DE69709561T2

DE69709561T2 - Östrogen-Rezeptor

Info

Publication number: DE69709561T2
Application number: DE69709561T
Authority: DE
Inventors: Rein Dijkema; Sietse Mosselman
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 2002-08-29
Anticipated expiration: 2017-03-26
Also published as: AU1652197A; EP0798378B1; EP0798378A3; EP1162264A3; ES2123482T3; HK1001978A1; US6680368B1; EP0798378A2; CA2200423A1; EP1162264A2; GR980300076T1; CA2200423C; DE69709561D1; KR19980041692A; JPH104986A; HU9700636D0; ATE212055T1; US6713270B1; HUP9700636A2; ES2123482T1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf den Bereich der Rezeptoren, die der Überfamilie der nukleären Hormonrezeptoren, insbesondere der Steroidrezeptoren, angehören. Die Erfindung bezieht sich auf DNA, die einen neuartigen Steroidrezeptor kodiert, auf die Herstellung des genannten Rezeptors, auf das Rezeptorprotein und auf deren Anwendung.
Steroidhormonrezeptoren gehören zu der Überfamilie der nukleären Hormonrezeptoren und sind an der Ligandenabhängigen transkriptionellen Kontrolle der Genexpression beteiligt. Zusätzlich beinhaltet diese Überfamilie Rezeptoren für nichtsteroidale Hormone, wie Vitamin D, Schilddrüsenhormone und Retinoide (Giguere et al., Nature 330, 624-629, 1987; Evans, R.M., Science 240, 889-895, 1988). Überdies sind eine Reihe von nukleären rezeptorartigen Sequenzen identifiziert worden, die sogenannte "Waisen (orphan)"-Rezeptoren kodieren: diese Rezeptoren sind strukturell verwandt und daher als nukleäre Rezeptoren klassifiziert, obwohl keine putativen Liganden bislang identifiziert worden sind (B.W. O'Malley, Endocrinology 125, 1119-1170, 1989; D.J. Mangelsdorf und R.M. Evans, Cell, 83, 841-850, 1995).
Der Überfamilie der nukleären Hormonrezeptoren ist eine moduläre Struktur gemeinsam, in welcher sechs ausgeprägte strukturelle und funktionelle Domänen, A bis F, dargestellt sind (Evans, Science 240, 889-895, 1988). Ein nukleärer Hormonrezeptor wird durch variable N-terminale Regionen (Domäne A/B) charakterisiert, gefolgt von einer zentral lokalisierten, stark konservierten, DNA-bindenden Domäne (hierin im Weiteren als DBD bezeichnet; Domäne C), einer variablen Gelenksregion (Domäne D), einer konservierten Liganden-bindenden Domäne (hierin im Weiteren als LBD bezeichnet; Domäne E) und einer variablen C-terminalen Region (Domäne F).
Die N-terminale Region, welche bezüglich Grösse und Sequenz stark variiert, ist unter den verschiedenen Mitgliedern der Überfamilie schwach konserviert. Dieser Teil des Rezeptors ist bei der Modulation der Transkriptionsaktivierung beteiligt (Bocquel et al., Nucl. Acid. Res., 17, 2581-2595, 1989; Tora et al., Cell 59, 477-487, 1989).
Die DBD beinhaltet ungefähr 66 bis 70 Aminosäuren und ist verantwortlich für die DNA-bindende Aktivität: sie leitet den Rezeptor an spezifische DNA-Sequenzen, die sogenannten hormonresponsiven Elemente (hierin im Weiteren als HRE bezeichnet) innerhalb der Transkriptionskontrolleinheit des spezifischen Zielgens auf dem Chromatin (Martinez und Wahli, in "Nuclear Hormone Receptors", Acad. Press, 125- 153, 1991).
Die LBD ist auf dem C-terminalen Teil des Rezeptors lokalisiert und ist primär verantwortlich für die Ligandenbindende Aktivität. Auf diese Weise ist das LBD notwendig für die Erkennung und Bindung des Hormonliganden und besitzt zusätzlich eine transkriptionsaktivierende Aufgabe, die somit die Spezifität und Selektivität der Hormonantwort auf den Rezeptor bestimmt. Obwohl sie strukturell mittelmässig konserviert sind, sind die LBDs dafür bekannt, dass sie sich in der Homologie zwischen den einzelnen Mitgliedern der nukleären Hormonrezeptor-Überfamilie beachtlich unterscheiden (Evans, Science 240, 889-895, 1988; P.J. Fuller, FASEB J., 5, 3092-3099, 1991; Mangelsdorf et al., Cell, Vol. 83, 835-839, 1995).
Die Funktionen in der N-terminalen Region lokalisiert, operieren LBD und DBD unabhängig voneinander und es konnte gezeigt werden, dass diese Domänen zwischen den nukleären Rezeptoren ausgetauscht werden können (Green et al., Nature, Vol. 325, 75-78, 1987). Dies ergibt chimäre, nukleäre Rezeptoren, wie sie zum Beispiel in WO-A-8905355 beschrieben werden.
Wenn ein Hormonligand für einen nukleären Rezeptor in die Zelle durch Diffusion eintritt und durch die LBD erkannt wird, wird er an ein spezifisches Rezeptorprotein binden und damit eine allosterische Veränderung des Rezeptorproteins einleiten. Als Folge dieser Veränderung wechselt der Ligand-Rezeptor-Komplex zu einem transkriptionell aktiven Zustand und als solcher ist er in der Lage über die Gegenwart von DBD mit hoher Affinität an den korrespondierenden HRE auf der Chromatin-DNA zu binden (Martinez und Wahli, "Nuclear Hormone Recegtors", 125-153, Acad. Press, 1991). Auf diese Weise moduliert der Ligand- Rezeptor-Komplex die Expression der spezifischen Zielgene. Die Diversität, die durch diese Familie von Rezeptoren erreicht wird, ergibt sich aus ihrer Fähigkeit auf verschiedene Liganden zu reagieren.
Die Steroidhormonrezegtoren sind eine Klasse für sich in der nukleären Rezeptorüberfamilie, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Liganden Steroidhormone sind. Die Rezeptoren für Glucokortikoide (GR), Mineralkortikoide (MR), Gestagene (PR), Androgene (AR) und Östrogene (ER) sind klassische Steroidrezeptoren. Die Steroidrezeptoren haben weiter die einzigartige Fähigkeit über die Aktivierung sich an palindromische DNA-Sequenzen, die sogenannten HREs, als Homodimere zu binden. Die GR, MR, PR und AR erkennen dieselbe DNA-Sequenz, während der ER eine andere DNA-Sequenz erkennt (Beato et al., Cell, Vol. 83, 851-857, 1995). Nach der Bindung an DNA soll der Steroidrezeptor mit Komponenten des transkriptionellen Basisvorgangs und sequenzspezifischen Transkriptionsfaktoren interagieren und damit die Expression spezifischer Zielgene modulieren.
Verschiedene HREs sind identifiziert worden, die auf den Hormon-Rezeptor-Komplex antworten. Diese HREs sind in den transkriptionellen Kontrolleinheiten der verschiedenen Zielgene lokalisiert, so wie die Wachstumshormon-Gene der Säugetiere (reagierend auf Glukokortikoid, Östrogen, Testosteron), Prolaktin-Gene und Progesteronrezeptor-Gene von Säugetieren (reagierend auf Östrogen), Ovalbumin-Gene der Vögel (reagierend auf Progesteron), Metallothionin-Gen (reagierend auf Glukokortikoide) und von Säugetieren stammendes hepatisches α2u-Globulin-Gen (reagierend auf Östrogen, Testosteron, Glukokortikoid).
Von den Steroidhormonrezeptoren ist bekannt gewesen, dass sie bei der Embryogenese, der Homöostase der Erwachsenen genauso wie bei der Organphysiologie eine Rolle spielen. Verschiedene Erkrankungen und Anomalien sind einer Störung in der Reaktionskette der Steroidhormone zuzuschreiben. Da die Steroidrezeptoren ihren Einfluss als hormonaktivierte transkriptionelle Modulatoren ausüben, kann es erwartet werden, dass Mutationen und Defekte in diesen Rezeptoren, genauso wie Überstimulationen oder Blockierungen dieser Rezeptoren die zugrundeliegende Ursache für die veränderten Phänomene sein könnte. Eine bessere Kenntnis dieser Rezeptoren, ihrer Reaktionsmechanismen und der Liganden, die an den genannten Rezeptor binden, könnten helfen einen besseren Einblick in die zugrundeliegenden Mechanismen der Hormon-Signal-Transduktions-Reaktionskette zu erlangen, was eventuell zu einer verbesserten Behandlung der Erkrankungen und Anomalien, die mit einer gestörten Hormon-Rezeptor- Funktion in Verbindung stehen, führen wird.
Aus diesem Grund sind cDNA's der steroidalen und verschiedener anderer nukleärer Rezeptoren von unterschiedlichen Säugetieren, einschliesslich der Menschen, isoliert worden und die korrespondierenden Aminosäuresequenzen sind abgeleitet worden, wie zum Beispiel die menschlichen Steroidrezeptoren PR, ER, GR, MR und AR, die menschlichen nichtsteroidalen Rezeptoren für Vitamin D, Schilddrüsenhormone und Retinoide, wie das Retinol A und Retinoinsäure. Zusätzlich sind cDNA's, die gut über 100 Orphanrezeptoren von Säugetieren kodieren, isoliert worden, für die bislang keine mutmasslichen Liganden bekannt sind (Mangelsdorf et al., Cell, Vol.83, 835-839, 1995). Trotzdem gibt es noch einen grossen Bedarf an der Erforschung anderer nukleärer Rezeptoren, um die unterschiedlichen Rollen, die diese Rezeptoren in Physiologie und Pathologie spielen, zu entwirren.
Die vorliegende Erfindung stellt einen solchen neuartigen nukleären Rezeptor bereit. Noch genauer stellt die Erfindung einen isolierten Östrogenrezeptor bereit, der eine N-terminale Domäne, eine DNA-bindende Domäne und eine Liganden-bindende Domäne besitzt, wobei die Aminosäuresequenz der genannten DNA-bindenden Domäne wenigstens eine 80% Homologie mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt wird, zeigt und die Aminosäuresequenz der genannten Liganden-bindenden Domäne des genannten Östrogenrezeptors wenigstens eine 70% Homologie mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 4 gezeigt wird, aufweist,
vorausgesetzt, dass der Östrogenrezeptor nicht die folgende Aminosäuresequenz hat:
Der Verzicht bezieht sich auf die nicht vorveröffentlichte Patenanmeldung WO 9709348.
Hiermit stellt die vorliegende Erfindung einen neuartigen Steroidrezeptor bereit, der eine Östrogen-vermittelte Aktivität besitzt. Die genannten neuartigen Steroidrezeptoren sind neuartige Östrogenrezeptoren, die in der Lage sind zum Beispiel Östradiol, Östron und Östradiol zu binden und durch sie aktiviert zu werden. Gemäss vorliegender Erfindung wurde festgestellt, dass ein neuartiger Östrogenrezeptor wie ein 8 kb Transkript im menschlichen Thymus, in der Milz, in den peripheren Blutlymphozyten (PBLs), Ovarien und Testis exprimiert wird. Weiter sind zusätzliche Transkripte identifiziert worden. Ein weiterer Transkript von ungefähr 10 kb wurde in den Ovarien, im Thymus und in der Milz identifiziert. In den Testis wurde ein zusätzlicher Transkript von 1,3 kb nachgewiesen. Diese Transkripte sind wahrscheinlich durch abwechselndes Spleissen der Gene, die den neuartigen, erfindungsgemässen Östrogenrezeptor kodieren, generiert worden.
