酸受容体由来のリガンド結合領域を有す
る；ＧＴａＲｂはグルココルチコイド受容体由来のＮ末
端、チロイド受容体α由来のＤＮＡ結合領域、および、
レチノイン酸受容体β由来のリガンド結合領域を有す
る。ここで用いる場合、ｈＧＲＮＸ、ｈＴＲβＮＸ、お
よびｈＲＲＮＸは、受容体のＤＮＡ結合領域の境界に隣
接してＮｏｔＩとＸｈｏＩの単一の切断部位を含むよう
に操作したｈＧＲ、ｈＴＲβ、およびｈＲＲ受容体を意
味する。これらの変異受容体は、ｈＧＲ，ｈＨＲ，ｈＥ
ＲＲ１，ｈＥＲＲ２，ｈＴＲα，ｈＴＲβ，ｒＴＲα，
ｒＲＡＲα，ｒＲＡＲβ由来のアミノ末端、ＤＮＡ結合
領域、およびリガンド結合領域のすべての可能な組み合
わせから成るハイブリッド受容体の構築を例示するもの
である。ここで用いる場合、サザンブロット分析は、変
性させたＤＮＡをアガロースゲルから、相補的な核酸と
ハイブリダイズさせることができるニトロセルロースフ
ィルターに転移させる方法を意味する。ここで用いる場
合、ノザンブロット分析とは、ＲＮＡをアガロースゲル
から、相補的なＤＮＡにハイブリダイズさせることがで
きるニトロセルロースフィルターに転移させる方法を意
味する。ここで用いる場合、本発明の“変異体”ＤＮＡ
とは、“野生型”あるいは操作していない配列とは異な
るように遺伝学的に操作したＤＮＡを意味する。このよ
うな遺伝子操作には、野生型配列への新しいヌクレオチ
ドの挿入、野生型配列からのヌクレオチドの削除、野生
型配列中のヌクレオチドの置換、または受容体間の機能
的領域の“交換（ｓｗａｐｐｉｎｇ）”が含まれる。機
能的領域をある受容体から別の受容体のものに交換する
ことによって操作された受容体もキメラ受容体あるいは
ハイブリッド受容体と呼ばれる。キメラ受容体はさら
に、新しいヌクレオチド、ヌクレオチドの欠失、ヌクレ
オチドの置換などを含む。本明細書および請求の範囲に
おける“実質的な配列相同性”という語の使用は、ここ
で開示され、請求される実際の配列と比較してわずか
な、重大でない配列の変化しか起こっていないＤＮＡ、
ＲＮＡ、またはアミノ酸配列が、添付された請求の範囲
に含まれることを意図していることを示す。この語句の
中で、“わずかな、重大でない”配列変化とは、相同な
配列がここで開示し、請求する核酸およびアミノ酸構造
と実質的に同様に機能して実質的に同じ構造を産生する
ことを意味する。ここで用いる場合、“組み換え的に産
生される”という語句は、単に天然物から生成されたの
ではなく、遺伝子組み換え技術を用いて作成されたこと
を意味する。ここに現れる多様なアミノ酸配列を構成す
るアミノ酸は、以下に示す３文字または１文字略号によ
って同定される。 ここに現れる多様な核酸配列を構成するヌクレオチド
は、本分野で通常用いられている１文字略号（Ａ，Ｇ，
Ｔ，Ｃ，またはＵ）を有する。ここで用いる場合、ｂｐ
とは塩基対を、ｋｂはキロ塩基対を意味する。本明細書
および請求の範囲において、ギリシャ文字アルファ
（α）、ベータ（β）などは、しばしばａ、ｂなどと示
される。
【０００４】寄託 プラスミドｐＲＳｈＧＲ（ｈＧＲ），ｐＲＳｈＭＲ（ｈ
ＭＲ），ｐｅＡ１０１（ｈＴ３β）およびＧＭＣＡＴ
は、すべて大腸菌ＨＢ１０１株に入っており、また、ｒ
ｅｂＡ１２（ｒＴＲα），ｐＥ４およびｐｈＫＡ（とも
にｈＥＲＲ１をコードする）、ｐｈＨ３（ｈＥＲＲ
２），ｐｈｅｒｂ−Ａ８．７（ｈＴＲα），ｐｈＦＡ８
（ｈＴＲαの部分的クローン）、およびプラスミドｐｈ
ＲＡＲ１は、米国メリーランド州ロックビルのアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）
に、特許技術目的の微生物寄託の国際認識に関するブダ
ペスト条約および本条約の下に公布されている条例に基
づいて寄託されている。該条約および条例、もしくは米
国および本出願または本出願の優先権を請求する出願が
提出されるか、このような出願が認められるいかなる特
許も認められるそのほかの国や国際組織の特許法および
条例にしたがって、プラスミド試料は法的に受け取る資
格がある産業所有権局などの者が入手することができ
る。ＡＴＣＣ寄託番号および寄託年月日を以下に示す： （＊は部分的クローンを意味する） （ｐＥ４＆ｐｈＨＫＡはともに完全なｈＥＲＲ１をコー
ドする）
【０００５】発明の概要 一つの局面においては、本発明は、ここではヒトレチノ
イン酸受容体タンパク質と呼ぶレチノイド受容体タンパ
ク質に特徴的なリガンド結合能およびＤＮＡ結合能（ま
たは転写活性化能）を有するタンパク質の一次配列をコ
ードするトリプレットの配列、断片のプラス鎖またはセ
ンス鎖が含んでいるような二本鎖ＤＮＡを含むものであ
る。本発明のこの局面によれば、二本鎖ＤＮＡ断片は、
レチノイン酸受容体タンパク質を発現できるものであ
る。別の局面においては、本発明は、レチノイン酸受容
体タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡのセンス鎖であ
る一本鎖ＤＮＡ、およびこの二本鎖ＤＮＡの転写によっ
て産生されるＲＮＡを含むものである。別の局面におい
ては、本発明は、本発明のレチノイン酸受容体タンパク
質（ＲＡＲα）をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐ
ｈＲＡＲ１を含む。このプラスミドはアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションに特許目的のために寄託
されている；これはＡＴＣＣ Ｎｏ．４０３９２として
登録されている。さらに別の局面においては、本発明は
レチノイン酸受容体タンパク質をコードするＤＮＡでト
ランスフォームした細胞、望ましくは哺乳動物細胞を含
む。本発明の本局面によれば、トランスフォームするＤ
ＮＡは細胞内で発現されることが可能であり、それによ
ってこのＤＮＡにコードされているレチノイン酸受容体
の細胞内の量を増加させる。本発明はさらに、レチノイ
ン酸受容体をコードするＤＮＡの発現によって産生また
はこのようなレチノイン酸受容体をコードするＤＮＡか
ら転写されたｍＲＮＡの翻訳によって産生された新しい
レチノイン酸受容体を含む。本発明の本局面によれば、
レチノイン酸受容体は、“修飾されていない”レチノイ
ン酸受容体をコードするＤＮＡおよびｍＲＮＡのタンパ
ク質産物であるか、受容体ＤＮＡ配列中に導入された変
異の結果として、対応する天然の“野生型”レチノイン
酸受容体タンパク質とひとつ以上のアミノ酸配列中の違
いを有するものである、修飾された、あるいは遺伝子操
作されたレチノイン酸受容体タンパク質産物である。こ
れらのレチノイン酸受容体は、“修飾されていない”か
“操作されている”かにかかわらず、対応する天然レチ
ノイン酸受容体の少なくとも約５％のレチノイン酸結合
活性および／または少なくとも約５％のＤＮＡ結合また
は転写活性化活性を有することが望ましい。本発明はさ
らに、別の型の機能的領域を持つひとつの受容体の機能
的領域を交換することによって作成されたキメラ受容体
を含む。このように産生されたキメラＤＮＡはそれらの
それぞれＤＮＡ結合領域およびリガンド結合領域の
“元”に基づく機能的特性を有するキメラ受容体タンパ
ク質をコードする。本発明のキメラ受容体は、キメラ受
容体をコードする二本鎖ＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡの
センス鎖である一本鎖ＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡの転
写によって産生されたｍＲＮＡを含む。本発明はまた、
本発明のキメラ受容体をコードするＤＮＡで形質転換さ
れた細胞、真核細胞および原核細胞を含む、を含むもの
である。本発明のキメラ受容体の局面によれば、キメラ
ＤＮＡ融合を行うために、３つの機能的領域に受容体Ｄ
ＮＡを分けるために、ＤＮＡ結合領域の中または近傍の
各受容体ｃＤＮＡの相同な位置に二つの制限エンドヌク
レアーゼ部位を導入する。（例えば、単一のＮｏｔＩ部
位をＤＮＡ結合領域の直前に導入し、単一のＸｈｏＩ部
位をＤＮＡ結合領域の直後に導入することができる。こ
れにより受容体は３つの機能的領域すなわち“カセッ
ト”に分けられる；（１）Ｎ末端カセット、（２）ＤＮ
Ａ結合領域カセット、および（３）リガンド結合領域カ
セットである。どの受容体由来の３つの領域またはカセ
ットでも別の受容体由来のカセットと結合させて多様な
キメラ受容体を作成することが可能である。本発明のこ
の局面は、明細書の“発明の詳細な説明”と題した部分
で例示される。） 本明細書および請求の範囲においては、キメラ受容体
（キメラまたはハイブリッドとも呼ばれる）は、多様な
領域の由来を示す文字によって命名される。ｈＧＲ由来
の領域は“Ｇ”領域と呼ばれ、ｈＴＲ由来の領域は
“Ｔ”領域と呼ばれ、ｈＥＲＲ由来の領域は“Ｅ”、ｈ
ＲＲ由来の領域は“Ｒ”領域と呼ばれる。例えば、キメ
ラ受容体“ＲＧＲ”はｈＲＲのアミノ末端およびカルボ
キシル末端を持ち、ｈＧＲのＤＮＡ結合領域を有する；
キメラ受容体“ＴＧＧ”はｈＴＲ由来のアミノ末端、ｈ
ＧＲ由来のＤＮＡ結合領域およびカルボキシル末端を有
する。（第７図に示した図においては、受容体のアミノ
末端は領域Ａ／Ｂとして示され、カルボキシル末端は領
域Ｅとして示されている。） 本明細書および請求の範囲で用いた命名法によれば、特
に述べない限り、“Ｔ”は一般にＴ３ＲαまたはＴ３Ｒ
β受容体のいずれかを意味する；“Ｅ”はｈＥＲＲ１ま
たはｈＥＲＲ２を意味する；また、“Ｒ”はＲＡＲαま
たはＲＡＲβ受容体のいずれかを意味する。本発明のキ
メラ受容体は、（１）ｈＧＲ，ｈＭＲ，ｈＥＲＲ１，ｈ
ＥＲＲ２，ｒＴＲα，ｈＴ３α，ｈＴ３β，ｈＲＡＲ
α，およびｈＲＡＲβからなる野生型受容体群から選択
されたＮ末端領域、（２）ｈＧＲ，ｈＭＲ，ｈＥＲ
Ｒ１，ｈＥＲＲ２，ｒＴＲα，ｈＴ３α，ｈＴ３β，ｈ
ＲＡＲα，およびｈＲＡＲβからなる野生型受容体群か
ら選択されたＤＮＡ結合領域、（３）ｈＧＲ，ｈＭＲ，
ｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ２，ｒＴＲα，ｈＴ３α，ｈＴ３
β，ｈＲＡＲα，およびｈＲＡＲβからなる野生型受容
体群から選択されたリガンド結合領域を有するキメラを
含み、それにおいて、どのキメラ受容体も少なくとも２
つの異なる“野生型受容体”源に由来するＮ末端領域、
ＤＮＡ結合領域、およびリガンド結合領域を有する。本
発明の望ましいキメラ受容体ＤＮＡとしては、ＧＲＲ，
ＧＲＧ，ＧＧＲ，ＲＧＧ，ＲＧＲ，ＲＲＧ，ＧＴＴ，Ｇ
ＴＧ，ＧＧＴ，ＴＧＧ，ＴＧＴ，ＴＴＧ，ＴＴＲ，ＴＲ
Ｔ，ＴＲＲ，ＲＴＴ，ＲＴＲ，ＲＲＴ，ＧＴＴ，ＧＴ
Ｇ，ＧＧＴ，ＴＧＧ，ＴＧＴ，およびＴＴＧ受容体ＤＮ
Ａが含まれ、およびこのようなキメラ受容体をコードす
るＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの翻訳による本発明の
キメラＤＮＡの発現によって産生されるキメラハイブリ
ッド受容体タンパク質が含まれる。これらのキメラ受容
体は、与えられた細胞内で外因性のバックグラウンド結
合または転写活性化活性を越える活性を有すること、ま
たは、対応する天然の受容体のＤＮＡ結合領域のＤＮＡ
結合活性または転写活性化活性の少なくとも約５％を持
つことおよび／または対応する天然のリガンド結合領域
の約５％のリガンド結合活性を有することが望ましい。
本発明はまた、受容体タンパク質に対する機能的リガン
ドを同定するための方法を含む。本方法によれば、受容
体タンパク質をコードし、少なくとも機能するリガンド
結合領域およびＤＮＡ結合領域を有するＤＮＡ配列（こ
こでは試料配列と呼ぶ）を同定することができる。（本
分野の技術に熟達したものには理解されるように、機能
的であるためにはリガンド結合領域のＤＮＡ配列のすべ
てが必要なわけではない。働き得る配列、すなわち、そ
の領域がリガンドに結合する場合になければならない配
列はその領域の欠失解析によって同定される。）試料Ｄ
ＮＡ配列が単離されると、別の受容体タンパク質、例え
ば、グルココルチコイド受容体タンパク質、チロイド受
容体タンパク質、ミネラロコルチコイド受容体タンパク
質、またはレチノイン酸受容体タンパク質などをコード
するＤＮＡ配列由来のＤＮＡ結合領域と試料ＤＮＡ配列
中のＤＮＡ結合領域とを置換することによってキメラ遺
伝子を作成することができる。次に、適当な受容体欠損
宿主細胞を、（１）発現プラスミドに載っていることが
望ましい、キメラ受容体遺伝子、および（２）ＣＡＴ遺
伝子やホタルのルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター
遺伝子であって、これもプラスミドに載っていることが
望ましく、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１８０，４７１においてレ
ポータープラスミドと呼ばれているものである。どの場
合においても、レポーター遺伝子は機能的に働き得るホ
ルモン反応性要素（ＨＲＥ）（野生型または操作したも
の）に連結しており、それにおいてはホルモン反応性要
素はキメラ受容体遺伝子の作成に使用するＤＮＡ結合領
域によって活性化され得るものである。（例えば、キメ
ラ受容体遺伝子がグルココルチコイド受容体をコードす
るＤＮＡ由来のＤＮＡ結合領域を含む場合、ＨＲＥは野
生型、または合成ＧＲＥ、すなわちグルココルチコイド
受容体タンパク質のＤＮＡ結合領域の機能的部分によっ
て活性化されるものである。チロイド受容体ＤＮＡ結合
領域を用いる場合には、野生型あるいは操作されたＨＲ
Ｅはチロイド（またはレチノイン酸）受容体タンパク質
などに反応性であるべきである。）次に、トランスフェ
クトされた細胞を、キメラ遺伝子によってコードされて
いるキメラタンパク質のリガンド結合領域と結合できる
可能性のあるリガンド候補群で試してみる。これらのう
ち、どのリガンドと機能的にキメラ受容体遺伝子を複合
体を形成するかを決定するために、受容体遺伝子の誘導
を、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質
のレベルを追跡する。（例えば、ルシフェラーゼがレポ
ーター遺伝子である場合には、ルシフェラーゼの産生は
レポーター制御による遺伝子転写を示唆する。）最後
に、レポーター遺伝子の転写を誘導できるリガンドが見
つかった際には、このリガンドが最初の試料ＤＮＡによ
ってコードされている受容体タンパク質に結合すると結
論づけられる。この結論は、レポーター遺伝子の発現を
誘導するリガンドと対応させて、最初の試料ＤＮＡ配列
にコードされている受容体タンパク質の結合能を試験す
ることによって、さらに証明することができる。本分野
の技術に熟達したものが理解するように、細胞が既に、
（ａ）（１）第一の受容体配列（すなわち第一の配列）
のＤＮＡ結合領域の機能領域が、（２）第二の受容体配
列（すなわち第二の配列）のリガンド結合領域の機能領
域と連結されているものからなるキメラ配列（Ｃ）、お
よび（ｂ）レポーター核酸配列が機能的に働き得るホル
モン反応性要素と連結しており、それにおいて第一の受
容体配列のＤＮＡ結合領域の機能領域がレポーター配列
に機能的に連結されているホルモン反応性要素に結合
し、活性化できるものを含んでいる場合には、受容体タ
ンパク質の機能的リガンドを同定するための方法は、少
なくとも一つの候補リガンドで細胞を処理し、レポータ
ー配列の発現産物の量における変化によってレポーター
配列の誘導を追跡することからなる。新しい機能的リガ
ンド同定アッセイにより、多数の潜在的なリガンドまた
はいかなる与えられた受容体も、受容体が野生型である
かキメラであるかどうかにかかわらず、スクリーニング
することが可能になる。機能的リガンド同定法は、ここ
では（１）レチノイド、レチノイン酸、およびその代謝
前駆体、レチノールがｐｈＲＡＲ１ＤＮＡによってコー
ドされる受容体の機能的リガンドであること、および、
（２）ＤＮＡ結合領域およびリガンド結合領域がキメラ
受容体の機能特性を決定すること、を示すことにより例
示される。新しい機能アッセイ、および新しいレチノイ
ン酸受容体、および新しいキメラ受容体について、以下
でさらに詳細に述べる。
【０００６】
【発明の実施の形態】レチノイン酸受容体 ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーを研究す
る努力が続けられているなかで、ステロイドホルモン受
容体のＤＮＡ結合領域に関する顕著な相同性を持つ新し
いゲノム配列を偶発的に同定することが利用されてきた
（デジーン（Ｄｅｊｅａｎ）他、１９８６参照）。この
配列は、ヒト肝臓細胞ガン由来のＢ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＢＶ）の内在化配列にまでわたる。この遺伝子がこれま
でに知られていなかった受容体をコードするという仮説
を追及するために、この配列由来のオリゴヌクレオチド
を標識し、多数のヒトｃＤＮＡライブラリーのプローブ
として用いた。５つのポジティブなクローンが最初に精
巣ｃＤＮＡライブラリーから単離された。これらのクロ
ーンの一つの挿入断片（１ｈＴ１Ｒ）を用いて、λｇｔ
１０腎臓ｃＤＮＡライブラリーからさらなるｃＤＮＡク
ローンを単離した。最大のクローン（ｐｈＲＡＲ１）の
制限酵素地図を第１Ａ図に示す。第１Ｂ−１図に示すよ
うに、ヌクレオチド配列解析により、ヌクレオチド１０
３−１０５に対応する仮定的な開始メチオニンコドンか
ら始まる４６２アミノ酸の長いオープン・リーディング
・フレームが見いだされた。このＡＴＧ周辺の配列は、
翻訳開始部位に関するコザック（Ｋｏｚａｋ）（１９８
７）によって示されたコンセンサス配列と一致する。Ａ
ＴＧの上流は、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）のタ
ーミネーターであり、開始メチオニンであることを支持
する。３０コドン下流に見られる別のＡＴＧはコンセン
サスには適合せず、イニシエーターではなさそうであ
る。１４８９−１４９１のターミネーターコドンに続い
て、ポリアデニル化領域の２０ヌクレオチド上流にポリ
アデニル化シグナルのコンセンサス配列（ＡＡＴＡＡ
Ａ）（プラウドフット（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ）他、１９
７６参照）を持つ３’−非翻訳領域が存在する。相対分
子量５０，７７２ｄ（５１ｋｄ）のポリペプチドが、翻
訳されるオープン・リーディング・フレーム内にコード
されている。ｐｈＲＡＲ１の挿入断片にコードされてい
るタンパク質の大きさは、この断片由来のＲＮＡのｉｎ
ｖｉｔｒｏ翻訳（クリーグ（Ｋｒｉｅｇ）他、（１９
８４）参照）によって確認され、５４ｋｄの推定分子量
に対応することが見いだされた（データは示さない）。
このタンパク質のアミノ酸配列を、グルココルチコイド
およびチロイドホルモン受容体と比較した。もっとも高
い相同性は、残基８８から始まる６６アミノ酸のシステ
インが豊富な配列に見いだされた。われわれのグループ
はすでに、ｈＧＲのこの領域がこの受容体のＤＮＡ結合
領域であることを示している。ギグレ（Ｇｉｇｕｅｒ
ｅ）他、（１９８７）およびホレンバーグ他、（１９８
７）参照。さらに、ミュータジェネシスおよび発現実験
により、グルココルチコイド反応性要素（ＧＲＥ）を有
する遺伝子の転写活性化の役割を果たしている直接の証
拠を示した。ギグレ他、（１９８７）およびホレンバー
グ他、（１９８７）参照。領域スイッチングと転写活性化 ｐｈＲＡＲ１の遺伝子産物に対するリガンドが知られて
いないので、リガンドを同定するための迅速で感度のよ
いアッセイを開発することが望まれた。これまでの研究
からヒトグルココルチコイドおよびエストロゲン受容体
のＤＮＡ結合領域は交換可能であり、機能するハイブリ
ッド受容体が得られることが示されている。このキメラ
はＭＭＴＶ−ＬＴＲのグルココルチコイド反応性要素を
認識するが、エストロゲンに依存して転写を刺激する
（グリーン他、（１９８７）参照）。このことにより、
新しいホルモン受容体のリガンド結合能の同定に一般的
な領域交換ストラテジーを利用できるのではないかと我
々は考えた。このアプローチを確かめるために、まずｐ
ｈＲＡＲ１のＤＮＡ結合領域をよく研究されているｈＧ
Ｒ由来のＤＮＡ結合領域と置換した（第２Ａ図）。（こ
のキメラ構造は、適当な宿主細胞内で発現されると、そ
のリガンド結合領域が、リガンド／受容体複合体がＧＲ
Ｅに結合する前に機能的な外来のリガンドと結合するよ
うなハイブリッド受容体タンパク質を産生し、それによ
ってグルココルチコイド誘導性プロモーターを活性化す
る。） 機能的リガンドの存在をアッセイするために、キメラ受
容体遺伝子を適当なＧＲＥ連結レポーター遺伝子ととも
に、適当な宿主細胞にトランスフェクトした。ＣＶ−１
細胞をＭＭＴＶ−ＣＡＴレポーター遺伝子とともにアッ
セイに用いた。（Ｍアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに特許目的のために寄託されている；本明
細書の“寄託”の項参照。本分野の技術に熟達したもの
には理解されるように、ハイブリッドチロイド受容体タ
ンパク質、すなわちチロイド受容体タンパク質のＤＮＡ
結合領域を有するハイブリッドタンパク質をアッセイす
るための適当なレポータープラスミドは、プラスミドＧ
Ｍ−ＣＡＴ上のＧＲＥをチロイドホルモン反応性転写要
素と置換することによって構築することができる。たと
えば、成長ホルモンプロモーターは最近のＣＡＴ遺伝子
に機能的に連結することができる。成長ホルモンプロモ
ーターはチロイド反応性転写要素を含んでいるので、こ
のようなプラスミドはハイブリッドチロイド受容体タン
パク質のアッセイに用いることができる。本明細書中の
小見出し“レポーターおよび発現プラスミドの構築”の
項参照。（ミネラロコルチコイド受容体はＧＲＥを活性
化できるので、ＧＭ−ＣＡＴなどのレポータープラスミ
ドをハイブリッドミネラロコルチコイド受容体タンパク
質のアッセイに使用することができる。） 機能的リガンド同定アッセイに戻ると、トランスフェク
トした細胞をつぎに、一群のリガンド候補で体系的に処
理し、ＣＡＴ活性の変化によって誘導を追跡した。その
ホルモン様活性のため、レチノール（ビタミンＡ）およ
びレチノイン酸を含むレチノイドは、潜在的なインデュ
ーサーとして評価されていた。注目すべきなのは、レチ
ノイン酸はハイブリッド受容体のＣＡＴの劇的な増加を
引き起こした（第２Ｂ図）。親のベクターｐＲＳｈＲＲ
ＮＸ、またはここではヒトレチノイン酸受容体（ｈＲＡ
Ｒα）と呼ぶｐｈＲＡＲ１由来の野生型遺伝子産物を用
いた場合にはＣＡＴ活性には何も影響がないことを我々
は示した。期待されたように、ハイブリッド受容体はグ
ルココルチコイドでは誘導されず、ｈＧＲはレチノイン
酸によっては誘導されない。第３Ａ図に示すように、レ
チノイン酸はハイブリッド受容体によって誘導されたＣ
ＡＴ活性に関して、６×１０−１０ＭのＥＤ５０値を示
し、これは多様な生物学的アッセイにおけるレチノイン
酸に対して観測されたＥＤ５０値と一致するものである
（スポーン（Ｓｐｏｒｎ）とロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔ
ｓ）１９８４参照）。レチノールは１００ｎＭ以上のＥ
Ｄ５０値で弱いアゴニストとして機能する。レチニル酢
酸およびレチニルパルミチン酸は弱いインデューサーと
してさえ機能する。テストステロン、ジヒドロテストス
テロン、エストロゲン、デキサメタゾン、コルチゾー
ル、アルドステロン、ブロゲステロン、Ｔ３，Ｔ４、ビ
タミンＤ３、および２５−ＯＨ−コレステロールを含む
多数の天然および合成リガンドはＣＡＴ活性を誘導する
ことができなかった。ｐｈＲＡＲ１遺伝子産物がレチノ
イン酸受容体であることを確認するために、発現産物の
