JPH09182597A

JPH09182597A - 変更された花を有する植物

Info

Publication number: JPH09182597A
Application number: JP8323898A
Authority: JP
Inventors: Celestina Mariani; マリアニ，セレスティーナ; Jan Leemans; レーマンス，ヤン; Willy De Greef; ドゥ・グリフ，ウィリー
Original assignee: Plant Genetic Systems NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 1989-08-10
Filing date: 1996-12-04
Publication date: 1997-07-15
Anticipated expiration: 2020-11-30
Also published as: ES2161681T3; AU625509B2; ZA906344B; DK0412911T3; GR3036893T3; JP3609654B2; FI120156B; HU906172D0; EP0412911B1; EP0412911A1; JP2000050755A; FI911728A0; IE902911A1; US6046382A; IL121301A0; AU6068890A; PT94964A; ATE496135T1; PT94964B; DE69034268D1

Abstract

(57)【要約】【課題】外来性ＤＮＡ配列を含む、遺伝子導入被稔性
回復植物を提供すること。【解決手段】（ａ）リボヌクレアーゼの抑制因子であ
るタンパク質をコードする稔性回復ＤＮＡ；及び（ｂ）
植物の細胞において発現を誘導する第１のプロモーター
を含む、植物の細胞中のリボヌクレアーゼの活性の中和
に用いられる組換えＤＮＡであって、前記回復ＤＮＡ
が、前記第１のプロモーターと同一の転写単位内にあっ
てその制御下にある組換えＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子導入核雄性
不稔又は雌性不稔植物の稔性を回復させる方法であっ
て、被回復植物の核ゲノム内に安定した形で組込まれた
回復植物の核ゲノムからの外来性ＤＮＡ配列を有する遺
伝子導入被稔性回復植物を提供するため、不稔性植物を
遺伝子導入稔性回復植物と交配することによる方法に関
する。本発明に基づく外来性ＤＮＡ配列は、外来性ＤＮ
Ａ（以下「稔性回復ＤＮＡ」と呼ぶ）を含んでおり、こ
の稔性回復ＤＮＡは、１）被回復植物の花、特にその雄
性又は雌性繁殖器官、又は種子又は胚の細胞中で産生又
は過剰産生された場合、花、種子又は胚細胞内の第２の
ＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドの活性を妨げる第
１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードし、
上記第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドは、
花、種子又は胚細胞中で産生又は過剰産生された場合、
この花、種子又は胚細胞の代謝、機能及び／又は発生を
不利な形で著しく妨げるものであり、２）第２のＲＮ
Ａ、タンパク質又はポリペプチドが産生又は過剰産生さ
れている被回復植物の少なくとも同じ花又は種子又は胚
細胞内で稔性回復ＤＮＡの発現を誘導することのできる
第１のプロモーターと同じ転写単位内にありこのプロモ
ータの制御下にある。第２のＲＮＡ、タンパク質又はポ
リペプチドは、不稔性植物の核ゲノムに由来し、被回復
植物の核ゲノム内に安定した形で組込まれている「不稔
性ＤＮＡ」にコードされており、この不稔性ＤＮＡは、
ｉ）被回復植物の各々の花、特に少なくとも１つのその
雄性又は雌性繁殖器、又は各々の種子又は各々の胚の特
定の細胞の中で選択的に不稔性ＤＮＡの発現を誘導する
ことができ、ii）特定の花、種子又は胚細胞内での稔性
回復ＤＮＡの発現が無い場合に被回復植物を雄性又は雌
性不稔にすることができる、「不稔性プロモーター」の
制御下にある。

【０００２】回復植物から被回復植物に移入された本発
明に基づく外来性ＤＮＡ配列は、場合によっては、第２
の外来性ＤＮＡ（「第１の標識ＤＮＡ」）をも含みうる
外来性キメラＤＮＡ配列であり、上記第２の外来性ＤＮ
Ａは、１）植物の少なくとも特定の組織又は特定の細胞
内に存在するとき、その植物全体を、少なくともその特
定の組織又は細胞内に第３のＲＮＡ、タンパク質又はポ
リペプチドを含まないその他の植物から容易に分離又は
識別できるものにするような第３のＲＮＡ、タンパク質
又はポリペプチドをコードし、２）植物の少なくとも特
定の組織又は特定の細胞内で第１の標識ＤＮＡの発現を
誘導することのできる第２のプロモーターと同じ転写単
位内にあって、このプロモーターの制御下にあり、しか
も、３）稔性回復ＤＮＡと同じ被回復植物核ゲノム遺伝
子座内にある。

【０００３】本発明は同様に、少なくとも１つの第１の
プロモーターの制御下にある少なくとも１つの稔性回復
ＤＮＡを含み、同様に稔性回復ＤＮＡ及び第１のプロモ
ーターに隣接して少なくとも１つの第２のプロモーター
の制御下にある少なくとも１つの第１の標識ＤＮＡをも
含みうるような外来性キメラＤＮＡ配列にも関する。

【０００４】本発明はさらに、本発明の外来性ＤＮＡ配
列を含み、植物細胞の形質転換に適したベクターであっ
て、かくして外来性ＤＮＡ配列は細胞の核ゲノム内に安
定した形で組込まれることになるようなベクター；結果
として得られる稔性回復植物細胞；かかる稔性回復植物
細胞の培養；このような稔性回復植物細胞から再生で
き、しかも、中に安定した形で組込まれた状態で外来性
ＤＮＡ配列を含む核ゲノムを有する、稔性回復植物及び
その生殖材料（例えば種子）；その核ゲノム内に安定し
た形で組込まれた状態で、外来性ＤＮＡ配列ならびに少
なくとも１つの不稔性プロモーターの制御下にある少な
くとも１つの不稔性ＤＮＡを含んでいる、被稔性回復植
物及びその生殖材料；及び、被稔性回復植物の細胞なら
びにその培養にも関する。

【０００５】本発明はさらに、植物の細胞を外来性ＤＮ
Ａ配列で形質転換することにより回復植物及びその生殖
材料を生産する方法において、稔性回復ＤＮＡは、１）
第１のプロモーターの制御下にあり、しかも、場合によ
っては、第２のプロモーターの制御下にある第１の標識
ＤＮＡと同じ遺伝子座内にあり、２）植物の細胞の核ゲ
ノム内に安定した形で組込まれることを特徴とする方法
にも関する。

【０００６】本発明はさらに、１）好ましくは回復植物
に除草剤抵抗性を付与するタンパク質をコードする第１
の標識ＤＮＡをも、核ゲノム内に安定した形で組込まれ
た状態で含んでいる回復植物を、２）核ゲノム内に安定
した形で組込まれた状態で、ａ）不稔性プロモーターの
制御下にある不稔性ＤＮＡと、この不稔性ＤＮＡに隣接
して好ましくは核ゲノムの同じ遺伝子座内にある、ｂ）
第４のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード
し、第２の標識ＤＮＡの発現によってこの植物がかかる
発現の無い植物と容易に分離又は識別されうる状態にな
るような少なくとも特定の組織又は細胞内での第２の標
識ＤＮＡの発現を誘導できる第３のプロモーターの制御
下にあり、好ましくは不稔性植物に除草剤抵抗性を付与
する、第２の標識ＤＮＡとを有する核雄性又は雌性不稔
植物と、交配することによって生産された雑種種子にも
関する。本発明は特に、過度の手作業を必要とせず、高
い他家受粉効率で、好ましくはほぼ無作為の個体群の中
で商業的規模で生産されるような雑種種子に関する。

【０００７】

【従来の技術】植物の雑種形成は、親株の望ましい形質
の組合せをもつ子孫を生産するための重要なプロセスと
して認められている。結果として得られた雑種の子孫
は、往々にして、収量、環境変化に対する適応能力及び
疾病抵抗性といったさまざまな形質において、親株をし
のぐ能力をもつ。この能力は「ヘテロ−シス（雑種強
勢）」又は「ハイブリッド・ヴィガー（雑種強勢）」と
呼ばれる。その結果、雑種形成は、トウモロコシ、テン
サイ及びヒマワリのような主要作物を改良するために広
く用いられてきた。主としてほとんどの植物が自家受粉
及び他家受粉の両方を受けることができるという事実に
関連するさまざまな理由から、雑種種子の収穫物を生産
するためのさほど自家受粉を伴わない制御された植物の
他家受粉は、商業的規模では達成し難いことであった。

【０００８】自然界においては、作物植物の大部分は、
同じ植物上、通常は同じ花の中で互いに近いところに、
雄性及び雌性の繁殖器を生成する。これは自家受粉に有
利に働く。しかしながら、いくつかの植物は、他家受粉
に有利に作用するその繁殖器の特別な形態の結果、その
例外となっている。これらの植物は、改良された生長力
及び適応能力をもつ雑種の子孫を生成する。Cannabis s
sp.(大麻）におけるこのような形態の１つでは、別々の
植物に雄器と雌器がある。Zea mays（トウモロコシ）に
おけるもう１つのこのような形態には、同一植物の異な
る部分に雄器及び雌器がある。Elaeis guineensis(ギネ
アアブラヤシ）におけるもう１つのこのような形態に
は、植物の発生中の異なる時期に稔性となる雄性及び雌
性の繁殖器がある。

【０００９】Ananas comosus（パイナップル）といった
その他のいくつかの植物種は、その繁殖器の特殊な生理
を通して他家受粉に有利に作用している。このような植
物は、１つの植物の花粉が同じ植物の又は同じ遺伝子型
をもつ他の植物の雌性繁殖器と受精できないようにする
いわゆる「自家不和合性システム」を発達させている。

【００１０】その他のいくつかの種は、いわゆる「雄性
不稔」のゲノム特性を自然に示すことにより、他家受粉
に有利に作用する。この特性により、植物の葯は、葯が
生成した花粉が成熟してしまわないうちに退化する。
〔「高等植物における雄性不稔」、M.L.H. Kaul, 1987
年（Monographs on Theoretical and Applied Genetics
10, Springer, Verlag 出版）を参照のこと。〕このよ
うな天然の雄性不稔特性は、劣性欠失が関与することが
多い広範な天然の突然変異の結果として生じるものと考
えられており、天然の条件下では種子が生成されないこ
とから、優勢に自家受粉する植物種においてはこの特性
を維持することは容易ではない。

【００１１】天然に発生するいくつかのタイプの雄性不
稔は細胞質でコードされるが、その他のものは核でコー
ドされる。雄性不稔の１つのタイプは、核にコードされ
た雄性不稔と細胞質にコードされた雄性不稔の両方の組
合せの結果である。雄性不稔を誘発する核対立遺伝子は
通常劣性であり、雄性不稔性細胞質対立遺伝子を含み、
雄性不稔誘発核対立遺伝子に関して同型接合である植物
だけが、表現型上雄性不稔である。このタイプの植物に
おいては、対応する優性の雄性稔性誘発対立遺伝子又は
「稔性回復遺伝子」は、雄性稔性の表現型を生成する。
その結果、このタイプの植物の雄性不稔性の子孫は、雄
性不稔植物を稔性回復遺伝子を含む花粉で受粉させるこ
とによって雄性稔性にすることができる。その結果、こ
のタイプの植物の子孫は、経済的産物が種子であるよう
な商業的価値のあるものである（例えばトウモロコシ、
モロコシ類及びヒマワリなど）。