Das Klonen der cDNA's, die den neuartigen, erfindungsgemässen Östrogenrezeptor kodieren, enthüllte, dass mehrere Spleiss-Varianten des genannten Rezeptors unterschieden werden können. Auf der Proteinebene unterscheiden sich diese Varianten nur am C-terminalen Teil.
Eine cDNA, die einen ER kodiert, ist isoliert (Green et al., Nature 320, 134-139, 1986; Greene et al., Science 231, 1150-1154, 1986) und die korrespondierende Aminosäuresequenz ist abgeleitet worden. Dieser Rezeptor und der Rezeptor der vorliegenden Erfindung sind trotzdem unterscheidbar und werden durch verschiedene Gene mit unterschiedlichen Nukleinsäuresequenzen kodiert. Nicht nur dass die ER im Stand der Technik (hierin im Weiteren als klassische ER bezeichnet) und die ER gemäss der vorliegenden Erfindung sich in der Aminosäuresequenz unterscheiden, sind sie auch auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert. Das Gen, dass den klassischen ER kodiert, ist auf dem Chromosom 6 lokalisiert, wohingegen nachgewiesen wurde, dass das Gen, das den erfindungsgemässen ER kodiert, auf dem Chromosom 14 lokalisiert ist. Ferner unterscheidet der erfindungsgemässe ER sich von dem klassischen Rezeptor durch Unterschiede in der Gewebeverteilung, was anzeigt, dass es wichtige Unterschiede zwischen diesen Rezeptoren auf der Ebene der östrogenen Signalgabe geben könnte.
Zusätzlich sind zwei Orphan-Rezeptoren, ERRα und ERRβ, die eine dem Östrogenrezeptor verwandte Struktur besitzen, beschrieben worden (Giguere et al., Nature 331, 91-94, 1988). Über diese Orphan-Rezeptoren ist allerdings nicht berichtet worden, ob sie in der Lage sind östrogene oder irgendwelche anderen Hormone, die an klassische ER binden, zu binden und andere Liganden, die an diese Rezeptoren binden, sind bislang nicht gefunden worden. Der neuartige, erfindungsgemässe Östrogenrezeptor unterscheidet sich deutlich von diesen Rezeptoren, da nachgewiesen wurde, dass er Östrogen bindet.
Die Tatsache, dass ein neuartiger, erfindungsgemässer ER nachgewiesen worden ist, ist insbesondere überraschend, als dass irgendwelche Hinweise bezüglich der Existenz von zusätzlichen Östrogenrezeptoren in der wissenschaftlichen Literatur nicht zu finden war: weder die Isolation von klassischen ER, noch die Orphan-Rezeptoren ERα und ERβ legten die Existenz zusätzlicher Östrogenrezeptoren, wie die erfindungsgemässen Rezeptoren, nahe. Die Identifikation zusätzlicher ER könnte ein grosser Schritt vorwärts in der bestehenden klinischen Therapie sein, die auf der Anwesenheit von einem Rezeptor basiert und damit alle Östrogen-vermittelten Störungen und/oder Erkrankungen diesem einen Rezeptor zugeschrieben werden. Die erfindungsgemässen Rezeptoren werden für die Entwicklung von Hormonanaloga, die selektiv entweder die klassischen ER oder den neuartigen, erfindungsgemässen Rezeptor aktivieren, nützlich sein. Dieses sollte als einer der Hauptvorteile der Erfindung betrachtet werden.
In einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte cDNA, die den neuartigen Steroidrezeptor kodiert, bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte cDNA zur Verfügung, die den neuartigen Östrogenrezeptor, wie er vorgängig beschrieben wurde, kodiert.
Entsprechend dieses Gesichtspunktes der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte DNA bereitgestellt, die ein Steroidrezeptorprotein kodiert, das eine N-terminale Domäne, eine DNA-bindende Domäne und eine Liganden-bindende Domäne besitzt, worin die Aminosäuresequenz genannter DNA- bindender Domäne des genannten Rezeptorproteins wenigstens eine 80% Homologie mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist, aufweist und die Aminosäuresequenz der genannten Liganden-bindenden Domäne des genannten Rezeptorproteins wenigstens eine 70% Homologie mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 4 gezeigt wird, ausfweist.
Insbesondere kodiert die isolierte DNA ein Steroidrezeptorprotein, das eine N-terminale Domäne, eine DNA-bindende Domäne und eine Liganden-bindende Domäne kodiert, wobei die Aminosäuresequenz der genannten DNA- bindenden Domäne des genannten Rezeptorproteins eine wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, noch bevorzugter 98% und am bevorzugtesten eine 100% Homologie mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt wird, aufweist.
Noch genauer kodiert die isolierte DNA ein Steroidrezeptorprotein, das eine N-terminale Domäne, eine DNA-bindende Domäne und eine Liganden-bindende Domäne besitzt, wobei die Aminosäuresequenz der genannten Liganden-bindenden Domäne des genannten Rezeptorproteins wenigstens eine 75%, vorzugsweise eine 80%, noch bevorzugter eine 90%, am bevorzugtesten eine 100% Homologie mit der Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 4 gezeigt wird.
Eine bevorzugte, isolierte, erfindungsgemässe DNA kodiert ein Steroidrezeptorprotein, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die in SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 21 oder in SEQ ID Nr. 25 gezeigt wird.
Eine noch bevorzugtere, isolierte, erfindungsgemässe DNA ist eine isolierte DNA, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 20 oder in SEQ ID Nr. 24 gezeigt wird.
Die DNA gemäss der Erfindung kann von einer cDNA gewonnen werden. Alternativ könnte die kodierende Sequenz eine genomische DNA sein oder unter Verwendung von DNA- Synthesetechniken hergestellt sein.
Die erfindungsgemässe DNA wird sehr nützlich für die in vivo Expression des neuartigen, erfindungsgemässen Rezeptorproteins in genügender Menge und in substantiell reiner Form sein.
In einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Steroidrezeptor bereitgestellt, der die Aminosäuresequenz umfasst, die durch die oben beschriebenen DNA-Moleküle kodiert wird.
Der erfindungsgemässe Steroidrezeptor hat eine N-terminale Domäne, eine DNA-bindende Domäne und eine Liganden-bindende Domäne, wobei die Aminosäuresequenz genannter DNA-bindender Domäne des genannten Rezeptors eine wenigstens 80% Homologie mit der Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt wird, und die Aminosäuresequenz der genannten Liganden-bindenden Domäne des genannten Rezeptors wenigstens eine 70% Homologie mit der Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 4 gezeigt wird.
Insbesondere hat der erfindungsgemässe Steroidrezeptor eine N-terminale Domäne, eine DNA-bindende Domäne und eine Liganden-bindende Domäne, wobei die Aminosäuresequenz der genannten DNA-bindenden Domäne des genannten Rezeptors eine wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, noch bevorzugter 98% und am bevorzugtesten eine 100% Homologie mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt wird, aufweist.
Noch genauer besitzt der erfindungsgemässe Steroidrezeptor eine N-terminale Domäne, eine DNA-bindende Domäne und eine Liganden-bindende Domäne, wobei die Aminosäuresequenz der genannten Liganden-bindenden Domäne des genannten Rezeptors wenigstens eine 75%, vorzugsweise eine 80%, noch bevorzugter eine 90%, am bevorzugtesten eine 100% Homologie mit der Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 4 gezeigt wird.
Es wird den in der Technik Erfahrenen offensichtlich sein, dass auch Steroidrezeptorproteine, die kombinierte DBD- und LBD-Präferenzen umfassen und DNA, die solche Rezeptoren kodieren, Gegenstand der Erfindung sind.
Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemässen Steroidrezeptoren eine Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 25 gezeigt wird.
Im Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung liegen auch Steroidrezeptorproteine, die Variationen in der Aminosäuresequenz der DBD und LBD ohne Verlust ihrer jeweiligen DNA-bindenden oder Liganden-bindenden Aktivität umfassen. Die Variationen, die in diesen Aminosäuresequenzen stattfinden können, umfassen Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen einer oder mehrerer Aminosäure(n) in genannter Sequenz, wobei genannte Variationen in einer Aminosäureänderung oder Aminosäureänderungen in der Gesamtsequenz resultieren. In der Protein- und Peptidtechnik ist es gut bekannt, dass diese Aminosäureänderungen zu Aminosäuresequenzen führen, die sich von der Aminosäuresequenz, von der sie abstammten, unterscheiden, aber noch homolog mit dieser sind.
Aminosäuresubstitutionen, von denen nicht erwartet wird, dass sie essentielle biologische und immunologische Aktivitäten verändern, sind zum Beispiel in Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D. C., 1978, Vol. 5, Suppl. 3, beschrieben worden. Aminosäureaustausche zwischen verwandten Aminosäuren oder Austausche, die oft in der Evolution stattgefunden haben, sind inter alia Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Arg/Lys, Asp/Asn, Ile/Val. Basierend auf dieser Information entwickelten Lipman und Pearson ein Verfahren für den schnellen und empfindlichen Proteinvergleich (Science 227, 1435-1441, 1985) und zur Bestimmung der funktionellen Gleichartigkeit zwischen homologen Polypeptiden.
Variationen in der Aminosäuresequenz der erfindungsgemässen DBD, die in einer Aminosäuresequenz resultieren, die wenigstens eine 80% Homologie mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 3 besitzt, wird zu einem Rezeptor führen, der eine noch genügende DNA-Bindungsaktivität aufweist.