結合特性を以下のＣＯＳ−１細胞のトランスフェクショ
ンによって評価した。第３Ｂ図に示したように、トラン
スフェクションした細胞は３Ｈ−レチノイン酸に特異的
に結合する能力が増大していることが示された。この増
加は、細胞性レチノイド結合タンパク質の存在および、
顕著な非特異的結合の結果と考えられる内在性のバック
グラウンドを超えておこっている。活性化の研究と一致
して、結合はレチノイン酸によって完全に競合される
が、レチノールによっては部分的にしか競合されない。
チロイドホルモン、デキサメタゾン、およびビタミンＤ
３は、レチノイン酸の結合と競合しなかった。遺伝子ファミリー 新しいレチノイン酸遺伝子が特異的なものであるかどう
かを決定するために、また潜在的に関連した遺伝子を同
定するために、ヒトＤＮＡをサザンブロット分析で調べ
た。制限酵素で切断したヒトＤＮＡをｈＲＲ遺伝子のコ
ード領域由来の標識したＤＮＡ断片とハイブリダイゼー
ションさせた結果、単一のハイブリダイズする遺伝子座
位とすべての切断で一致する３本のバンドが見られた
（第４Ａ図）。このハイブリダイゼーションパターンは
デジーン他（１９８６）がＨＢＶ前挿入部位に関して記
載した制限酵素地図とは関連がないものである。しか
し、ハイブリダイゼーション条件を緩くすると、各酵素
消化産物でさらに６本のバンドが見いだされた（第４Ｂ
図）。これらの観察により、ヒトゲノム中に少なくとも
さらに１カ所、あるいはそれ以上レチノイン酸受容体に
関連する座位が存在することが示唆された。現在ＲＡＲ
βが発見された。ブランド（Ｂｒａｎｄ）他、（１９８
８）参照。ｈＲＲ遺伝子の発現 レチノイン酸は多数の異なる細胞型に影響を与えること
が知られているので、我々はｈＲＲ遺伝子の発現を調べ
た。多様なラットおよびヒト組織から単離された全細胞
質ＲＮＡをサイズで分離し、ニトロセルロースフィルタ
ーに転移させた。ｐｈＲＡＲ１由来の６００ｂｐ制限断
片とのハイブリダイゼーションにより、海馬、副腎、小
脳、視床下部、および精巣で最も高レベルに、３，２０
０ヌクレオチドの主要なＲＮＡが見られた（第５図）。
長い感光により、肝臓などのいくつかの組織では検出さ
れなかったが、ほとんどの組織で少量の３．２ｋｂ転写
産物が見られた。レチノイン酸受容体データ要約 ここで示したデータは、ｐｈＲＡＲ１の遺伝子産物を３
つの基準に基づいてヒトレチノイン酸受容体として同定
するものである。第１に、ｈＲＲのステロイドおよびチ
ロイドホルモン受容体に対する全体的な構造上の相同性
（第６図）は、ｈＲＲがリガンド反応性調節タンパク質
であることを示唆している。第２に、ｈＧＲのＤＮＡ結
合領域とｈＲＲの予想されるリガンド結合領域からな
る、発現されたキメラ受容体は、レチノイン酸の存在す
る場合にのみ、グルココルチコイド誘導性レポーター遺
伝子の転写制御因子として働く。この誘導は生理学的レ
ベルで起こる。第３に、トランスフェクトされた細胞中
のｈＲＲの候補の発現が選択的に、これらの細胞がレチ
ノイン酸に結合する能力を増大させる。発生とガン化 レチノイドは、広範な系においてい発生と分化に難解な
効果を表わす、レチノイン酸、レチノール（ビタミン
Ａ）および一連の天然ならびに合成誘導体からなる化合
物のグループからなるものである。スポーン（Ｓｐｏｒ
ｎ）とロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ），（１９８３）；マ
ンデル（Ｍａｎｄｅｌ）とコーエン（Ｃｏｈｅｎ），
（１９８５）；ウォルバック（Ｗｏｌｂａｃｋ）とホウ
（Ｈｏｗｅ），（１９２５）；ロタン（Ｌｏｔａｎ），
（１９８０）；フックス（Ｆｕｃｈｓ）とグリーン（Ｇ
ｒｅｅｎ），（１９８０）を参照のこと。初期の研究が
上皮の成長および分化に対するレチノイドの効果に焦点
を当てたにもかかわらず、それらの作用がはじめに考え
られていたよりもさらに広範にわたるものであることが
示された。最近の多くの研究により、神経芽細胞腫（ハ
ウスレー（Ｈａｕｓｌｅｒ）ら，（１９８３）を参
照）、黒色腫（ロタンら，（１９８３）を参照）および
線維芽細胞（シュローダー（Ｓｈｒｏｄｅｒ）ら，（１
９８２）を参照）を含む種々の培養細胞系列に対するこ
れらの分子の効果が示されている。ヒト前骨芽細胞性白
血細胞（ＨＬ−６０）において、レチノイン酸は、側内
胚葉の分化および後期マウス胚盤胞の特徴を誘導する
（ストリックランド（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ）とマーダ
ビ（Ｍａｈｄａｖｉ），（１９７８）；ジェッテン（Ｊ
ｅｔｔｅｎ）ら，（１９７９）；ワング（Ｗａｎｇ）
ら，（１９８５）を参照）。レチノイン酸は発生におい
て同様に強力な効果を示すことが明らかにされている。
例えば、レチノイン酸は、発生途上のニワトリの肢芽に
おいて前後軸が確立する際に、極性領域の作用を代用で
きるのである（ティックル（Ｔｉｃｋｌｅ）とアイヒー
ル（Ｅｉｃｈｅｌｅ），（１９８５）を参照）。レチノ
イン酸の投与を調節することにより、新奇なパターンを
もつ肢構造を作ることが可能である。レチノイン酸は、
主にはモルフォゲン（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ）であると考
えられるにもかかわらず。ノザンブロット分析によっ
て、成体におけるその機能についての再評価が示唆され
ている。ヒトにおいて、レチノールの欠損は種々のガン
の驚くべき増加と関連している（ムーン（Ｍｏｏｎ）と
イトリ（Ｉｔｒｉ），（１９８４）を参照）。レチノイ
ドは、動物において腫瘍の成長を阻害し、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏでの腫瘍促進因子の作用を妨害することも示されて
いる。これと関連して、ｈＲＲは、ガン化の負の制御因
子であると考えられる。制御遺伝子のスーパーファミリー ２つの驚くべき結果がここに示した研究から明らかとな
った。まず第一は、レチノイン酸受容体関連遺伝子ファ
ミリーの発見であり、これは、密接に関連した性質をも
つ複数のタンパク質の存在を予言するものである（例え
ば、ブランド（Ｂｒａｎｄ）ら，（１９８８）により記
述されたＲＡＲβ）。生理学的研究から、レチノイン酸
はレチノール（ビタミンＡ）と同様に、細胞の分化に強
力な効果を発揮し、これらの効果はしばしば関連しない
ものであることが示されている。したがって、少なくと
もひとつの関連遺伝子産物が、特異的なレチノール受容
体あるいはレチノイドファミリーのもうひとつのメンバ
ーに対する受容体であるということがありそうである。
これらの結果から得られる第二の驚くべき観察は、レチ
ノイド受容体とチロイドホルモン受容体との密接な類縁
関係である。（われわれが以下に示すように、レチノイ
ン酸受容体はチロイド応答エレメントまたはＴＲＥを活
性化できる；「レチノイン酸とチロイドホルモンは共通
の応答エレメントを介して遺伝子発現を誘導する」と分
類された明細書の節を参照のこと。）この関係は、チロ
イドホルモンとレチノイドの構造的相違性から、ある程
度驚きである。チロイドホルモンは２つのチロシン分子
の縮合から生ずる一方、レチノイドは、メバロン酸から
誘導される。化学的に異なる分子が共通の構造をもつ受
容体と相互作用するという観察はもっぱら、それらがそ
の個々の調節効果を引き出すところの作用様式の共通性
を反映しているように見える。この類推に基づいて、細
胞内受容体とレチノイドの相互作用が、ホルモン／受容
体複合体による特定の遺伝子群の活性化を引き起こす調
節カスケードを誘導するという考えを現在われわれは提
出している。動物は、その発生と生理状態を調節するた
めに種々の方法をとっているが、レチノイン酸受容体が
ステロイド受容体スーパーファミリーの一部であるとい
う証拠は、形態形成および恒常性をつかさどる機構がは
じめに考えられていたよりもさらに一般的であることを
示唆している。キメラ受容体の構築と特徴付け キメラ受容体遺伝子の構築は、上述の「定義」、「発明
の要約」および「ドメインの切り替えおよび転写活性
化」に分類される明細書の項目で論議されている。それ
に続く項目において、キメラ受容体の構築と特徴付け
は、ＧＲ／ＴＲハイブリッドの構築と特徴付けを示すこ
とにより説明される。
【０００７】
【実施例】細胞培養とトランスフェクション ＣＶ−１細胞は、キメラＲＲ／ＴＲ受容体を持つ発現プ
ラスミドおよび、ＣＡＴレポーター遺伝子を持つレポー
タープラミドでトランスフェクトする受容体欠損宿主細
胞として用いられた。ＣＶ−１（アフリカミドリザルの
腎臓）細胞の生育およびトランスフェクションの条件
は、リン酸カルシウム沈澱を細胞の上に４−８時間お
き、このとき、培地を５％のＴ３フリーのウシ血清（ス
カンチボディーズ）なし、あるいは１０−７ＭのＴ
３（シグマ）を含んだＤＭＥＭにかえることを除いて
は、以前に述べられたもの（ギギュアー（Ｇｉｇｕｅｒ
ｅ）ら，（１９８６））と同様だった。Ｔ３の添加３６
時間後に細胞を集め、ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら，
（１９８２）によって述べられているようにしてＣＡＴ
アッセイを行った。代表的なものは、５μｇのレポータ
ーと１μｇの発現ベクターをコトランスフェクション
し、これとともに２．５μｇのＲＳＶ−βｇａｌをトラ
ンスフェクション効率の対照として用いるものである。
アッセイ化および非アセチル化型の［１４Ｃ］クロラム
フェニコールを薄層クロマトグラフィーにより分離し、
切り出し、５％ＤＭＳＯを含むエコノフルアー（デュポ
ン社）中で液体シンチレーションカウンターを用いてカ
ウントを測定することにより定量した。β−ガラクトシ
ダーゼのアッセイはハーボメル（Ｈｅｒｂｏｍｅｌ）
ら，（１９８４）により記載されたようにして行った。
ＣＡＴ活性は、β−ガラクトシダーゼ活性によって割っ
た転換率により表わされる。レポーターおよび発現プラスミドの構築 ラット成長ホルモン遺伝子の−１６９から−２００に相
当する合成オリゴヌクレオチドを、−１９０／−１８１
の位置にＨｉｎｄＩＩＩサイトを有するＭＴＶ−ＣＡＴ
のリンカー精査型変異体（ビュティ（Ｂｕｅｔｔｉ）と
クーネル（Ｋｕｈｎｅｌ），（１９８６））に組み込ん
だ。発現ベクターは、ｐｈｅＡ１２（ｈＴＲβ、ワイン
バーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、（１９８６）を
参照）およびｒｂｅＡ１２（ｈＴＲα、トンプソン（Ｔ
ｈｏｍｐｓｏｎ）ら、（１９８７）を参照）の全長のｃ
ＤＮＡを、ｐＲＳベクター（キギュアーら、（１９８
６）および（１９８７））のＫｐｎＩとＢａｍＨＩサイ
トの間に挿入することによりチロイドホルモン受容体に
対して構築した。キメラ受容体の構築 ｈＧＲＮＸの構築法は既に記載がある（ギギュアーら、
（１９８７））。ｈＧＲＮＸを構築するために、ｐｈｅ
Ａ１２（ｈＴＲβ、ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ
ｅｒ）ら、（１９８５）と（１９８６）を参照）のｃＤ
ＮＡ挿入断片をＭ１３ｍｐ１９のＫｐｎＩとＢａｍＨＩ
サイトの間にサブクローニングし、クンケル（１９８
５）の方法により変異を生起させた。ＮｏｔＩサイトを
生ずるために用いたオリゴヌクレオチドは３つのアミノ
酸、すなわちＡｓｐ９７をＡｒｇへ、Ｌｙｓ９８をＰｒ
ｏへ、Ａｓｐ９９をＰｒｏへと変化させた。ＸｈｏＩサ
イトを生ずるために用いたオリゴヌクレオチドは２つの
アミノ酸、すなわちＴｈｒ１７１をＬｅｕへ、Ａｓｐ１
７２をＧｌｙへと変化させた。次に変異型受容体ｃＤＮ
Ａを発現ベクターｐＲＳ（ギギュアーら、（１９８６）
および（１９８７））に移した；この複合体は、ＲＳｈ
ＧＲＮＸとＲＳｈＴＲβＮＸの間のＫｐｎＩ−Ｎｏｔ
Ｉ、ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ制限
酵素断片を交換することにより構築された。ＲＳｈＧＲ
ＮＸは、野生型に対し約７５％のＤＮＡ結合活性を有
し、ＲＳｈＴＲβＮＸは野生型の約６０％のＤＮＡ結合
活性を有している。Ｃｉｓ／Ｔｒａｎｓ作用性リガンド同定アッセイ ｃｉｓ／Ｔｒａｎｓ機能リガンド同定のためのコトラン
スフェクションアッセイは、グルココルチコイド、およ
びチロイドならびにレチノイン酸受容体の間でドメイン
を交換することにより構築したキメラ受容体を研究する
ために用いられた。（当業者には理解されるように、ｃ
ｉｓ／Ｔｒａｎｓコトランスフェクションアッセイは、
野生型あるいは遺伝的に操作された受容体のあるドメイ
ンにおける、機能的な交換によって作製されたキメラ受
容体を研究するために用いることが可能である。ｃｉｓ
／Ｔｒａｎｓアッセイにおいて、２種のプラスミドを受
容体受容細胞系列にトランスフェクションする事が好ま
しい。第一のプラスミドは受容体タンパク質（野生型か
あるいはキメラまたは遺伝的に操作を加えたもの）を発
現するために使われる。第二のプラスミドは、リガンド
あるいはホルモン応答性プロモーターからの転写をモニ
ターするために用いられる。チロイドホルモン受容体ア
ッセイの場合、発現プラスミドは、チロイドホルモン受
容体をコードするｃＤＮＡを発現に向かわせるラウス肉
腫ウイルスの長い終末反復配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）から
なる。ｈＧＲの場合、レポータープラスミドは、細菌の
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）遺伝子を配合したマウス乳腺腫瘍ウイルスの長い
終末反復配列（ＭＴＶ−ＬＴＲ）である。ＭＴＲ−ＣＡ
Ｔをチロイドホルモン応答性レポーターに変換するため
に、チロイドホルモン応答性エレメント（ＴＲＥ）を含
むオリゴヌクレオチドをＭＴＶ−ＬＴＲの−１９１の位
置に挿入した。この配列、すなわちラット成長ホルモン
（ｒＧＨ）遺伝子の−１６９から−２００は、チロイド
ホルモン受容体に特異的に結合し異種プロモーターにＴ
３応答性を付与する（グラス（Ｇｌａｓｓ）ら、（１９
８７））。発現およびレポータープラスミドはＣＶ−１
細胞にコトランスフェクションし、ＣＡＴ活性はＴ３存
在、非存在下で測定した。このアッセイにより、αおよ
びβチロイドホルモン受容体のどちらも、Ｔ３存在、非
存在下でＭＴＲ−ＣＡＴからの転写を活性化しないこと
が示された（データは示さない）。しかし、ＴＲＥをつ
けることにより、チロイドホルモン応答性のＭＴＶプロ
モーターが作られる。ＣＡＴ活性の誘導は、機能的なα
あるいはβチロイドホルモン受容体のコトランスフェク
ションとＴ３の添加に依存的である。Ｔ３存在下でα受
容体（ｒＴＲα）はＣＡＴ活性を約１５倍まで誘導する
が、一方β受容体（ｈＴＲβ）は約５倍まで活性を誘導
する。複合チロイドホルモン／グルココルチコイド受容
体は、チロイドおよびグルココルチコイドホルモン受容
体の機能的性質を比較するために構築された。キメラ複
合受容体の構築を促進するために、ＮｏｔＩとＸｈｏＩ
の制限酵素に対する唯一の切断点をｈＧＲとｈＴＲβの
ＤＮＡ結合ドメインに隣接して挿入した。これらの変異
型受容体は、ｈＧＲＮＸとｈＴＲβＮＸと呼ばれ、これ
らの受容体に対するアミノ末端、ＤＮＡ結合ドメイン、
リガンド結合ドメインの全ての可能な組合せにおける複
合体を作るために用いることができる。（当業者には理
解されるように、共通点を有するプラスミド、例えばば
ｐＲＡＲαＮＸあるいはｐＭＲＮＸは、ステロイドホル
モン受容体のスーパーファミリーにおける種々の受容体
から、全ての機能ドメインの全ての可能な組合せにおけ
るキメラ受容体を作るために用いることが可能である。
受容体と種々の機能ドメインの位置は第８図に示されて
いる。）複合体およびその親型の受容体は、Ｔ３あるい
は合成グルココルチコイドデキサメタゾンの存在、非存
在下で、チロイドホルモンおよびグルココルチコイド応
答性プロモーター両者を用いてアッセイが可能である。
複合チロイド／グルココルチコイド受容体の構造および
活性は第９図に示されている。受容体は３つの部分に分
けられ、複合体はドメインの「起点」を表わす文字で名
付けられており、例えば「Ｔ−Ｇ−Ｔ」はｈＴＲβのア
ミノ末端およびカルボキシ末端を持ち（Ｔ−，−Ｔ）、
ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメイン（−Ｇ−）を持っている。
推定上のｈＴＲβのＤＮＡ結合ドメイン（ＴＴＧ，ＧＴ
Ｔ，ＧＴＧ）との複合体は、ＴＲＥ−ＣＡＴからの転写
を活性化するが、一方ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメイン（Ｇ
ＧＴ，ＴＧＧ，ＴＧＴ）との複合体はＧＲＥ−ＣＡＴか
らの転写を活性化した、これはｈＴＲβのこの領域がｈ
ＧＲのＤＮＡ結合ドメインに類似しており、プロモータ
ーの認識に関与していることを示している。ｈＴＲβカ
ルボキシ末端との複合受容体はＴ３により活性化される
が、一方ｈＧＲのカルボキシ末端との複合受容体はデキ
サメタゾンにより活性化された。これは、カルボキシ末
端がホルモンの結合および活性化の特異性を負っている
受容体の一部であるとする認識と一致するものである。
これとあわせて、これらの複合体の機能的性質は、ｈＴ
ＲβのＤＮＡおよびリガンド結合ドメインの帰属を支持
するものである。レチノイン酸およびチロイドホルモンは共通の応答性エ
レメントを介して遺伝子発現を誘導している 機能的なレチノイン酸応答性エレメント（ＲＡＲＥ）の
同定はレチノイン酸受容体が遺伝子発現を活性化し、細
胞の分化を制御する機構をわれわれが理解する上で決定
的なものである。こうした研究のひとつの障害は、その
転写がレチノイン酸受容体−ホルモン複合体に直接依存
している遺伝子が全く同定されていないことである。Ｒ
ＡＲＥの局在を探るそのほかの手段は、クローン化した
ｃＤＮＡから生産されるレチノイン酸受容体を用いて既
知のホルモン応答性プロモーターの誘導性を体系的に調
べていくものである。（「Ｃｉｓ／Ｔｒａｎｓアッセ
イ」という見出しで述べたように、この系において、Ｈ
ＲＥを含むプロモーターからの転写活性化は、ＣＶ−１
といった受容体欠損細胞においてコトランスフェクジョ
ンした発現プラスミドからの機能的な受容体の発現に依
存性を示す。）レチノイン酸およびチロイドホルモン受
容体のＤＮＡ結合ドメインは高い関連性を持つ（アミノ
酸配列において６２％の一致、第６図を参照）ため、レ
チノイド受容体がＴＲＥを介して遺伝子発現を活性化す
る可能性が検討された。ＴＲＥは、例えばグラスら（１
９８７）を参照すると、チロイドホルモン（３，５，
３’−トリヨード−Ｌ−チロニン、Ｔ３）調節に必須
な、ラット成長ホルモン５’隣接ゲノム配列におけるｃ
ｉｓ−作用エレメントであるという議論により知られて
いる。ＴＲＥがＲＡＲＥとして効果的に機能できるかを
調べるために、新奇なＴ３応答性プロモーターを、マウ
ス乳腺肉腫ウイスル長終結反復配列（ＭＴＶ−ＬＴＲ）
中に存在するグルココルチコイド応答性エレメントを、
天然のＴＲＥＣＨをコードするオリゴヌクレオチドと置
換することにより構築した。次に、このプロモーターレ
ポータープラスミドΔＭＴＶ−ＴＲＥＧＨ−ＣＡＴを作
製するために、細菌のクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子と融合した。ＣＶ−
１細胞へ短期間のトランスフェクションを行った後、こ
のプロモーターの誘導性をＣＡＴ活性を測定することに
より決定した。ＣＶ−１細胞を、ヒトチロイドホルモン
受容体β（ｐＲＳｈＴ３Ｒβ）を含む発現ベクターおよ
びレポータープラスミドΔＭＴＶ−ＴＲＥＧＨ−ＣＡＴ
でコトランスフェクションした場合、ＣＡＴ活性の誘導
はＴ３の存在下で測定する。これとは対照的に、ヒトグ
ルココルチコイド受容体（ｐＲＳｈＧＲα）をコードす
る発現ベクターと同じレポータープラスミドをコトラン
スフェクションすると、合成グルココルチコイドデキサ
メタゾンに応答してこのプロモーターからのＣＡＴ活性
を活性化しなかった。これらの結果は、野生型のＭＴＶ
−ＬＴＲが応答性でないことから（データは示さな
い）、ＲＡＲαによるＣＡＴ活性の誘導がＴＲＥによる
ものであることを明らかに示している。これらの結果は
また、ｈＲＡＲαがＴＲＥを含むプロモーターからの遺
伝子発現を特異的に誘導できることを示している。ＲＡＲとＧＲのキメラ受容体 上で議論したように、ステロイドホルモン受容体のモジ
ュラー構造は、ある受容体から他の受容体へ機能的ドメ
インを交換して機能的なキメラ受容体を作製することを
可能としている。この戦略は、ＲＡＲのＤＮＡ結合ドメ
インとＧＲのリガンド結合ドメインを持つｈＧＲ／ｈＲ
ＡＲαキメラを作製するために用いられた。ＣＶ−１細
胞をｈＧＲＧをコードする発現プラスミドとレポーター
ΔＭＴＶ−ＴＲＥＧＨ−ＣＡＴでコトランスフェクショ
ンすると、デキサメタゾンは特異的にＣＡＴ活性を誘導
した（データは示さない）。この実験は、ｈＲＡＲαの
ＤＮＡ結合ドメインが標的遺伝子の活性化の特異性を決
定するという直接的証拠を与えた。
【０００８】図表の詳細な説明 第１図．ｐｈＲＡＲ１のＤＮＡおよび主要なアミノ酸配
列。Ａ、ｐｈＲＡＲ１クローンの模式的な説明と制限酸
素地図。点を打ったボックスは推定される遺伝子の読み
枠を示す。Ｂ、（Ｂ−１，Ｂ−２，Ｂ−３として示され
ている）ｐｈＲＡＲ１の完全なヌクレオチド配列が長い
読み枠の上にアミノ酸配列とともに示されている。ヌク
レオチド８５−８７の上流域にあるインフレームの終止
コドンおよびポリアデニル化シグナルは下線を施してあ
る。 第１図の方法．デジャン（Ｄｅｊｅａｎ）ら、（１９８
６）によって発表されているゲノムはう列のヌクレオチ
ド４０８−４７７に相当する６３−ｍｅｒのオリゴヌク
レオチドは、ヒト精巣λｇｔ１０ライブラリーを検索す
るためのハイブリダイゼーションプローブとして用いら
れた。ハイブリダイゼーション混合液は、３５％ホルム
アミド、１×デンハルト、５×ＳＳＰＥ、０．１％ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ ｍｌ−１
の変性サケ精子ＤＮＡおよび１０６ｃ．ｐ．ｍ ｍｌ
−１の３２ｐ−標識オリゴヌクレオチドを含んでいた。
２重にしたニトロセルロースフィルターを４２℃で１６
時間ハイブリダイゼーションし、２×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭ
クエン酸ナトリウム）で２０分間、５５℃で３回洗い、
増感紙を用いて−７０℃でオートラジオグラフにかけ
た。この検索により得られたクローン１ｈＴ１Ｒは、部
分的に性質を調べた後、ヒト腎臓ωｇｔ１０ ｃＤＮＡ
ライブラリーを検索するためのハイブリダイゼーション
プローブとして用いた（ベル（Ｂｅｌｌ），（１９８
６）を参照）。この検索のために、洗いは６８℃で１×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳという条件に変えた。いくつか
のｃＤＮＡクローンが単離され、そのうち最も長いクロ
ーンであるｐｈＲＡＲ１を多種の制限酵素で切断し、得
られた断片をＭ１３シーケンシングベクターｍｐ１８な
らびにｍｐ１９に、両向きにサブクローニングし、ジデ
オキシ法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、（１９７
７））で塩基配列を決定した。ＤＮＡ配列を編集し、デ
ヴェルクス（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら、（１９８４）およ
びシュターデン（Ｓｔａｄｅｎ），（１９８２）のプロ
グラムによって分析した。 第２図．Ａ、キメラ受容体ｈＲＧＲの構築。種々の構築
のドメイン構造は、模式的に示されており、番号は各々