【００１２】天然に発生する既知の雄性不稔性遺伝子及
び対応するその稔性回復遺伝子の大部分は、ａ）雄性不
稔及び回復特性の原因である遺伝子の質が不充分であ
る、及びｂ）これらを発生させる作物の他家受粉能力が
低い、という２つの基本的な理由のため、新しい品種の
育種又は生産において、これまで使用されなかった。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】

１．遺伝子の品質雄性不稔／稔性回復システムの潜在力を充分に実現する
ためには、次のようないくつかの品質必要条件を達成し
なくてはならない：ａ）広範な異なる環境条件下での雄性不稔性をコードす
る遺伝子の安定性。現在知られているシステムの大部分
は、それが核でコードされるか細胞質でコードされるか
に係わらず、充分な安定性を示さない。その結果、予想
できない或る種の気象条件下では、植物内で自家受粉が
起こり、異種起源の子孫が収穫される。種子証明規定要
件によると、ほとんどの主要農作物について１％未満の
非雑種種子が許容される。ｂ）植物に対する副作用が無いこと。数多くの細胞質雄
性不稔性遺伝子は、草勢の減少を誘発する。これは、雑
種強勢効果がマイナス効果に比較して作物の著しい改良
を提供する場合、或る程度までは許容できる。雄性不稔
性遺伝子を有する作物中に見られたもう１つの副作用
は、或る種の植物病原体に対する感受性の増大にある
（例えば、Ｔ−細胞質雄性不稔を有するトウモロコシ植
物はきわめてHelminthosporium maydis に感染しやす
い）。回復遺伝子も又、通常これらの遺伝子自体のせい
ではなく回復遺伝子に密に関連した遺伝子のせいである
ものの、往々にしてマイナスの副作用を示す。これらの
副作用は、ほとんどの場合において、疾病又は有害生物
に対する感受性の増大又は作物品質の低下をおこす。

【００１４】２．他家受粉の効率受容できるコストでの雑種種子の生産のためには、妥当
な効率の他家受粉が不可欠である。他家受粉に対する適
合性の低い主要農作物については、手で他家受粉を行な
うことは現実的なことではない。従って、商品として、
Ｆ₁ 雑種ではなくそれを自殖させたＦ₂ 子孫を販売する
ことが考慮されてきた（例えば、綿及び小麦）。しかし
ながら、この方法の欠点は、均一性及び雑種強勢（ヘテ
ロ−シス）の喪失及び特異的に有用な遺伝子組合せの分
離にある。農民による作物の高い収量を確保するために
は、雑種作物が充分に稔性であることが有利である（た
だし、トウモロコシやナタネといったきわめて効率の良
い他家受粉種は例外である）。これは特に、風により容
易に輸送されない重い又は粘着性ある花粉を形成する作
物（例えば綿）、花粉媒介昆虫に対して魅力の無い作物
（例えば小麦）及び閉花受精を示す作物（例えば大豆）
の場合に言えることである。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明に従うと、核ゲノ
ムの中に安定した形で組込まれた状態で、外来性ＤＮＡ
配列、好ましくは外来性キメラＤＮＡ配列を含んでいる
ような遺伝子導入被稔性回復植物が提供される。上記外
来性ＤＮＡ配列又は外来性キメラ配列は、（ａ）植物の
花、特にその雄器又は雌器、種子又は胚の細胞内で産生
又は過剰産生された場合、花、種子又は胚細胞内で第２
のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドの活性を妨げる
第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードす
る稔性回復ＤＮＡ；この第２のＲＮＡ、タンパク質又は
ポリペプチドは、花、種子又は胚細胞中で産生又は過剰
産生された場合に、花、種子又は胚細胞の代謝、機能及
び／又は発生を著しく妨害しうるものであり；第２のＲ
ＮＡ、タンパク質又はポリペプチドは、同様に植物の核
ゲノム内に安定した形で組込まれ、しかも植物の花、特
にその雄器又は雌器、及び／又は種子及び／又は胚の各
々の特定の細胞内で選択的に不稔性ＤＮＡの発現を誘導
すること、ひいては特定の花、種子及び／又は胚の細胞
内で稔性回復ＤＮＡの発現が無い場合に、その植物を雄
性不稔又は雌性不稔にすることのできる不稔性プロモー
ターの制御下にある不稔性ＤＮＡによって、コードされ
る；及び（ｂ）不稔性プロモーターが不稔性ＤＮＡの遺
伝子発現を誘導する植物の、少なくとも特定の花、種子
及び／又は胚細胞内で、稔性回復ＤＮＡの発現を誘導す
ることのできる第１のプロモーター；なお稔性回復ＤＮ
Ａは、この第１のプロモーターと同じ転写単位内にあ
り、このプロモーターの制御下にある、ことを特徴とす
る。

【００１６】被回復植物の核ゲノム内の外来性ＤＮＡ配
列は、同様に、好ましくは稔性回復ＤＮＡと同じ遺伝子
座内に、（ｃ）植物の少なくとも特定の組織又は特定の
細胞内に存在するとき、この植物を、少なくとも特定の
組織又は特定の細胞内に第３のＲＮＡ、タンパク質又は
ポリペプチドを含まないその他の植物から容易に分離又
は識別できるものにするような第３のＲＮＡ、タンパク
質又はポリペプチドをコードする第１の標識遺伝子；及
び（ｄ）少なくとも特定の組織又は特定の細胞内で第１
の標識ＤＮＡの発現を誘導することのできる第２のプロ
モーター（なお第１の標識ＤＮＡは第２のプロモーター
と同じ転写単位内にあり、このプロモーターの制御下に
ある）をも含んでいてもよい。

【００１７】同様に本発明に従うと、稔性回復ＤＮＡ及
び第１のプロモーターを含み、しかも第１の標識ＤＮＡ
及び第２のプロモーターならびに、その細胞質内で外来
性キメラＤＮＡ配列が発現されている植物細胞の葉緑体
又はミトコンドリア内へと第１のタンパク質又はポリペ
プチド又は第３のタンパク質又はポリペプチドを輸送す
ることのできるトランジットペプチドをコードする少な
くとも１つの付加的なＤＮＡをも含みうる、外来性キメ
ラＤＮＡ配列が提供される。

【００１８】さらに本発明に従うと、安定した形で組込
まれた状態で、不稔性プロモーターの制御下にある不稔
性ＤＮＡ及び好ましくは第３のプロモーターの制御下に
ある第２の標識ＤＮＡを含む核ゲノムを有する、遺伝子
導入雄性不稔又は雌性不稔植物を、第１のプロモーター
の制御下にある稔性回復ＤＮＡ及び好ましくは第２のプ
ロモーターの制御下にある第１の標識ＤＮＡが安定した
形で組込まれている核ゲノムをもつ遺伝子導入稔性回復
植物と交配することによって、遺伝子導入稔性回復植物
を提供するための方法が提供される。

【００１９】さらに本発明に従うと、外来性ＤＮＡ配列
で形質転換され、稔性回復植物を再生するのに使用でき
る、遺伝子導入稔性回復植物の細胞ならびにそれで構成
された培養細胞；遺伝子導入被稔性回復植物の細胞なら
びにそれで構成された培養細胞；及び遺伝子導入稔性回
復植物を、不稔性プロモーターの制御下にある不稔性Ｄ
ＮＡを有する遺伝子導入雄性又は雌性不稔植物と交配す
ることによって、遺伝子導入被稔性回復植物へと生長す
る雑種種子を得るための方法も提供される。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明に従うと、細胞の核ゲノム
内に本発明に基づく外来性ＤＮＡ配列を安定した形で挿
入するよう周知のやり方で植物細胞を形質転換すること
によって、稔性回復植物が、植物の単一の細胞から生産
される。この外来性ＤＮＡ配列には、第１のプロモータ
ーの制御下にあり、その５′末端でこの第１のプロモー
ターに融合され、その３′末端でポリアデニル化シグナ
ルを含む適当な転写終結（又は調節）シグナルに融合さ
れている、少なくとも１つの稔性回復ＤＮＡが含まれ
る。かくして、第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプ
チドは、少なくとも回復植物の花、好ましくはその単数
又は複数の雄性又は単数又は複数の雌性繁殖器、及び／
又は種子及び／又は胚の各々の細胞内で産生又は過剰産
生され、そのため回復植物が核雄性不稔又は核雌性不稔
植物と交配された場合、雑種雄性稔性雌性稔性の子孫が
得られることになる。この外来性ＤＮＡ配列は、第２の
プロモーターの制御下にあり、その５′末端でこの第２
のプロモーターに融合され、その３′末端でポリアデニ
ル化シグナルを含む適当な転写終結シグナルに融合され
た、少なくとも１つの第１の標識ＤＮＡをも含んでいて
もよい。この第１の標識ＤＮＡは、好ましくは稔性回復
ＤＮＡと同じ遺伝子座内にあり、かくして第３のＲＮ
Ａ、タンパク質又はポリペプチドは、少なくとも稔性回
復植物の特定の組織又は特定の細胞内で産生され、この
植物を特定の組織又は特定の細胞内に第３のＲＮＡ、タ
ンパク質又はポリペプチドを含まない植物から容易に識
別及び／又は分離できるようにしている。こうして、き
わめて高い確実性で稔性回復ＤＮＡ及び第１の標識ＤＮ
Ａの両方が植物の子孫にいっしょに分離することが保証
される。

【００２１】植物（特にAgrobacterium の感染を受ける
ことのできる植物）の細胞は、好ましくは、外来性ＤＮ
Ａ配列を含みAgrobacterium により運ばれる非病原化さ
れたＴｉ−プラスミドであるベクターを用いて、本発明
に従って形質転換される。この形質転換は、例えば欧州
特許公報０，１１６，７１８号及び０，２７０，８２２
号内に記されている手順を用いて行なうことができる。
好ましいＴｉ−プラスミドベクターは、Ｔｉ−プラスミ
ドのＴ−ＤＮＡのボーダー配列の間、又は少なくとも右
側ボーダー配列の左側に位置づけされた形で、外来性Ｄ
ＮＡ配列を含む。当然のことながら、直接遺伝子移入
（例えば欧州特許公報０，２２３，２４７号に記載のも
の）、花粉媒介形質転換（例えば欧州特許公報０，２７
０，３５６号、ＰＣＴ公報Ｗ０８５／０１８５６号及び
欧州特許公報０，２７５，０６９号に記されているも
の）、生体外原形質体（プロトプラスト）形質転換（例
えば米国特許４，６８４，６１１号に記されているも
の）、植物ＲＮＡウイルス媒介形質転換（例えば欧州特
許公報０，０６７，５５３号及び米国特許４，４０７，
９５６号に記載のもの）及びリボゾーム媒介形質転換
（例えば米国特許４，５３６，４７５号に記載のもの）
といった手順を用いて、その他のタイプのベクターを植
物細胞の形質転換のために用いることもできる。