Variationen in der Aminosäuresequenz der erfindungsgemässen LBD, die eine Aminosäuresequenz zur Folge haben, die wenigstens eine 70% Homologie mit der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 4 gezeigt wird, aufweist, wird zu Rezeptoren führen, die eine noch genügende Liganden-bindende Aktivität besitzen.
Die Homologie, wie sie hierin definiert ist, wird in Prozenten ausgedrückt, die über PCGENE bestimmt wird. Die Homologie wird als prozentualer Anteil der, mit der erfindungsgemässen Sequenz identischen Reste in einer Ausrichtung berechnet. Gaps sind zur Erlangung der maximalen Ausrichtung erlaubt.
Der Vergleich der Aminosäuresequenzen der klassischen ER mit den erfindungsgemässen ER offenbarten einen hohen Grad an Gleichartigkeit innerhalb ihrer entsprechenden DBDs. Die Konservierung der P-Box (Aminosäuren E-G-X-X-A), welche verantwortlich für die tatsächliche Interaktion der klassischen ER mit dem Ziel-DNA-Element verantwortlich ist, ist hinweisend auf eine Erkennung der Östrogen-responsiven Elemente (ERE's) durch die erfindungsgemässen ER. Die erfindungsgemässen Rezeptoren zeigten tatsächlich eine Liganden-abhängige Transaktivierung auf ERE-enthaltende Reporterkonstrukte. Damit könnten die klassischen ER und die neuartigen, erfindungsgemässen ER überlappende Zielgenspezifitäten haben. Diese könnte anzeigen, dass in Geweben, die beide betreffenden ER miteinander exprimieren, diese Rezeptoren sich bezüglich der EREs konkurrenzieren. Die erfindungsgemässen ER könnten die Transkription der Zielgene unterschiedlich von der klassischen ER-Regulation regulieren oder sie könnten die klassische ER-Funktion einfach durch Besetzung der Östrogen-responsiven Elemente blockieren. Alternativ könnte die Transkription durch Heterodimerisation der unterschiedlichen Rezeptoren beeinflusst werden.
Folglich umfasst ein bevorzugter Steroidrezeptor gemäss der Erfindung eine Aminosäuresequenz E-G-X-X-A innerhalb der P- Box der DNA-bindenden Domäne, worin X für irgendeine Aminosäure steht. Auch im Anwendungsbereich der Erfindung liegt eine isolierte DNA, die einen solchen Rezeptor kodiert.
Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Rezeptoren sind im Stand der Technik gut bekannt (Sambrook et al., Molecular cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989). Die praktikabelste Herangehensweise ist die Herstellung des Rezeptors durch Expression der DNA, die das gewünschte Protein kodiert.
Eine grosse Vielzahl von Wirtszellen und Kombinationen von Klonierungsvehikeln könnten in nützlicher Weise für das Klonen der Nukleinsäuresequenz, die den Rezeptor der Erfindung kodiert, genutzt werden. Zum Beispiel könnten nützliche Klonierungsvehikel chromosomale, nicht- chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen beinhalten, wie zahlreiche bekannte bakterielle Plasmide und eine weite Wirtspalette von Plasmiden und Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden und Phagen oder Virus-DNA stammen. Geeignete Wirte können bakterielle Wirte, Hefen und andere Pilz-, Pflanzen- oder Tierwirte, wie chinesische Hamsterovarzellen (CHO) oder Affenzellen und andere Wirte, mit der Ausnahme von Menschen, umfassen.
Weiter werden die Vehikel, die bei der Expression der Liganden-bindenden Domäne der vorliegenden Erfindung verwendet werden, Kontrollsequenzen, die betriebsbereit mit der Nukleinsäuresequenz, die die Liganden-bindende Domäne kodiert, verbunden sind, umfassen. Solche Kontrollsequenzen umfassen im Allgemeinen eine Promotorsequenz und Sequenzen, die Expressionsebenen regulieren und/oder erhöhen. Weiter ist der Startpunkt der Replikation und/oder ein dominanter Marker häufig in solchen Vehikeln vorhanden. Natürlich können Kontroll- und andere Sequenzen abhängig von der ausgewählten Wirtszelle variieren.
Techniken zur Transformierung oder Transfektion von Wirtszellen sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Rekombinante Expressionsvektoren, die die DNA der Erfindung, genauso wie die mit der genannten DNA oder dem genannten Expressionsvektor transformierten Zellen umfassen, bilden auch einen Teil der vorliegenden Erfindung.
Da Steroidrezeptoren drei Domänen mit unterschiedlichen Funktionen, die mehr oder weniger unabhängig sind, besitzen, ist es möglich, dass alle drei funktionellen Domänen von verschiedenen Mitgliedern der Überfamilie der Steroidrezeptoren stammen.
Moleküle, die Teile beinhalten, die verschiedenen Ursprungs sind, werden als chimär bezeichnet. Solch ein chimärer Rezeptor, der die Liganden-bindende Domäne und/oder die DNA-bindende Domäne der Erfindung umfasst, kann durch chemische Kopplung hergestellt werden, aber am bevorzugtesten wird die Kopplung auf DNA-Ebene mit standardisierten molekularbiologischen Verfahren mittels Fusionierung der Nukleinsäuresequenzen, die die notwendigen Steroidrezeptordomänen kodieren, erreicht. Folglich sind die DNA, die die chimären Rezeptorproteine gemäss der Erfindung kodieren auch Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
Solche chimären Proteine können durch Transfektion der DNA, die diese chimären Rezeptorproteine kodiert, in geeignete Wirtszellen und durch Kultivierung dieser Zellen unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Es ist ausgesprochen praktisch, wenn neben der Information für die Expression des Steroidrezeptors auch die Wirtszelle mit einem Vektor, der die Information für ein Reporter-Gen trägt, transformiert oder transfiziert wird. Solch ein Vektor, der ein Reportergen kodiert, ist durch den Besitz einer Promotorsequenz gekennzeichnet, die eine oder mehrere Hormon-responsiven Elemente (HRE), die funktionell an ein operatives Reportergen gebunden sind, beinhalten. Solch ein HRE ist das DNA-Ziel des aktivierten Steroidrezeptors und folglich die Transkription der DNA erhöht, die das Reportermolekül kodiert. Unter in vivo Bedingungen der Steroidrezeptoren umfasst das Reportermolekül die zelluläre Antwort auf die Stimulation des Liganden. Trotzdem ist es möglich, die Liganden-bindende Domäne eines Rezeptors mit der DNA-bindenden Domäne und Transkriptions-aktivierenden Domäne anderer Steroidrezeptoren in vitro zu verbinden, und dabei die Verwendung anderer HRE und Reportermolekül- Systeme zu ermöglichen. Ein solches System wird durch ein HRE, das in der MMTV-LTR ("mouse mammary tumor virus long terminal repeat sequence") in Verbindung mit einem Reportermolekül, wie dem Feuerfliegen-Luciferasegen, oder dem bakteriellen Gen für CAT (Chloramphenicol-Transferase), etabliert. Andere HREs, die verwendet werden können, sind der Ratten-Oxytozin-Promotor, das Retinoinsäure-responsive Element, das Schilddrüsenhormon-responsive Element und das Östrogen responsive Element, auch synthetische beantwortende Elemente sind beschrieben worden (zum Beispiel in Fuller, ibid Seite 3096). Als Reportermoleküle können neben CAT und Luciferase die β-Galaktosidase verwendet werden.
Steroidhormonrezeptoren und chimäre Rezeptoren gemäss der vorliegenden Erfindung können zur in vitro-Identifizierung von neuartigen Liganden oder hormonalen Analoga verwendet werden. Für diesen Zweck können Bindungsstudien mit Zellen durchgeführt werden, die mit der erfindungsgemässen DNA oder mit einem Expressionsvektor, der die erfindungsgemässe DNA umfasst, transformiert wurden, wobei genannte Zellen die Steroidrezeptoren oder chimäre Rezeptoren gemäss der Erfindung exprimieren.
Der neuartige Steroidhormonrezeptor und die chimären Rezeptoren gemäss der Erfindung, genauso wie die Ligandenbindende Domäne der Erfindung, können in einem Test zur Identifikation funktioneller Liganden oder Hormonanaloga für nukleäre Rezeptoren verwendet werden.
Damit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von funktionellen Liganden für die Steroidrezeptoren und die chimären Rezeptoren gemäss der Erfindung bereit, wobei das genannte Verfahren die Schritte:
a) Einleitung in eine geeignete Wirtszelle von 1) DNA oder einem Expressionsvektor gemäss der Erfindung und 2) von einem geeigneten Reporter-Gen, der funktionell an ein operatives Hormon-responsives Element gebunden ist, wobei genanntes HRE durch die DNA-bindende Domäne des Rezeptorproteins, das durch die genannte DNA kodiert wird, aktiviert werden kann.
b) In-Kontakt-bringen der Wirtszelle von Schritt a) mit potentiellen Liganden, die möglicherweise an die Liganden-bindende Domäne des Rezeptorproteins, das durch genannte DNA von Schritt a) kodiert wird, binden wird;
c) Aufzeichnung der Expression des Rezeptorproteins, das durch genanntes Reporter-Gen von Schritt a) kodiert wird,
umfasst.
Wenn die Expression des Reporter-Gens hinsichtlich der Grundexpression (ohne Ligand) induziert wird, kann der funktionelle Ligand als Agonist betrachtet werden; wenn die Expression des Reporter-Gens unverändert bleibt oder hinsichtlich der Grundexpression vermindert ist, kann der funktionelle Ligand ein geeigneter (partieller) Antagonist sein.
Zur Durchführung solcher Untersuchungen werden Wirtszellen, die mit jeweils einem Vektor, der einen funktionellen Steroidrezeptor kodiert, und mit einem Vektor, der die Information für ein Hormon-responsives Element besitzt, und mit einem verbundenen Reportermolekül transformiert oder transfiziert wurden, in einem geeigneten Medium kultiviert. Nach Zugabe eines geeigneten Liganden, der den Rezeptor aktivieren wird, wird die Produktion des Reportermoleküls verstärkt werden, dessen Herstellung einfach durch Testverfahren mit geeigneter Sensitivität für Reportermoleküle bestimmt werden kann. Siehe hierzu zum Beispiel WO-A-8803168. Testverfahren mit bekannten Steroidrezeptoren sind beschrieben worden (zum Beispiel S. Tsai et al., Cell 57, 443, 1989; M. Meyer et al., Cell 57, 433, 1989).