のドメインのアミノ酸の位置に対応している。ＤＮＡ結
合ドメインは「ＤＮＡ」で表わされており、リガンド結
合ドメインは各々の誘導物質により表わされている。受
容体間のＤＮＡ結合ドメインの交換を可能とするため
に、部位標的突然変異導入法により作られたＮｏｔＩお
よびＸｈｏＩ部位が示されている。Ｂ、レチノイン酸に
よるＣＡＴ活性の誘導。発現ベクターはレポータープラ
スミドＭＴＶＣＡＴとともにＣＶ−１細胞にコトランス
フェクションし、１００ｎＭのデキサメタゾン（ＤＥ
Ｘ）あるいはレチノイン酸（ＲＡ）の存在、非存在下で
２日間培養した。発現ベクターに挿入された受容体は：
ｐＲＳｈＲＧＲではヒトグルココチコイド受容体；ｐＲ
ＳｈＲＲではヒト・レチノイン酸受容体；ｐＲＳｈＲＲ
ｎｘではＮｏｔＩとＸｈｏＩ部位を有する変異型ヒト・
レチノイン酸受容体；ｐＲＳｈＲＧＲでは、ＤＮＡ結合
ドメインがヒト・グルココルチコイド受容体のＤＮＡ結
合ドメインによって置換された、ヒト・レチノイン酸受
容体キメラ受容体である。 第２図の方法．Ａ、ｐｈＲＡＲとｈＧＲ（ホレンバーグ
（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら，（１９８５）を参照）の
ｃＤＮＡ挿入断片の制限酸素断片を、ｍｐ１９ベクター
のｋｐｎＩとＢａｒｍＨＩ部位にサブクローニングし、
クンケル（１９８５）の方法にしたがい変異誘起処理し
た。ｈＧＲおよびｈＲＲ内にＮｏｔＩ部位を作製するた
めに用いたオリゴヌクレオチドは各々２８と３１ヌクレ
オチドであるが、一方ｈＧＲとｈＲＲにＸｈｏＩを作る
ために用いたオリゴヌクレオチドは２４と２３ヌクレオ
チドであった。ＮｏｔＩが生起した結果、ｈＧＲＮｘで
はＰｒｏ４１６からＡｒｇへの変異が、またｈＲＲＮｘ
ではＩｌｅ８４およびＴｙｒ８５がＰｒｏへと変異し
た。ＸｈｏＩ部位の導入によりｈＧＲＮｘアミノ酸配列
は変化しないが、ｈＲＲＮｘではＬｙｓ１５５がＬｅｕ
残基へ変異した。変異型受容体は次に、発現ベクターｐ
ＲＳ（ギギュアーら，（１９８６）を参照）に移され、
ｈＧＲＤＮＡ結合ドメインを含むｐＲＳｈＧＲＮｘのＮ
ｏｔＩ／ＸｈｏＩ制限酵素断片を、ｐＲＳｈＲＮｘのＮ
ｏｔＩとＸｈｏＩ部位の間に導入してｐＲＳｈＲＧＲを
生ずる。Ｂ、細胞のトランスフェクションとＣＡＴアッ
セイ。組換え体ＤＮＡ構築物（各々５μｇ）はリン酸カ
ルシゥム共沈法（ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら，（１
９７９））によってＣＶ−１細胞に導入された。次に、
細胞は誘導物質の存在、非存在下で、ニュートリドーマ
（ベーリンガー・マンハイム社）を補った無血清培地内
で２日間培養した。ＣＶ−１細胞は、次にゴーマンら，
（１９８２）によって記載されたようにしてＣＡＴアッ
セイのために調製し、２５μｇのタンパク抽出物を用い
て３時間行った。レチノールを用いた全ての実験は、緩
光下で行った。 第３図．Ａ、レチノイドの投与量に対する応答。ｐＲＳ
ｈＲＧＲおよびｐＭＴＶＣＡＴでトランスフェクション
したＣＶ−１細胞に、レチノイドの濃度を上昇させるあ
るいはテストステロン、ジヒドロテストステロン、エス
トロゲン、コルチゾル、アルドステロン、プロゲステロ
ン、トリヨードチロニン（Ｔ３）、チロキシン
（Ｔ４）、ジヒドロキシ−ビタミンＤ３（ＶＤ３）およ
び２５−ＯＨ−コレステロールなどの１μＭにおける単
独投与（＊）処理を行った。ＣＡＴ活性のレベルは、こ
の実験において観察された最大応答に対するパーセント
としてプロットされた。Ｂ，トランスフェクションした
ＣＯＳ−１細胞の細胞質抽出物に対するレチノイン酸の
結合。棒は、１０００倍過剰量の種々の競合物質非存在
（黒色の棒）、存在下（白ぬきの棒）で決定された、結
合した３Ｈ−レチノイン酸量を表わしている。値は、４
連の測定を平均したものを示している。競合物質は、レ
チノイン酸（ＲＡ）、レチノール（Ｒ）、Ｔ４、デキサ
メタゾン（ＤＥＸ）およびビタミンＤ３（ＶＤ３）であ
る。 第３図の方法．Ａ、ＣＶ−１細胞のコトランスフェクシ
ョンとＣＡＴアッセイは第２図で述べたようにして行っ
た。レチノイン酸は最少限のジメチルスルフォキシドに
溶解し、エタノールで希釈した。他の全ての産物はエタ
ノールで希釈し、対照の培養には培地に０．１％の溶媒
（Ｖ／Ｖ）を与えた。レチノイド処理の投与量−応答の
曲線は三連で行った。Ｂ、準密集状態のＣＯＳ−１細胞
を、ＤＥＡＥ−デキストラン法（ディーンズ（Ｄｅａｎ
ｓ）ら、（１９８４）を参照）によりディッシュ当り１
０μｇの対照プラスミド（ｐＲＳ）あるいはｐＲＳｈＲ
Ｒでトランスフェクションした。細胞を５％の活性炭処
理した仔ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に２日間おき、
次にＴＮＥ（４０ｍＭ トリス−ＨＣＬｐＨ７．４，１
５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で集め、低
張緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４，０．
１ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭジチオスレイトール，１０ｍ
Ｍ ＮａＭｏ０４，１０％グリセロール，０．５ｍＭ
フェニルメチルスルフオニル・フルオライド）中で、ド
ウンス・ホモジナイゼーションを用いて融解し、細胞質
画分を得るために１００，０００×ｇで３０分間遠心し
た。イキュベーションは、総量２００μｌ中で、細胞質
画分からの１５０μｇのタンパク質および２×１０−８
Ｍの３Ｈ−レチノイン酸（ＮＥＮ，５２．５Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌｅ）とともに、低張緩衝液中で行った。特異的結合
は２×１０−５Ｍの競合物質を添加することにより測定
した。反応は４℃で１６時間行った。結合した３Ｈ−レ
チノイン酸はＤＥ−８１フィルターを用いて定量した。
反応液をフィルター上に１分間おいた後、洗浄緩衝液
（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４，０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ，０．１％ トライトンＸ−１００）でリン
スした。フィルターを乾燥させ、液体シンチレーション
分光法によりカウントを測定した。 第４図．ヒト・ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析。
Ａ、ヒト胎盤ＤＮＡを表示した制限酵素で切断した。切
断したＤＮＡを０．８％のアガロースゲル（レーン当り
１０μｇ）で分離し、ニトロセルロースフィルターに転
写した（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ），（１９７５））
後、ブロットは、ｈＲＲのＤＮＡ結合ドメインを含むｐ
ｈＲＡＲ１（約６００塩基対）由来のＥｃｏＲＩ×Ｐｖ
ｕＩＩ断片と、高度に厳しい条件（５０％ フォルムア
ミド，５×ＳＳＰＥ，１×デンハルト，０．１％ ＳＤ
Ｓ，１００μｇ ｍｌ−１サケ精子ＤＮＡ）下でハイブ
リダイゼーションした。このフィルターを０．１×ＳＳ
Ｃ、０．１％ ＳＤＳ中、６５℃で洗った。λ Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ ＤＮＡマーカー（サイズはＫｂで表示）はオ
ートラジオグラムの左にならべてある。Ｂ、ゆるい条件
下でのＡと同様なプローブを用いたヒト胎盤ＤＮＡの分
析。同一の試料を含む平行なブロットは、３５％のフォ
ルムアミドを用いた以外は、Ａと同様にしてハイブリダ
イゼーションした。このフィルターは２×ＳＳＣ、０．
１％ＳＤＳ中、５５℃で洗った。 第５図．ラットおよびヒトの組織におけるレチノイン酸
受容体ｍＲＮＡの、ノザンブロツト分析。 第５図の方法．全ＲＮＡは、グアニジンチオシアネート
を用いて種々の組織から単離され（チャーグウィン（Ｃ
ｈｉｒｇｗｉｎ）ら，（１９８０））、１％アガロース
ーフォルムアルデヒドゲルで分離し、ニトロセルロース
に転写した後、第４図で述べられたプローブを用いて、
厳しい条件下でハイブリダイゼーションした。全てのレ
ーンにおいて２０μｇの全ＲＮＡが用いられた。リボソ
ームＲＮＡ（２８Ｓと１８Ｓ）の移動度はサイズマーカ
ーに対して示されている。ニトロセルロースフィルター
は増感紙を用い、−７０℃で１週間オートラジオグラフ
ィーを行った。 第６図．ｈＧＲ，ｈＲＲおよびｈＴ３Ｒβ構造の模式的
なアミノ酸の比較。アミノ酸配列は点線にはさまれる領
域におけるアミノ酸の一致の割合とともに、模式的に並
べられている。第７図は、一般化したステロイド＼チロ
イド＼レチノイン酸受容体遺伝子を模式的に図示したも
のであり、遺伝子の区分を領域Ａ＼Ｂ，Ｃ，Ｄ．Ｅとし
て示している。Ａ＼Ｂの領域の機能は、解明が始まった
ばかりであり；Ｃ領域は、ＤＮＡ結合ドメインをコード
し；Ｄ領域はちょうつがいの領域であり；Ｅ領域はリガ
ンド結合ドメインである。第８図は、ステロイドホルモ
ン受容体スーパーフアミリーのメンバーについてアミノ
酸配列を比較した模式図を示している。一次アミノ酸配
列は最もアミノ酸の類似性が高い領域に基づいて並べら
れており、ｈＧＲ（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら，（１９
８５）を参照）に関連した各々の位置に対してアミノ酸
の同一性をパーセントで表示している。示されているド
メインは；「最大活性」に必要とされるＮＨ２−末端の
ドメイン；６６−６８アミノ酸のＤＮＡ結合ドメインコ
ア（「ＤＮＡ」）；および２５０アミノ酸のリガンド結
合（あるいはホルモン結合ドメイン）（「ホルモン」）
である。各々のドメインの境界にあるアミノ酸の位置が
示されている。全ての受容体に対するアミノ酸の番号
は、ｖ−ｅｒｂ−ＡおよびＥ７５（セグレイブス（Ｓｅ
ｇｒａｖｅｒｓ），１９８８）を除いてヒト型を示して
いる。機能の帰属は、グルココルチコイドおよびエスト
ロゲン受容体の性質を調べることにより決定された。名
称は以下の通りである：ＧＲはグルココルチコイド受容
体；ＭＲはミネラロコルチコイド受容体；ＰＲはプロゲ
ステロン受容体；ＥＲはエストロゲン受容体；ＥＲＲ１
あるいはＥＲＲ２はエストロゲン関連体１または２；Ｖ
ＤＲビタミンＤ３受容体；およびＴ３ＲβとＴ３Ｒαは
チロイドホルモン受容体である。（＋）あるいは（−）
とは、特定の性質がクローン化した受容体ＤＮＡの産物
あるいは精製された受容体について示されるかを表わし
ている。ＨＲＥはホルモン応答性エレメントである。こ
れは、結合部位が構造的に同定されているか、またはこ
れがその促進性が遺伝子転移を行った研究によって示さ
れるかに関連している。ＰＲについては、ＤＮＡ結合性
は無傷の精製された受容体についてのみ示されている。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ ホルモン結合性」は、その性質が
ウサギの網状赤血球溶解物の系（ホレンバーグら，（１
９８５））で翻訳することにより示されるかどうかを示
している。「クロモソーム」は、ヒトのクロモソームの
位置を示している。種は、ｈ，ヒト；ｒ、ラット；ｍ、
マウス；ｃ、ニワトリ；ｄ、ショウジョウバエである。 第９図、キメラチロイド／グルココルチコイド受容体の
構造と活性。 第９図の方法。複合型受容体を構築するために、ｈＧＲ
とｈＴＲβのＤＮＡ結合ドメインに隣接して唯一のＮｏ
ｔＩおよびＸｈｏＩ部位が挿入された。複合体は、受容
体ｃＤＮＡの適当な部分を交換することにより作製され
た。「ＤＮＡ」はＤＮＡ結合ドメインを表わし；「Ｔ３
／Ｔ４」および「コルチゾル」はそれぞれｈＴＲβとｈ
ＧＲのリガンド結合ドメインを示している。箱の上の数
字はアミノ酸残基を表わしている。複合体はドメインの
起点に関連した文字によりつけられている；例えば、
「ＴＧＴ」はｈＴＲβのアミノおよびカルボキシ末端、
ならびにｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインを持っている。全
ての受容体に関し、Ｔ３および合成グルココルチコイド
・デキサメタゾン（「ｄｅｘ」）の非存在あるいは存在
下で、ＴＲＥ−ＭＣＡＴおよびＧＲＥ−ＭＣＡＴにおけ
るアッセイを行った。示されている全ての組合せは、バ
ックグラウンド以上に活性化を与えた。
【０００９】参考文献 本明細書は以下の出版物を引用しており、その各々はこ
の参考文献によって明確に取り入れられている。
【００１０】明細書の要約 上述の説明から、通常の当業者はこの発明がレチノイン
酸受容体タンパク質と呼ばれるレチノイド受容体タンパ
ク質をコードする、実質的に純粋なＤＮＡを与えること
を理解することができる。本発明はまた、レチノイン酸
受容体ＤＮＡを含むプラスミドを与える。このプラスミ
ド、すなわちｐｈＲＡＲ１は、特許取得の目的でアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されて
いる。本発明は、本発明のＤＮＡ（あるいはｍＲＮＡ）
から発現される、修飾された機能型のタンパク質を含む
レチノイン酸受容体タンパク質をもまた含んでいる。新
奇なレチノイン酸受容体ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質組
成物に加え、本発明は互いにｈＧＲ，ｈＭＲ，ｈＥＲＲ
１，ｈＥＲＲ２，Ｔ３Ｒα，Ｔ３Ｒβ，ＲＡＲαおよび
ＲＡＲβ受容体由来の（１）Ｎ−末端ドメイン、（２）
ＤＮＡ結合ドメイン、（３）リガンド結合ドメインを交
換することにより作製されたキメラ複合型受容体を含ん
でいる。このようにして構築されたキメラ受容体は、各
々が起因するところの「親」受容体が持つＤＮＡ結合ド
メインおよびリガンド結合ドメインの特徴に似た、ＤＮ
Ａ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインの性質を有
している。最後に、本発明は野生型およびキメラ型の受
容体タンパク質に対する、機能的リガンドを決定するバ
イオアッセイを含んでいる。本発明のｐｈＲＡＲ１ Ｄ
ＮＡは、その品質において以前は生産が不可能であった
ようなレチノイン酸受容体タンパク質および、その機能
的修飾を行った形のタンパク質を作るために用いること
ができる。これは、キメラ受容体に関しても当てはまる
ことである。本発明の結果得られる受容体タンパク質の
品質に関し、リガンド／受容体複合体およびリガンド／
受容体／ＨＲＥ複合体の両者について詳細な研究が可能
である。加えて、レチノイン酸受容体タンパク質を適切
に供給できるということは、現在では、それらをレチノ
イン酸受容体の拮抗物質、あるいはレチノイン酸受容体
に対する拮抗活性を有する化合物を検索するために用い
ることも可能であることを意味している。受容体タンパ
ク質が入手可能であるということは、種々の組織および
体液中に存在するレチノイン酸のレベルを決定する診断
のためのアッセイに、それらを用いることができること
を意昧している。本発明の精神および目的から離れるこ
となしに、或または通常の当業者は、本発明を種々の用
法および条件に適用するために、本発明に対し種々の変
更および修飾をすることが可能である。そのような場
合、これらの変更および修飾は、以下に示す請求の範囲
の同義の全域において適切でかつ正当であり、またその
ようになされるよう意図するものである。
【図面の簡単な説明】
以下に図面の簡単な説明を示す。より詳細な説明は、
“図面の詳細な説明”と題した部分で述べる。第１図
（ＡおよびＢ）はｐｈＲＡＲαのＤＮＡヌクレオチド配
列および一次タンパク質配列を示す図である。第１Ａ図
はｐｈＲＡＲαの成分構造を制限酵素切断部位と並べて
示した線状図である。第１Ｂ−１図、第１Ｂ−２図、第
１Ｂ−３図はｐｈＲＡＲαの全長のヌクレオチド配列お
よびその一次アミノ酸配列を示している。第２図（Ａお
よびＢ）は図とブロットから成っている。第２Ａ図はキ
メラ受容体ｈＲＧＲの構造の模式図である。第２Ｂ図は
レチノイン酸によるＣＡＴ活性の誘導を示すブロットで
ある。第３図（ＡおよびＢ）は二つのグラフから構成さ
れている。第３Ａ図はレチノイドに対する使用量依存性
を示すグラフである。第３Ｂ図はトランスフェクトされ
たＣＯＳ−１細胞の細胞質抽出液に対するレチノイン酸
結合を示す棒グラフである。第４図（ＡおよびＢ）はヒ
トゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を示している。第
４Ａ図は厳しい条件下でハイブリダイズさせた、消化さ
れたヒト胎盤ＤＮＡを示している；第４Ｂ図は同じＤＮ
Ａを厳しくない条件下でハイブリダイズさせたものを示
している。第５図はラットおよびヒト組織中のレチノイ
ン酸受容体ｍＲＮＡのノザンブロット分析を示してい
る。第６図は、ｈＧＲ、ｈＲＲ、およびｈＴ３Ｒβの比
較を示す模式図である。第７図は一般化したステロイド
／チロイド／レチノイン酸受容体遺伝子の模式図であ
る。第８図はステロイドホルモン受容体スーパーファミ
リーに含まれるもののアミノ酸比較を示す模式図であ
る。第９図はキメラチロイド／グルココルチコイド受容
体の構造および活性を示す模式図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年１０月２０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 レチノインレセプターの構成および方
法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は国立衛生研究所の研
究助成金のもとで政府の援助によってなされたものであ
る（助成金番号ＧＭ２６４４４）。
【０００２】本発明は、一般的には、リガンド反応性調
節タンパク質およびそれらをコードする遺伝子に関する
ものである。より詳細には、本発明はレチノイド関連調
節タンパク質およびそれらをコードする遺伝子、組み換
えＤＮＡなどの遺伝子工学技術によって上記およびその
他の調節タンパク質および遺伝子を修飾したもの、およ
び修飾されていないものと修飾されてたものの双方を含
むレチノイド関連調節タンパク質および遺伝子の使用に
関するものである。
【０００３】さらに、本発明は、リガンド反応性タンパ
ク質に対する機能的リガンドを同定するための新しい方
法に関するものである。本方法は、新しく発見された受
容体タンパク質に対する機能的リガンドを同定する場合
に特に有用である。ビタミンＡ関連モルフォゲン、レチ
ノイン酸が、新しく発見されたレチノイン酸受容体タン
パク質に対する機能的リガンドであることを示すことに
よって本方法は一部例示される。
【０００４】
【従来の技術】真核生物における中心的な問題は、ホル
モンや成長因子などの外来性誘導因子に反応して特異的
な遺伝子制御を媒介する分子および機構の説明を行うこ
とであり続けている。各機構の特異性に関してはまた学
ばねばならないことが多く残されてはいるものの、ホル
モンなどの外来性因子は細胞内受容体およびホルモン反
応性エレメントすなわちＨＲＥとして知られる個々のＤ
ＮＡを含む細胞内要素と協調して働くことによって遺伝
子の転写を調節することが知られている。
【０００５】さらに具体的には、グルココルチコイドお
よびチロイドホルモンのようなホルモンは促進された拡
散によって細胞に入ることが知られている。ホルモンが
次に特異的な受容体タンパク質に結合し、それによって
ホルモン／受容体複合体を作ることも知られている。ホ
ルモンの受容体への結合により、受容体タンパク質のア
ロステリック変化が開始されると考えられている。この
変化の結果として、ホルモン／受容体複合体がクロマチ
ンのＤＮＡ上の特異的部位に高親和性で結合できると考
えられている。
【０００６】ホルモン反応性エレメントすなわちＨＲＥ
を含むこのような部位は、本分野では様々な名前で呼ば
れているが、近くの標的遺伝子のプロモーターの発現
（ＲＮＡの転写）を調節している。
【０００７】ホルモンなどの外来性誘導因子による遺伝
子制御の特異性をさらに理解するための主要な障害は、
タンパク質の適切な解析を行うために十分な量および純
度の受容体タンパク質が入手できないことであった。こ
の欠乏のために、多様な体液や組織中の外来性誘導因子
（例えばホルモン）の存在を決定するための診断用アッ
セイにおける受容体の使用、およびキメラ受容体タンパ
ク質アナログを操作するための“プロトタイプ”として
の受容体の使用が妨げられて来た。
【０００８】受容体タンパク質が入手困難であることを
克服する努力がなされ、本出願の譲受人であるソーク生
物学研究所（ｔｈｅ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ）が受
託された、共に審査中の出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０８，
４７１号により、グルココルチコイド−、チロイド−、
ミネラロコルチコイド−、および新しいステロイド関連
受容体を含む多様な受容体タンパク質のクローン化され
た遺伝子が開示されている。Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０８，
４７１号はさらに、これらの分子の詳細な生化学的解析
を行い、別々のＤＮＡ結合領域およびリガンド結合領域
を受容体タンパク質が含むことを示した。（Ｕ．Ｓ．
Ｓ．Ｎ．１０８，４７１号の一部は出版されている；グ
ルココルチコイド受容体のクローニングとこの分子の各
領域に分ける解析に関する部分については、ホレンバー
グ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）他、（１９８５）、および
ギゲレ（Ｇｉｇｕｅｒｅ）他、（１９８６）；受容体に
関するその他の研究に関しては、ホレンバーグ（Ｈｏｌ
ｌｅｎｂｅｒｇ）他、（１９８７）、グリーン（Ｇｒｅ
ｅｎ）他、（１９８６）、グリーンとシャンボン（Ｃｈ
ａｍｂｏｎ）、（１９８７）、クマー（Ｋｕｍａｒ）
他、（１９８７）、ミースフェルド（Ｍｉｅｓｆｅｌ
ｄ）他、（１９８７）、およびエバンス（１９８８）を
参照のこと）。
【０００９】受容体の生化学的解析に関してはさらに、
ヒトグルココルチコイド受容体遺伝子の配列解析によ
り、トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）のガン遺伝子であ
るｖ−ｅｒｂ−Ａの産物と相同性があることが示された
（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）他、（１９
８５）参照）。このグループおよび別のグループは続い
て、ｖ−ｅｒｂ−Ａの細胞内相同体がβチロイドホルモ
ン受容体であることを示した（ワインバーガー（Ｗｅｉ
ｎｂｅｒｇｅｒ）他、（１９８６）、およびサップ（Ｓ
ａｐ）他、（１９８６）参照）。
【００１０】ステロイドホルモン受容体とチロイドホル
モン受容体のＤＮＡ結合領域が非常によく保存されてい
ることから、関連しているリガンド誘導性転写制御因子
に関してこの領域が特徴的なのだろうかという疑問が出
された。また、これらの領域をコードするＤＮＡ配列
を、関連しているが新しいリガンド反応性受容体に関し
てゲノムを検索するハイブリダイゼーション用プローブ
として使用可能だろうかという疑問も出された。この手
法により、ソーク研究所の我々のグループは、幾つかの
新しい遺伝子産物を同定した。Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０
８，４７１号に示されているように、一つはヒトアルド
ステロン受容体（ｈＭＲ，ＡＴＣＣ第６７２０１号）
（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０８，４７１号のこの部分の出版