【００２２】好ましくは、本発明に基づく稔性回復植物
は、第１のプロモーターの制御下にある稔性回復ＤＮＡ
（及び場合によっては第２のプロモータの制御下にある
第１の標識ＤＮＡ）を含む外来性ＤＮＡ配列を含む非病
原化されたＴｉ−プラスミドベクターを用いて、植物細
胞を形質転換することによって提供される。標識ＤＮＡ
は、Ｔｉ−プラスミドベクターにおいて稔性回復ＤＮＡ
の上流にあっても下流にあってもよいが、好ましくはこ
れら２つは互いに隣接し合い、Ｔｉ−プラスミドベクタ
ーのボーダー配列の間にあるか又は少なくとも右側ボー
ダー配列の左側に位置づけされ、植物細胞の核ゲノム内
に一緒に適切に移入されるようになっている。しかし望
まれる場合には、細胞を、最初、稔性回復ＤＮＡ及び第
１のプロモーターを含む外来性ＤＮＡ配列で形質転換
し、その後、稔性回復ＤＮＡと同じ細胞核ゲノム内遺伝
子座内に挿入される形で標識ＤＮＡ及び第２のプロモー
ターを用いて形質転換してもよいし、或いは又この形質
転換を逆に行なうこともできる。この目的に適当なベク
ターは、外来性ＤＮＡ配列での細胞の形質転換の場合に
ついて前述したものと同じである。好ましいベクターは
非病原化されたＴｉ−プラスミドベクターである。

【００２３】本発明に基づく稔性回復ＤＮＡの選定は重
要なことではないが、回復されるべき雄性又は雌性不稔
性の原因である不稔性ＤＮＡの選択によって左右され、
このＤＮＡに対応していなくてはならない。特に、稔性
回復ＤＮＡによりコードされる第１のＲＮＡ、タンパク
質又はポリペプチドの産生又は過剰産生は、被回復植物
の花細胞、好ましくは少なくとも１つの雄性又は少なく
とも１つの雌性繁殖器の細胞、又は種子細胞又は胚細胞
内で、不稔性ＤＮＡによりコードされる第２のＲＮＡ、
タンパク質又はポリペプチドの特異的活性を中和、阻
害、相殺、克服又はその他の形で妨害しなくてはならな
い。

【００２４】本発明の稔性回復ＤＮＡに対応しなくては
ならず、又これらが妨害すべき作用を有するような雄性
及び雌性不稔ＤＮＡの例については、それぞれ本書中に
参考として包含されている欧州特許出願明細書８９４０
１１９４．９号及び９０４０２１９６．１号の中に記述
されている。不稔性プロモーターにより不稔性ＤＮＡが
発現されている花、特に雄器又は雌器、種子及び／又は
胚のいずれかの細胞内における不稔性ＤＮＡの効果を克
服するよう、周知の方法で適当な稔性回復ＤＮＡを選択
及び分離することができる。

【００２５】稔性回復ＤＮＡの好ましい例は、バルナー
ゼ（これはあらゆるグアニン残基の後の結合を加水分解
することによりＲＮＡ分子を分解する）の活性を中和す
るバルスター；エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩの活性を
妨げるＥｃｏＲＩメチラーゼ；又はパパインのようなタ
ンパク質分解酵素（例：パパインチモーゲン及びパパイ
ン活性タンパク質）の活性を中和するタンパク質分解酵
素抑制因子、をコードする。

【００２６】稔性回復ＤＮＡのもう１つの例は、不稔性
プロモーターの制御下で、そうでなければ不稔性である
植物の花、種子又は胚細胞内で転写される不稔性ＤＮＡ
をコードするＤＮＡの１つの鎖に対し相補的なＤＮＡの
鎖をコードするアンチセンスＤＮＡ（例えば欧州特許公
報０，２２３，３９９号に記載のもの）である。このよ
うなアンチセンスＤＮＡは、不稔性ＤＮＡの発現の結果
として花、種子及び／又は胚内に生成された「不稔性Ｒ
ＮＡ」のコード部分及び／又は非コード部分に結合する
ことのできるＲＮＡ配列内に転写され得、かくしてこの
ように産生された不稔性ＲＮＡの翻訳を中和する。この
ようなアンチセンスＤＮＡの例としては、バルナーゼ；
ＥｃｏＲＩ；サイトキニン生合成の第１段階にて触媒と
して作用しAgrobacterium Ｔ−ＤＮＡの遺伝子４により
コードされる酵素であるイソペンテニルトランスフェラ
ーゼ等の植物ホルモンの合成に対し触媒として作用する
酵素；オーキシン合成に関与する、Agrobacterium Ｔ−
ＤＮＡの遺伝子１及び遺伝子２によりコードされる酵
素、又は代替的に遺伝子１又は遺伝子２のいずれかによ
りコードされる酵素；グルカナーゼ；ホスホリパーゼＡ
₂ 等のリパーゼ〔Verheij 他著（1981年）Rev. Bioche
m. Pharmacol, 91., 92-203〕；脂質ペルオキシダー
ゼ；植物細胞壁抑制因子；及び細菌毒素等の植物細胞に
とって有害なタンパク質（例：ジフテリア毒素又はボツ
リヌス毒素のＡ−フラグメント）；等の第２のタンパク
質をコードする不稔性ＤＮＡのアンチセンスＤＮＡ、な
らびに天然の自家不和合性遺伝子をコードする不稔性Ｄ
ＮＡのアンチセンスＤＮＡがある。稔性回復ＤＮＡのそ
の他の例は、Haseloff及びGerlach(1988年）Nature 33
4,585-591 によって記述されているように、一定の与え
られた標的配列に対するきわめて特異的な切断が可能な
特異的ＲＮＡ酵素（すなわち、いわゆる「リボザイ
ム」）をコードする。このようなリボザイムは、例え
ば、上に挙げた不稔性ＤＮＡの１つをその標的とするリ
ボザイムである。

【００２７】稔性回復ＤＮＡのさらなる例は、上述の異
なる稔性回復ＤＮＡの単数又は複数の組合せでありう
る。

【００２８】本発明の外来性ＤＮＡ配列に関して用いて
いる「外来性」という語は、この外来性ＤＮＡ配列が外
来性稔性回復ＤＮＡ及び／又は外来性の第１のプロモー
ターを含んでいることを意味している。外来性ＤＮＡ配
列内の、稔性回復ＤＮＡ及び第１のプロモーター等のＤ
ＮＡ、ならびに第１の標識ＤＮＡ、第２のプロモーター
及びその他のＤＮＡ、のようなＤＮＡに関して用いられ
る「外来性」という語は、このようなＤＮＡが、本発明
に従ってこのＤＮＡで形質転換された植物細胞の中で、
その起源である植物、細菌、動物、真菌、ウイルスその
他の細胞の中で自然に見い出されるのと同じゲノム環境
の中にないということを意味している。すなわち、例え
ば、外来性稔性回復ＤＮＡ又は第１の標識ＤＮＡは、
１）原植物内の核ＤＮＡであり、２）形質転換された植
物細胞に対し内在性であり（すなわち形質転換される植
物と同じ遺伝子型をもつ原植物からのものである）；し
かも３）形質転換された植物細胞内の本発明に基づく外
来性ＤＮＡ配列内で（原植物からの）３′末端転写調節
シグナル及びそれ自体の内在性プロモーターと同じ転写
単位内にあるものの、４）形質転換された植物内では原
植物内で天然にそれをとり囲んでいた遺伝子によってと
り囲まれることがないよう、原植物内における場合とは
異なる場所に、形質転換された植物の核ゲノム内に挿入
されていることが考えられる。外来性稔性回復ＤＮＡ又
は第１の標識ＤＮＡは同様に、例えば１）原植物内の核
ＤＮＡであり、２）形質転換された植物細胞に対し内在
性であるものの、３）形質転換された植物細胞内の本発
明の外来性キメラＤＮＡ配列内で、異なる（すなわちそ
れ自身のものでない）内在性プロモーター及び／又は
３′末端転写調節シグナルと同じ転写単位内にあること
が考えられる。外来性稔性回復ＤＮＡ又は第１の標識Ｄ
ＮＡは同様に、例えば１）原植物内の核ＤＮＡであり、
２）形質転換された植物細胞に対し内在性であるもの
の、３）形質転換された植物細胞内で本発明の外来性キ
メラＤＮＡ配列内の非相同プロモーター及び／又は３′
末端転写調節シグナルと同じ転写単位内にあることが考
えられる。外来性稔性回復又は第１の標識ＤＮＡは、例
えば、形質転換された植物細胞に対して非相同で、しか
も、形質転換された植物細胞内の本発明の外来性キメラ
ＤＮＡ配列内で、内在性プロモーター及び／又は３′転
写調節シグナル（例えば、形質転換される植物と同じ遺
伝子型をもつ植物の核ゲノムからのもの）と同じ転写単
位内にあることも考えられる。外来性稔性回復ＤＮＡの
一例は、形質転換される植物と同じ遺伝子型をもつ植物
の核ゲノムからのもので、形質転換される植物に対し内
在性であるタンパク質分解酵素又はリボヌクレアーゼ抑
制因子等の触媒酵素の抑制因子をコードすることがで
き、そのためこの酵素は、それが中で発現される花細
胞、特に雄器及び雌器細胞、又は種子細胞又は胚細胞の
代謝、機能及び／又は発生を不利な形で著しく妨害する
ようなタンパク質分解酵素又はリボヌクレアーゼ（すな
わち雄性又は雌性不稔性ＤＮＡによりコードされる第２
のタンパク質）の活性を中和するべく、形質転換された
細胞内で過剰産生されることになる。

【００２９】好ましくは、各々の稔性回復ＤＮＡ及び第
１の標識ＤＮＡは、形質転換される植物細胞に対し非相
同である。

【００３０】本発明の外来性ＤＮＡ配列内の稔性回復Ｄ
ＮＡ、第１又は第３のプロモーター、第１の標識ＤＮＡ
及びその他のＤＮＡ等の、ＤＮＡに関して用いられてい
る「非相同の(heterologous)」という語は、このような
ＤＮＡが、形質転換される植物と同じ遺伝子型をもつ植
物の細胞の核ゲノム内に、天然に見い出されないという
ことを意味している。非相同ＤＮＡの例としては、形質
転換される植物と同じ遺伝子型を有する植物から得られ
た葉緑体及びミトコンドリアＤＮＡがあるが、好ましい
例は、形質転換される植物とは異なる遺伝子型をもつ植
物からの葉緑体、ミトコンドリア及び核のＤＮＡ、及
び、動物及び細菌性ゲノムからのＤＮＡ及び真菌及びウ
イルス性ゲノムからの染色体及びプラスミドＤＮＡであ
る。