Legenden zu den Abbildungen

Abb. 1

Northern Blot Analyse des neuartigen Östrogenrezeptors (ERβ). Zwei unterschiedliche Mehrfachgewebe Northern Blots (Clontech) wurden mit einer spezifischen Probe für ERβ hybridisiert (siehe Beispiele). Die menschlichen Gewebe, von denen die RNA stammt, sowie die Position der Grössenmarker (in Kilobasen) sind gekennzeichnet.

Abb. 2

Histogramm, das die 3- bis 4-fache stimulatorische Wirkung von 17β-Östradiol, Östriol und Östron auf die, durch ERβ vermittelt Luciferaseaktivität zeigt. Ein Expressionsvektor, der ERβ kodiert, wurde vorübergehend in CHO-Zellen zusammen mit einem Reporterkonstrukt, das den Ratten- Oxytozinpromotor vor der Feuerfliegen-Luciferase kodierenden Sequenz enthält, transfiziert (siehe Beispiele).

Abb. 3

Wirkung von 17β-Östradiol (E2) allein oder in Kombination mit dem Anti-Östrogen ICI-164384 (ICI) auf ERα und ERβ. Expressionskonstrukte für ERα (der klassische ER) und ERβ wurden vorübergehend auf CHO-Zellen zusammen mit dem Ratten Oxytozinpromotor-Luciferase-Reporterkonstrukt, wie in den Beispielen beschrieben wird, transfiziert. Die Luciferaseaktivitäten wurden in dreifacher Ausführung und für die Transfektionswirksamkeit mittels Messung der β- Galaktosidase in demselben Lysat normiert bestimmt.

Abb. 4

Expression von ERα und ERβ in einer Reihe von Zelllinien, die durch RT-PCR-Analyse bestimmt wird (siehe Beispiele). Die verwendeten Zeillinien stammten von verschiedenen Gewebe/Zelltypen:
Endometrium (ECC1, Ishikawa, HEC-1A, RL95-2); Osteosarkom (SAOS-2, U2-OS, HOS, MG63); Brusttumoren (MCF-7, T47D), Endothelium (HUV-EC-C, BAEC-1); glatte Muskulatur (HISM, PAC-1, A7R5, A10, RASMC, CavaSMC); Leber (HepG2); Kolon (CaCo2) und Vagina (Hs-760T, SW-954).
Alle Zelllinien waren menschlich, ausser PAC-1, A7R5, A10 und RASMC, die von Ratten stammen, BAEC-1, das von dem Schwein abstammt, und CavaSMC, das von Meerschweinchen stammt.