物としては、アリザ（Ａｒｒｉｚａ）他、（１９８７）
参照）；二番目は、ラット中枢神経系で高レベルで発現
されている新しいチロイドホルモン受容体である（ｒＴ
Ｒα，ＡＴＣＣ第６７２８１号）Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０
８，４７１号のこの部分の出版物としては、トンプソン
（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）他、（１９８７）参照）。
【００１１】本開示は、ステロイドおよびチロイドホル
モン受容体のＤＮＡ結合領域およびリガンド結合領域と
相同性のある新しいレチノイド受容体タンパク質をコー
ドする、クローニングされた全長のｃＤＮＡの分離と解
析を示している。さらに、グルココルチコイド、ミネラ
ロコルチコイド、チロイド、エストロゲン関連、および
レチノイン酸受容体の間の機能領域を交換（“ｓｗａｐ
ｐｉｎｇ”）することによって作成されたキメラ受容体
の構築と解析についても述べている。これらのキメラ受
容体は、キメラ中に取り込まれた“親の”ＤＮＡ結合領
域およびリガンド結合領域の“起源”に基づいたハイブ
リッド機能特性を有する。例えば、キメラ受容体のＤＮ
Ａ結合領域がレチノイン酸受容体のＤＮＡ結合領域であ
れば（すなわち野生型レチノイン酸受容体から得られた
ものであるか、レチノイン酸ＤＮＡ結合領域の機能的要
素を含む変異体である場合）、キメラはレチノイン酸受
容体のＤＮＡ結合特性を有することになる。リガンド結
合領域に関しても同様である。キメラ受容体中のリガン
ド結合領域がチロイドホルモンに結合する場合には、キ
メラはチロイドホルモン受容体の持つリガンド結合特性
を有することになる。
【００１２】本開示はまた、リガンド反応性受容体タン
パク質に対する機能的リガンドを同定するための新しい
方法を示すものである。本方法は、（１）レチノイド、
レチノイン酸およびその代謝前駆体、レチノールが新し
く発見された受容体タンパク質に対する機能的リガンド
であること、（２）ＤＮＡ結合領域およびリガンド結合
領域がキメラ受容体の機能特性を決定すること、を示す
ことにより例示される。
【００１３】
【課題を解決するための手段】定義 本明細書および請求の範囲において、ここで用いるため
に以下のように特に定義される技術用語が参照される。
【００１４】ここで用いる場合、一般的な語“レチノイ
ド”はレチノイン酸、ビタミンＡ（レチノール）およ
び、多様な系で発生と分化に重要な影響を及ぼすことの
できる一連の天然および合成誘導体を含む化合物群を意
味する。
【００１５】ここで用いる場合、生物種は以下のように
同定される：ｈ，ヒト；ｒ，ラット；ｍ，マウス；ｃ，
ニワトリ；およびｄ，ドロソフィラ（ショウジョウバ
エ）。
【００１６】ここで用いる場合、“ステロイドホルモン
受容体スーパーファミリー”とは、グルココルチコイ
ド、ミネラロコルチコイド、プロゲステロン、エステロ
ゲン、エステロゲン関連、ビタミンＤ3、チロイド、Ｖ
−ｅｒｂ−Ａ、レチノイン酸、およびＥ７５（ショウジ
ョウバエ）受容体からなる関連した受容体群を意味する
ものである。エバンス（１９８８）、およびそこで引用
されている参考文献参照。
【００１７】ここで用いる場合、ＲＲおよびＲＡＲはと
もにレチノイン酸受容体を意味する。かしら文字、ｈＲ
ＲおよびｈＲＡＲは、ヒトレチノイン酸受容体を意味す
る。ｐｈＲＡＲαと呼ばれるＤＮＡはヒトレチノイン酸
受容体αをコードする。ｈＲＡＲαはＡＴＣＣ 第４０
３９２号として寄託されているｐｈＲＡＲ１によってコ
ードされている。ｈＲＡＲβと呼ばれるＤＮＡはヒトレ
チノイン酸受容体βをコードする。ブランド（Ｂｒａｎ
ｄ）他（１９８８）参照。ここで用いる場合、ＧＲはグ
ルココルチコイド受容体を意味する。ｈＧＲと呼ばれる
ＤＮＡはヒトグルココルチコイド受容体ＧＲをコードす
る。ｈＧＲはＡＴＣＣ 第６７２００号として寄託され
ているｐＲＳｈＧＲによってコードされている。
【００１８】ここで用いる場合、ＭＲはミネラロコルチ
コイド受容体を意味する。ｈＭＲと呼ばれるＤＮＡはヒ
トミネラロコルチコイド受容体ＭＲをコードする。ｈＭ
ＲはＡＴＣＣ第６７２０１号として寄託されているｐＲ
ＳｈＭＲによってコードされている。
【００１９】ここで用いる場合、ＴＲはチロイド受容体
を意味する。ＴＲαおよびＴＲβはチロイド受容体のα
型およびβ型を意味する。ｃ−ｅｒｂ−Ａ，ｈｅｒｂ−
Ａ８．７、ｐｅＡ１０１、ｒｂｅＡ１２、およびｈＦＡ
８と呼ばれるＤＮＡはすべてチロイド受容体をコードす
るものである。プラスミドｐｈｅｒｂ−Ａ ８．７はｈ
ＴＲαをコードする；これは特許目的のために寄託さ
れ、ＡＴＣＣ第４０３７４号として登録されている。プ
ラスミドｐｅＡ１０１はｈＴＲβをコードしている；こ
れは特許目的のために寄託され、ＡＴＣＣ第６７２４４
号として登録されている。プラスミドｒｂｅＡ１２はｒ
ＴＲαをコードする；これは特許目的のために寄託さ
れ、ＡＴＣＣ第６７２８１号として登録されている。プ
ラスミドｐｈＦＡ８はクローンの“リガンド結合”領域
に欠失をもつ、ｈＴＲαの部分的クローン（すなわち、
受容体タンパク質のカルボキシ末端をコードするＤＮ
Ａ）をコードしている。プラスミドｐｈＦＡ８はＡＴＣ
Ｃ第４０３７２号として登録されている。
【００２０】ここで用いる場合、ＥＲＲはエストロゲン
関連受容体を意味する。ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２の
頭文字は、ヒトエストロゲン関連受容体１および２であ
ることを意味する。これらの受容体はチロイド受容体よ
りもステロイド受容体により近いが、既知のステロイド
ホルモンのどの主要なクラスにも結合しない（キゲレ
（Ｇｉｇｕｅｒｅ）他、１９８８）。ｈＥＲＲ１はプラ
スミドｐＥ４およびｐＨＫＡにコードされており、これ
はそれぞれＡＴＣＣ第６７３０９号および第６７３１０
号として寄託されている。（ｐＥ４もｐＨＫＡも完全な
クローンではない；ｈＥＲＲ１は両方のクローン由来の
断片を結合して構築された）。ｈＥＲＲ２はプラスミド
ｐｈＨ３にコードされており、ＡＴＣＣ第４０３７３号
として寄託されている。
【００２１】ここで用いる場合、ＶＤＲはビタミンＤ3
受容体を意味する。
【００２２】ここで用いる場合、ＭＴＶは乳癌ウイルス
を意味する；ＭＭＴＶはマウス乳癌ウイルスを意味す
る。
【００２３】ここで用いる場合、ＲＳＶはラウス肉腫ウ
イルスを意味する；ＳＶはサルウイルスを意味する。
【００２４】ここで用いる場合、ＣＡＴは、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼを意味する。
【００２５】ここで用いる場合、ルシフェラーゼはホタ
ルのルシフェラーゼを意味する。Ｉ．Ｒ．デ・ウエット
（ｄｅ Ｗｅｔ）、Ｋ．Ｖ．ウッド（Ｗｏｏｄ）、Ｍ．
デルカ（ＤｅＬｕｃａ）、Ｄ．Ｒ．ヘリンスキ（Ｈｅｌ
ｉｎｓｋｉ）、およびＳ．スブラマニ（Ｓｕｂｒａｍａ
ｎｉ）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７
３７（１９８７）参照。
【００２６】ここで用いる場合、ＣＯＳはＴ抗原（Ｔａ
ｇ）を発現しているサル腎臓細胞を意味する。グルツマ
ン（Ｇｌｕｚｍａｎ）、Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９
８１）参照。ＣＯＳ細胞は受容体欠損細胞であり、本発
明の機能的リガンド同定アッセイに有用なものである。
【００２７】ここで用いる場合、ＣＶ−１は“ＣＶ−
１”と呼ばれる細胞系由来のマウス腎臓細胞を意味す
る。ＣＶ−１はＣＯＳの親系である。ＳＶ４０ Ｔ抗原
（Ｔａｇ）を発現するように形質転換されているＣＯＳ
細胞とは異なり、ＣＶ−１細胞はＴ抗原を発現しない。
ＣＶ−１細胞は、本発明の機能的リガンド同定アッセイ
にも有用な受容体欠損細胞である。
【００２８】ここで用いる場合、“ホルモン反応性要
素”または“ＨＲＥ”、“転写調節ユニット”、“ホル
モン反応性プロモーター／エンハンサー要素”、“エン
ハンサー様ＤＮＡ配列”、および“転写刺激を媒介する
ＤＮＡ配列”などの一般的な技術用語は、すべて同一物
を意味しており、すなわち、転写のホルモン（またはリ
ガンド）による活性化に必要なｃｉｓに働く配列（約２
０塩基対）である。これらの要素をホルモン非反応性遺
伝子に接続することにより、その遺伝子がホルモン反応
性となる。これらの配列はホルモン反応性要素またはＨ
ＲＥとして最もよく呼ばれており、位置および向きに関
係無く機能する。他のエンハンサーとは異なり、ＨＲＥ
の活性はリガンドの存在の有無に依存する。（エバンス
（１９８８）およびそこで引用されている参考文献参
照。）本明細書および請求の範囲においては、“ホルモ
ン反応性要素”という語を、これらの配列を記述するた
めに本分野で用いられるすべての語によって示唆される
機能的特性を意味し、具体化するために一般的な意味で
用いられる。
【００２９】ここで用いる場合、合成ＨＲＥとは、自動
ヌクレオチド合成機を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され
たＨＲＥを意味する。ＨＲＥはわずか約２０ｂｐなの
で、この方法で容易に合成することができる。操作され
た、あるいは合成の野生型ＨＲＥがホルモン非反応性プ
ロモーターに連結されると、これらのプロモーターはホ
ルモン反応性となる。エバンス（１９８８）およびそこ
で引用されている文献参照。
【００３０】ここで用いる場合、頭文字ＧＲＥはグルコ
コルチコイド受容体反応性要素を、ＴＲＥはチロイド受
容体反応性要素を意味する。ＧＲＥはＧＲとの相互作用
によるグルココルチコイド反応性を与えるホルモン反応
性要素である。ペイバー（Ｐａｙｖａｒ）他、Ｃｅｌ
ｌ，３５：３８１（１９８３）、およびシーデライト
（Ｓｃｈｉｅｄｅｒｅｉｔ）他、Ｎａｔｕｒｅ，３０
４：７４９（１９８３）参照。ＧＲＥは、ＤＮＡ結合領
域がＧＲＥと機能的に結合できる（すなわち、活性化で
きる）ものであるいかなる野生型またはキメラ受容体と
も使用可能である。例えば、ＧＲ、ＭＲ、およびＰＲ受
容体は全てＧＲＥを活性化することができ、ＧＲ、Ｍ
Ｒ、またはＰＲ型のＤＮＡ結合領域を有するいかなる野
生型またはキメラ受容体ともＧＲＥを使用することがで
きる。ＴＲＥは、ＴＲとの相互作用によるチロイドホル
モン反応性を与えることを除いては、ＧＲＥと同様であ
る。ＴＲＥは、ＤＮＡ結合領域が機能的にＴＲＥと結合
できる（すなわち活性化できる）ようないかなる野生型
またはキメラ受容体とも使用可能である。ＴＲおよびＲ
Ｒ受容体はＴＲＥを活性化することができ、したがっ
て、ＴＲまたはＲＲ型のＤＮＡ結合領域を有するいかな
る受容体ともＴＲＥを使用可能である。
【００３１】ここで用いる場合、リガンドとはホルモン
または成長物質などの誘導因子を意味する。細胞内で、
リガンドは受容体タンパク質に結合し、それによってリ
ガンド／受容体複合体を形成し、それが適当なホルモン
反応性要素に結合することができる。単一のリガンドが
複数の受容体を持つこともある。Ｔ3ＲαおよびＴ3Ｒβ
はいずれもＴ3などのチロイドホルモンと結合する。
【００３２】ここで用いる場合、”リガンド反応性プロ
モーターおよび有効なレポーター遺伝子に機能的に連結
している有効なホルモン反応性要素”という語句中の
“有効な”という語は、それぞれのＤＮＡ配列（“ホル
モン反応性要素”、“リガンド反応性プロモーター”、
および“レポーター遺伝子”という語で表される）が作
用可能である、すなわち、ホルモン反応性要素が受容体
タンパク質（野生型またはキメラ）のＤＮＡ結合領域と
結合可能であること、リガンド反応性プロモーターがレ
ポーター遺伝子の転写調節を行えること（ＨＲＥ／受容
体タンパク質／リガンド複合体による適当な活性化によ
る）、およびレポーター遺伝子が宿主細胞で発現され得
ることを意味する。“機能的に連結する”という語句
は、ＤＮＡ断片が連結された場合に適当な活性化によっ
てレポーター遺伝子（例えばＣＡＴまたはルシフェラー
ゼ）が発現されることを意味する。この発現は、“リガ
ンド反応性プロモーター”（ホルモン反応性要素の下流
であり、適当なリガンド／受容体タンパク質複合体にＨ
ＲＥが結合すると“活性化”され、その結果レポーター
遺伝子の転写を“調節”する）が“オンの状態とな
る”、あるいは、ホルモン反応性要素にリガンド／受容
体タンパク質複合体が結合した結果として活性化された
ものである。
【００３３】ここで用いる場合、受容体の“ＤＮＡ結合
領域”という語句は、クロマチンＤＮＡ上のＨＲＥ部位
に結合する受容体タンパク質（グルココルチコイド受容
体、チロイド受容体、ミネラロコルチコイド受容体、エ
ステロゲン関連受容体、およびレチノイン酸受容体）の
その部分を呼ぶものである。これらのＤＮＡ結合領域に
対する結合は、ステロイドホルモンスーパーファミリー
に関して同定され、解析された。図１１および１２、お
よびギゲレ他（１９８６）；ホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅ
ｎｂｅｒｇ）他、（１９８７）；グリーンとシャンボン
（１９８７）；およびミースフィールド（Ｍｉｅｓｆｉ
ｅｌｄ）他（１９８７）、エバンス（１９８８）参照。
【００３４】多様なステロイドホルモンスーパーファミ
リー受容体に関するＤＮＡ結合領域に対する結合を図１
１および１２に示す；結合は以下に示すものである： −ｈＧＲ（ｐＲＳｈＧＲ）：ヌクレオチド１３９３〜１５９０ アミノ酸４２１〜４８６（ＡＴＣＣ ＃６７２００参照） −ｈＴＲｂ（ｐｅＡ１０１）：ヌクレオチド６０４〜８０７ アミノ酸１０２〜１６９（ＡＴＣＣ ＃６７２４４参照） −ｈＴＲａ （ｐｈｅｒｂ−Ａ ８．７）：ヌクレオチド１６８〜３７２ アミノ酸５０〜１１７（ＡＴＣＣ ＃４０３７４参照） アミノ酸２９１〜３５８（ＡＴＣＣ ＃６７２８１参照） −ＥＲＲ１ （ｐＥ４ ＆ ｐＨＫＡ）：アミノ酸１７６〜２４１ （ＡＴＣＣ ＃６７３０９＆ ＃６７３１０参照） −ＥＲＲ２（ｐｈＨ３）：アミノ酸１０３〜１６８ （ＡＴＣＣ ＃４０３７３参照） −ｈＭＲ（ｐＲＳｈＭＲ）：ヌクレオチド２０２９〜２２２６ アミノ酸６０３〜６６８（ＡＴＣＣ ＃６７２０１参照） −ｈＲＡＲａ（ｐｈＲＡＲ１）：ヌクレオチド３６４〜５６１ アミノ酸８８〜１５３（ＡＴＣＣ ＃４０３９２参照） 受容体のステロイドホルモンスーパーファミリーのＤＮ
Ａ結合領域は６６から６８アミノ酸のアミノ断片からな
る。この断片は９個のシステイン残基を含み、そのうち
の一つが断片の最初のアミノ酸である。この最初のＣｙ
ｓ残基から Ｃｙｓ−Ｘ2−Ｃｙｓ−Ｘ13−Ｘ15−Ｃｙｓ−Ｘ2−Ｃｙ
ｓ （ここでＸはいかなるアミノ酸残基でもよい）と記述さ
れるモチーフが開始される。ＤＮＡ結合領域は常にアミ
ノ酸Ｇｌｙ−Ｍｅｔで終わる。
【００３５】クローニング法の簡便のために、ＤＮＡ結
合領域の前および／または後の１〜６アミノ酸をＤＮＡ
結合領域とともに転換することも可能である。
【００３６】ここで用いる場合、受容体の“リガンド結
合領域”という語句は成長因子またはホルモンなどのリ
ガンドに結合する、受容体タンパク質の部分に関するも
のである。ステロイド受容体スーパーファミリーに対す
るリガンド結合領域のこれらの結合が同定され、解析さ
れた。図１１および１２およびエバンス（１９８８）参
照。
【００３７】多様な受容体のリガンド結合領域が図１１
および１２に示されている；該領域の幾つかを以下に示
す： −ｈＧＲ（ｐＲＳｈＧＲ）：アミノ酸５２８〜７７７
（ＡＴＣＣ ＃６７２００参照） −ｈＴＲｂ（ｐｅＡ１０１）：アミノ酸２３２〜４５６
（ＡＴＣＣ ＃６７２４４参照） −ｈＴＲａ（ｐｈｅｒｂ−Ａ８．７）： アミノ酸１８
３〜４１０（ＡＴＣＣ ＃４０３７４参照） −ｒＴＲ（ｒｂｅＡ１２）：アミノ酸４２１〜６３９
（ＡＴＣＣ ＃６７２８１参照） −ＥＲＲ１（ｐＥ４ ＆ ｐＨＫＡ）：アミノ酸２９５
〜５２１（ＡＴＣＣ ＃６７３０９参照） −ＥＲＲ２（ｐｈＨ３）：アミノ酸２１２〜４３３（Ａ
ＴＣＣ ＃４０３７３参照） −ｈＭＲ（ｐＲＳｈＭＲ）：アミノ酸７３４〜９８４
（ＡＴＣＣ ＃６７２０１参照） −ｈＲＡＲａ（ｐｈＲＡＲ１）：アミノ酸１９８〜４６
２（ＡＴＣＣ ＃４０３９２参照） 受容体間の機能的領域の交換を可能にするために、受容
体ｃＤＮＡクローンに共通の制限エンドヌクレアーゼ部
位を導入しなければならない。図１１および１２に示し
た多様な受容体のいずれにおいても、ＤＮＡ結合領域の
直前に第一の共通部位を導入し、直後に第二の共通部位
を導入することが可能である。（例えば、図１１および
１２に示した受容体のステロイドホルモンスーパーファ
ミリーのいずれにおいても、ＤＮＡ結合領域の直前に単
独のＮｏｔＩ部位を導入し、直後に単独のＸｈｏＩ位を
導入することが出来る。これにより受容体は３つの機能
的領域または“カセット”に分割される；（１）Ｎ末端
カセット、（２）ＤＮＡ結合領域カセット、（３）リガ
ンド結合領域カセット。どの受容体由来の３つの領域ま
たはカセットは別の受容体由来のカセットと組み合わせ
て多様なキメラ受容体を作成することができる。
【００３８】ここで用いる場合、キメラ受容体を同定す
るために用いた命名法は以下のようである：可変性機能
領域（Ｎ末端、ＤＮＡ結合領域、およびリガンド結合領
域）は、それらの元となった“親”受容体によって同定
される。例えば、ＧＲ由来の領域は“Ｇ”領域である；
ＴＲ領域は“Ｔ”領域である（そうでなければさらに
“Ｔａ”または“Ｔｂ”領域として特定される）；ＭＲ
領域は“Ｍ”領域である；ＲＡＲ領域は“Ｒ”領域であ
る（もしくは、さらに“Ｒａ”または“Ｒｂ”として特
定される）；またＥＲＲ領域は“Ｅ”領域である（もし
くは、さらに“Ｅ1”または“Ｅ2”領域として特定され
る）。この表記法によれば、特定しない限り、“Ｔ”は
一般的にＴ3ＲαまたはＴ3Ｒβ受容体のどちらかを意味
する；“Ｅ”はｈＥＲＲ１またはｈＥＲＲ２のどちらか
を意味する；また、“Ｒ”はＲＡＲαまたはＲＡＲβ受
容体のどちらかを意味する。野生型受容体はいかなる交
換領域も含まないので、この表記系にしたがうと、Ｇ−
Ｇ−Ｇ（またはＧＧＧ）、Ｔａ−Ｔａ−Ｔａ（またはＴ
ａＴａＴａ）、Ｔb−Ｔb−Ｔb（またはＴbＴbＴb）、Ｍ
−Ｍ−Ｍ（またはＭＭＭ）、Ｒａ−Ｒａ−Ｒａ（または
ＲａＲａＲａ）、Ｒb−Ｒb−Ｒb（またはＲbＲbＲb）、
Ｅ1−Ｅ1−Ｅ1またはＥ2−Ｅ2−Ｅ2として同定され、こ
こで最初に示される領域はＮ末端領域、中央の領域はＤ
ＮＡ結合領域、および最後の領域はリガンド結合領域で
ある。いかなるキメラ受容体も少なくとも二つの野生型
または親受容体由来の機能領域を持つことになる。例え
ば、キメラ受容体ＧＧＲａはグルココルチコイド受容体
由来のＮ末端およびＤＮＡ結合領域を持ち、グルココル
チコイド受容体由来のＤＮＡ結合領域、およびαレチノ
イン酸受容体由来のリガンド結合領域を有する；ＧＴａ
Ｒbはグルココルチコイド受容体由来のＮ末端、チロイ
ド受容体α由来のＤＮＡ結合領域、およびレチノイン酸
受容体β由来のリガンド結合領域を有する。
【００３９】ここで用いる場合、ｈＧＲNX、ｈＴＲ
βNX、およびｈＲＲNXは、受容体のＤＮＡ結合領域の境
界に隣接してＮｏｔ１とＸｈｏ１の単一の切断部位を含
むように操作したｈＧＲ、ｈＴＲβ、およびｈＲＲ受容
体を意味する。これらの変異受容体は、ｈＧＲ、ｈＭ
Ｒ、ｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ２，ｈＴＲα，ｈＴＲβ，ｒ
ＴＲα，ｒＲＡＲα，ｒＲＡＲβ由来のアミノ末端、Ｄ
ＮＡ結合領域、およびリガンド結合領域のすべての可能
な組み合わせから成るハイブリッド受容体の構築を例示
するものである。
【００４０】ここで用いる場合、サザンブロット分析
は、変性させたＤＮＡをアガロースゲルから、相補的な
核酸とハイブリダイズさせることができるニトロセルロ
ースフィルターに転移させる方法を意味する。
【００４１】ここで用いる場合、ノザンブロット分析と
は、ＲＮＡをアガロースゲルから、相補的なＤＮＡにハ
イブリダイズさせることができるニトロセルロースフィ
ルターに転移させる方法を意味する。
【００４２】ここで用いる場合、本発明の“変異体”Ｄ
ＮＡとは、“野生型”あるいは操作していない配列とは
異なるように遺伝学的に操作したＤＮＡを意味する。こ
のような遺伝子操作には、野生型配列への新しいヌクレ
オチドの挿入、野生型配列からのヌクレオチドの削除、
野生型配列中のヌクレオチドの置換、または受容体間の
機能的領域の“交換（ｓｗａｐｐｉｎｇ）”が含まれ
る。機能的領域をある受容体から別の受容体のものに交
換することによって操作された受容体もキメラ受容体あ
るいはハイブリッド受容体と呼ばれる。キメラ受容体は
さらに、新しいヌクレオチド、ヌクレオチドの欠失、ヌ
クレオチドの置換などを含む。
【００４３】本明細書および請求の範囲における“実質
的な配列相同性”という語の使用は、ここで開示され、
請求される実際の配列と比較してわずかな、重大でない
配列の変化しか起こっていないＤＮＡ、ＲＮＡ、または
アミノ酸配列が、添付された請求の範囲に含まれること
を意図していることを示す。この語句の中で、“わずか
な、重大でない“配列変化とは、相同な配列がここで開
示し、請求する核酸およびアミノ酸構造と実質的に同様
に機能して実質的に同じ構造を産生することを意味す
る。
【００４４】ここで用いる場合、“組み換え的に生産さ
れる“という語句は、単に天然物から生成されたのでは
なく、遺伝子組み換え技術を用いて作成されたことを意
味する。
【００４５】ここに現れる多様なアミノ酸配列を構成す
るアミノ酸は、以下に示す３文字または１文字略号によ
って同定される。
【００４６】アミノ酸 ３文字略号 １文字略号 Ｌ−アラニン Ａｌａ Ａ Ｌ−アルギニン Ａｒｇ Ｒ Ｌ−アスパラギン Ａｓｎ Ｎ Ｌ−アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ Ｌ−システイン Ｃｙｓ Ｃ Ｌ−グルタミン Ｇｌｎ Ｑ Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ Ｌ−ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ Ｌ−イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ Ｌ−ロイシン Ｌｅｕ Ｌ Ｌ−リジン Ｌｙｓ Ｋ Ｌ−メチオニン Ｍｅｔ Ｍ Ｌ−フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ Ｌ−プロリン Ｐｒｏ Ｐ Ｌ−セリン Ｓｅｒ Ｓ Ｌ−スレオニン Ｔｈｒ Ｔ Ｌ−トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ Ｌ−チロシン Ｔｙｒ Ｙ Ｌ−バリン Ｖａｌ Ｖ ここに現れる多様な核酸配列を構成するヌクレオチド
は、本分野で通常用いられている１文字略号（Ａ，Ｇ，
Ｔ，Ｃ，またはＵ）を有する。
【００４７】ここで用いる場合、ｂｐとは塩基対を、ｋ
ｂはキロ塩基対を意味する。
【００４８】本明細書および請求の範囲において、ギリ
シャ文字アルファ（α）、ベータ（β）などは、しばし
ばａ、ｂなどと示される。
【００４９】寄託 プラスミドｐＲＳｈＧＲ（ｈＧＲ），ｐＲＳｈＭＲ（ｈ
ＭＲ），ｐｅＡ１０１（ｈＴ3β）およびＧＭＣＡＴ
は、すべて大腸菌ＨＢ１０１株に入っており、また、ｒ
ｅｂＡ１２（ｒＴＲα），ｐＥ４およびｐｈｋＡ（とも
にｈＥＲＲ１をコードする）、ｐｈＨ３（ｈＥＲＲ
２），ｐｈｅｒｂ−Ａ ８．７（ｈＴＲα），ｐｈＦＡ
８（ｈＴＲαの部分的クローン）、およびプラスミドｐ