【００３１】本発明の外来性ＤＮＡ配列に関して用いる
「キメラ（の）」という語は、その稔性回復ＤＮＡのう
ち少なくとも１つが、１）自然界で、１つの稔性回復Ｄ
ＮＡに対するその第１のプロモーターの制御下になく；
及び／又は２）自然界で、その第１の標識ＤＮＡの少な
くとも１つと同じ遺伝子座内に見い出されない、という
ことを意味している。本発明の外来性キメラＤＮＡ配列
の例には、植物起源の第１のプロモーターの制御下にあ
る細菌起源の稔性回復ＤＮＡ；及び植物起源の第１のプ
ロモーターの制御下にあり、しかも細菌起源の第１の標
識ＤＮＡと同じ遺伝子座内にある、植物起源の稔性回復
ＤＮＡが含まれる。

【００３２】「花」というのは、その発生が全体的又は
部分的に遅らされたか又は止められた場合、花の中の生
存種子の発生及び／又は増殖又はその雄性繁殖器の発生
及び／又は増殖が妨げられるような、苗条軸、がく片、
花片、雄性繁殖器（又は雄ずい）及び／又は雌性繁殖器
（又は心皮）全体を含むものとする。「雄器」又は「雄
性繁殖器」というのは、花の中で雄性配偶子の生産に関
与している器官全体、ならびにその葯、花粉及び花糸等
の単数又は複数のその個々の部分のことである；「雌
器」又は「雌性繁殖器」というのは、花のうち雌性繁殖
器及び／又は生存種子及び／又は生存胚の生産に関与す
る器官全体、ならびに胚珠、子房、花柱、柱頭、花冠、
花盤、隔膜、がく及び胎座等の単数又は複数の個々の部
分を意味する。「胚」というのは、植物の胚全体、なら
びにその胚軸及び子葉等の単数又は複数の個々の部分を
含む。

【００３３】稔性回復ＤＮＡが、被稔性回復植物のう
ち、少なくとも、不稔性ＤＮＡが中で発現されているよ
うな特定の細胞内で発現されるためには、稔性回復ＤＮ
Ａの発現を制御する第１のプロモーターが、少なくと
も、不稔性プロモーターの制御下にある不稔性ＤＮＡが
中で選択的に発現されているような同じ被稔性回復植物
細胞（すなわち特定の花細胞、好ましくは雄器又は雌器
細胞、又は種子細胞又は胚細胞）内で、遺伝子発現を誘
導することのできるプロモーターであることが好まし
い。このような第１のプロモーターは、内在性プロモー
ターであっても外因性プロモーターであってもよく、植
物細胞のミトコンドリア又は葉緑体ゲノムから又は核ゲ
ノムからのものでありうる。いずれの場合でも、第１の
プロモーターは、形質転換されている植物細胞の核ゲノ
ムに対し外来性である。第１のプロモーターは構成的プ
ロモーターであってよいが、同様に、不稔性プロモータ
ーと同じ選択的プロモーターであってもよい。好ましく
は、第１のプロモーターは、不稔性ＤＮＡが発現されて
いるものと同じ特定の花、種子又は胚細胞、特に同じ特
定の花細胞の中での、充分な量の稔性回復用の第１のＲ
ＮＡ、タンパク質又はポリペプチドの産生を通して、稔
性の回復をひき起こす。

【００３４】本発明に基づく第１のプロモーターは、例
えば、植物の雄ずい（例えば葯）細胞内で選択的に不稔
性ＤＮＡの発現を誘導し、この植物のその他の部分にお
ける不稔性ＤＮＡの発現を妨げるのに有効な雄性不稔性
プロモーターを開示する、本書に参照により包含される
欧州特許出願明細書８９，４０１１９４．９号；ならび
に、植物の花の細胞、特に雌器（例えば雌ずい）、又は
種子細胞又は胚細胞内で選択的に不稔性ＤＮＡの発現を
誘導し、この植物のその他の部分における不稔性ＤＮＡ
の発現を妨げるのに有効な雌性不稔プロモーターを開示
している、本書に参照により包含される欧州特許出願明
細書９０４０２１９６．１号の中に記されているよう
に、１つの植物種から既知の方法で選択及び単離されう
る。例えば、適当な内在性の器官又は組織特異的な第１
のプロモーターは、１つの植物内で、以下の作業により
識別及び単離されうる：

【００３５】１．花、種子又は胚、好ましくは葯、花
粉、花糸、子房、胚珠、花柱、柱頭、胎座、がく、胚
盤、隔膜、種皮、胚乳又は子葉の発生の間にのみ植物の
中に存在するｍＲＮＡを探すこと；２．この特異的ｍＲＮＡを単離すること；３．この特異的ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製すること；４．このｃＤＮＡをプローブとして用いて、特異的ｍＲ
ＮＡをコードするＤＮＡを含む植物ゲノム内の領域を識
別すること、そして次に５．特異的ｍＲＮＡをコードするＤＮＡから上流にあり
（すなわち５′側）、このＤＮＡのプロモーターを含む
植物ゲノムの一部分を識別すること。

【００３６】これらの第１のプロモーターにより制御さ
れる遺伝子はさらに、上述の工程４と同様にしてプロー
ブとして用いることができる。ハイブリダイゼーション
条件において、これらのプローブは、もう１つの植物種
のゲノムからのＤＮＡ配列の混合物中の特定のｍＲＮＡ
をコードするＤＮＡとハイブリダイズする〔Maniatis他
著（1982年）, 「Molecular Cloning. A Laboratory Man
ual 」Cold Spring Harbor Laboratory 刊行〕。その
後、上記工程５にあるように、もう１つの植物種につい
ての特異的な第１のプロモーターを識別することができ
る。

【００３７】雄器特異的な第１のプロモーター及び不稔
性プロモーターの例としては、欧州特許出願明細書８９
４０１１９４．９号に記されているような、タバコから
分離されたタペタム特異プロモーターであるＰＴＡ２９
プロモーター、ＰＴＡ２６プロモーター及びＰＴＡ１３
プロモーター；ならびに、ＰＴＡ２９、ＰＴＡ２６及び
ＰＴＡ１３プロモーターが単離された遺伝子である欧州
特許出願明細書８９４０１１９４．９号の遺伝子ＴＡ２
９、ＴＡ２６又はＴＡ１３にハイブリダイズ可能なタペ
タム特異的ｍＲＮＡをコードする遺伝子のあらゆるプロ
モーターがある。雌器特異的な第１のプロモーター及び
不稔性プロモーターの例としては、欧州特許出願明細書
９０４０２１９６．１号内に記載のｃＤＮＡクローンｐ
ＭＯＮ９６０８に対応する胚珠特異的プロモーター及び
ＰＳＴＭＧ０７、ＰＳＴＭＧ０８、ＰＳＴＭＧ４Ｂ１２
及びＰＳＴＭＧ３Ｃ９等の花柱及び／又は柱頭特異的プ
ロモーター；ならびに、それぞれｉ）ＳＴＭＧタイプの
花柱−柱頭特異的遺伝子又はii）欧州特許出願明細書９
０４０２１９６．１号のｃＤＮＡクローンｐＭＯＮ９６
０８、に対しハイブリダイズ可能な、ｉ）花柱−柱頭特
異的又はii）胚珠特異的ｍＲＮＡをコードする遺伝子の
プロモーターがある。

【００３８】本発明の遺伝子導入稔性回復植物と交配さ
れるべき遺伝子導入不稔植物の中に複数の核不稔性ＤＮ
Ａが存在する場合には、回復植物は、少なくとも不稔性
植物の核ゲノム内の不稔性ＤＮＡの数に等しい数の本発
明に基づく複数の稔性回復ＤＮＡがその核ゲノム内に挿
入されている必要があるかもしれない。全ての稔性回復
ＤＮＡが単一の第１のプロモーターの制御下にあっても
よいが、好ましくは、各々の稔性回復ＤＮＡは、少なく
とも、不稔性プロモーターが不稔性ＤＮＡに第２のＲＮ
Ａ、タンパク質又はポリペプチドを発現させるような細
胞内において、第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプ
チドの発現を誘導するような独自の個別の第１のプロモ
ーターの制御下にある。各々の稔性回復ＤＮＡはその第
１のプロモーターに隣接しており、全ての稔性回復ＤＮ
Ａ及びその第１のプロモーターは、好ましくは、本発明
の外来性ＤＮＡ配列内で、及びこのような外来性ＤＮＡ
配列で植物細胞を形質転換するのに用いられるあらゆる
ベクターの中で、互いに隣接している。しかしながら、
稔性回復ＤＮＡが外来性ＤＮＡ配列内で互いに隣接する
必要はなく、いくつかの場合において、これらは独立し
た形質転換事象を通して回復植物の核ゲノム内に挿入さ
れてもよい。

【００３９】本発明の第１の標識ＤＮＡの選択も同様に
重要ではない。第１の標識ＤＮＡを発現する植物がこれ
を発現しない植物から容易に識別され、分離されうるよ
うにする、第３のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチド
をコードするように、周知の方法で適当な第１の標識Ｄ
ＮＡを選択し、単離することができる。多くの場合にお
いて、第１の標識ＤＮＡは、本発明に従って稔性が回復
されるべき核雄性又は雌性不稔植物内で第２の標識ＤＮ
Ａがコードするのと同じＲＮＡ、タンパク質又はポリペ
プチドをコードする。第１の標識ＤＮＡの例としては、
ジヒドロケルセチン−４−還元酵素をコードするＡ１遺
伝子〔Meyer 他（1987年）Nature 330,677-678 〕及び
グルクロニダーゼ遺伝子〔Jefferson 他（1988年）、Pr
oc, Natl, Acad, Sci. U.S.A (「PNAS]) 83, 8447〕のよ
うに植物細胞に対し識別可能な色を与えるもの；矮形性
成長又は葉の異なる形状等の特定の形態学的特性を提供
するもの；欧州特許出願明細書８８４０２２２２．９号
に記されているようにスーパーオキシドジスムターゼを
コードする遺伝子により提供されるように、植物にスト
レス許容性を付与するもの；欧州特許出願明細書８６３
００２９１．１号に記されているように虫害抵抗性を付
与するBacillus thuringiensis内毒素をコードする遺伝
子により提供されるもののように、疾病又は有害生物に
対する抵抗性を植物に付与するもの；或いは、欧州特許
出願明細書８８４０１６７３．４号に記されている細菌
ペプチドにより提供されるような、細菌抵抗性を植物に
付与するもの等の、いずれかのタンパク質又はポリペプ
チドをコードする、欧州特許出願明細書８９４０１１９
４．９号及び９０４０２１９６．１号に記されている核
雄性及び雌性不稔植物の核ゲノム内の標識ＤＮＡがあ
る。