Abb. 5

Transaktivierungstest, der beständig transfizierte CHO- Zelllinien verwendet, die ERα und ERβ zusammen mit dem Ratten Oxytozin-Luciferase Östrogen-responsiven Reporter exprimieren (Details in den Beispielen). Hormonabhängige Transaktivierungskurven wurden für 17β-Östradiol und für Org4094 bestimmt. Für den ER-Antagonisten Raloxifen wurden Zellen mit 2 · 10&supmin;¹&sup0; mol/L 17β-Östradiol zusammen mit steigenden Konzentrationen von Raloxifen behandelt. Maximalwerte für die Antworten wurden willkürlich als 100% genommen.

Beispiele

A. Molekulares Klonen des neuartigen Östrogenrezeptors

Zwei degenerierte Inosin (I)-enthaltende Oligonukleotide waren auf konservierten Regionen der DNA-bindenden Domänen und die Liganden-bindenden Domänen der menschlichen Steroidhormonrezeptoren gegründet.

Primer #1:

5'-GGIGA(C/T)GA(A/G)GC(A/T)TCIGGITG(C/T)CA(C/T)TA(C/T)GG-3' (SEQ ID Nr. 7).

Primer #2:

5'-AAGCCTGG(C/G)A(C/T)IC(G/T)(C/T)TTIGCCCAI(C/T)'TIAT-3' (SEQ ID Nr. 8).
Als Template wurde cDNA von menschlichen EBV-stimulierten PBLs (peripheren Blutleukozyten) verwendet. Ein Mikrogramm der Gesamt-RNA wurde in 20 ul eines Reaktionsgemisches, das 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 4 mM MgCl&sub2;, 1 mM dNTPs (Pharmacia), 100 umol Random Hexanukleotide (Pharmacia), 30 Einheiten Rnase-Inhibitor (Pharmacia) und 200 Einheiten M- MLV reverse Transkriptase (Gibco BRL) enthält, revers transkribiert. Die Reaktionsgemische wurden bei 37ºC über 30 Minuten und bei 100ºC für 5 Minuten hitzeinaktiviert. Die gewonnene cDNA wurde in 100 ul PCR-Reaktionsgemisch angewendet, das 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,001% Gelatine (G/V)), 3% DMSO, 1 Mikrogramm von Primer #1 und Primer #2 und 2,5 Einheiten Amplitaq DNA- Polymerase (Perkin Eimer) enthält. Die PCR-Reaktionen wurden in dem Perkin Eimer 9600 Temperaturwechsler durchgeführt. Der initialen Denaturierung (4 Minuten bei 94ºC) folgten 35 Zyklen unter den folgenden Bedingungen: 30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 45ºC, 1 Minute bei 72ºC und 7 Minuten bei 72ºC, danach wurden die Reaktionsgemische bei 4ºC gelagert. Aliquote dieser Reaktionsgemische wurden auf einem 1,5% Agarosegel analysiert. Die interessierenden Fragmente wurde aus dem Gel herausgeschnitten, unter Verwendung von identischen PCR-Bedingungen reamplifiziert und mit Qiaex II (Qiagen) gereinigt. Fragmente wurden in dem pCRII-Vektor geklont und unter Verwendung von dem TA- Cloning Set (Invitrogen) in Bakterien transformiert. Die Plasmid-DNA wurde für die Nukleotidsequenzanalyse unter Verwendung des Qiagen PTasmid Midi-Protokoll isoliert. Die Nukleotidsequenzanalyse wurde mit dem ALF-Automatik Sequencer (Pharmacia) unter Verwendung eines T7 DNA Sequenzierungsset (Pharmacia) mit vektorspezifischen oder fragmentspezifischen Primern durchgeführt.
Ein geklontes Fragment korrespondiert mit einem neuartigen Östrogenrezeptor (ER), der mit dem klassischen Östrogenrezeptor eng verwandt ist. Ein Teil des geklonten neuartigen Östrogenrezeptorfragments (Nukleotid 466 bis 797 in SEQ ID 1) wurde mit PCR unter Verwendung des Oligonukleotids #3 TGTTACGAAGTGGGAATGGTGA (SEQ ID Nr. 9) und des Oligonukleotids #2 amplifiziert und als Probe für das Screening einer cDNA-Bibliothek des menschlichen Testis in λgt11 (Clontech #HL1010b) verwendet.
Rekombinante Phagen wurden in einer Dichte von 40 000 pfu ("Plaque-forming Units") pro 135 mm Platte plattiert (unter Verwendung von Y1090 Bakterien, die in LB Medium, dem 0,2% Maltose zugesetzt ist, gewachsen sind) und Replikafilter wurden nach Anleitung des Herstellers erstellt. Die Filter wurden in einer Lösung, die 0,5 M Phosphatpuffer (pH 7,5) und 7% SDS bei 65ºC über mindestend 30 Minuten vorhybridisiert. DNA-Proben wurden mit Qiaex II (Qiagen) gereinigt, mit einem Decaprime-Set (Ambion) mit 32P gekennzeichnet und der vorhybridisierten Lösung hinzugefügt. Die Filter wurde bei 65ºC über Nacht hybridisiert und DNA in 0,5 · SSC/0,1% SDS bei 65ºC gewaschen. Zwei positive Plaques wurden identifiziert und es konnte gezeigt werden, dass sie identisch sind. Diese Klone werden durch nochmaliges Screenen gereinigt. Eine PCR auf Phageneluaten mit den λgt11-spezifischen Primern #4: 5'- TTGACACCAGACCAACTGGTAATG-3' (SEQ ID Nr. 10) und #5: 5'- GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG-3' (SEQ ID Nr. 11) ergab ein Fragment von 1700 Basenpaaren auf beiden Klonen.
Nachfolgende PCR-Reaktionen unter Verwendung von Kombinationen eines genspezifischen Primer #6: 5'- GTACACTGATTTGTAGCTGGAC-3' (SEQ ID Nr. 12) mit dem λgtllspezifischen Primer #4 und dem genspezifischen Primer #7: 5'-CCATGATGATGTCCCTGACC-3' (SEQ ID Nr. 13) mit dem λgt11spezifischen Primer #5 ergab Fragmente von ungefähr 450 bp bzw. 1000 bp, die in dem pCRII-Vektor geklont wurden und für die Nukleotidsequenzanalyse verwendet wurden. Die Bedingungen für diese PCR-Reaktionen waren wie die vorgängig Beschriebenen, abgesehen von den Konzentrationen des Primers (200 ng von jedem Primer) und der Anlauftemperatur (60ºC). Da in dem cDNA-Klon die Homologie mit dem ER an einer Stelle, die mit der Exon 7/Exon 8- Grenze in dem ER (zwischen Nukleotid 1247 und 1248 in SEQ ID Nr. 1) korrespondiert, abrupt verloren geht, wurde vorgeschlagen, dass diese Sequenz mit dem Intron 7 des neuartigen ER-Gens korrespondiert. Für die Verifizierung der Nukleotidsequenzen dieses cDNA-Klons wurde ein 1200 bp- Fragment auf dem cDNA-Klon mit dem λgt11- Primer #4 mit einem genspezifischen Primer #8, der mit dem 3'-Ende des Exon 7 korrespondiert: 5'-TCGCATGCCTGACGTGGGAC-3' (SEQ ID Nr. 14), mit der Kontroll-Pfu-Polymerase (Stratagene) generiert. Dieses Fragment wurde auch in dem pCRII-Vektor geklont und vollständig sequenziert und ist identisch mit den vorher gewonnenen Sequenzen.
Um die Nukleotidsequenzen der neuartigen ER downstream von Exon 7 zu gewinnen, wurde ein degeneriertes Oligonukleotid, das auf der AF-2-Region des klassischen ER beruht (#9: 5'- GGC(C/G)TCCAGCATCTCCAG(C/G)A(A/G)CAG-3'; SEQ ID Nr. 15), zusammen mit dem genspezifischen Oligonukleotid #10: 5'- GGAAGCTGGCTCACTTGCTG-3' (SEQ ID Nr. 16) mit Testis- cDNA als Template (Marathon Ready Testis cDNA, Clontech Cat #7414-1) verwendet. Ein spezifisches 220 bp-Fragment, das mit den Nukleotiden 1112 bis 1332 in SEQ ID Nr. 1 korrespondiert, wurde geklont und sequenziert. Die Nukleotide 1112 bis 1247 waren identisch mit der korrespondierenden Sequenz des cDNA-Klons. Die davon downstream gelegene Sequenz ist in hohem Ausmass homolog mit der korrespondierenden Region in dem klassischen ER. Um Sequenzen des neuartigen ER, die downstream von der AF-2- Region gelegen sind, zu gewinnen, werden RACE ("rapid amplification of cDNA ends") -PCR-Reaktionen mit der Marathon-Ready-Testis cDNA (Clontech) als Template durchgeführt. Die initiale PCR wurde mit Oligonukleotid #11: 5'-TCTTGTTCTGGACAGGGATG-3' (SEQ ID Nr. 17) in Verbindung mit dem AP1-Primer, der im Set enthalten ist, durchgeführt. Eine gebündelte PCR wurde an einem Aliquot dieser Reaktion unter Verwendung des Oligonukleotid #10 (SEQ ID Nr. 16) in Verbindung mit dem Oligo-dT-Primer, der im Set enthalten ist, durchgeführt. Nachfolgend wurde ein Aliquot dieser Reaktion in einer gebündelten PCR unter Verwendung von Oligonukleotid #12: 5'-GCATGGAACATCTGCTCAAC-3' (SEQ ID Nr. 18) in Verbindung mit dem Oligo-dT-Primer verwendet. Die Nukleotidsequenzanalyse eines spezifischen Fragments, das gewonnen wurde (korrespondierend zu den Nukleotiden 1256 bis 1431 in SEQ ID Nr. 1), offenbarte eine Sequenz, die den Carboxy-Terminus der Liganden-bindenden Domäne des neuartigen ER, einschliesslich der F-Domäne und eines umcodierenden Stop-Codons und eines Teils der 3'-nicht umcodierten Sequenz, die nicht in der SEQ ID Nr. 1 enthalten ist, kodiert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz wird in SEQ ID Nr. 5 gezeigt.
Um die Möglichkeit zu untersuchen, dass der neuartige Östrogenrezeptor upstream zusätzliche Translationsinitiations-Codone besitzt, wurden RACE-PCR-Untersuchungen mit Marathon-Ready Testis-cDNA (Clontech Cat. # T414-1) durchgeführt. Zuerst wurde eine PCR mit Oligonukleotid SEQ ID Nr. 12 (gegensinnig korrespondierend mit den Nukleotiden 416-395 in SEQ ID Nr. 1) und AP-1 (im Set enthalten) durchgeführt. Eine gebündelte PCR wurde dann mit einem Oligonukleotid, das SEQ ID Nr. 27 hat (gegensinnig korrespondierend mit den Nukleotiden 254-231 in SEQ ID Nr. 1), mit AP-2 (im Set enthalten) durchgeführt. Von dem gewonnenen Abstrich wurde die Region, die mit Fragmenten korrespondierte, die grösser als 300 Basenpaare sind, herausgeschnitten, mittels GenecleanII-Set (BIO101) gereinigt und mithilfe dem TA-Klonierungs-Set (Clontech) geklont. Die Kolonien wurden durch PCR unter Verwendung von genspezifischen Primern, SEQ ID Nr. 22 und SEQ ID Nr. 28, gescreent. Der Klon, der die grösste Insertion enthielt, wurde sequenziert. Die Nukleotidsequenz korrespondiert mit Nukleotid 1 bis 490 in SEQ ID Nr. 24. Von dieser Sequenz ist es offensichtlich, dass das erste, im Leseraster befindliche Translationsinitiations-Codon stromaufwärts von Position 77-79 in SEQ ID Nr. 24 vorhanden ist. Stromaufwärts dieses Translationsstartcodons ist ein im Leseraster befindliches Stop-Codon vorhanden (11-13 in SEQ ID Nr. 24). Daraus folgend beträgt der Leserahmen des neuartigen Östrogenrezeptors 530 Aminosäuren (in SEQ ID Nr. 25 gezeigt) und hat ein berechnetes Molekulargewicht von 59,234 kD.
Um die mittels 5' RACE gewonnenen Nukleotidsequenzen zu bestätigen, wurden menschliche genomische Klone gewonnen und analysiert. Eine menschliche Genom-Bibliothek in λEMBL3 (Clontech HL1067J) wurde mit einer Probe, die mit Nukleotid 1 bis 416 in SEQ ID Nr. 1 korrespondiert, gescreent. Ein streng hybridisierender Klon wurde von Plaques gereinigt und die DNA unter Verwendung von Standardprotokollen (Sambrook et al., 1989) isoliert. Die DNA wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, eine Elektropherese auf Agarosegel durchgeführt und auf Nylonfiltern geblottet. Die Hybridisierung des Blot mit einer Probe, die mit dem oben genannten RACE-Fragment (Nukleotide 1-490 in SEQ ID Nr. 24) korrespondiert, ergab ein hybridisierendes Sau3A-Fragment von ungefähr 800 Basenpaaren. Dieses Fragment wurde in die BamH1-Stelle des pGEM3Z geklont und sequenziert. Die Nukleotidsequenz beinhaltet eine Basendifferenz, die wahrscheinlich eine PCR-induzierte Punktmutation in dem RACE-Fragment ist. Nukleotid 172 war ein G-Rest in dem 5'RACE-Fragment, aber eine A-Rest in mehreren unabhängigen genomischen Subklonen.