ｈＲＡＲ１は、米国メリーランド州ロックビルのアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）
に、特許技術目的の微生物寄託の国際認識に関するブダ
ペスト条約および本条約の下に公布されている条例に基
づいて寄託されている。該条約および条例、もしくは米
国および本出願または本出願の優先権を請求する出願が
提出されるか、このような出願が認められるいかなる特
許も認められるそのほかの国や国際組織の特許法および
条例にしたがって、プラスミド試料は法的に受け取る資
格がある産業所有権局などの者が入手することができ
る。
【００５０】ＡＴＣＣ寄託番号および寄託年月日を以下
に示す： ｐＲＳｈＧＲ（ｈＧＲ） ６７２００ １９８６．９．９ ｐＲＳｈＭＲ（ｈＭＲ） ６７２０１ １９８６．９．９ ｐＥ４（ｈＥＲＲ１＊） ６７３０９ １９８７．１．３０ ｐｈＨＫＡ（ｈＥＲＲ１＊） ６７３１０ １９８７．１．３０ ｐｈＨ３（ｈＥＲＲ２） ４０３７３ １９８７．９．２９ ＧＭＣＡＴ（レポーター） ６７２８２ １９８６．１２．１８ ｐｈｅｒｂ−Ａ ８．７（ｈＴＲａ） ４０３７４ １９８７．９．２７ ｐｈＦＡ ８（ｈＴＲａ＊） ４０３７２ １９８７．９．２７ ｐｅＡ１０１（ｈＴＲｂ） ６７２４４ １９８６．１０．２２ ｐｒｂｅＡ１２（ｒＴＲａ） ６７２８１ １９８６．１２．１８ ｐｈＲＡＲａ（ｈＲＡＲａ） ４０３９２ １９８７．１１．２０ （＊は部分的クローンを意味する。） （ｐＥ４ ＆ ｐｈＨＫＡはともに完全なｈＥＲＲ１をコードする。）発明の概要 一つの局面においては、本発明は、ここではヒトレチノ
イン酸受容体タンパク質と呼ぶレチノイド受容体タンパ
ク質に特徴的なリガンド結合能およびＤＮＡ結合能（ま
たは転写活性化能）を有するタンパク質の一次配列をコ
ードするトリプレットの配列、断片のプラス鎖またはセ
ンス鎖が含んでいるような二本鎖ＤＮＡを含むものであ
る。本発明のこの局面によれば、二本鎖ＤＮＡ断片は、
レチノイン酸受容体タンパク質を発現できるものであ
る。
【００５１】別の局面においては、本発明は、レチノイ
ン酸受容体タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡのセン
ス鎖である一本鎖ＤＮＡ、およびこの二本鎖ＤＮＡの転
写によって産生されるＲＮＡを含むものである。
【００５２】別の局面においては、本発明は、本発明の
レチノイン酸受容体タンパク質（ＲＡＲα）をコードす
るＤＮＡを含むプラスミドｐｈＲＡＲ１を含む。このプ
ラスミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンに特許目的のために寄託されている；これはＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．４０３９２として登録されている。
【００５３】さらに別の局面においては、本発明はレチ
ノイン酸受容体タンパク質をコードするＤＮＡでトラン
スフォームした細胞、望ましくは哺乳動物細胞を含む。
本発明の本局面によれば、トランスフォームするＤＮＡ
は細胞内で発現されることが可能であり、それによって
このＤＮＡにコードされているレチノイン酸受容体の細
胞内の量を増加させる。
【００５４】本発明はさらに、レチノイン酸受容体をコ
ードするＤＮＡの発現によって産生またはこのようなレ
チノイン酸受容体をコードするＤＮＡから転写されたｍ
ＲＮＡの翻訳によって産生された新しいレチノイン酸受
容体を含む。本発明の本局面によれば、レチノイン酸受
容体は、“修飾されていない”レチノイン酸受容体をコ
ードするＤＮＡおよびｍＲＮＡのタンパク質産物である
か、受容体ＤＮＡ配列中に導入された変異の結果とし
て、対応する天然の“野生型”レチノイン酸受容体タン
パク質とひとつ以上のアミノ酸配列中の違いを有するも
のである、修飾された、あるいは遺伝子操作されたレチ
ノイン酸受容体タンパク質産物である。これらのレチノ
イン酸受容体は、“修飾されていない”か“操作されて
いる”かにかかわらず、対応する天然レチノイン酸受容
体の少なくとも約５％のレチノイン酸結合活性および／
または少なくとも約５％のＤＮＡ結合または転写活性化
活性を有することが望ましい。
【００５５】本発明はさらに、別の型の機能的領域を持
つひとつの受容体の機能的領域を交換することによって
作成されたキメラ受容体を含む。このように産生された
キメラＤＮＡはそれらのそれぞれＤＮＡ結合領域および
リガンド結合領域の“元”に基づく機能的特性を有する
キメラ受容体タンパク質をコードする。本発明のキメラ
受容体は、キメラ受容体をコードする二本鎖ＤＮＡ、お
よび二本鎖ＤＮＡのセンス鎖である一本鎖ＤＮＡ、およ
び二本鎖ＤＮＡの転写によって産生されたｍＲＮＡを含
む。本発明はまた、本発明のキメラ受容体をコードする
ＤＮＡで形質転換された細胞、真核細胞および原核細胞
を含む、を含むものである。
【００５６】本発明のキメラ受容体の局面によれば、キ
メラＤＮＡ融合を行うために、３つの機能的領域に受容
体ＤＮＡを分けるために、ＤＮＡ結合領域の中または近
傍の各受容体ｃＤＮＡの相同な位置に二つの制限エンド
ヌクレアーゼ部位を導入する。（例えば、単一のＮｏｔ
Ｉ部位をＤＮＡ結合領域の直前に導入し、単一のＸｈｏ
Ｉ部位をＤＮＡ結合領域の直後に導入することができ
る。これにより受容体は３つの機能的領域すなわち“カ
セット”に分けられる；（１）Ｎ末端カセット、（２）
ＤＮＡ結合領域カセット、および（３）リガンド結合領
域カセットである。どの受容体由来の３つの領域または
カセットでも別の受容体由来のカセットと結合させて多
様なキメラ受容体を作成することが可能である。本発明
のこの局面は、明細書の“発明の詳細な説明”と題した
部分で例示される。） 本明細書および請求の範囲においては、キメラ受容体
（キメラまたはハイブリッドとも呼ばれる）は、多様な
領域の由来を示す文字によって命名される。ｈＧＲ由来
の領域は“Ｇ”領域と呼ばれ、ｈＴＲ由来の領域は
“Ｔ”領域と呼ばれ、ｈＥＲＲ由来の領域は“Ｅ”、ｈ
ＲＲ由来の領域は“Ｒ”領域と呼ばれる。例えば、キメ
ラ受容体“ＲＧＲ”はｈＲＲのアミノ末端およびカルボ
キシル末端を持ち、ｈＧＲのＤＮＡ結合領域を有する；
キメラ受容体“ＴＧＧ”はｈＴＲ由来のアミノ末端、ｈ
ＧＲ由来のＤＮＡ結合領域およびカルボキシル末端を有
する。（図１０に示した図においては、受容体のアミノ
末端は領域 Ａ／Ｂとして示され、カルボキシル末端は
領域Ｅとして示されている。） 本明細書および請求の範囲で用いた命名法によれば、特
に述べない限り、“Ｔ”は一般にＴ3ＲαまたはＴ3Ｒβ
受容体のいずれかを意味する；“Ｅ”は ｈＥＲＲ1ま
たはｈＥＲＲ2を意味する；また、“Ｒ”はＲＡＲαま
たはＲＡＲβ受容体のいずれかを意味する。本発明のキ
メラ受容体は、（１）ｈＧＲ，ｈＭＲ，ｈＥＲＲ1，ｈ
ＥＲＲ2，ｒＴＲα，ｈＴ3α，ｈＴ3β，ｈＲＡＲα，
およびｈＲＡＲβからなる野生型受容体群から選択され
たＮ末端領域、（２）ｈＧＲ，ｈＭＲ，ｈＥＲＲ1，ｈ
ＥＲＲ2，ｒＴＲα，ｈＴ3α，ｈＴ3β，ｈＲＡＲα，
およびｈＲＡＲβからなる野生型受容体群から選択され
たＤＮＡ結合領域、（３）ｈＧＲ，ｈＭＲ，ｈＥＲ
Ｒ1，ｈＥＲＲ2，ｒＴＲα，ｈＴ3α，ｈＴ3β，ｈＲＡ
Ｒα，およびｈＲＡＲβからなる野生型受容体群から選
択されたリガンド結合領域を有するキメラを含み、それ
において、どのキメラ受容体も少なくとも２つの異なる
“野生型受容体”源に由来するＮ末端領域、ＤＮＡ結合
領域、およびリガンド結合領域を有する。
【００５７】本発明の望ましいキメラ受容体ＤＮＡとし
ては、ＧＲＲ，ＧＲＧ，ＧＧＲ，ＲＧＧ，ＲＧＲ，ＲＲ
Ｇ，ＧＴＴ，ＧＴＧ，ＧＧＴ，ＴＧＧ，ＴＧＴ，ＴＴ
Ｇ，ＴＴＲ，ＴＲＴ，ＴＲＲ，ＲＴＴ，ＲＴＲ，ＲＲ
Ｔ，ＧＴＴ，ＧＴＧ，ＧＧＴ，ＴＧＧ，ＴＧＴ，および
ＴＴＧ受容体ＤＮＡが含まれ、およびこのようなキメラ
受容体をコードするＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの翻
訳による本発明のキメラＤＮＡの発現によって産生され
るキメラハイブリッド受容体タンパク質が含まれる。こ
れらのキメラ受容体は、与えられた細胞内で外因性のバ
ックグラウンド結合または転写活性化活性を越える活性
を有すること、または、対応する天然の受容体のＤＮＡ
結合領域のＤＮＡ結合活性または転写活性化活性の少な
くとも約５％を持つことおよび／または対応する天然の
リガンド結合領域の約５％のリガンド結合活性を有する
ことが望ましい。
【００５８】本発明はまた、受容体タンパク質に対する
機能的リガンドを同定するための方法を含む。本方法に
よれば、受容体タンパク質をコードし、少なくとも機能
するリガンド結合領域およびＤＮＡ結合領域を有するＤ
ＮＡ配列（ここでは試料配列と呼ぶ）を同定することが
できる。（本分野の技術に塾達したものには理解される
ように、機能的であるためにはリガンド結合領域のＤＮ
Ａ配列のすべてが必要なわけではない。働き得る配列、
すなわち、その領域がリガンドに結合する場合になけれ
ばならない配列はその領域の欠失解析によって同定され
る。）試料ＤＮＡ配列が単離されると、別の受容体タン
パク質、例えば、グルココルチコイド受容体タンパク
質、チロイド受容体タンパク質、ミネラロコルチコイド
受容体タンパク質、またはレチノイン酸受容体タンパク
質などをコードするＤＮＡ配列由来のＤＮＡ結合領域と
試料ＤＮＡ配列中のＤＮＡ結合領域とを置換することに
よってキメラ遺伝子を作成することができる。次に、適
当な受容体欠損宿主細胞を、（１）発現プラスミドに載
っていることが望ましい、キメラ受容体遺伝子、および
（２）ＣＡＴ遺伝子やホタルのルシフェラーゼ遺伝子な
どのレポーター遺伝子であって、これもプラスミドに載
っていることが望ましく、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１８０，４
７１においてレポータープラスミドと呼ばれているもの
である。どの場合においても、レポーター遺伝子は機能
的に働き得るホルモン反応性要素（ＨＲＥ）（野生型ま
たは操作したもの）に連結しており、それにおいてはホ
ルモン反応性要素はキメラ受容体遺伝子の作成に使用す
るＤＮＡ結合領域によって活性化され得るものである。
（例えば、キメラ受容体遺伝子がグルココルチコイド受
容体をコードするＤＮＡ由来のＤＮＡ結合領域を含む場
合、ＨＲＥは野生型、または合成ＧＲＥ、すなわちグル
ココルチコイド受容体タンパク質のＤＮＡ結合領域の機
能的部分によって活性化されるものである。チロイド受
容体ＤＮＡ結合領域を用いる場合には、野生型あるいは
操作されたＨＲＥはチロイド（またはレチノイン酸）受
容体タンパク質などに反応性であるべきである。）次
に、トランスフェクトされた細胞を、キメラ遺伝子によ
ってコードされているキメラタンパク質のリガンド結合
領域と結合できる可能性のあるリガンド候補群で試して
みる。これらのうち、どのリガンドと機能的にキメラ受
容体遺伝子を複合体を形成するかを決定するために、受
容体遺伝子の誘導を、レポーター遺伝子によってコード
されるタンパク質のレベルを追跡する。（例えば、ルシ
フェラーゼがレポーター遺伝子である場合には、ルシフ
ェラーゼの産生はレポーター制御による遺伝子転写を示
唆する。）最後に、レポーター遺伝子の転写を誘導でき
るリガンドが見つかった際には、このリガンドが最初の
試料ＤＮＡによってコードされている受容体タンパク質
に結合すると結論づけられる。この結論は、レポーター
遺伝子の発現を誘導するリガンドと対応させて、最初の
試料ＤＮＡ配列にコードされている受容体タンパク質の
結合能を試験することによって、さらに照明することが
できる。
【００５９】本分野の技術に熟達したものが理解するよ
うに、細胞が既に、（ａ）（１）第一の受容体配列（す
なわち第一の配列）のＤＮＡ結合領域の機能領域が、
（２）第二の受容体配列（すなわち第二の配列）のリガ
ンド結合領域の機能領域と連結されているものからなる
キメラ配列（Ｃ）、および（ｂ）レポーター核酸配列が
機能的に働き得るホルモン反応性要素と連結しており、
それにおいて第一の受容体配列のＤＮＡ結合領域の機能
領域がレポーター配列に機能的に連結されているホルモ
ン反応性要素に結合し、活性化できるものを含んでいる
場合には、受容体タンパク質の機能的リガンドを同定す
るための方法は、少なくとも一つの候補リガンドで細胞
を処理し、レポーター配列の発現産物の量における変化
によってレポーター配列の誘導を追跡することからな
る。
【００６０】新しい機能的リガンド同定アッセイによ
り、多数の潜在的なリガンドまたはいかなる与えられた
受容体も、受容体が野生型であるかキメラであるかどう
かにかかわらず、スクリーニングすることが可能にな
る。
【００６１】機能的リガンド同定法は、ここでは（１）
レチノイド、レチノイン酸、およびその代謝前駆体、レ
チノールがｐｈＲＡＲ１ ＤＮＡによってコードされる
受容体の機能的リガンドであること、および、（２）Ｄ
ＮＡ結合領域およびリガンド結合領域がキメラ受容体の
機能特性を決定すること、を示すことにより例示され
る。
【００６２】新しい機能アッセイ、および新しいレチノ
イン酸受容体、および新しいキメラ受容体について、以
下でさらに詳細に述べる。
【００６３】
【発明の実施の形態】レチノイン酸受容体 ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーを研究す
る努力が続けられているなかで、ステロイドホルモン受
容体のＤＮＡ結合領域に関する顕著な相同性を持つ新し
いゲノム配列を偶発的に同定することが利用されてきた
（デジーン（Ｄｅｊｅａｎ）他、１９８６参照）。この
配列は、ヒト肝臓細胞ガン由来のＢ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＢＶ）の内在化配列にまでわたる。
【００６４】この遺伝子がこれまでに知られていなかっ
た受容体をコードするという仮説を追及するために、こ
の配列由来のオリゴヌクレオチドを標識し、多数のヒト
ｃＤＮＡライブラリーのプローブとして用いた。５つの
ポジティブなクローンが最初に精巣ｃＤＮＡライブラリ
ーから単離された。これらのクローンの一つの挿入断片
（１ｈＴ１Ｒ）を用いて、λｇｔ１０腎臓ｃＤＮＡライ
ブラリーからさらなるｃＤＮＡクローンを単離した。最
大のクローン（ｐｈＲＡＲ１）の制限酵素地図を図１に
示す。図２に示すように、ヌクレオチド配列解析によ
り、ヌクレオチド１０３−１０５に対応する仮定的な開
始メチオニンコドンから始まる４６２アミノ酸の長いオ
ープン・リーディング・フレームが見いだされた。この
ＡＴＧ周辺の配列は、翻訳開始部位に関するコザック
（Ｋｏｚａｋ）（１９８７）によって示されたコンセン
サス配列と一致する。ＡＴＧの上流は、インフレーム
（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）のターミネーターであり、開始メ
チオニンであることを支持する。３０コドン下流に見ら
れる別のＡＴＧはコンセンサスには適合せず、イニシエ
ーターではなさそうである。１４８９−１４９１のター
ミネーターコドンに続いて、ポリアデニル化領域の２０
ヌクレオチド上流にポリアデニル化シグナルのコンセン
サス配列（ＡＡＴＡＡＡ）（プラウドフット（Ｐｒｏｕ
ｄｆｏｏｔ）他、１９７６ 参照）を持つ３’−非翻訳
領域が存在する。
【００６５】相対分子量５０，７７２ｄ（５１ｋｄ）の
ポリペプチドが、翻訳されるオープン・リーディング・
フレーム内にコードされている。ｐｈＲＡＲ１の挿入断
片にコードされているタンパク質の大きさは、この断片
由来のＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳（クリーグ（ｋｒ
ｉｅｇ）他、（１９８４）参照）によって確認され、５
４ｋｄの推定分子量に対応することが見いだされた（デ
ータは示さない）。このタンパク質のアミノ酸配列を、
グルココルチコイドおよびチロイドホルモン受容体と比
較した。もっとも高い相同性は、残基８８から始まる６
６アミノ酸のシステインが豊富な配列に見いだされた。
われわれのグループはすでに、ｈＧＲのこの領域がこの
受容体のＤＮＡ結合領域であることを示している。ギグ
レ（Ｇｉｇｕｅｒｅ）他、（１９８７）およびホレンバ
ーグ他、（１９８７）参照。さらに、ミュータジェネシ
スおよび発現実験により、グルココルチコイド反応性要
素（ＧＲＥ）を有する遺伝子の転写活性化の役割を果し
ている直接の証拠を示した。ギグレ他、（１９８７）お
よびホレンバーグ他、（１９８７）参照。
【００６６】領域スイッチングと転写活性化 ｐｈＲＡＲ１の遺伝子産物に対するリガンドが知られて
いないので、リガンドを同定するための迅速で感度のよ
いアッセイを開発することが望まれた。これまでの研究
からヒトグルココルチコイドおよびエストロゲン受容体
のＤＮＡ結合領域は交換可能であり、機能するハイブリ
ッド受容体が得られることが示されている。このキメラ
はＭＭＴＶ−ＬＴＲのグルココルチコイド反応性要素を
認識するが、エストロゲンに依存して転写を刺激する
（グリーン他、（１９８７）参照）。このことにより、
新しいホルモン受容体のリガンド結合能の同定に一般的
な領域交換ストラテジーを利用できるのではないかと我
々は考えた。このアプローチを確かめるために、まずｐ
ｈＲＡＲ１のＤＮＡ結合領域をよく研究されているｈＧ
Ｒ由来のＤＮＡ結合領域と置換した（図５Ａ）。（この
キメラ構造は、適当な宿主細胞内で発現されると、その
リガンド結合領域が、リガンド／受容体複合体がＧＲＥ
に結合する前に機能的な外来のリガンドと結合するよう
なハイブリッド受容体タンパク質を産生し、それによっ
てグルココルチコイド誘導性プロモーターを活性化す
る。） 機能的リガンドの存在をアッセイするために、キメラ受
容体遺伝子を適当なＧＲＥ連結レポーター遺伝子ととも
に、適当な宿主細胞にトランスフェクトした。ＣＶ−１
細胞をＭＭＴＶ−ＣＡＴレポーター遺伝子とともにアッ
セイに用いた。（ＭＭＴＶ−ＣＡＴはレポータープラス
ミドＧＭ−ＣＡＴ上に載っており、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに特許目的のために寄託さ
れている；本明細書の“寄託”の項参照。
【００６７】本分野の技術に熟達したものには理解され
るように、ハイブリッドチロイド受容体タンパク質、す
なわちチロイド受容体タンパク質のＤＮＡ結合領域を有
するハイブリッドタンパク質をアッセイするための適当
なレポータープラスミドは、プラスミドＧＭ−ＣＡＴ上
のＧＲＥをチロイドホルモン反応性転写要素と置換する
ことによって構築することができる。たとえば、成長ホ
ルモンプロモーターは細菌のＣＡＴ遺伝子に機能的に連
結することができる。成長ホルモンプロモーターはチロ
イド反応性転写要素を含んでいるので、このようなプラ
スミドはハイブリッドチロイド受容体タンパク質のアッ
セイに用いることができる。本明細書中の小見出し“レ
ポーターおよび発現プラスミドの構築”の項参照。（ミ
ネラロコルチコイド受容体はＧＲＥを活性化できるの
で、ＧＭ−ＣＡＴなどのレポータープラスミドをハイブ
リッドミネラロコルチコイド受容体タンパク質のアッセ
イに使用することができる）。
【００６８】機能的リガンド同定アッセイに戻ると、ト
ランスフェクトした細胞をつぎに、一群のリガンド候補
で体系的に処理し、ＣＡＴ活性の変化によって誘導を追
跡した。
【００６９】そのホルモン様活性のため、レチノール
（ビタミンＡ）およびレチノイン酸を含むレチノイド
は、潜在的なインデューサーとして評価されていた。注
目すべきなのは、レチノイン酸はハイブリッド受容体の
ＣＡＴの劇的な増加を引き起こした（図５Ｂ）。親のベ
クターｐＲＳｈＲＲNX，またはここではヒトレチノイン
酸受容体（ｈＲＡＲα）と呼ぶｐｈＲＡＲ１由来の野生
型遺伝子産物を用いた場合にはＣＡＴ活性には何も影響
がないことを我々は示した。期待されたように、ハイブ
リッド受容体はグルココルチコイドでは誘導されず、ｈ
ＧＲはレチノイン酸によっては誘導されない。
【００７０】図６Ａに示すように、レチノイン酸はハイ
ブリッド受容体によって誘導されたＣＡＴ活性に関し
て、６×１０-10ＭのＥＤ50値を示し、これは多様な生
物学的アッセイにおけるレチノイン酸に対して観測され
たＥＤ50値と一致するものである（スポーン（Ｓｐｏｒ
ｎ）とロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）１９８４参照）。レ
チノールは１００ｎＭ以上のＥＤ50値で弱いアゴニスト
として機能する。レチニル酢酸およびレチニルパルミチ
ン酸は弱いインデューサーとしてさえ機能する。テスト
ステロン、ジヒドロテストステロン、エストロゲン、デ
キサメタゾン、コルチゾール、アルドステロン、プロゲ
ステロン、Ｔ3，Ｔ4、ビタンＤ3、および２５−ＯＨ−
コレステロールを含む多数の天然および合成リガンドは
ＣＡＴ活性を誘導することができなかった。
【００７１】ｐｈＲＡＲ１遺伝子産物がレチノイン酸受
容体であることを確認するために、発現産物の結合特性
を以下のＣＯＳ−１細胞のトランスフェクションによっ
て評価した。図６Ｂに示したように、トランスフェクシ
ョンした細胞は3Ｈ−レチノイン酸に特異的に結合する
能力が増大していることが示された。この増加は、細胞
性レチノイド結合タンパク質の存在および、顕著な非特
異的結合の結果と考えられる内在性のバックグラウンド
を超えておこっている。活性化の研究と一致して、結合
はレチノイン酸によって完全に競合されるが、レチノー
ルによっては部分的にしか競合されない。チロイドホル
モン、デキサメタゾン、およびビタミンＤ3は、レチノ
イン酸の結合と競合しなかった。
【００７２】遺伝子ファミリー 新しいレチノイン酸遺伝子が特異的なものであるかどう
かを決定するために、また潜在的に関連した遺伝子を同
定するために、ヒトＤＮＡをサザンブロット分析で調べ
た。制限酵素で切断したヒトＤＮＡをｈＲＲ遺伝子のコ
ード領域由来の標識したＤＮＡ断片とハイブリダイゼー
ションさせた結果、単一のハイブリダイズする遺伝子座
位とすべての切断で一致する３本のバンドが見られた
（図７Ａ）。このハイブリダイゼーションパターンはデ
ジーン他（１９８６）がＨＢＶ前挿入部位に関して記載
した制限酵素地図とは関連がないものである。しかし、
ハイブリダイゼーション条件を緩くすると、各酵素消化
産物でさらに６本のバンドが見いだされた（図７Ｂ）。
これらの観察により、ヒトゲノム中に少なくともさらに
１カ所、あるいはそれ以上レチノイン酸受容体に関連す
る座位が存在することが示唆された。現在ＲＡＲβが発
見された。ブランド（Ｂｒａｎｄ）他、（１９８８）参
照。
【００７３】ｈＲＲ遺伝子の発現 レチノイン酸は多数の異なる細胞型に影響を与えること
が知られているので、我々はｈＲＲ遺伝子の発現を調べ
た。多様なラットおよびヒト組織から単離された全細胞
質ＲＮＡをサイズで分離し、ニトロセルロースフィルタ
ーに転移させた。ｐｈＲＡＲ１由来の６００ｂｐ制限断
片とのハイブリダイゼーションにより、海馬、副腎、小
脳、視床下部、および精巣で最も高レベルに、３，２０
０ヌクレオチドの主要なＲＮＡが見られた（図８）。長
い感光により、肝臓などのいくつかの組織では検出され
なかったが、ほとんどの組織で少量の３．２ｋｂ転写産
物が見られた。
【００７４】レチノイン酸受容体データ要約 ここで示したデータは、ｐｈＲＡＲ１の遺伝子産物を３
つの基準に基づいてヒトレチノイン酸受容体として同定
するものである。第１に、ｈＲＲのステロイドおよびチ
ロイドホルモン受容体に対する全体的な構造上の相同性
（図９）は、ｈＲＲがリガンド反応性調節タンパク質で
あることを示唆している。第２に、ｈＧＲのＤＮＡ結合
領域とｈＲＲの予想されるリガンド結合領域からなる、
発現されたキメラ受容体は、レチノイン酸の存在する場