【００４０】好ましい第１の標識ＤＮＡは、欧州特許出
願明細書８７４００５４４．０号内に記載されているよ
うなBialaphos 及びホスフィノトリシン等のグルタミン
シンセターゼ抑制因子に対する抵抗性を付与する酵素を
コードするｓｆｒ遺伝子及びｓｆｒｖ遺伝子；ならび
に、欧州特許公報０，２４０，７９２号に記されている
ホスフィノトリシンの標的としての改変グルタミンシン
セターゼ及びヨーロッパ特許公報０，２１８，５７１号
に記されているグリホセートの標的としての改変５−エ
ノールピルビルシキメート−３リン酸塩シンターゼ等
の、天然に産生される内在性酵素に比べ除草剤に対する
親和力が低い、いくつかの除草剤の改変標的酵素をコー
ドする遺伝子等の、除草剤の活性を抑制又は中和する第
３のタンパク質又はポリペプチドをコードする。その他
の第１の標識ＤＮＡは、除草剤ブロモキシニル〔Stalke
r 他著（1988年）；「Genetic Improvements of Agricu
lturally important Crops」、刊行：R.T. Fraley, N.
M. Frey及びJ. Schell, Cold Spring Harbor Laborator
ies〕又は除草剤スルホニル尿素〔Lee 他著（1988年）E
MBOJ. 7, 1241-1248 〕又は除草剤２，４−Ｄ（エルサ
レムにて１９８８年１１月１３−１８日に開催された第
２回国際植物分子生物学シンポジウムにて公表）の作用
を中和する第３のタンパク質をコードする。

【００４１】第１の標識ＤＮＡを制御する本発明の第２
のプロモーターは、同様に、第３のＲＮＡ、タンパク質
又はポリペプチドの性質に応じて望まれるように、植物
全体の中に構成的に、又は単数又は複数の特定の組織又
は細胞内で選択的に、第１の標識ＤＮＡが発現されるよ
うに、周知のやり方で選択及び単離されうる。多くの場
合において、第２のプロモーターは、本発明に従って稔
性が回復されるべき雄性又は雌性不稔植物内で第２の標
識ＤＮＡを制御する第３のプロモーターと同じである。
例えば、第１の標識ＤＮＡが除草剤抵抗性をコードする
場合、３５Ｓプロモーター〔Odell 他（1985年）Nature
313, 810-812 〕、３５Ｓ′３プロモーター〔Hull及び
Howell（1987年）「Virology」 86, 482-493〕、Ｔｉ−
プラスミドのノパリンシンセターゼ遺伝子のプロモータ
ー（「ＰＮＯＳ」）〔Herrera-Estrella (1983年) 、Na
ture 303, 209-213 〕又はオクトピンシンターゼ遺伝子
のプロモーター（「ＰＯＣＳ」）〔De Greve他、（1982
年）、J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 〕等の強
い構成的な第２のプロモーターを用いて、第１の標識Ｄ
ＮＡを植物の全ての細胞内で発現させることが有益であ
りうる。第１の標識ＤＮＡが、疾病抵抗性を付与するタ
ンパク質をコードする場合には、例えばＴｉ−プラスミ
ドのＴＲ１′又はＴＲ２′プロモーター等のＴＲプロモ
ーターである〔Velten他（1984年）EMBO J. 3, 2723-27
30〕第２のプロモーターを用いることにより、傷害組織
内で第１の標識ＤＮＡを選択的に発現させると有利かも
しれない。第１の標識ＤＮＡが除草剤抵抗性をコードす
る場合には、例えば、Rubiscoの小サブユニットをコー
ドする遺伝子のプロモーター（欧州特許出願明細書８７
４００５４４．０号）等を第２のプロモーターとして用
いて、緑色組織内で第１の標識ＤＮＡを選択的に発現さ
せることが有利であるかもしれない。第１の標識ＤＮＡ
が色素をコードする場合には、第１の標識ＤＮＡが花弁
細胞、葉細胞又は種子細胞等の特定の細胞、好ましくは
種皮の外側層内で発現されるように、第２のプロモータ
ーを選択することが有利であるかもしれない。

【００４２】本発明の回復植物又は被回復植物内で本発
明の外来性ＤＮＡ配列内に包含させるのに適した組織特
異的な第２のプロモーターを既知の方法で識別及び単離
し、かくして、第２のプロモーターの制御下にある第１
の標識ＤＮＡを担持しているものとしてこの植物を容易
に識別できるようにすることができる。これは、以下の
作業によって可能である：

【００４３】１．花弁、葉又は種子等の特定の組織の発
生中にのみその植物内に存在するｍＲＮＡを探すこと、２．この組織特異的ｍＲＮＡを単離すること、３．この組織特異的ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製するこ
と、４．このｃＤＮＡをプローブとして用いて、組織特異的
ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを含む植物ゲノム内の領域
を識別すること、そして次に、５．組織特異的ｍＲＮＡをコードするＤＮＡから上流に
あり、このＤＮＡのためのプロモーターを含む植物ゲノ
ムの一部分を識別する。

【００４４】本発明の外来性ＤＮＡ配列の中に複数の第
１の標識ＤＮＡが存在する場合、全ての第１の標識ＤＮ
Ａが単一の第２のプロモーターの制御下にあってもよい
が、好ましくは、各々の第１の標識ＤＮＡはそれ自体の
個別の第２のプロモーターの制御下にある。さらに好ま
しくは、各々の第１の標識ＤＮＡは、独自の第２のプロ
モーターの制御下にあり、形質転換された植物に対して
異なる識別可能な特性を与える異なる第３のＲＮＡ、タ
ンパク質又はポリペプチドをコードする。いずれの場合
でも、第１の標識ＤＮＡ及び第２のプロモーターは、互
いに対して、及び、本発明の外来性ＤＮＡ配列内及び外
来性ＤＮＡ配列で植物細胞を形質転換するのに用いられ
るあらゆるベクター内に含まれる単数又は複数の稔性回
復ＤＮＡに対して、隣接しているべきである。

【００４５】一般に、稔性回復ＤＮＡによりコードされ
る第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドは、不稔
性ＤＮＡが発現されている植物細胞の核又は細胞質内
で、不稔性ＤＮＡによりコードされる第２のＲＮＡ、タ
ンパク質又はポリペプチドの活性を実質的に妨げるもの
であることが好ましい。しかしながら、第１のタンパク
質又はポリペプチド及び／又は第３のタンパク質又はポ
リペプチドを、形質転換された植物の細胞の葉緑体又は
ミトコンドリアへと細胞質から輸送させることが望まし
い場合、外来性ＤＮＡ配列はさらに、トランジットペプ
チドをコードする付加的な外来性ＤＮＡを含むことがで
きる。この付加的なＤＮＡは、第１のタンパク質又はポ
リペプチドがこのように輸送されるべきである場合、稔
性回復ＤＮＡと第１のプロモーターの間にあり、第３の
タンパク質又はポリペプチドがこのように輸送されるべ
き場合には、第１の標識ＤＮＡと第２のプロモータの間
にある。「トランジットペプチド」というのは、通常、
葉緑体又はミトコンドリアタンパク質又はこのタンパク
質のサブユニットと結合しており、細胞の核ＤＮＡによ
りコードされる前駆体タンパク質として細胞内に生成さ
れるポリペプチドフラグメントのことである。トランジ
ットペプチドは、葉緑体又はミトコンドリアの中への、
核にコードされた葉緑体又はミトコンドリアタンパク質
又はサブユニットの転移プロセスの原因となるものであ
り、このようなプロセス中に、トランジットペプチドは
葉緑体又はミトコンドリアタンパク質又はサブユニット
から分離されるか又はタンパク質分解により除去され
る。欧州特許出願明細書８５４０２５９６．２号及び８
８４０２２２２．９号及びVan den Broeck他（1985年）
Nature 313, 358-363; Schatz （1987年）Eur. J. of B
ioch. 165, 1-6; 及びBoutry他（1987年）Nature 328,
340-342 に一般的に記されているように、単数又は複数
の第１又は第３のタンパク質又はポリペプチドを輸送す
るために本発明の外来性ＤＮＡ配列内にこのような付加
的なＤＮＡを単数又は複数与えることが可能である。葉
緑体内への輸送のための適当なトランジットペプチドの
一例は、酵素ＲＵＢＰカルボキシラーゼの小サブユニッ
トのトランジットペプチドであり（欧州特許出願明細書
８５４０２５９６．２号）、ミトコンドリア内への輸送
のためのトンジットペプチドの一例は、酵素Ｍｎ−スー
パーオキシドジスムターゼのトランジットペプチド（欧
州特許出願明細書８９４０１１９４．９号；本書例３も
参照のこと）である。

【００４６】本発明の外来性ＤＮＡ配列において、３′
転写終結シグナルは、植物細胞内で適正な転写終結とｍ
ＲＮＡのポリアデニル化を提供することのできるものの
中から選ぶことができる。転写終結シグナルは、転写さ
れるべき外来性遺伝子又はＤＮＡの天然のものであって
もよいし、或いは外来性又は非相同性のものであっても
よい。

【００４７】非相同性転写終結シグナルの例としては、
オクトピンシンターゼ遺伝子〔Gielen他（1984年）EMB
O. J. 3, 835-845 〕およびＴ−ＤＮＡ遺伝子７〔Velte
n及びSchell（1985年）「Nucleic Acid Research 」
（「ＮＡＲ」, 13, 6981-6998 〕のものがある。

【００４８】同様に、本発明に従うと、本発明の外来性
ＤＮＡ配列を含む植物細胞の培養（物）は、一倍体細胞
培養物〔Chuong及びBeversdof （1985年）Plant Sci 3
9, 219-226 〕について必要な形質転換を行ない、次に
周知の技術により（例えばコルヒチンを使用して）染色
体の数を倍増させることによって；又代替的には２倍体
細胞培養（物）について必要な形質転換を行ない、次
に、後に２倍体にされうる１倍体後代を生産すべく再生
植物の葯を培養することによって、同型接合優性稔性回
復植物を再生するのに用いることができる。Plant Tiss
ue and Cell Culture, Plant Biology 3, A.R. Liss, I
nc. N.Y.（1987）参照のこと。かくして外来性ＤＮＡ配
列は、培養（物）のこのようにして形質転換された植物
の各々の核ゲノム内に同型接合の形で存在することにな
る。これは、稔性回復ＤＮＡがそれから誘導された全て
の雄性又は雌性繁殖器又は植物細胞の中で存在し、発現
されうるように、ｉ）特に減数分裂後の、花粉等の植物
の雄性繁殖器、ii）特に減数分裂後の、胚珠等の植物の
雌性繁殖器又はiii)種子又は胚細胞等の雄性又は雌性繁
殖器から誘導された細胞、の或る一定の発生段階におい
て遺伝子の発現を誘導する第１のプロモーターの制御下
にある稔性回復ＤＮＡを含む植物細胞培養にとって好ま
しいことである。