B. Identifikation zweier Spleissvarianten des neuartigen Östrogenrezeptors

Wiederholtes Screening der Testis cDNA-Bibliothek mit einer Probe, die mit Nukleotid 918 bis 1246 in SEQ ID Nr. 1 korrespondiert, ergab zwei hybridisierende Klone, wobei deren 3'-Enden mit PCR (genspezifischer Primer #10: 5'- GGAAGCTGGCTCACTTGCTG-3' (SEQ ID Nr. 16) zusammen mit dem Primer #4, SEQ ID Nr. 10) amplifiziert, geklont und sequenziert wurden. Bei einem Klon wurde ein alternatives Exon 8 (Exon 8B) im neuartigen ER nachgewiesen. In SEQ ID Nr. 2 ist das Protein, das einen Teil und das Stopcodon dieser Spleissvariante kodiert, dargestellt. Als Folge der Einführung dieses Exons über eine alternative Spleissreaktion ist der Leserahmen, der den neuartigen ER kodiert, sofort terminiert, auf diese Weise einen Abbruch des Carboxyterminus des neuartigen ER erzeugend (SEQ ID Nr. 6).
Das Screenen einer menschlichen Thymus-cDNA-Bibliothek (Clontech HL1074a) mit der Probe, die mit Nukleotid 918 bis 1246 in SEQ ID Nr. 1 korrespondiert, ergab eine weitere Spleissvariante. Das 3'-Ende des einen hybridisierenden Klons wurde unter Verwendung des Primer #10 (SEQ ID Nr. 16) mit dem λgt-10-spezifischen Primer #13 5'- AGCAAGTTCAGCCTGTTAAGT-3' (SEQ ID Nr. 19) amplifiziert, geklont und sequenziert. Die gewonnene Nukleotidsequenz, die stromaufwärts der Grenze zwischen Exon 7 und Exon 8 gelegen ist, war identisch mit den früher identifizierten Klonen. Trotzdem wurde ein alternatives Exon 8 (Exon 8C) an dem 3'-Ende, das zwei C-terminale Aminosäuren gefolgt von einem Stopcodon kodiert, nachgewiesen. Die Nukleotidsequenz des proteinkodierenden Teils dieser Spleissvariante ist in SEQ ID Nr. 20 gezeigt, die korrespondierende Proteinsequenz ist SEQ ID Nr. 21. Diese zwei Varianten des neuartigen Östrogenrezeptors enthalten nicht die AF-2-Region und damit fehlt ihnen wahrscheinlich die Fähigkeit die Transkription der Zielgene in einer Ligandenabhängigen Weise zu modulieren. Trotzdem können die Varianten möglicherweise mit der Funktion des Wildtyps des klassischen ER und/oder des Wildtyps des neuartigen ER interferieren, entweder durch Heterodimerisierung oder durch Besetzen der Östrogen responsiven Elemente oder durch die Interaktionen mit anderen Transkriptionsfaktoren. Eine Mutante des klassischen ER (ER1-530), die den zwei Varianten des oben beschriebenen, neuartigen Östrogenrezeptors stark ähnelt, ist beschrieben worden. Es konnte gezeigt werden, dass ER- 530 sich wie ein dominant negativer Rezeptor verhält, indem er zum Beispiel die intrazelluläre Aktivität des ER- Wildtyps modulieren kann (Ince et al., J. Biol. Chem. 268, 14026-14032, 1993).