合にのみ、グルココルチコイド誘導性レポーター遺伝子
の転写制御因子として働く。この誘導は生理学的レベル
で起こる。第３に、トランスフェクトされた細胞中のｈ
ＲＲの候補の発現が選択的に、これらの細胞がレチノイ
ン酸に結合する能力を増大させる。
【００７５】発生とガン化 レチノイドは、広範な系において発生と分化に難解な効
果を表わす、レチノイン酸、レチノール（ビタミンＡ）
および一連の天然ならびに合成誘導体からなる化合物の
グループからなるものである。スポーン（Ｓｐｏｒｎ）
とロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ），（１９８３）；マンデ
ル（Ｍａｎｄｅｌ）とコーエン（Ｃｏｈｅｎ），（１９
８５）；ウォルバック（Ｗｏｌｂａｃｋ）とホウ（Ｈｏ
ｗｅ），（１９２５）；ロタン（Ｌｏｔａｎ），（１９
８０）；フックス（Ｆｕｃｈｓ）とグリーン（Ｇｒｅｅ
ｎ），（１９８０）を参照のこと。初期の研究が上皮の
成長および分化に対するレチノイドの効果に焦点を当て
たにもかかわらず、それらの作用がはじめに考えられて
いたよりもさらに広範にわたるものであることが示され
た。最近の多くの研究により、神経芽細胞腫（ハウスレ
ー（Ｈａｕｓｌｅｒ）ら，（１９８３）を参照）、黒色
腫（ロタンら，（１９８３）を参照）および線維芽細胞
（シュローダー（Ｓｈｒｏｄｅｒ）ら，（１９８２）を
参照）を含む種々の培養細胞系列に対するこれらの分子
の効果が示されている。ヒト前骨芽細胞性白血細胞（Ｈ
Ｌ−６０）において、レチノイン酸は、側内胚葉の分化
および後期マウス胚盤胞の特徴を誘導する（ストリック
ランド（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ）とマーダビ（Ｍａｈｄ
ａｖｉ），（１９７８）；ジェッテン（Ｊｅｔｔｅｎ）
ら，（１９７９）；ワング（Ｗａｎｇ）ら，（１９８
５）を参照）。レチノイン酸は発生において同様に強力
な効果を示すことが明らかにされている。例えば、レチ
ノイン酸は、発生途上のニワトリの肢芽において前後軸
が確立する際に、極性領域の作用を代用できるのである
（ティックル（Ｔｉｃｋｌｅ）とアイヒール（Ｅｉｃｈ
ｅｌｅ），（１９８５）を参照）。レチノイン酸の投与
を調節することにより、新奇なパターンをもつ肢構造を
作ることが可能である。レチノイン酸は、主にはモルフ
ォゲン（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ）であると考えられるにも
かかわらず。ノザンブロット分析によって、成体におけ
るその機能についての再評価が示唆されている。ヒトに
おいて、レチノールの欠損は種々のガンの驚くべき増加
と関連している（ムーン（Ｍｏｏｎ）とイトリ（Ｉｔｒ
ｉ），（１９８４）を参照）。レチノイドは、動物にお
いて腫瘍の成長を阻害し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍促
進因子の作用を妨害することも示されている。これと関
連して、ｈＲＲは、ガン化の負の制御因子であると考え
られる。
【００７６】制御遺伝子のスーパーファミリー ２つの驚くべき結果がここに示した研究から明らかとな
った。まず第一は、レチノイン酸受容体関連遺伝子ファ
ミリーの発見であり、これは、密接に関連した性質をも
つ複数のタンパク質の存在を予言するものである（例え
ば、ブランド（Ｂｒａｎｄ）ら，（１９８８）により記
述されたＲＡＲβ）。生理学的研究から、レチノイン酸
はレチノール（ビタミンＡ）と同様に、細胞の分化に強
力な効果を発揮し、これらの効果はしばしば関連しない
ものであることが示されている。したがって、少なくと
もひとつの関連遺伝子産物が、特異的なレチノール受容
体あるいはレチノイドファミリーのもうひとつのメンバ
ーに対する受容体であるということがありそうである。
これらの結果から得られる第二の驚くべき観察は、レチ
ノイド受容体とチロイドホルモン受容体との密接な類縁
関係である。（われわれが以下に示すように、レチノイ
ン酸受容体はチロイド応答エレメントまたはＴＲＥを活
性化できる；「レチノイン酸とチロイドホルモンは共通
の応答エレメントを介して遺伝子発現を誘導する」と分
類された明細書の節を参照のこと。）この関係は、チロ
イドホルモンとレチノイドの構造的相違性から、ある程
度驚きである。チロイドホルモンは２つのチロシン分子
の縮合から生ずる一方、レチノイドは、メバロン酸から
誘導される。化学的に異なる分子が共通の構造をもつ受
容体と相互作用するという観察はもっぱら、それらがそ
の個々の調節効果を引き出すところの作用様式の共通性
を反映しているように見える。この類推に基づいて、細
胞内受容体とレチノイドの相互作用が、ホルモン／受容
体複合体による特定の遺伝子群の活性化を引き起こす調
節カスケードを誘導するという考えを現在われわれは提
出している。動物は、その発生と生理状態を調節するた
めに種々の方法をとっているが、レチノイン酸受容体が
ステロイド受容体スーパーファミリーの一部であるとい
う証拠は、形態形成および恒常性をつかさどる機構がは
じめに考えられていたよりもさらに一般的であることを
示唆している。
【００７７】キメラ受容体の構築と特徴付け キメラ受容体遺伝子の構築は、上述の「定義」、「発明
の要約」および「ドメインの切り替えおよび転写活性
化」に分類される明細書の項目で論議されている。それ
に続く項目において、キメラ受容体の構築と特徴付け
は、ＧＲ／ＴＲハイブリッドの構築と特徴付けを示すこ
とにより説明される。
【００７８】
【実施例】細胞培養とトランスフェクション ＣＶ−１細胞は、キメラＲＲ／ＴＲ受容体を持つ発現プ
ラスミドおよび、ＣＡＴレポーター遺伝子を持つレポー
タープラスミドでトランスフェクトする受容体欠損宿主
細胞として用いられた。ＣＶ−１（アフリカミドリザル
の腎臓）細胞の生育およびトランスフェクションの条件
は、リン酸カルシウム沈澱を細胞の上に４−８時間お
き、このとき、培地を５％のＴ3フリーのウシ血清（ス
カンチボディーズ）なし、あるいは１０-7ＭのＴ3（シ
グマ）を含んだＤＭＥＭにかえることを除いては、以前
に述べられたもの（ギギュアー（Ｇｉｇｕｅｒｅ）ら，
（１９８６））と同様だった。Ｔ3の添加３６時間後に
細胞を集め、ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら，（１９８
２）によって述べられているようにしてＣＡＴアッセイ
を行った。代表的なものは、５μｇのレポーターと１μ
ｇの発現ベクターをコトランスフェクションし、これと
ともに２．５μｇのＲＳＶ−βｇａｌをトランスフェク
ション効率の対照として用いるものである。アッセイ化
および非アセチル化型の［14Ｃ］クロラムフェニコール
を薄層クロマトグラフィーにより分離し、切り出し、５
％ ＤＭＳＯを含むエコノフルアー（デュポン社）中で
液体シンチレーションカウンターを用いてカウントを測
定することにより定量した。β−ガラクトシダーゼのア
ッセイはハーボメル（Ｈｅｒｂｏｍｅｌ）ら，（１９８
４）により記載されたようにして行った。ＣＡＴ活性
は、β−ガラクトシダーゼ活性によって割った転換率に
より表わされる。
【００７９】レポーターおよび発現プラスミドの構築 ラット成長ホルモン遺伝子の−１６９から−２００に相
当する合成オリゴヌクレオチドを、−１９０／−１８１
の位置にＨｉｎｄIIIサイトを有するＭＴＶ−ＣＡＴの
リンカー精査型変異体（ビュティ（Ｂｕｅｔｔｉ）とク
ーネル（Ｋｕｈｎｅｌ），（１９８６））に組み込ん
だ。発現ベクターは、ｐｈｅＡ１２（ｈＴＲβ、ワイン
バーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、（１９８６）を
参照）およびｒｂｅＡ１２（ｈＴＲα、トンプソン（Ｔ
ｈｏｍｐｓｏｎ）ら、（１９８７）を参照）の全長のｃ
ＤＮＡを、ｐＲＳベクター（ギギュアーら、（１９８
６）および（１９８７））のＫｐｎIとＢａｍＨIサイト
の間に挿入することによりチロイドホルモン受容体に対
して構築した。
【００８０】キメラ受容体の構築 ｈＧＲNXの構築法は既に記載がある（ギギュアーら、
（１９８７））。ｈＧＲNXを構築するために、ｐｈｅＡ
１２（ｈＴＲβ、ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅ
ｒ）ら、（１９８５）と（１９８６）を参照）のｃＤＮ
Ａ挿入断片をＭ１３ｍｐ１９のＫｐｎIとＢａｍＨIサイ
トの間にサブクローニングし、クンケル（１９８５）の
方法により変異を生起させた。ＮｏｔIサイトを生ずる
ために用いたオリゴヌクレオチドは３つのアミノ酸、す
なわちＡｓｐ９７をＡｒｇへ、Ｌｙｓ９８をＰｒｏへ、
Ａｓｐ９９をＰｒｏへと変化させた。ＸｈｏIサイトを
生ずるために用いたオリゴヌクレオチドは２つのアミノ
酸、すなわちＴｈｒ１７１をＬｅｕへ、Ａｓｐ１７２を
Ｇｌｙへと変化させた。次に変異型受容体ｃＤＮＡを発
現ベクターｐＲＳ（ギギュアーら（１９８６）および
（１９８７））に移した；この複合体は、ＲＳｈＧＲNX
とＲＳｈＴＲβNXの間のＫｐｎI−ＮｏｔI、ＫｐｎI−
ＸｈｏIおよびＮｏｔI−ＸｈｏI制限酵素断片を交換す
ることにより構築された。ＲＳｈＧＲNXは、野生型に対
し約７５％のＤＮＡ結合活性を有し、ＲＳｈＴＲβNXは
野生型の約６０％のＤＮＡ結合活性を有している。
【００８１】Ｃｉｓ／Ｔｒａｎｓ作用性リガンド同定ア
ッセイ Ｃｉｓ／Ｔｒａｎｓ機能リガンド同定のためのコトラン
スフェクションアッセイは、グルココルチコイド、およ
びチロイドならびにレチノイン酸受容体の間でドメイン
を交換することにより構築したキメラ受容体を研究する
ために用いられた。（当業者には理解されるように、Ｃ
ｉｓ／Ｔｒａｎｓコトランスフェクションアッセイは、
野生型あるいは遺伝的に操作された受容体のあるドメイ
ンにおける、機能的な交換によって作製されたキメラ受
容体を研究するために用いることが可能である。Ｃｉｓ
／Ｔｒａｎｓアッセイにおいて、２種のプラスミドを受
容体受容細胞系列にトランスフェクションする事が好ま
しい。第一のプラスミドは受容体タンパク質（野生型か
あるいはキメラまたは遺伝的に操作を加えたもの）を発
現するために使われる。第二のプラスミドは、リガンド
あるいはホルモン応答性プロモーターからの転写をモニ
ターするために用いられる。チロイドホルモン受容体ア
ッセイの場合、発現プラスミドは、チロイドホルモン受
容体をコードするｃＤＮＡを発現に向かわせるラウス肉
腫ウイルスの長い終末反復配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）から
なる。ｈＧＲの場合、レポータープラスミドは、細菌の
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）遺伝子を配合したマウス乳腺腫瘍ウイルスの長い
終末反復配列（ＭＴＶ−ＬＴＲ）である。ＭＴＲ−ＣＡ
Ｔをチロイドホルモン応答性レポーターに変換するため
に、チロイドホルモン応答性エレメント（ＴＲＥ）を含
むオリゴヌクレオチドをＭＴＶ−ＬＴＲの−１９１の位
置に挿入した。この配列、すなわちラット成長ホルモン
（ｒＧＨ）遺伝子の−１６９から−２００は，チロイド
ホルモン受容体に特異的に結合し異種プロモーターにＴ
3応答性を付与する（グラス（Ｇｌａｓｓ）ら、（１９
８７））。発現およびレポータープラスミドはＣＶ−１
細胞にコトランスフェクションし、ＣＡＴ活性はＴ3存
在、非存在下で測定した。このアッセイにより、αおよ
びβチロイドホルモン受容体のどちらも、Ｔ3存在、非
存在下でＭＴＲ−ＣＡＴからの転写を活性化しないこと
が示された（データは示さない）。しかし、ＴＲＥをつ
けることにより、チロイドホルモン応答性のＭＴＶプロ
モーターが作られる。ＣＡＴ活性の誘導は、機能的なα
あるいはβチロイドホルモン受容体のコトランスフェク
ションとＴ3の添加に依存的である。Ｔ3存在下でα受容
体（ｒＴＲα）はＣＡＴ活性を約１５倍まで誘導する
が、一方β受容体（ｈＴＲβ）は約５倍まで活性を誘導
する。
【００８２】複合チロイドホルモン／グルココルチコイ
ド受容体は、チロイドおよびグルココルチコイドホルモ
ン受容体の機能的性質を比較するために構築された。キ
メラ複合受容体の構築を促進するために、ＮｏｔＩとＸ
ｈｏＩの制限酵素に対する唯一の切断点をｈＧＲとｈＴ
ＲβのＤＮＡ結合ドメインに隣接して挿入した。これら
の変異型受容体は、ｈＧＲNXとｈＴＲβNXと呼ばれ、こ
れらの受容体に対するアミノ末端、ＤＮＡ結合ドメイ
ン、リガンド結合ドメインの全ての可能な組合せにおけ
る複合体を作るために用いることができる。（当業者に
は理解されるように、共通点を有するプラスミド、例え
ばｐＲＡＲαNXあるいはｐＭＲNXは、ステロイドホルモ
ン受容体のスーパーファミリーにおける種々の受容体か
ら、全ての機能ドメインの全ての可能な組合せにおける
キメラ受容体を作るために用いることが可能である。受
容体と種々の機能ドメインの位置は図１１および１２に
示されている。）複合体およびその親型の受容体は、Ｔ
3あるいは合成グルココルチコイドデキサメタゾンの存
在、非存在下で、チロイドホルモンおよびグルココルチ
コイド応答性プロモーター両者を用いてアッセイが可能
である。
【００８３】複合チロイド／グルココルチコイド受容体
の構造および活性は図１３に示されている。受容体は３
つの部分に分けられ、複合体はドメインの「起点」を表
わす文字で名付けられており、例えば「Ｔ−Ｇ−Ｔ」は
ｈＴＲβのアミノ末端およびカルボキシ末端を持ち（Ｔ
−，−Ｔ）、ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメイン（−Ｇ−）を
持っている。推定上のｈＴＲβのＤＮＡ結合ドメイン
（ＴＴＧ，ＧＴＴ，ＧＴＧ）との複合体は、ＴＲＥ−Ｃ
ＡＴからの転写を活性化するが、一方ｈＧＲのＤＮＡ結
合ドメイン（ＧＧＴ，ＴＧＧ，ＴＧＴ）との複合体はＧ
ＲＥ−ＣＡＴからの転写を活性化した、これはｈＴＲβ
のこの領域がｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインに類似してお
り、プロモーターの認識に関与していることを示してい
る。ｈＴＲβカルボキシ末端との複合受容体はＴ3によ
り活性化されるが、一方ｈＧＲのカルボキシ末端との複
合受容体はデキサメタゾンにより活性化された。これ
は、カルボキシ末端がホルモンの結合および活性化の特
異性を負っている受容体の一部であるとする認識と一致
するものである。これとあわせて、これらの複合体の機
能的性質は、ｈＴＲβのＤＮＡおよびリガンド結合ドメ
インの帰属を支持するものである。
【００８４】レチノイン酸およびチロイドホルモンは共
通の応答性エレメントを介して遺伝子発現を誘導してい
る 機能的なレチノイン酸応答性エレメント（ＲＡＲＥ）の
同定はレチノイン酸受容体が遺伝子発現を活性化し、細
胞の分化を制御する機構をわれわれが理解する上で決定
的なものである。こうした研究のひとつの障害は、その
転写がレチノイン酸受容体−ホルモン複合体に直接依存
している遺伝子が全く同定されていないことである。Ｒ
ＡＲＥの局在を探るそのほかの手段は、クローン化した
ｃＤＮＡから生産されるレチノイン酸受容体を用いて既
知のホルモン応答性プロモーターの誘導性を体系的に調
べていくものである。（「Ｃｉｓ／Ｔｒａｎｓアッセ
イ」という見出しで述べたように、この系において、Ｈ
ＲＥを含むプロモーターからの転写活性化は、ＣＶ−１
といった受容体欠損細胞においてコトランスフェクショ
ンした発現プラスミドからの機能的な受容体の発現に依
存性を示す。）レチノイン酸およびチロイドホルモン受
容体のＤＮＡ結合ドメインは高い関連性を持つ（アミノ
酸配列において６２％の一致、図９を参照）ため、レチ
ノイド受容体がＴＲＥを介して遺伝子発現を活性化する
可能性が検討された。
【００８５】ＴＲＥは、例えばグラスら（１９８７）を
参照すると、チロイドホルモン（３，５，３’−トリヨ
ード−Ｌ−チロニン、Ｔ3）調節に必須な、ラット成長
ホルモン５’隣接ゲノム配列におけるｃｉｓ−作用エレ
メントであるという議論により知られている。
【００８６】ＴＲＥがＲＡＲＥとして効果的に機能でき
るかを調べるために、新規なＴ3応答性プロモーター
を、マウス乳線肉腫ウイルス長終結反復配列（ＭＴＶ−
ＬＴＲ）中に存在するグルココルチコイド応答性エレメ
ントを、天然のＴＲＥGHをコードするオリゴヌクレオチ
ドと置換することにより構築した。次に、このプロモー
ターレポータープラスミド△ＭＴＶ−ＴＲＥGH−ＣＡＴ
を作製するために、細菌のクロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子と融合した。Ｃ
Ｖ−１細胞へ短期間のトランスフェクションを行った
後、このプロモーターの誘導性をＣＡＴ活性を測定する
ことにより決定した。ＣＶ−１細胞を、ヒトチロイドホ
ルモン受容体β（ｐＲＳｈＴ3Ｒβ）を含む発現ベクタ
ーおよびレポータープラスミド△ＭＴＶ−ＴＲＥGH−Ｃ
ＡＴでコトランスフェクションした場合、ＣＡＴ活性の
誘導はＴ3の存在下で測定する。これとは対照的に、ヒ
トグルココルチコイド受容体（ｐＲＳｈＧＲα）をコー
ドする発現ベクターと同じレポータープラスミドをコト
ランスフェクションすると、合成グルココルチコイドデ
キサメタゾンに応答してこのプロモーターからのＣＡＴ
活性を活性化しなかった。これらの結果は、野生型のＭ
ＴＶ−ＬＴＲが応答性でないことから（データは示さな
い）、ＲＡＲαによるＣＡＴ活性の誘導がＴＲＥによる
ものであることを明らかに示している。これらの結果は
また、ｈＲＡＲαがＴＲＥを含むプロモーターからの遺
伝子発現を特異的に誘導できることを示している。
【００８７】ＲＡＲとＧＲのキメラ受容体 上で議論したように、ステロイドホルモン受容体のモジ
ュラー構造は、ある受容体から他の受容体へ機能的ドメ
インを交換して機能的なキメラ受容体を作製することを
可能としている。この戦略は、ＲＡＲのＤＮＡ結合ドメ
インとＧＲのリガンド結合ドメインを持つｈＧＲ／ｈＲ
ＡＲαキメラを作製するために用いられた。ＣＶ−１細
胞をｈＧＲＧをコードする発現プラスミドとレポーター
△ＭＴＶ−ＴＲＥGH−ＣＡＴでコトランスフェクション
すると、デキサメタゾンは特異的にＣＡＴ活性を誘導し
た（データは示さない）。この実験は、ｈＲＡＲαのＤ
ＮＡ結合ドメインが標的遺伝子の活性化の特異性を決定
するという直接的証拠を与えた。
【００８８】図表の詳細な説明 図１−４：ｐｈＲＡＲ１のＤＮＡおよび主要なアミノ酸
配列。図１：ｐｈＲＡＲ１クローンの模式的な説明と制
限酵素地図。点を打ったボックスは推定される遺伝子の
読み枠を示す。図２−４：ｐｈＲＡＲ１の完全なヌクレ
オチド配列が長い読み枠の上にアミノ酸配列とともに示
されている。ヌクレオチド８５−８７の上流域にあるイ
ンフレームの終止コドンおよびポリアデニル化シグナル
は下線を施してある。
【００８９】図１−４の方法：デジャン（Ｄｅｊｅａ
ｎ）ら、（１９８６）によって発表されているゲノム配
列のヌクレオチド４０８−４７７に相当する６３−ｍｅ
ｒのオリゴヌクレオチドは、ヒト精巣λｇｔ１０ライブ
ラリーを検索するためのハイブリダイゼーションプロー
ブとして用いられた。ハイブリダイゼーション混合液
は、３５％ホルムアミド、１×デンハルト、５×ＳＳＰ
Ｅ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、（１
００μｇ ｍｌ-1の変性サケ精子ＤＮＡおよび１０
6ｃ．ｐ．ｍ ｍｌ-1の32Ｐ−標識オリゴヌクレオチド
を含んでいた。２重にしたニトロセルロースフィルター
を４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションし、２×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム）で２０分間、５５
℃で３回洗い、増感紙を用いて−７０℃でオートラジオ
グラフにかけた。この検索により得られたクローン１ｈ
Ｔ１Ｒは、部分的に性質を調べた後、ヒト腎臓ωｇｔ１
０ ｃＤＮＡライブラリーを検索するためのハイブリダ
イゼーションプローブとして用いた（ベル（Ｂｅｌ
ｌ），（１９８６）を参照）。この検索のために、洗い
は６８℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳという条件に変
えた。いくつかのｃＤＮＡクローンが単離され、そのう
ち最も長いクローンであるｐｈＲＡＲ１を多種の制限酵
素で切断し、得られた断片をＭ１３シーケンシングベク
ターｍｐ１８ならびにｍｐ１９に、両向きにサブクロー
ニングし、ジデオキシ法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）
ら、（１９７７））で塩基配列を決定した。ＤＮＡ配列
を編集し、デヴェルクス（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら、（１
９８４）およびシュターデン（Ｓｔａｄｅｎ），（１９
８２）のプログラムによって分析した。
【００９０】図５：図５Ａ：キメラ受容体ｈＲＧＲの構
築。種々の構築のドメイン構造は、模式的に示されてお
り、番号は各々のドメインのアミノ酸の位置に対応して
いる。ＤＮＡ結合ドメインは「ＤＮＡ」で表わされてお
り、リガンド結合ドメインは各々の誘導物質により表わ
されている。受容体間のＤＮＡ結合ドメインの交換を可
能とするために、部位標的突然変異導入法により作られ
たＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ部位が示されている。図５
Ｂ：レチノイン酸によるＣＡＴ活性の誘導。発現ベクタ
ーはレポータープラスミドＭＴＶＣＡＴとともにＣＶ−
１細胞にコトランスフェクションし、１００ｎＭのデキ
サメタゾン（ＤＥＸ）あるいはレチノイン酸（ＲＡ）の
存在、非存在下で２日間培養した。発現ベクターに挿入
された受容体は：ｐＲＳｈＲＧＲではヒトグルココチコ
イド受容体；ｐＲＳｈＲＲではヒト・レチノイン酸受容
体；ｐＲＳｈＲＲｎｘではＮｏｔＩとＸｈｏＩ部位を有
する変異型ヒト・レチノイン酸受容体；ｐＲＳｈＲＧＲ
では、ＤＮＡ結合ドメインがヒト・グルココルチコイド
受容体のＤＮＡ結合ドメインによって置換された、ヒト
・レチノイン酸受容体キメラ受容体である。
【００９１】図５の方法：図５Ａ：ｐｈＲＡＲとｈＧＲ
（ホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、（１９８
５）を参照）のｃＤＮＡ挿入断片の制限酸素断片を、ｍ
ｐ１９ベクターのＫｐｎIとＢａｍＨＩ部位にサブクロ
ーニングし、クンケル（１９８５）の方法にしたがい変
異誘起処理した。ｈＧＲおよびｈＲＲ内にＮｏｔI部位
を作製するために用いたオリゴヌクレオチドは各々２８
と３１ヌクレオチドであるが、一方ｈＧＲとｈＲＲにＸ
ｈｏＩを作るために用いたオリゴヌクレオチドは２４と
２３ヌクレオチドであった。ＮｏｔIが生起した結果、
ｈＧＲNXではＰｒｏ４１６からＡｒｇへの変異が、また
ｈＲＲNXではＩｌｅ８４およびＴｙｒ８５がＰｒｏへと
変異した。ＸｈｏI部位の導入によりｈＧＲNXアミノ酸
配列は変化しないが、ｈＲＲNXではＬｙｓ１５５がＬｅ
ｕ残基へ変異した。変異型受容体は次に、発現ベクター
ｐＲＳ（ギギュアーら，（１９８６）を参照）に移さ
れ、ｈＧＲＤＮＡ結合ドメインを含むｐＲＳｈＧＲNXの
ＮｏｔI／ＸｈｏI制限酵素断片を、ｐＲＳｈＲNXのＮｏ
ｔIとＸｈｏI部位の間に導入してｐＲＳｈＲＧＲを生ず
る。図５Ｂ：細胞のトランスフェクションとＣＡＴアッ
セイ。組換え体ＤＮＡ構築物（各々５μｇ）はリン酸カ
ルシウム共沈法（ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら，（１