【００４９】さらに本発明に従うと、雑種稔性回復植物
に生長しうる雑種種子を生成するための方法も提供され
ている。１つの方法には、少なくとも１つの第３のプロ
モーターの制御下にある少なくとも１つの第２の標識Ｄ
ＮＡを含む核雄性不稔雌性稔性植物を、第２の標識ＤＮ
Ａと同じものである第１の標識ＤＮＡを持たず、少なく
とも１つの第１のプロモーターの制御下にある少なくと
も１つの核雄性稔性回復ＤＮＡを含む同型接合の核雄性
稔性回復植物と、交配する工程が関与している。この方
法においては、雄性不稔及び雌性稔性植物は無作為に播
かれ、受粉の後、第２の標識ＤＮＡによりコードされた
選択可能な標識を用いて、稔性回復植物が除去され、か
くして雄性不稔植物上でのみ種子が収穫されることにな
る。このことにより、収穫された全ての種子が雑種であ
ると同時に稔性であることが保証される。もう１つの方
法には、同型接合型で第２のプロモーターの制御下にあ
る核第１標識ＤＮＡ及び第１のプロモーターの制御下に
ある核雌性稔性回復ＤＮＡを含む核雄性不稔雌性稔性回
復植物を、同型接合型で少なくとも第２のプロモーター
の制御下にある同じ核第１標識ＤＮＡ及び第１のプロモ
ーターの制御下にある核雄性稔性回復ＤＮＡを含む核雄
性稔性雌性不稔回復植物と、交配する作業が関与してい
る。雄性不稔及び雄性稔性の親株の両者共、ほぼ無作為
の個体群（母集団）の中で栽培することができ、かくし
て正確な栽植パターンの必要無く他家受粉の機会が増大
され、第１の標識ＤＮＡによりコードされた特性を用い
て、１００％稔性の雑種種子を収穫することができる。
好ましくはこれらの方法の両方において、第１の標識Ｄ
ＮＡは構成的な第２のプロモーターの制御下にあり、不
稔性植物を特定の除草剤に対し耐性あるものにする第３
のタンパク質又はポリペプチドをコードする。すると、
特定の除草剤を用いて、他家受粉に先立ち、望ましくな
い遺伝子型を破壊することができる。

【００５０】１）本発明に従った、優性対立遺伝子とし
て何世代にもわたり伝達可能な、核ゲノム内に安定した
形で組込まれている稔性回復ＤＮＡを含む稔性回復植物
を、２）欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号及び９
０４０２１９６．１号に従った、優性対立遺伝子として
何世代にもわたって伝達可能な、核ゲノム内に安定した
形で組込まれた不稔性ＤＮＡ、好ましくは不稔性ＤＮＡ
と第２の標識ＤＮＡの両方を含む雄性又は雌性不稔性植
物と交配する、本発明に従った方法は、以下に記述する
ように、雑種作物を育種し生産するための現在用いられ
ているシステムに対する１つの代替案であり、このシス
テムに比べいくつかの利点を提供している：

【００５１】１．穀物（例えば小麦、大麦、エンバ
ク）、米、綿及び多くのマメ科植物（例えば大豆及びエ
ンドウ豆）といったような、容易に他家受粉せず、種子
が経済的産物であり、増殖速度が低い作物については、
本発明に基づく方法は、１００％雑種の稔性子孫を生産
し、かくして高い結実及び正常な収率を保証する可能性
を提供する。親株として雄性不稔及び雌性不稔親株、及
びそのそれぞれの不稔性に対する回復遺伝子を用いて、
雑種植物を生産するための典型的な戦略の一例には、以
下のような工程が含まれると考えられる（なお、ここ
で、「ＦＨ１」というのは、除草剤１抵抗性に関連する
雌性不稔性を意味し、「ＲＦ」というのは、雌性不稔性
の回復遺伝子であり、「Ｍ１Ｈ１」というのは、除草剤
１抵抗性に関連する雄性不稔性１を意味し、「Ｍ２Ｈ
２」は除草剤２抵抗性に関連する雄性不稔性２を意味
し、「ＲＭ１」は雄性不稔性１の回復遺伝子、「Ａ」は
雌性親株、「Ｂ」は雄性親株を表わす）：

【００５２】Ａ．雌性親株Ａの育成１Ａａ）（雄性親株の雌性不稔性ＤＮＡの発現生成物を
特異的に中和する）第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリ
ペプチドをコードし、少なくとも雄性植物内の雌性不稔
性ＤＮＡが発現されるべきものと同じ細胞の中で遺伝子
発現を誘導する第１のプロモーターの制御下にある、本
発明に基づく稔性回復ＤＮＡを用いて、植物Ａを形質転
換する。こうしてＡ^RF/rf が生み出される。１Ａｂ）Ａ^RF/rf を自家受粉させ、２５％のＡ^RF/RF 植
物を得る。１Ａｃ）雄器特異的プロモーターの制御下にある「雄性
不稔ＤＮＡ１」及び除草剤１に対する抵抗性を付与する
標識ＤＮＡを含むキメラＤＮＡ配列を用いて、Ａ^RF/RF
を形質転換する。こうして雄性不稔性植物Ａ
^{RF/RF;M1H1/mh} が生み出される。１Ａｄ）Ａ^{RF/RF;M1H1/mh} ×Ａ^RF/RF;mh/mh の交配を行
なうことにより雄性不稔性植物を増殖し、５０％Ａ^{RF/RF;M1H1/mh} ：雄性不稔１、除草剤１に対し
て抵抗性、５０％Ａ^RF/RF;mh/mh ：雄性稔性、除草剤感受性、から成る子孫を得る。

【００５３】この混合物を雌性親株のスケールアップの
連続する世代にわたって播き、純粋な雌性親株ストック
を作り出すため交互の畦又は畦ブロックの形で除草剤１
を用いる。除草剤が散布されていない畦又は畦ブロック
は、花粉源として用いられる。除草剤処理された畦又は
畦ブロックの種子だけを収穫して次の世代を構成させ
る。

【００５４】Ｂ．雄性親株Ｂの育成Ｂの経済的な生産のために、雌性不稔親株は２つの異な
る不稔性ＤＮＡの使用を必要とする。第１のＤＮＡは、
植物の雌器の細胞内で選択的に遺伝子発現を誘導するプ
ロモーターの制御下にあり、除草剤１に対する抵抗性を
付与する標識ＤＮＡに連結された雌性不稔ＤＮＡであ
る。第２のものは、植物の雄器細胞内で選択的に遺伝子
発現を誘導するプロモーターの制御下にあり、除草剤２
に対する抵抗性を付与する第２の標識ＤＮＡに連結され
ている雄性不稔ＤＮＡ（雄性不稔ＤＮＡ１とは異なるも
ので、「雄性不稔ＤＮＡ２」と呼ばれる）である。

【００５５】１Ｂａ）少なくとも雌性親株内の雄性不稔
ＤＮＡ１が発現される同じ雄器細胞内で遺伝子発現を誘
導する第１のプロモーターの制御下にあり、雌性親株で
発現される雄性不稔ＤＮＡ１の活性を特異的に中和する
第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードす
る本発明の外来性ＤＮＡ配列で、植物Ｂを形質転換す
る。こうしてＢ^RM1/rmが生み出される。１Ｂｂ）Ｂ^RM1/rmを自家受粉させて、２５％のＢ
^RM1/RM1 を得る。１Ｂｃ）（１）植物の雌器細胞内で選択的に遺伝子発現
を誘導するプロモーターの制御下にある雌性不稔ＤＮＡ
及び除草剤１に対する抵抗性を付与する標識ＤＮＡを含
むキメラＤＮＡ配列で、Ｂ^RM1/RM1 を形質転換する。こ
うして雌性不稔植物Ｂ^{RM1/RM1;FH1/fh}が得られる。

【００５６】（２）雄器特異的プロモーターの制御下に
ある雄性不稔ＤＮＡ２及び除草剤２に対する除草剤抵抗
性を付与する標識ＤＮＡを含むキメラＤＮＡ配列で、Ｂ
^RM1/RM1 を形質転換する。こうして雄性不稔植物Ｂ
^{RM1/RM1;M2H2/mh} が得られる。１Ｂｄ）（１）Ｂ^{RM1/RM1;M2H2/mh} ×Ｂ^{RM1/RM1;mh/mh}
の交配を行なうことにより、１Ｂｃ）（２）の雄性不稔
植物を増殖させ、５０％Ｂ^{RM1/RM1;M2H2/mh} ：雄性不稔、除草剤抵抗性、
及び５０％Ｂ^{RM1/RM1;mh/mh} ：雄性不稔、除草剤感受性、から成る子孫を得る。

【００５７】（２）別々の畦に植栽されたＢ
^{RM1/RM1;M2H2/mh;fh/fh} ×Ｂ^{RM1/RM1;mh/mh;FH1/fh}の交
配を行なうことにより、１Ｂｃ）（１）の雌性不稔植物
を増殖させ、雄性不稔畦に以下の遺伝子型を生み出す：２５％Ｂ^{RM1/RM1;M2H2/mh;FH1/fh}：不稔で、除草剤１及
び２に対して抵抗性、２５％Ｂ^{RM1/RM1;mh/mh;FH1/fh}：雌性不稔で除草剤１に
対して抵抗性、２５％Ｂ^{RM1/RM1;M2H2/mh;fh/fh} ：雄性不稔で除草剤２
に対して抵抗性、及び２５％Ｂ^{RM1/RM1;mh/mh;fh/fh} ：稔性で除草剤感受性。

【００５８】１Ｂｅ）この混合物は再び、さらなる増殖
交雑において雄性親株（Ｂ^{RM1/RM1;mh/mh;FH1/fh}）とし
て用いることができ、かくして各世代で除草剤１を噴霧
することで雌性稔性植物は除去され、雄性親株が維持さ
れる。この混合物は、１Ｂｄ（１）で得られた混合物と
共に交互の畦又は畦ブロックに植栽される。この１Ｂｄ
（１）の混合物は、雄性稔性植物を除去すべく除草剤２
で処理される。代替的には、１Ｂｄ）（２）で得られた
混合物をこのようにして播き、交互の畦を除草剤１又は
除草剤２のいずれかで処理することもできる。このよう
な状況下では、工程１Ｂｄ）（１）は不要である。

【００５９】Ｃ．雑種種子ＡＢの生産工程１Ａｄ）及び１Ｂｅ）で得た混合物を無作為に播
く。他家受粉が起こらないうちに、除草剤１を噴霧して
望ましくない遺伝子型を全て除去する。Ａ^{RF/RF;rf/rf;M1H1/mh;fh/fh} ×Ｂ
^{RM1/RM1;rm/rm;mh/mh;FH1/fh} で他家受粉が起こり、１００％稔性雑種粒子を構成す
る、２５％ＡＢ^{RF/rf;M1H1/mh;rm/RM1;FH1/fh} ２５％ＡＢ^{RF/rf;M1H1/mh;rm/RM1;fh/fh} ２５％ＡＢ^{RF/rf;mh/mh;rm/RM1;FH1/fh} ２５％ＡＢ^{RF/rf;mh/mh;rm/RM1;fh/fh} を生み出す。