C. Northern Blot Analyse

Northern Blots für menschliche Mehrfachgewebe (MTN-Blots) wurden bei Clontech gekauft und über wenigstens eine Stunde bei 65ºC in 0,5 M Phosphatpuffer pH 7,5 mit 7% SDS vorhybridisiert. Das DNA-Fragment, das als Probe (korrespondierend zu Nukleotid 466 bis 797 in SEQ ID Nr. 1) verwendet wurde, mithilfe eines Markierungsset (Ambion) mit ³²P markiert, durch Kochen denaturiert und der vorhybridisierten Lösung zugefügt wurde. Gewaschen wurde wie folgt: 3 · SSC bei Raumtemperatur, gefolgt durch 3 · SSC bei 65ºC und schliesslich 1 · SSC bei 65ºC. Die Filter wurden dann Röntgenfilmen für eine Woche ausgesetzt. Zwei Transkripte von ungefähr 8 kb und 10 kb wurden in Thymus, Milz, Ovarien und Testis nachgewiesen. Zusätzlich wurde ein 1,3 kb - Transkript im Testis nachgewiesen.

D. RT-PCR-Analyse der Expression von ERα und ERβ in Zeltlinien

RNA wurde unter Anwendung von RNAzol B (Cinna/Biotecx) aus einer Reihe menschlicher und tierischer Zellinien isoliert. cDNA wurde mit 2,5 Mikrogramm der Gesamt-RNA unter Verwendung des Superscript II-Sets (BRL) gemäss den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Ein Teil der cDNA wurde für spezifische PCR-Amplifikationen der Fragmente verwendet, die entweder mit der, den ER kodierenden mRNA oder mit dem neuartigen Östrogenrezeptor korrespondiert. (Es muss betont werden, dass die verwendeten Primer auf menschlichen und von Ratten stammenden Sequenzen basieren, wohingegen einige der Zelllinien weder von Menschen noch von Ratten stammt, siehe Legende zu Abb. 4.)
Für ERα wurden folgende Primer verwendet: "sense" 5'- GATGGGCTTACTGACCAACC-3' und "antisense" 5'- AGATGCTCCATGCCTTTG-3', die ein 548 Basenpaarfragment generieren, das mit einem Teil des LBD korrespondiert. Für ERβ gilt: "sense" 5'-TTCACCGAGGCCTCCATGATG-3' und "antisense" 5'-CAGATGTTCCATGCCCTTGTT-3', die ein 565 Basenpaarfragment generieren, das mit einem Teil des LBD korrespondiert. Die PCR-Proben wurden auf Agarose analysiert, das auf Nyloimiembranen geblottet wurde. Diese Blots wurden mit ³²P markierten PCR-Fragmenten hybridisiert, die mit den oben erwähnten Primern auf ERα- und ERβ- Plasmid-DNA unter standardisierten, experimentellen Verfahren generiert wurden (Sambrook et al., 1989).

E. Ligandenabhängige Transkriptionsaktivierung durch das neuartige Östrogenrezeptorprotein

Zellkultur

Chinesische Hamsterovar-Zellen (CHO K1) wurden aus ATCC (CCL 61) gewonnen und bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre (5% CO&sub2;) als einschichtige Kultur in Phenolrotfreiem M505-Medium gehalten. Das letztere Medium beinhaltet eine Mischung (1 : 1) aus Dulbecco's modifizierten Eagle's Medium (DMEM, Gibco 074-200) und Nährmedium F12 (Ham's F12, Gibco 074-1700), dem 2,5 mg/ml Natriumkarbonat (Baker), 55 ug/ml Natriumpyruvat (Fluka), 273 ug/ml β-Merkaptoethanol (Baker), 1,2 ug/ml Ethanolamin (Baker), 360 ug/ml L-Glutamin (Merck), 0,45 ug/ml Natriumselenit (Fluka), 62,5 ug/ml Penicillin (Mycopharm), 62,5 ug/ml Streptomycin (Serva) und 5% mit Kohle behandeltes Rinderkälberserum (Hyclone) zugefügt wurde.

Rekombinate Vektoren

Die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte ERβ-kodierende Sequenz wurde mit PCR unter Verwendung von den Oligonukleotiden 5'- CTTGGACCATAGCCCTGCTGTGATGAATTACAG-3' (SEQ ID Nr. 22, das Translationsinitiationscodon ist unterstrichen) in Verbindung mit 5'-GATGGATCCTCACCTCAGGGCCAGGCGTCACTG-3' (SEQ ID Nr. 23, unterstrichen ist das "antisense" Translationsstopcodon) amplifiziert. Das resultierende BamH1-Fragment (ungefähr 1450 Basenpaare) wurde dann in dem Säugetierzellexpressionsvektor pNGV1 (Genbank Zugangsnr. X99274) geklont.
Ein Expressionskonstrukt, das den ERß-Leserahmen, wie er in SEQ ID Nr. 24 dargestellt ist, kodiert, wurde durch Ersetzen eines BamH1-Msc1-Fragments (Nukleotide 1-81 in SEQ ID Nr. 1) durch ein BamH1-Msc1-Fragment, das mit den Nukleotiden 77-316 in SEQ ID Nr. 24 korrespondiert, hergestellt.
Das letztere Fragment wurde durch PCR mit SEQ ID Nr. 26 in Verbindung mit SEQ ID Nr. 28 unter Verwendung des oben genannten 5'-RACE-Fragments hergestellt.
Der Reportervektor basierte auf dem regulatorischen Bereich des Ratten-Oxytocin-Gens (Position -363/+16 als ein HindIII/MboI-Fragment; R. Ivell und D. Richter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2006-2010, 1984), das an die Sequenz kodierende Feuerfliegen-Luciferase gebunden ist; es konnte gezeigt werden, dass die regulatorische Region des Oxytocingens funktionelle Östrogenhormon-responsive- Elemente für Ratten (R. Adan et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 175, 117-122, 1991) sowie für Menschen (S. Richard und H. Zingg, J. Biol. Chem. 265, 6098-6103, 1990) in vitro besitzt.

Transiente Transfektion

1 · 105 CHO-Zellen wurden in 6-Nunclon- Gewebekulturplattenvertiefungen gegeben und die DNA mittels Lipofektin eingeführt. Hierfür wurde die DNA (1 ug von jeweils dem Rezeptor und dem Reportervektor in 250 uL Opimem, Gibcao BRL) mit einer volumengleichen Menge von Lipofektinreagenz (7 uL in 250 uL Optimem, Gibco) gemischt und danach für 15 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach zweimaligen Waschen der Zellen mit serumfreien Medium (M505) wurde ein neues Medium (500 uL Ptimem, Gibco) den Zellen zugefügt, gefolgt von tropfenweiser Zugabe der DNA-Lipofektin-Mischung. Nach einer Inkubationsperiode von 5 Stunden bei 37ºC wurden die Zellen zweimal mit Phenolrotfreiem M505 plus 5% kohlebehandeltem Rinderkälberserum gewaschen und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Hormone dem Medium beigefügt (10&supmin;&sup7; mol/L). 48 Stunden posttransfektionem wurden die Zellextrakte durch Zugabe von 200 uL Lysispuffer (0,1 M Phosphatpuffer pH 7,8, 0,2% Triton X-100) hergestellt. Nach Inkubation von 5 Minuten bei 37ºC wurde die Zellsuspension zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge, 5 min.) und 20 uL der Probe wurde 50 uL Luciferase-Testreagenz (Promega) zugefügt. Die Lichtemmision wurde in einem Leuchtkraftmesser (Berthold Biolumat) über 10 Sekunden bei 562 nm gemessen.