９７９））によってＣＶ−１細胞に導入された。次に、
細胞は誘導物質の存在、非存在下で、ニュートリドーマ
（ベーリンガー・マンハイム社）を補った無血清培地内
で２日間培養した。ＣＶ−１細胞は、次にゴーマンら、
（１９８２）によって記載されたようにしてＣＡＴアッ
セイのために調製し、２５μｇのタンパク抽出物を用い
て３時間行った。レチノールを用いた全ての実験は、緩
光下で行った。
【００９２】図６：図６Ａ：レチノイドの投与量に対す
る応答。ｐＲＳｈＲＧＲおよびｐＭＴＶＣＡＴでトラン
スフェクションしたＣＶ−１細胞に、レチノイドの濃度
を上昇させるあるいはテストステロン、ジヒドロテスト
ステロン、エストロゲン、コルチゾル、アルドステロ
ン、プロゲステロン、トリヨードチロニン（Ｔ3）、チ
ロキシン（Ｔ4）、ジヒドロキシ−ビタミンＤ3（Ｖ
Ｄ3）および２５−ＯＨ−コレステロールなどの１μＭ
における単独投与（＊）処理を行った。ＣＡＴ活性のレ
ベルは、この実験において観察された最大応答に対する
パーセントとしてプロットされた。図６Ｂ：トランスフ
ェクションしたＣＯＳ−１細胞の細胞質抽出物に対する
レチノイン酸の結合。棒は、１０００倍過剰量の種々の
競合物質非存在（黒色の棒）、存在下（白ぬきの棒）で
決定された、結合した3Ｈ−レチノイン酸量を表わして
いる。値は、４連の測定を平均したものを示している。
競合物質は、レチノイン酸（ＲＡ）、レチノール
（Ｒ）、Ｔ4、デキサメタゾン（ＤＥＸ）およびビタミ
ンＤ3（ＶＤ3）である。
【００９３】図６の方法：図６Ａ：ＣＶ−１細胞のコト
ランスフェクションとＣＡＴアッセイは図５で述べたよ
うにして行った。レチノイン酸は最小限のジメチルスル
フォキシドに溶解し、エタノールで希釈した。他の全て
の産物はエタノールで希釈し、対照の培養には培地に
０．１％の溶媒（Ｖ／Ｖ）を与えた。レチノイド処理の
投与量−応答の曲線は三連で行った。図６Ｂ：準密集状
態のＣＯＳ−１細胞を、ＤＥＡＥ−デキストラン法（デ
ィーンズ（Ｄｅａｎｓ）ら、（１９８４）を参照）によ
りディッシュ当り１０μｇの対照プラスミド（ｐＲＳ）
あるいはｐＲＳｈＲＲでトランスフェクションした。細
胞を５％の活性炭処理した仔ウシ胎児血清を含むＤＭＥ
Ｍ中に２日間おき、次にＴＮＥ（４０ｍＭ トリス−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）中で集め、低張緩衝液（５０ｍＭ トリス−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７．４，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭジチ
オスレイトール，１０ｍＭ ＮａＭｏＯ4，１０％グリ
セロール，０．５ｍＭフェニルメチルスルフォニル・フ
ルオライド）中で、ドウンス・ホモジナイゼーションを
用いて融解し、細胞質画分を得るために１００，０００
×ｇで３０分間遠心した。インキュベーションは、総量
２００μｌ中で、細胞質画分からの１５０μｇのタンパ
ク質および２×１０-8Ｍの3Ｈ−レチノイン酸（ＮＥ
Ｎ，５２．５Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）とともに、低張緩衝液
中で行った。特異的結合は２×１０-5Ｍの競合物質を添
加することにより測定した。反応は４℃で１６時間行っ
た。結合した3Ｈ−レチノイン酸はＤＥ−８１フィルタ
ーを用いて定量した。反応液をフィルター上に１分間お
いた後、洗浄緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ
７．４，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ トライトン
Ｘ−１００）でリンスした。フィルターを乾燥させ、液
体シンチレーション分光法によりカウントを測定した。
【００９４】図７：ヒト・ゲノムＤＮＡのサザンブロッ
ト分析。図７Ａ：ヒト胎盤ＤＮＡを表示した制限酵素で
切断した。切断したＤＮＡを０．８％のアガロースゲル
（レーン当り１０μｇ）で分離し、ニトロセルロースフ
ィルターに転写した（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ），
（１９７５））後、ブロットは、ｈＲＲのＤＮＡ結合ド
メインを含むｐｈＲＡＲ１（約６００塩基対）由来のＥ
ｃｏＲＩ×ＰｖｕII断片と、高度に厳しい条件（５０％
フォルムアミド，５×ＳＳＰＥ，１×デンハルト，
０．１％ ＳＤＳ，１００μｇ ｍｌ-1サケ精子ＤＮ
Ａ）下でハイブリダイゼーションした。このフィルター
を０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、６５℃で洗っ
た。λ ＨｉｎｄIII ＤＮＡマーカー（サイズはＫｂ
で表示）はオートラジオグラムの左にならべてある。図
７Ｂ：ゆるい条件下でのＡと同様なプローブを用いたヒ
ト胎盤ＤＮＡの分析。同一の試料を含む平行なブロット
は、３５％のフォルムアミドを用いた以外は、Ａと同様
にしてハイブリダイゼーションした。このフィルターは
２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５℃で洗った。
【００９５】図８：ラットおよびヒトの組織におけるレ
チノイン酸受容体ｍＲＮＡのノザンブロット分析。
【００９６】図８の方法：全ＲＮＡは、グアニジンチオ
シアネートを用いて種々の組織から単離され（チャーグ
ゥィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら，（１９８０））、１％
アガロース−フォルムアルデヒドゲルで分離し、ニトロ
セルロースに転写した後、図７で述べられたプローブを
用いて、厳しい条件下でハイブルダイゼーションした。
全てのレーンにおいて２０μｇの全ＲＮＡが用いられ
た。リボソームＲＮＡ（２８Ｓと１８Ｓ）の移動度はサ
イズマーカーに対して示されている。ニトロセルロース
フィルターは増感紙を用い、−７０℃で１週間オートラ
ジオグラフィーを行った。
【００９７】図９：ｈＧＲ，ｈＲＲおよびｈＴ3Ｒβ構
造の模式的なアミノ酸の比較。アミノ酸配列は点線には
さまれる領域におけるアミノ酸の一致の割合とともに、
模式的に並べられている。
【００９８】図１０は、一般化したステロイド＼チロイ
ド＼レチノイン酸受容体遺伝子を模式的に図示したもの
であり、遺伝子の区分を領域Ａ＼Ｂ，Ｃ，Ｄ．Ｅとして
示している。Ａ＼Ｂの領域の機能は、解明が始まったば
かりであり；Ｃ領域は、ＤＮＡ結合ドメインをコード
し；Ｄ領域はちょうつがいの領域であり；Ｅ領域はリガ
ンド結合ドメインである。
【００９９】図１１および１２は、ステロイドホルモン
受容体スーパーファミリーのメンバーについてアミノ酸
配列を比較した模式図を示している。一次アミノ酸配列
は最もアミノ酸の類似性が高い領域に基づいて並べられ
ており、ｈＧＲ（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら，（１９８
５）を参照）に関連した各々の位置に対してアミノ酸の
同一性をパーセントで表示している。示されているドメ
インは：「最大活性」に必要とされるＮＨ2−末端のド
メイン；６６−６８アミノ酸のＤＮＡ結合ドメインコア
（「ＤＮＡ」）；および２５０アミノ酸のリガンド結合
（あるいはホルモン結合ドメイン）（「ホルモン」）で
ある。各々のドメインの境界にあるアミノ酸の位置が示
されている。全ての受容体に対するアミノ酸の番号は、
ｖ−ｅｒｂ−ＡおよびＥ７５（セグレイブス（Ｓｅｇｒ
ａｖｅｒｓ），１９８８）を除いてヒト型を示してい
る。機能の帰属は、グルココルチコイドおよびエストロ
ゲン受容体の性質を調べることにより決定された。名称
は以下の通りである：ＧＲはグルココルチコイド受容
体；ＭＲはミネラロコルチコイド受容体；ＰＲはプロゲ
ステロン受容体；ＥＲはエストロゲン受容体；ＥＲＲ１
あるいはＥＲＲ２はエストロゲン関連体１または２；Ｖ
ＤＲビタミンＤ3受容体；およびＴ3ＲβとＴ3Ｒαはチ
ロイドホルモン受容体である。（＋）あるいは（−）と
は、特定の性質がクローン化した受容体ＤＮＡの産物あ
るいは精製された受容体について示されるかを表わして
いる。ＨＲＥはホルモン応答性エレメントである。これ
は、結合部位が構造的に同定されているか、またはこれ
がその促進性が遺伝子転移を行った研究によって示され
るかに関連している。ＰＲについては、ＤＮＡ結合性は
無傷の精製された受容体についてのみ示されている。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ ホルモン結合性」は、その性質が
ウサギの網状赤血球溶解物の系（ホレンバーグら，（１
９８５））で翻訳することにより示されるかどうかを示
している。「クロモソーム」は、ヒトのクロモソームの
位置を示している。種は、ｈ，ヒト；ｒ、ラット；ｍ、
マウス；ｃ、ニワトリ；ｄ、ショウジョウバエである。
【０１００】図１３：キメラチロイド／グルココルチコ
イド受容体の構造と活性。
【０１０１】図１３の方法：複合型受容体を構築するた
めに、ｈＧＲとｈＴＲβのＤＮＡ結合ドメインに隣接し
て唯一のＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ部位が挿入された。複
合体は、受容体ｃＤＮＡの適当な部分を交換することに
より作製された。「ＤＮＡ」はＤＮＡ結合ドメインを表
わし；「Ｔ3／Ｔ4］および「コルチゾル」はそれぞれｈ
ＴＲβとｈＧＲのリガンド結合ドメインを示している。
箱の上の数字はアミノ酸残査を表わしている。複合体は
ドメインの起点に関連した文字によりつけられている；
例えば、「ＴＧＴ」はｈＴＲβのアミノおよびカルボキ
シ末端、ならびにｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインを持って
いる。全ての受容体に関し、Ｔ3および合成グルココル
チコイド・デキサメタゾン（「ｄｅｘ」）の非存在ある
いは存在下で、ＴＲＥ−ＭＣＡＴおよびＧＲＥ−ＭＣＡ
Ｔにおけるアッセイを行った。示されている全ての組合
せは、バックグラウンド以上に活性化を与えた。
【０１０２】参考文献 本明細書は以下の出版物を引用しており、その各々はこ
の参考文献によって明確に取り入れられている。
【０１０３】１．Ａｒｒｉｚａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，
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Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７ （１９７５）． ５０．Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．＆ Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．
Ｂ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４３：３０３４−３０４
０ （１９８３）． ５１．Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．＆ Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．
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ｉ，Ｖ．，Ｃｅｌｌ １５：３９３−４０３ （１９７
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Ｒｅｓ．１０：２９５１−２９６１ （１９８２）． ５５．Ｔｏｒａ，Ｌ．，Ｇｒｏｎｅｍｅｙｅｒ，Ｈ．，
Ｔｕｒｃｏｔｔｅ，Ｂ．，Ｇａｕｂ，Ｍ−Ｐ．，ａｎｄ
Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｐ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３３：１
８５−１８８ （１９８８）． ５６．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ
ｅｒ，Ｃ．，Ｉｅｂｏ，Ｒ．＆ Ｅｖａｎｓ，Ｒ．
Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７： １６１０−１６１４
（１９８７）． ５７．Ｔｉｃｋｌｅ，Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｊ．＆ Ｅｉｃｈ
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Ｇｕｄａｓ，Ｌ．Ｊ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１０７：７
５−８６ （１９８５）． ６０．Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｎ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｓ．，Ｊｉ
ｎ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄＣｈａｍｂｏｎ，Ｐ．，Ｃｅｌｌ
５４：１９９−２０７ （１９８８）． ６１．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．，Ｈｏｌｌｅｎｂｕ
ｒｇ，Ｓ．Ｍ．，Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．＆ Ｅ
ｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：６７０−
６７２ （１９８５）． ６２．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．，Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｏｎｇ，Ｅ．Ｓ．，Ｌｅｂｏ，Ｒ．，Ｇ
ｒｕｏｌ，Ｄ．Ｊ．＆ Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３２４：６４１−６４６ （１９８６）． ６３．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．，Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｏｎｇ，Ｅ．Ｓ．，Ｌｅｂｏ，Ｒ．，Ｇ
ｒｕｏｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２４：６４１−６４６ （１９８６）． ６４．Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ
１６：７７７−７８５（１９７９）． ６５．Ｗｏｌｂａｃｋ，Ｓ．Ｂ．＆ Ｈｏｗｅ，Ｐ．
Ｒ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６２：７５３−７７７
（１９２５）。
【０１０４】明細書の要約 上述の説明から、通常の当業者はこの発明がレチノイン
酸受容体タンンパク質と呼ばれるレチノイド受容体タン
パク質をコードする、実質的に純粋なＤＮＡを与えるこ
とを理解することができる。本発明はまた、レチノイン
酸受容体を含むプラスミドを与える。このプラスミド、
すなわちｐｈＲＡＲ１は、特許取得の目的でアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されてい
る。
【０１０５】本発明は、本発明のＤＮＡ（あるいはｍＲ
ＮＡ）から発現される、修飾された機能型のタンパク質
を含むレチノイン酸受容体タンパク質をもまた含んでい
る。
【０１０６】新奇なレチノイン酸受容体ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、タンパク質組成物に加え、本発明は互いにｈＧＲ、
ｈＭＲ、ｈＥＲＲ１、ｈＥＲＲ２、Ｔ３Ｒα、Ｔ３Ｒ
β、ＲＡＲαおよびＲＡＲβ受容体由来の（１）Ｎ−末
端ドメイン、（２）ＤＮＡ結合ドメイン、（３）リガン
ド結合ドメインを交換することにより作製されたキメラ
複合型受容体を含んでいる。このようにして構築された
キメラ受容体は、各々が起因するところの「親」受容体
が持つＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメイン
の特徴に似た、ＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合
ドメインの性質を有している。
【０１０７】最後に、本発明は野生型およびキメラ型の
受容体タンパク質に対する、機能的リガンドを決定する
バイオアッセイを含んでいる。
【０１０８】本発明のｐｈＲＡＲ１ ＤＮＡは、その品
質において以前は生産が不可能であったようなレチノイ
ン酸受容体タンパク質および、その機能的修飾を行った
形のタンパク質を作るために用いることができる。これ
は、キメラ受容体に関しても当てはまることである。本
発明の結果得られる受容体タンパク質の品質に関し、リ
ガンド／受容体複合体およびリガンド／受容体／ＨＲＥ
複合体の両者について詳細な研究が可能である。加え
て、レチノイン酸受容体タンパク質を適切に供給できる
ということは、現在では、それらをレチノイン酸受容体
の拮抗物質、あるいはレチノイン酸受容体に対する拮抗
活性を有する化合物を検索するために用いることも可能
であることを意味している。受容体タンパク質が入手可
能であるということは、種々の組織および体液中に存在
するレチノイン酸のレベルを決定する診断のためのアッ
セイに、それらを用いることができることを意味してい
る。
【０１０９】本発明の精神および目的から離れることな
しに、或または通常の当業者は、本発明を種々の用法お
よび条件に適用するために、本発明に対し種々の変更お
よび修飾をすることが可能である。そのような場合、こ
れらの変更および修飾は、以下に示す請求の範囲の同義
の全域において適切でかつ正当であり、またそのように
なされるよう意図するものである。
【０１１０】
【配列表】
【０１１１】配列番号：１ 配列の長さ：２９４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： GCCATCTGGG CCCAGGCCCC ATGCCCCGAG GAGGGGTGGT CTGAAGCCCA CCAGAGCCCC 60 CTGCCAGACT GTCTGCCTCC CTTCTGACTG 90 TGG CCG CTT GGC ATG GCC AGC AAC AGC AGC TCC TGC CCG ACA CCT 135 Met Ala Ser Asn Ser Ser Ser Cys Pro Thr Pro 1 11 GGG GGC GGG CAC CTC AAT GGG TAC CCG GTG CCT CCC TAC GCC TTC 180 Gly Gly Gly His Leu Asn Gly Tyr Pro Val Pro Pro Tyr Ala Phe 21 TTC TTC CCC CCT ATG CTG GGT GGA CTC TCC CCG CCA GGC GCT CTG 225 Phe Phe Pro Pro Met Leu Gly Gly Leu Ser Pro Pro Gly Ala Leu 31 41 ACC ACT CTC CAG CAC CAG CTT CCA GTT AGT GGA TAT AGC ACA CCA 270 Thr Thr Leu Gln His Gln Leu Pro Val Ser Gly Tyr Ser Thr Pro 51 TCC CCA GCC ACC ATT GAG ACC CAG AGC AGC AGT TCT GAA GAG ATA 315 Ser Pro Ala Thr Ile Glu Thr Gln Ser Ser Ser Ser Glu Glu Ile 61 71 GTG CCC AGC CCT CCC TCG CCA CCC CCT CTA CCC CGC ATC TAC AAG 360 Val Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro Pro Leu Pro Arg Ile Tyr Lys 81 CCT TGC TTT GTC TGT CAG GAC AAG TCC TCA GGC TAC CAC TAT GGG 405 Pro Cys Phe Val Cys Gln Asp Lys Ser Ser Gly Tyr His Tyr Gly 91 101 GTC AGC GCC TGT GAG GGC TGC AAG GGC TTC TTC CGC CGC AGC ATC 450 Val Ser Ala Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Ile 111 CAG AAG AAC ATG GTG TAC ACG TGT CAC CGG GAC AAG AAC TGC ATC 495 Gln Lys Asn Met Val Tyr Thr Cys His Arg Asp Lys Asn Cys Ile 121 131 ATC AAC AAG GTG ACC CGG AAC CGC TGC CAG TAC TGC CGA CTG CAG 540 Ile Asn Lys Val Thr Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Leu Gln 141 AAG TGC TTT GAA GTG GGC ATG TCC AAG GAG TCT GTG AGA AAC GAC 585 Lys Cys Phe Glu Val Gly Met Ser Lys Glu Ser Val Arg Asn Asp 151 161 CGA AAC AAG AAG AAG AAG GAG GTG CCC AAG CCC GAG TGC TCT GAG 630 Arg Asn Lys Lys Lys Lys Glu Val Pro Lys Pro Glu Cys Ser Glu 171 AGC TAC ACG CTG ACG CCG GAG GTG GGG GAG CTC ATT GAG AAG GTG 675 Ser Tyr Thr Leu Thr Pro Glu Val Gly Glu Leu Ile Glu Lys Val 181 191 CGC AAA GCG CAC CAG GAA ACC TTC CCT GCC CTC TGC CAG CTG GGC 720 Arg Lys Ala His Gln Glu Thr Phe Pro Ala Leu Cys Gln Leu Gly 201 AAA TAC ACT ACG AAC AAC AGC TCA GAA CAA CGT GTC TCT CTG GAC 765 Lys Tyr Thr Thr Asn Asn Ser Ser Glu Gln Arg Val Ser Leu Asp 211 221 ATT GAC CTC TGG GAC AAG TTC AGT GAA CTC TCC ACC AAG TGC ATC 810 Ile Asp Leu Trp Asp Lys Phe Ser Glu Leu Ser Thr Lys Cys Ile 231 ATT AAG ACT GTG GAG TTC GCC AAG CAG CTG CCC GGC TTC ACC ACC 855 Ile Lys Thr Val Glu Phe Ala Lys Gln Leu Pro Gly Phe Thr Thr 