【００６０】２．育種される作物の特別な特性に応じ
て、前述の一般的戦略を単純化することが可能である。
このような特殊な特性としては、以下のものがある：（２．１）作物が昆虫による適正な又は優れた他家受粉
を受ける場合、混合物中の親株Ｂの相対的割合は、作物
の収量に影響を及ぼすことなく下げることができる
（例；綿、Pisum(エンドウ）のようなマメ科植物、アル
ファルファ、ナタネ及びトウモロコシ）。代替的には、
雄性不稔及び除草剤抵抗性にされた雌性親株及び雄性不
稔のための稔性回復遺伝子を有する雄性親株が関与する
作物のためには、はるかに単純化された育種計画を用い
ることが可能である。これにより以下の戦略が可能とな
る：掛け合せ：同時的に着花しない作物について、畦状に又
は無作為にＡ^MH/mh ×Ｂ^RM/RM を播く。無作為に播種し
た場合、受粉後に除草剤処理する。収量：１００％稔性雑種子孫を構成する、５０％ＡＢ
^MH/mh;RM/rm 及び５０％ＡＢ^mh/mh;RM/rm 。

【００６１】（２．２）Ｆ２子孫が商業的種子産物であ
る場合（例・綿）、以下の派生戦略を用いることができ
る：ａ）親株Ａの雄性不稔植物を形質転換により生産し、Ａ
^M/m;r/r を得る。ｂ）生成物がａ）の雄性不稔植物内の雄性不稔遺伝子の
活性を特異的に中和するような稔性回復遺伝子をその核
ゲノムの２つの独立した遺伝子座内にもつ稔性回復植物
を、２回の独立した形質転換事象により生産し、自家受
粉によって同型接合形で両方の回復遺伝子を得、Ｂ
^{m/m;R1/R1;R2/R2} を生じさせる。ｃ）Ａ^M/m;r/r ×Ｂ^{m/m;R1/R1;R2/R2} のかけ合せを行な
い、１００％雑種稔性子孫を構成する５０％ＡＢ
^{M/m;R1/r;R2/r} 及び５０％ＡＢ^{m/m;R1/r;R2/r} を生産す
る。そして、ｄ）ｃ）で得た混合物を自家受粉させる。子孫の半数は
以下の表１に示されている通りであり、合計６４本の植
物のうちわずか１本のみが雄性不稔である（表１）に＊
で示されているもの）、その他全ては稔性である。この結果はこの方法を経済的に価値あるものにしてい
る。

【００６２】

【表１】

【００６３】（２．３）雄性不稔ＤＮＡ２が除草剤２に
対する抵抗性をコードする遺伝子以外の標識ＤＮＡ（例
えば色遺伝子）に連結される場合、この雄性不稔性ＤＮ
Ａを有する植物は、その他の植物に損傷を与えることな
く容易に除去されうる。代替的には、いかなる選択可能
な標識ＤＮＡも無く、雄性不稔ＤＮＡ２を導入すること
ができる。雄性不稔ＤＮＡ２を担持する植物の除去は、
小規模でのみ行なう必要のある、手による選択によって
行なうことが可能である〔前記（１）Ｂｄ）参照のこ
と〕。

【００６４】（２．４）形質転換すべき親株の組織が一
倍体物質で構成されている場合、これはその後の育種を
著しく減少させ、同型接合形で不稔性をコードする優性
遺伝子を与える。

【００６５】（２．５）種子の価値又は手作業コスト
が、少なくとも雑種生産前の最後の工程まで、望ましく
ない遺伝子型の手による除去を可能にする場合、全体的
システムも同様に単純化できる。

【００６６】３．本発明の稔性回復システムと組合わさ
れた雄性及び雌性不稔を用いた育種戦略のもう１つの例
には、以下のような工程が含まれると考えられる：３Ａ．雌性親株Ａの育成３Ａａ）雄性親株で発現された雌性不稔ＤＮＡの生成物
の活性を特異的に中和する第１のＤＮＡ、タンパク質又
はポリペプチドをコードし；少なくとも雄性親株の雌性
不稔ＤＮＡが中で発現されている細胞と同じ雌器細胞内
で稔性回復ＤＮＡの発現を誘導するような第１のプロモ
ーターの制御下にあり；除草剤２に対する抵抗性をコー
ドする第１の標識ＤＮＡに隣接している、本発明の稔性
回復ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡ配列で、系統Ａを形質転
換する。これによりＡ^RFH2/rfhを生じさせる。

【００６７】同様にこれと並行して、雄器特異的プロモ
ーターの制御下にあり、第１の標識ＤＮＡによりコード
されたものとは異なる除草剤抵抗性（すなわち除草剤１
に対する抵抗性）をコードする第２の標識ＤＮＡに隣接
している雄性不稔ＤＮＡを含むＤＮＡ配列で、系統Ａを
形質転換する。これによりＡ^MH1/mhを生じさせる。３Ａｂ）Ａ^RFH2/rfh×Ａ^MH1/mhのかけ合わせを行ない、２５％Ａ^{RFH2/rfh;MH1/mh} ２５％Ａ^{RFH2/rfh;mh/mh} ２５％Ａ^{rfh/rfh;MH1/mh} ２５％Ａ^{rfh/rfh;mh/mh} を生じさせる。

【００６８】除草剤１及び２を噴霧し、Ａ
^{RFH2/rfh;MH1/mh} を選択する。３Ａｃ）Ａ^RFH2/rfh×Ａ^RFH2/rfhの自家受粉を行ない、
自家受粉により維持できる２５％Ａ^RFH2/RFH2 を生じさ
せる。３Ａｄ）Ａ^{RFH2/RFH2;mh/mh} ×Ａ^{RFH2/rfh;MH1/mh} のか
け合せを行なう。こうして２５％Ａ^{RFH2/RFH2;MH1/mh} ２５％Ａ^{RFH2/RFH2;mh/mh} ２５％Ａ^{RFH2/rfh;MH1/mh} ２５％Ａ^{RFH2/rfh;mh/mh}を生じさせ、

【００６９】かくして、同型接合形で稔性回復ＤＮＡを
有する雄性不稔植物を、除草剤１の噴霧及び親株Ａ系統
とのテスト交配により選択することができる。

【００７０】３Ａｅ）Ａ^{RFH2/RFH2;MH1/mh}×Ａ
^{RFH2/RFH2;mh/mh} の交配を行なうことにより、雌性親株
Ａを維持する。

【００７１】Ｂ．雄性親株Ｂの育成３Ｂａ）雌性親株で発現された雄性不稔ＤＮＡの生成物
の活性を特異的に中和する第１のＲＮＡ、タンパク質又
はポリペプチドをコードし；少なくとも雄性不稔ＤＮＡ
が発現されている細胞と同じ雄器細胞内で稔性回復ＤＮ
Ａの発現を誘導する第１のプロモーターの制御下にあ
り；除草剤２に対する抵抗性をコードする第１の標識Ｄ
ＮＡに隣接している、本発明の稔性回復ＤＮＡを含む外
来性ＤＮＡ配列で、系統Ｂを形質転換する。これにより
Ｂ^RMH2/rmhを生じる。

【００７２】これと並行して同様に、雌器特異的プロモ
ーターの制御下にあり、除草剤１に対する抵抗性をコー
ドする第２の標識ＤＮＡに隣接する雌性不稔ＤＮＡを含
むＤＮＡ配列で、系統Ｂを形質転換する。これによりＢ
^FH1/fhを生じさせる。３Ｂｂ）Ｂ^{RMH2/rmh;fh/fh}×Ｂ^{rmh/rmh;FH1/fh}をかけ合
わせ、２５％Ｂ^{RMH2/rmh;FH1/fh} ２５％Ｂ^{RMH2/rmh;fh/fh} ２５％Ｂ^{rmh/rmh;FH1/fh} ２５％Ｂ^{rmh/rmh;fh/fh} を生じさせる。

【００７３】除草剤１及び２を噴霧することにより、Ｂ
^{RMH2/rmh;FH1/fh} を分離する。３Ｂｃ）Ｂ^RMH2/rmh×Ｂ^RMH2/rmhの自家受粉を行ない、
自家受粉を通じて維持されうる２５％Ｂ^RMH2/RMH2 を生
じさせる。３Ｂｄ）Ｂ^RMH2/RMH2 ×Ｂ^{RMH2/rmh;FH1/fh} を掛け合わ
せ、２５％Ｂ^{RMH2/RMH2;FH1/fh} ２５％Ｂ^{RMH2/RMH2;FH/fh} ２５％Ｂ^{RMH2/rmh;FH1/fh} ２５％ ^{RMH2/rmh;fh/fh} を生じさせ、かくして同型接合形の稔性回復ＤＮＡをも
つ雌性稔性植物は、除草剤１の噴霧及び親株Ｂ系統との
テスト交配により選択される。

【００７４】３Ｂｅ）Ｂ^{RMH2/RMH2;fh/fh} ×Ｂ
^{RMH2/RMH2;FH1/fh}の交配を行なうことにより、雄性親株
Ｂを維持する。

【００７５】Ｃ．雄性又は雌性親株（Ａ又はＢを両方共
Ｃと呼ぶ）の育成のための代替的方法３Ｃａ）もう一方の親株で発現された不稔性ＤＮＡの生
成物の活性を特異的に中和する第１のＲＮＡ、タンパク
質又はポリペプチドをコードし；少なくとももう一方の
親株の不稔性ＤＮＡが発現されている細胞の中で稔性回
復ＤＮＡの発現を誘導する第１のプロモーターの制御下
にあり；除草剤２に対する抵抗性をコードする第１の標
識ＤＮＡに隣接している、本発明の稔性回復ＤＮＡを含
む外来性ＤＮＡ配列で、系統Ｃを形質転換する。これに
よりＣ^RH2/rhを生じさせる。３Ｃｂ）Ｃ^RH2/rh×Ｃ^RH2/rhの自家受粉を行ない、自家
受粉を通じて維持されうる２５％Ｃ^RH2/RH2 を生産す
る。３Ｃｃ）雄器又は雌器特異的プロモーターの制御下にあ
り、除草剤１に対する抵抗性をコードする第２の標識Ｄ
ＮＡに隣接する不稔性ＤＮＡを含むＤＮＡ配列で、Ｃ
^RH2/RH2 を形質転換する。これにより、Ｃ
^{RH2/RH2;SH1/sh}が生じる（なお、ここで「ｓ」は雄性又
は雌性不稔を意味する）。３Ｃｄ）Ｃ^{RH2/RH2;SH1/sh}×Ｃ^{RH2/RH2;sh/sh} のかけ合
わせにより系統Ｃを維持する。

【００７６】３Ｄ．雑種種子ＡＢの生産工程３Ａｅ）及び３Ｂｅ）で得られた混合物又は工程３
Ｃｄ）で得られた混合物を無作為に播種する。自家受粉
が起こる前に、望ましくない全ての遺伝子型を除去する
ため除草剤１及び２を噴霧する。この結果、次のかけ合
せが導かれる；Ａ^{RFH2/RFH2;rm/rm;MH1/mh;fh/fh}×Ｂ
^{RMH2/RMH2;rf/rf;FH1/fh;mh/mh}。こうして１００％雑種稔性種子から成る、以下の子孫が
生じる：２５％ＡＢ^{RFH2/rf;RMH2/rm;MH1/mh;FH1/fh} ２５％ＡＢ^{RFH2/rf;RMH2/rm;MH1/mh;fh/fh} ２５％ＡＢ^{RFH2/rf;RMH2/rm;mh/mh;FH1/fh} ２５％ＡＢ^{RFH2/rf;RMH2/rm;mh/mh;fh/fh} 。