Beständige Transfektion des neuartigen Östrogenrezeptors

Das Expressionsplasmid, das die volle Länge des ERβ1-530 (siehe oben) kodiert, wurde beständig in CHO K1-Zellen, wie kürzlich beschrieben (Theunissen et al., J. Biol. Chem. 268, 9035-9040, 1993), transfiziert. Einzelzellklone, die auf diese Weise gewonnen wurden, wurden mittels transienter Transfektion des Reporterplasmids (Ratten-Oxytozin- Luciferase), wie oben beschrieben, gescreent. Ausgewählte Klone wurden für eine zweite beständige Transfektion des Ratten-Oxytozinluciferase-Reporterplasmids zusammen mit dem Plasmid pDR2A, das ein Hygromyzin-Resistenzgen für die Selektion beinhaltet, verwendet. Einzelne, gewonnene Zellklone wurden auf die Antwort gegenüber 17β-Östradiol getestet. Anschliessend wurde ein ausgewählter, einzelner Zellklon für Transaktivitätsuntersuchungen verwendet. Kurz gesagt, wurden Zellen auf 96-Mikrotiterplattenvertiefungen gegeben (1,6 · 10&sup4; Zellen pro Wanne). Nach 24 Stunden wurden verschiedene Hormonkonzentrationen in Medium gelöst und den Vertiefungen zugefügt. Für antagonistische Untersuchungen wurde 2 · 10&supmin;¹&sup0; M 17β-östradiol jeder Vertiefung beigefügt und unterschiedliche Konzentrationen eines Antagonisten zugefügt. Die Zellen wurden einmal mit PBS nach einer 24- stündigen Inkubation gewaschen und dann durch Zugabe von 40 Mikroliter Lysepuffer (siehe oben) lysiert. Das Luciferasereagenz wurde jeder Vertiefung hinzugefügt (50 Mikroliter) und die Lichtemission mit dem Topcount (Packard) gemessen.

Ergebnisse

Ein Vergleich der zwei Expressionskonstrukte (SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 24) bezüglich ihrer transienten Transfektion in CHO-Zellen zeigte eine identische Transaktivierung in der Antwort gegenüber einer Anzahl von Agonisten und Antagonisten. CHO-Zellen, die transient mit dem ERβ- Expressionsvektor und einem Reporterplasmid transfiziert wurden, zeigten im Vergleich zu unbehandelten Zellen eine 3- bis 4-fache Zunahme der Luciferaseaktivität in der Antwort auf 17β-Östradiol (siehe Abb. 2). Eine gleiche Transaktivierung wurde nach Behandlung mit Östriol und Östron erreicht. Die Ergebnisse zeigen nicht nur, dass der neuartige ER (ERβ) Östrogene binden kann, sondern auch, dass der Liganden-aktivierte Rezeptor an Östrogen responsive Elemente (EREs) innerhalb der Ratten-Oxytozinpromoter binden kann und die Transkription des Luciferase- Reportergens aktivieren kann. Abb. 3 zeigt, dass in einem unabhängigen gleichen Experiment 10&supmin;&sup9; mol/L 17β- Östradiol eine 18-fache Stimulation mit ERα und eine 7- fache Stimulation mit ERβ ergab. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass das Antiöstrogen ICI-164384 ein Antagonist für ERα sowie für ERβ ist, wenn es mit 17β-Östradiol aktiviert wird, wohingegen der Antagonist alleine keine Wirkung zeigte. In diesem Experiment wurde 0,25 ug β- Galaktosidasevektor mittransfiziert, um Unterschiede in der Transfektionseffizienz zu normieren.
Transaktivierungsuntersuchungen, die an stabil transfizierten ERα und ERβ-Zelllinien durchgeführt wurden, ergaben gleiche Luciferase-Absolutwerte. Die Kurven für 17β- Östradiol sind sehr ähnlich und zeigen, dass eine halbmaximale Transaktivierung mit niedrigeren Hormonkonzentrationen auf ERα im Vergleich zu ERβ erreicht wird (Abb. 5). Für Org4094 ist dies auch der Fall, allerdings ist die beobachtete Wirkung wesentlich deutlicher. Die Kurven für Raloxifen zeigen, dass die Wirksamkeit dieses Antagonisten auf die Blockierung der Transaktivierung auf ERα grösser ist als seine Wirksamkeit auf die Blockierung der ERβ-Transaktivierung.

SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION:

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(C) CITY: Arnhem
(E) COUNTRY: The Netherlands
(F) POSTAL CODE (ZIP): 6824 BM
(G) TELEPHONE: 0412-666379
(H) TELEFAX: 0412-650592
(I) TELEX 37503 akpha nl
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(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12:
GTACACTGAT TTGTAGCTGG AC 22
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13:
CCATGATGAT GTCCCTGACC 20
(i) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 14:
TCGCATGCCT GACGTGGGAC 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 24 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 15:
GGCSTCCAGC ATCTCCAGSA RCAG 24
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear 4
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 16:
GGAAGCTGGC TCACTTGCTG 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 17:
TCTTGTTCTG GACAGGGATG 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 18:
GCATGGAACA TCTGCTCAAC 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(H) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 19:
AGCAAGTTCA GCCTGTTAAG T 21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1257 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 20:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 418 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 21:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 34 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 22:
CTTGGATCCA TAGCCCTGCT GTGATGAATT ACAG 34
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 33 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 23:
GATGGATCCT CACCTCAGGG CCAGGCGTCA CTG 33
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1898 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQVENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 24:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 530 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 25:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 26:
GTGCGGATCC TCTCAAGACA TGGATATAAA 30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 25 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 27:
AGTAACAGGG CTGGCGCAAC GGTTC 25
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 22 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 28:
ACTGGCGATG GACCACTAAA GG 22

Claims

1. Isolierter Östrogenrezeptor mit einer N-terminalen Domäne, eine DNA-Bindungsdomäne und einer Ligandenbindungsdomäne, worin die Aminosäuresequenz der genannten DNA-Bindungsdomäne mindestens 80% Homologie mit der in SEQ ID Nr.:3 gezeigten Aminosäuresequenz besitzt und die Aminosäuresequenz der genannten Ligandenbindungsdomäne des genannten Östrogenrezeptors mindestens 70% Homologie mit der in SEQ ID Nr.:4 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist, vorausgesetzt, dass der Östrogenrezeptor nicht die folgenden Aminosäuresequenz besitzt:

2. Isolierter Östrogenrezeptor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz der genannten DNA- Bindungsdomäne mindestens 90% Homologie mit der in der SEQ ID. Nr.:3 gezeigten Aminosäuresequenz hat.

3. Isolierter Östrogenrezeptor nach einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz der genannten Ligandenbindungsdomäne mindestens 75% Homologie mit der in der SEQ ID. Nr.:4 gezeigten Aminosäuresequenz hat.

4. Isolierter Östrogenrezeptor nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Östrogenrezeptor die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.:5. SEQ ID Nr.:6, SEQ ID Nr.:21 oder SEQ ID Nr.:25 umfasst.

5. Isolierte DNA, welche für einen Östrogenrezeptor nach den Ansprüchen 1-4 codiert.

6. Isolierte DNA nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte DNA die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID Nr.:1, SEQ ID Nr.:2, SEQ ID Nr.:20 oder SEQ ID Nr.:24 umfasst.

7. Rekombinanter Expressionsvektor, welcher die DNA nach einem der Ansprüche 5 oder 6 umfasst.

8. Zelle, welche mit der DNA nach einem der Ansprüche 5 oder 6 oder einem Expressionsvektor nach Anspruch 7 transfiziert ist.

9. Zelle nach Anspruch 8, welche eine stabil transfizierte Zelllinie ist, die den Östrogenrezeptor nach einem der Ansprüche 1-4 exprimiert.

10. Verwendung einer DNA nach einem der Ansprüche 5 oder 6, eines Expressionsvektors nach Anspruch 7, einer Zelle nach Anspruch 8 oder 9, einem Rezeptor nach einem der Ansprüche 1-4 in einem Screening-Assay zur Identifizierung neuer Arzneimittel.

11. Verfahren zur Identifizierung funktionaler Liganden für einen Rezeptor nach einem der Ansprüche 1-4, worin das genannte Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Einbringen in eine geeignete Wirtszelle von 1) DNA nach den Ansprüchen 5 dder 6 und 2) von einem geeigneten Reporter-Gen, das funktional mit einem operativen responsiven Hormonelement (HRE) verbunden ist, wobei das genannte HRE fähig ist, von der DNA-Bindungsdomäne des von der genannten DNA codierten Rezeptors aktiviert zu werden;

b) in Kontakt Bringen der genannten Wirtszelle von a) mit potentiellen Liganden, die möglicherweise an die Ligandenbindungsdomäne des von der genannten DNA codierten Rezeptors von Schritt

a) binden und

c} Überwachen der Expression des Rezeptors, der von dem genannten Reportergen von Schritt a) codiert wird.