241 251 CTC ACC ATC GCC GAC CAG ATC ACC CTC CTC AAG GCT GCC TGC CTG 900 Leu Thr Ile Ala Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Ala Cys Leu 261 GAC ATC CTG ATC CTG CGG ATC TGC ACG CGG TAC ACG CCC GAG CAG 945 Asp Ile Leu Ile Leu Arg Ile Cys Thr Arg Tyr Thr Pro Glu Gln 271 281 GAC ACC ATG ACC TTC TCG GAC GGG CTG ACC CTG AAC CGG ACC CAG 990 Asp Thr Met Thr Phe Ser Asp Gly Leu Thr Leu Asn Arg Thr Gln 291 ATG CAC AAC GCT GGC TTC GGC CCC CTC ACC GAC CTG GTC TTT GCC 1035 Met His Asn Ala Gly Phe Gly Pro Leu Thr Asp Leu Val Phe Ala 301 311 TTC GCC AAC CAG CTG CTG CCC CTG GAG ATG GAT GAT GCG GAG ACG 1080 Phe Ala Asn Gln Leu Leu Pro Leu Glu Met Asp Asp Ala Glu Thr 321 GGG CTG CTC AGC GCC ATC TGC CTC ATC TGC GGA GAC CGC CAG GAC 1125 Gly Leu Leu Ser Ala Ile Cys Leu Ile Cys Gly Asp Arg Gln Asp 331 341 CTG GAG CAG CCG GAC CGG GTG GAC ATG CTG CAG GAG CCG CTG CTG 1170 Leu Glu Gln Pro Asp ArgV Al Asp Met Leu Gln Glu Pro Leu Leu 351 GAG GCG CTA AAG GTC TAC GTG CGG AAG CGG AGG CCC AGC CGC CCC 1215 Glu Ala Leu Lys Val Tyr Val Arg Lys Arg Arg Pro Ser Arg Pro 361 371 CAC ATG TTC CCC AAG ATG CTA ATG AAG ATT ACT GAC CTG CGA AGC 1260 His Met Phe Pro Lys Met Leu Met Lys Ile Thr Asp Leu Arg Ser 381 ATC AGC GCC AAG GGG GCT GAG CGG GTG ATC ACG CTG AAG ATG GAG 1305 Ile Ser Ala Lys Gly Ala Glu Arg Val Ile Thr Leu Lys Met Glu 391 401 ATC CCG GGC TCC ATG CCG CCT CTC ATC CAG GAA ATG TTG GAG AAC 1350 Ile Pro Gly Ser Met Pro Pro Leu Ile Gln Glu Met Leu Glu Asn 411 TCA GAG GGC CTG GAC ACT CTG AGC GGA CAG CCG GGG GGT GGG GGG 1395 Ser Glu Gly Leu Asp Thr Leu Ser Gly Gln Pro Gly Gly Gly Gly 421 431 CGG GAC GGG GGT GGC CTG GCC CCC CCG CCA GGC AGC TGT AGC CCC 1440 Arg Asp Gly Gly Gly Leu Ala Pro Pro Pro Gly Ser Cys Ser Pro 441 AGC CTC AGC CCC AGC TCC AAC AGA AGC AGC CCG GCC ACC CAC TCC 1485 Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn Arg Ser Ser Pro Ala Thr His Ser 451 461 CCG TGA CCGCCCACGC CACATGGACA CAGCCCTCGC CCTCCGCCC 1530 Pro End CGGCTTTTCT CTGCCTTTCT ACCGACCATG TGACCCCGCA CCAGCCCTGC CCCCACCTGC 1590 CCTCCCGGGC AGTACTGGGG ACCTTCCCTG GGGGACGGGG AGGGAGGAGG CAGCGACTCC 1650 TTGGACAGAG GCCTGGGCCC TCAGTGGACT GCCTGCTCCC ACAGCCTGGG CTGACGTCAG 1710 AGGCCGAGGC CAGGAACTGA GTGAGGCCCC TGGTCCTGGG TCTCAGGATG GGTCCTGGGG 1770 GCCTCGTGTT CATCAAGACA CCCCTCTGCC CAGCTCACCA CATCTTCATC ACCAGCAAAC 1830 GCCAGGACTT GGCTCCCCCA TCCTCAGAAC TCACAAGCCA TTGCTCCCCA GCTGGGGAAC 1890 CTCAACCTCC CCCCTGCCTC GGTTGGTGAC AGAGGGGGTG GGACAGGGGC GGGGGGTTCC 1950 CCCTGTACAT ACCCTGCCAT ACCAACCCCA GGTATTAATT CTCGCTGGTT TTGTTTTTAT 2010 TTTAATTTTT TTGTTTTGAT TTTTTTAATA AGAATTTTCA TTTTAAGCAC ATTTATACTG 2070 AAGGAATTTG TGCTGTGTAT TGGGGGGAGC TGGATCCAGA GCTGGAGGGG GTGGGTCCGG 2130 GGGAGGGAGT GGCTCGGAAG GGGCCCCCAC TCTCCTTTCA TGTCCCTGTG CCCCCCAGTT 2190 CTCCTCCTCA GCCTTTTCCT CCTCAGTTTT CTCTTTAAAA CTGTGAAGTA CTAACTTTCC 2250 AAGGCCTGCC TTCCCCTCCC TCCCACTGGA GAAGCCGCCA GCCCCTTTCT CCCTCTGCCT 2310 GACCACTGGG TGTGGACGGT GTGGGGCAGC CCTGAAAGGA CAGGCTCCTG GCCTTGGCAC 2370 TTGCCTGCAC CCACCATGAG GCATGGAGCA GGGCAGAGCA AGGGCCCCGG GACAGAGTTT 2430 TCCCAGACCT GGCTCCTCGG CAGAGCTGCC TCCCGTCAGG GCCCACATCA TCTAGGCTCC 2490 CCAGCCCCCA CTGTGAAGGG GCTGGCCAGG GGCCCGAGCT GCCCCCACCC CCGGCCTCAG 2550 CCACCAGCAC CCCCATAGGG CCCCCAGACA CCACACACAT GCGCGTGCGC ACACACACAA 2610 ACACACACAC ACTGGACAGT AGATGGGCCG ACACACACTT GGCCCGAGTT CCTCCATTTC 2670 CCTGGCCTGC CCCCCACCCC CAACCTGTCC CACCCCCGTG CCCCCTCCTT ACCCCGCAGG 2730 ACGGGCCTAC AGGGGGGTCT CCCCTCACCC CTGCACCCCC AGCTGGGGGA GCTGGCTCTG 2790 CCCCGACCTC CTTCACCAGG GGTTGGGGCC CCTTCCCCTG GAGCCCGTGG GTGCACCTGT 2850 TACTGTTGGG CTTTCCACTG AGATCTACTG GATAAAGAAT AAAGTTCTAT TTATTCTAAA 2910 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2940
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はｐｈＲＡＲαの成分構造を制限酵素切
断部位と並べて示した線状図である。
【図２】 図２は、ｐｈＲＡＲαのＤＮＡヌクレオチド
配列および一次タンパク質配列を示す図である。図２−
４は、ｐｈＲＡＲαの全長のヌクレオチド配列およびそ
の一次アミノ酸配列を示している。
【図３】 図３は、ｐｈＲＡＲαのＤＮＡヌクレオチド
配列および一次タンパク質配列を示す図である。図２−
４は、ｐｈＲＡＲαの全長のヌクレオチド配列およびそ
の一次アミノ酸配列を示している。
【図４】 図４は、ｐｈＲＡＲαのＤＮＡヌクレオチド
配列および一次タンパク質配列を示す図である。図２−
４は、ｐｈＲＡＲαの全長のヌクレオチド配列およびそ
の一次アミノ酸配列を示している。
【図５】 図５Ａはキメラ受容体ｈＲＧＲの構造の模式
図である。図５Ｂはレチノイン酸によるＣＡＴ活性の誘
導を示すブロットである。
【図６】 図６Ａはレチノイドに対する使用量依存性を
示すグラフである。図６ＢはトランスフェクトされたＣ
ＯＳ−１細胞の細胞質抽出液に対するレチノイン酸結合
を示す棒グラフである。
【図７】 図７ＡおよびＢはヒトゲノムＤＮＡのサザン
ブロット分析を示している。図７Ａは厳しい条件下でハ
イブリダイズさせた、消化されたヒト胎盤ＤＮＡを示し
ている。図７Ｂは同じＤＮＡを厳しくない条件下でハイ
ブリダイズさせたものを示している。
【図８】 図８はラットおよびヒト組織中のレチノイン
酸受容体ｍＲＮＡのノザンブロット分析を示している。
【図９】 図９は、ｈＧＲ、ｈＲＲ、およびｈＴ3 Ｒβ
の比較を示す模式図である。
【図１０】 図１０は一般化したステロイド／チロイド
／レチノイン酸受容体遺伝子の模式図である。
【図１１】 図１１はステロイドホルモン受容体スーパ
ーファミリーに含まれるもののアミノ酸比較を示す模式
図である。
【図１２】 図１２はステロイドホルモン受容体スーパ
ーファミリーに含まれるもののアミノ酸比較を示す模式
図である。
【図１３】 図１３はキメラチロイド／グルココルチコ
イド受容体の構造および活性を示す模式図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図１０】
【図２】
【図４】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/566 33/566 // Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 596086505 10010 Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉ ｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ ａｌｉｆｏｒｎｉａ 92037，Ｕｎｉｔｅ ｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 エヴァンス，ロナルド・マーク アメリカ合衆国カリフォルニア州92037, ラ・ホーラ，ラ・ホーラ・シーニック・ド ライブ・ノース 8615 (72)発明者 ジギュール，ヴィンセント カナダ国オンタリオ州エム９エイ・５シー ６，エトビコーク，イスリントン・アベニ ュー 1320，アパートメント 606 (72)発明者 オング，エステリタ・セバスチャン アメリカ合衆国カリフォルニア州92117, サンディエゴ，ハノン・コート 6307 (72)発明者 セギュイ，プルディマー・セラーノ アメリカ合衆国カリフォルニア州92104, サンディエゴ，オレゴン・ストリート 4152，アパートメント ４ (72)発明者 ウメソノ，カズヒコ アメリカ合衆国カリフォルニア州92122, サンディエゴ，デコーロ・ストリート 4178 ナンバー 60 (72)発明者 トンプソン，キャサリン・キャロライン アメリカ合衆国カリフォルニア州92037, ラ・ホーラ，ミラマー・ストリート 3903，アパートメント エフ

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 受容体タンパク質に対する機能的リガン
    ドを同定する方法であって、 （ａ） 推定上のリガンド結合ドメインおよび推定上の
    ＤＮＡ結合ドメインを有するＤＮＡ配列を単離し； （ｂ） 工程（ａ）のＤＮＡ配列のＤＮＡ結合ドメイン
    領域を、既知のリガンド応答性受容体タンパク質からの
    ＤＮＡ結合ドメイン領域で置き換えることにより、キメ
    ラ遺伝子を構築し； （ｃ） 適当な受容体欠損宿主細胞を、 （１） 工程（ｂ）からのキメラ遺伝子、および（２）
    工程（ｂ）のキメラ遺伝子によりコードされる受容体
    タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン領域により活性化され
    ることができる作用性のホルモン応答性要素と機能的に
    連結されたレポーター遺伝子、によりトランスフェクト
    し； （ｄ） 工程（ｃ）で得られたトランスフェクトされた
    宿主細胞を、工程（ｂ）のキメラ遺伝子によりコードさ
    れるキメラ受容体タンパク質のリガンド結合ドメイン領
    域と結合することが可能である一群の候補リガンドを用
    いて検定し； （ｅ） レポーター遺伝子によりコードされるタンパク
    質のタンパク質レベルの変化によりレポーター遺伝子の
    誘導をモニターし； （ｆ） レポーター遺伝子のタンパク質産物の産生を誘
    導しうるリガンドを機能的リガンドとして選択する；の
    各工程を含む方法。
  2. 【請求項２】 工程（ｂ）における既知のリガンド応答
    性受容体タンパク質が、グルココルチコイド受容体、ミ
    ネラルコルチコイド受容体、ヒトチロイド受容体αおよ
    びβおよびラットチロイド受容体α、エストロゲン関連
    受容体ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２、ならびにレチノイ
    ン酸受容体αおよびβからなる群より選択される、請求
    項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 工程（ｃ）における宿主細胞がＣＯＳ細
    胞である請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 工程（ｃ）（２）におけるレポーター遺
    伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
    ーゼ（ＣＡＴ）遺伝子およびホタルルシフェラーゼ遺伝
    子からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 工程（ｃ）（２）におけるホルモン応答
    性要素が、野生型の、工学的につくり出されたまたは合
    成の、（１）グルココルチコイド応答性要素、（２）チ
    ロイド応答性要素、（３）ミネラルコルチコイド応答性
    要素、（４）エストロゲン関連応答性要素、（５）レチ
    ノイン酸応答性要素、および（６）ビタミンＤ３応答性
    要素、からなる群より選択される、請求項１記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 グルココルチコイド応答性要素が乳癌ウ
    イルス長末端反復配列（ＭＴＶ ＬＴＲ）の一部分であ
    り、かつ、チロイド応答性要素が成長ホルモンプロモー
    ター配列の一部分である、請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 工程（ｆ）において同定されるリガンド
    が、工程（ａ）のＤＮＡ配列の発現産物および工程
    （ｆ）において同定されるリガンドの結合特性を評価す
    ることにより確証される、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 細胞内の受容体タンパク質に対する機能
    的リガンドを同定する方法であって、該細胞は、（ａ）
    第２の受容体配列のリガンド結合ドメインの作用性の
    部分（Ｂ）と連結された第１の受容体配列のＤＮＡ結合
    ドメインの作用性の部分（Ａ）からなるキメラＤＮＡ配
    列（Ｃ）、および（ｂ） 作用性のホルモン応答性要素
    に機能的に連結されたレポーター核酸配列を含み、ここ
    で第１の受容体配列のＤＮＡ結合ドメインの作用性の部
    分はレポーター配列に機能的に連結されたホルモン応答
    性要素と機能的に結合しかつそれを活性化させることが
    でき、該方法は、細胞を少なくとも１つの候補リガンド
    で試験し、レポーター配列の発現産物の量の変化により
    レポーター核酸配列の誘導をモニターすることを含む方
    法。
  9. 【請求項９】 前記細胞がＣＯＳ細胞である、請求項８
    記載の方法。
  10. 【請求項１０】 レポーター遺伝子が、クロラムフェニ
    コールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子お
    よびホタルルシフェラーゼ遺伝子からなる群より選択さ
    れる、請求項８記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ホルモン応答性要素が、野生型の、工
    学的につくり出されたまたは合成の、（１）グルココル
    チコイド応答性要素、（２）チロイド応答性要素、
    （３）ミネラルコルチコイド応答性要素、（４）エスト
    ロゲン関連応答性要素、（５）レチノイン酸応答性要
    素、および（６）ビタミンＤ３応答性要素、からなる群
    より選択される請求項８記載の方法。
  12. 【請求項１２】 グルココルチコイド応答性要素が、乳
    癌ウイルス長末端反復配列（ＭＴＶ ＬＴＲ）の一部分
    であり、かつ、チロイド応答性要素が成長ホルモンプロ
    モーター配列の一部分である、請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 化合物がレチノイン酸レセプターの機
    能的リガンドであるか否かを評価するためのバイオアッ
    セイ法であって、（ａ）レチノイン酸レセプターを発現
    する非外来性ＤＮＡ、およびレポーター遺伝子に連結さ
    れた、作用可能なレチノイン酸レセプター応答要素を含
    むＤＮＡを含む細胞を培養し、ここで前記培養は、前記
    レチノイン酸レセプターのリガンドとして機能するその
    能力を決定することが求められている少なくとも１つの
    化合物の存在下で実施され、そして（ｂ）前記細胞にお
    ける前記レポーター遺伝子の転写の証拠についてアッセ
    イするの各工程を含む方法。
  14. 【請求項１４】 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求
    項１３記載のバイオアッセイ法。
  15. 【請求項１５】 前記細胞がＣＶ−１またはＣＯＳ細胞
    である、請求項１３または１４に記載のバイオアッセイ
    法。
  16. 【請求項１６】 前記レポーター遺伝子がレポータープ
    ラスミド中に含まれ、ここで前記レチノイン酸レセプタ
    ーを発現する前記非外来性ＤＮＡは発現プラスミド中に
    含まれ、ここで、前記レポーターおよび発現プラスミド
    は真核生物複製起点をも含む、請求項１３−１５のいず
    れかに記載のバイオアッセイ法。
  17. 【請求項１７】 前記レポーター遺伝子がレポータープ
    ラスミド中に含まれ、ここで前記レチノイン酸レセプタ
    ーを発現する前記非外来性ＤＮＡは発現プラスミド中に
    含まれ、ここで前記レポーターおよび発現プラスミドは
    選択マーカーをも含む、請求項１３−１６のいずれかに
    記載のバイオアッセイ法。
  18. 【請求項１８】 前記レポーター遺伝子がＣＡＴであ
    る、請求項１３−１７のいずれかに記載のバイオアッセ
    イ法。
  19. 【請求項１９】 前記アッセイが前記レポーター遺伝子
    から転写されたｍＲＮＡを含む、請求項１３−１８のい
    ずれかに記載のバイオアッセイ法。
  20. 【請求項２０】 前記バイオアッセイ法が前記細胞にお
    ける前記レポーター遺伝子の転写の誘導をアッセイする
    ことを含む、請求項１３−１９のいずれかに記載のバイ
    オアッセイ法。
  21. 【請求項２１】 化合物がレチノイン酸レセプターのア
    ンタゴニストであるか否かを評価するためのバイオアッ
    セイ法であって、（ａ）レチノイン酸レセプターのアゴ
    ニストの転写活性化活性を阻害するその能力を決定する
    ことが求められている、増加する濃度の少なくとも１つ
    の化合物、および固定された濃度の少なくとも１つの前
    記レチノイン酸レセプターのアゴニストを含む培地中で
    試験細胞を培養し、ここで前記試験細胞は、前記レチノ
    イン酸レセプターを発現する非外来性ＤＮＡ、およびレ
    ポーター遺伝子に作用可能なように連結されたレチノイ
    ン酸レセプター応答要素を含むＤＮＡを含み；次に
    （ｂ）前記培地中の前記化合物の濃度の関数として、前
    記細胞における前記レポーター遺伝子の転写の証拠につ
    いてアッセイし、このことによりレチノイン酸レセプタ
    ーのアゴニストによる転写の活性化を阻害する前記化合
    物の能力が指示される、の各工程を含む方法。
  22. 【請求項２２】 細胞が哺乳動物細胞である、請求項２
    １記載のバイオアッセイ法。
  23. 【請求項２３】 前記細胞がＣＶ−１またはＣＯＳ細胞
    である、請求項２１または２２に記載のバイオアッセイ
    法。
  24. 【請求項２４】 前記レポーター遺伝子がレポータープ
    ラスミド中に含まれ、ここで前記ホルモンレセプター蛋
    白質を発現する前記非外来性ＤＮＡまたはその機能的改
    変形が発現プラスミド中に含まれ、ここで前記レポータ
    ーおよび発現プラスミドは真核生物複製起点をも含む、
    請求項２１−２３のいずれかに記載のバイオアッセイ
    法。
  25. 【請求項２５】 前記レポーター遺伝子がレポータープ
    ラスミド中に含まれ、ここで前記ホルモンレセプター蛋
    白質を発現する前記非外来性ＤＮＡまたはその機能的改
    変形が発現プラスミド中に含まれ、ここで前記レポータ
    ーおよび発現プラスミドは選択マーカーをも含む、請求
    項２１−２４のいずれかに記載のバイオアッセイ法。
  26. 【請求項２６】 前記レポーター遺伝子がＣＡＴであ
    る、請求項２１−２５のいずれかに記載のバイオアッセ
    イ法。
  27. 【請求項２７】 前記監視が、前記レポーター遺伝子か
    ら転写されたｍＲＮＡをアッセイすることを含む、請求
    項２１−２６のいずれかに記載のバイオアッセイ法。
  28. 【請求項２８】 前記バイオアッセイ法が、前記細胞に
    おける前記レポーター遺伝子の転写の誘導をアッセイす
    ることを含む、請求項２１−２７のいずれかに記載のバ
    イオアッセイ法。
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