【００７７】４．以前のシステムに比べて、欧州特許出
願明細書８９４０１１９４．９号及び９０４０２１９
６．１号に記されている雄性又は雌性不稔システムと組
み合わせた本発明に基づく稔性回復システムは、さらに
以下のような利点を有する：ａ）品質を管理するため充分に識別及び選択可能な複数
の標識を用いるフールプルーフ生産；ｂ）信頼性の高い生産及び生産コストの低減にとって必
要不可欠なことである、最終種子増殖因子レベルでの複
雑性の著しい削減。及びｃ）商業的雑種種子の生産に必要な時間の縮減。

【００７８】以下の例が本発明を明確に説明している。
例中に相反する記述のないかぎり、組換え型ＤＮＡを作
り、操作するための全ての手順は、Maniatis他著「分子
クローニング、−実験室マニュアル」、Cold Spring Ha
rbor Laboratory(1982年）に記されている標準化された
手順により実施された。例中で用いられている以下のプ
ラスミド及びベクターは、ブタペスト条約の規定に基づ
きドイツ連邦共和国Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braun
schweigのDeutsche Sammlung Feur Mikroorganismen un
d Zellculturen （「ＤＳＭ」）に寄託されている：

【００７９】

【表２】

【００８０】

【実施例】例１−ＰＴＡ２９及びバルスター遺伝子のキ
メラＤＮＡ配列の構築図１に示されている「ｐＴＶＥ７
４」という名のプラスミドを、ＰＴＡ２９プロモーター
と以下の周知のＤＮＡフラグメントを組合わせることに
よって構築する；

【００８１】１．ペニシリナーゼ（β−ラクタマーゼ）
遺伝子が欠失しているｐＧＳＣ１７００〔Cornelissen
及びVandewiele（1989年）NAR 17(1) 19-29 〕から誘導
された、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列を含むベクターフラグ
メント；なおこれらのボーダー配列の間には以下のＤＮ
Ａフラグメント２及び３が位置づけられている。

【００８２】２．細胞外リボヌクレアーゼBarnase 〔Ha
rtley 他（1972年）Preparative Biochemistry 2 (3) 2
43-250; Hartley 及びSmeaton （1973年）J. Biol. Che
m. 248 (16), 5624-5626〕の細胞抑制因子であるバルス
ターをコードするBacillus amyloliquefaciensの遺伝子
とＡＴＧ開始コドンにてフレーム内で融合された、欧州
特許出願明細書８９４０１１９４．９号からのプロモー
ターカセットＰＴＡ２９を含むキメラ配列；なお、以下
の工程が実施される：

【００８３】ａ）コード配列の第１のメチオニンコドン
において適当なＣｌａＩクローニング部位を得るため、
第１のＡＴＧコドンの上流の位置７〜１０にあるヌクレ
オチド配列ＧＣＡＣを、ヌクレオチド配列ＡＴＣＧへと
突然変異させる（図２参照）；これは、部位特異的突然
変異誘発（欧州特許出願明細書８７４０２３４８．４
号）を用いて達成され、ｐＭｃ５−ＴＰＢＳＣを生成す
る；酵素ＳＩによりＣｌａＩ突出末端を消化し、３３０
ヌクレオチド（図２）のＣｌａＩ−ＨｉｎｄIIIフラグ
メントとしてバルスター遺伝子を単離する；そして

【００８４】ｂ）ｐＭＢ３のＳＩ処理を受けたＮｃｏＩ
−ＨｉｎｄIII フラグメント（欧州特許出願明細書８９
４０１１９４．９号）及び、転写終結及びポリアデニル
化のためのノパリンシンセターゼ（「ＮＯＳ」）の３′
末端シグナルを含む制限フラグメント〔An他（1985年 ,
EMBO J. 4 (2), 277 〕と、ＳＩ処理を受けたｐＭｃ５
−ＴＰＢＳＣのＣｌａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントを
融合させる；及び

【００８５】３．Arabidopsis Rubisco ＳＳＵプロモー
ター（「ＰＳＳＵ」又は「ＰＳＳＵＡＲＡ」）、カナマ
イシン抵抗性をコードするｎｅｏ遺伝子（欧州特許出願
明細書８７４００，５４４．０号）、及びオクトピンシ
ンターゼ（「ＯＣＳ」）遺伝子の３′末端シグナル〔Dh
aese他（1983年）EMBO J. 2, 419〕を含むキメラ配列。

【００８６】ｐＴＶＥ７４は、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列
内に、３つのキメラ配列、すなわち；独自の第２のプロ
モーターの制御下にある第１の標識ＤＮＡを含むＰＮＯ
Ｓ−ｎｅｏ及びＰＳＳＵ−ｓｆｒ；ならびに、バルスタ
ーが、タペタム特異的ＰＴＡ２９第１プロモーターの制
御下で発現されたときに、そうでなければ雄性不稔であ
る植物のタペタム細胞の中で、欧州特許出願明細書８９
４０１１９４．９号に記されているようにタペタム特異
的不稔性プロモーターの制御下で不稔性ＤＮＡによりコ
ードされたバルナーゼの活性を中和することになる稔性
回復ＤＮＡであるようなＰＴＡ２９−バルスター、を含
むバイナリータイプのＴ−ＤＮＡベクターである。

【００８７】例２−タバコ及びナタネへの例１のキメラ
ＤＮＡ配列の導入E. coli(大腸菌）から、ｐＭＰ９０を含むAgrobacteriu
m tumefaciens Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆ^R 中にｐＴＶＥ７４
（例１からのもの）を可動化（授動）することにより、
組換え型Agrobacterium 菌株を構築する〔Koncz 及びSc
hell（1986年）Mol. Gen. Genetics 204, 383-396 〕。
結果として得られたｐＭＰ９０とｐＴＶＥ７４を宿した
Agrobacterium 菌株は、例えば欧州特許出願明細書８７
４００５４４．０号に記されているような標準的手順を
用いてタバコのリーフディスク（N. tabacum Petite Ha
vane SR1）を形質転換するため、及びLloyd 他（1986
年）Science 234, 464-466及びKlimaszewska他（1985
年）Plant Cell Tissue OrganCulture 4, 183-197の手
順に従ってナタネ（Brassica napus）を形質転換するた
めに用いられる。感染後、Agrobacterium 菌株を殺すた
めにはカルベニリシンが用いられる。

【００８８】形質転換されたカルスを、１００μg/mlの
カナマイシンを含む基質上で選択し、抵抗性のあるカル
スを植物へと再生させる。苗条（従長枝）及び根の誘導
後、形質転換体を温室に移し、着花するまで栽培する。
花を検査したところ、完全に天然の形態を示していた。
これらの花の花粉は、欧州特許出願明細書８９４０１１
９４．９号の例１３に記されているタペタム細胞特異的
ＰＴＡ２９不稔性プロモーターの制御下で、不稔性ＤＮ
Ａとしてバルナーゼ遺伝子を含む核雄性不稔タバコ及び
ナタネ植物を受粉させるために用いられる。これらの受
粉した雄性不稔植物の子孫を分析してみると、その花の
７５％は雄性不稔表現型（すなわち、その花の雄ずい内
の正常なタペタム層の欠如）を示していない。

【００８９】例３−ＰＴＡ２９及びＥｃｏＲＩメチラー
ゼ遺伝子のキメラＤＮＡ配列の構築ＰＴＡ２９プロモー
ターと以下の周知のフラグメントを組立てることによ
り、図３に示されている「ｐＴＶＥ７３」と呼ばれるプ
ラスミドを構築する：

【００９０】１．ボーダー配列の間に以下のＤＮＡフラ
グメント２〜４がある状態の、例１に記載のｐＧＳＣ１
７００から誘導されたＴ−ＤＮＡボーダー配列を含むベ
クターフラグメント；２．ｎｅｏ遺伝子、及びＯＣＳ遺伝子の３′末端の発現
を制御するｐＳＳＵプロモーターを含む、例１のキメラ
配列（No. ３）；３．ノパリンシンターゼプロモーター（「ＰＮＯＳ」）
〔欧州特許出願明細書８７４００５４４．０号〕、ハイ
グロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｐｈ遺伝子
〔Van den Elzen 他（1985年）Plant Molecular Biolog
y 5, 299-302〕及びＮＯＳ遺伝子の３′末端（例１）を
含むキメラ配列；及び４．その発現生成物が、ＧＡＡＴＴＣ部位で２本鎖ＤＮ
Ａを切断するＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼの活性
を中和する〔Wilson（1988年）TIG 4 (11), 314-318
〕、ＥｃｏＲＩメチラーゼ遺伝子〔Botterman 及びZab
eau（1985年）Gene37, 229-239〕とフレーム内で融合さ
れた、例１からのＰＴＡ２９プロモーターカセットを含
むキメラ配列；

【００９１】なお、以下の工程が実施される：ａ）ＥｃｏＲＩメチラーゼのコード配列を含むｐＥｃｏ
Ｒ４からのＢｇｌII−ＨｉｎｄIII フラグメント〔Bott
erman 及びZabeau, 1985年〕を、ｐＭａ５−８内にクロ
ーニングする（欧州特許出願明細書８７４０２３４８．
４号）；部位特異的突然変異誘発により、メチラーゼコ
ード配列のＮ末端にＦｓｐＩ部位を導入する。

【００９２】ｂ）ｐＭＢ３のプロモーターフラグメント
を、その充てんされたＮｃｏＩ部位で平滑ＦｓｐＩ末端
に連結し、を生み出し、例１のＮＯＳ遺伝子の３′末端と融合させ
る。

【００９３】ｐＴＶＥ７３は、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列
内に、３つのキメラ配列、すなわち；独自の第２プロモ
ーターの制御下にある第１の標識ＤＮＡであるＰＳＳＵ
−ｎｅｏ及びｐＮＯＳ−ｈｐｈ；ならびに、タペタム特
異的ＰＴＡ２９第１プロモーターの制御下にある稔性回
復ＤＮＡであるＰＴＡ２９−ＥｃｏＲＩメチラーゼ遺伝
子、を含むバイナリータイプのＴ−ＤＮＡベクターであ
る。ＰＴＡ２９プロモータの制御下にある稔性回復ＤＮ
Ａの、そうでなければ雄性不稔である植物のタペタム細
胞内での発現は、欧州特許出願明細書８９４０１１３
４．９号の例１６に記されているようにタペタム特異的
不稔性プロモーターの制御下にある不稔性ＤＮＡにより
コードされたＥｃｏＲＩのこのような細胞内での活性を
中和することになる。

【００９４】図４に示されている「ｐＴＶＥ７６」とい
う名のプラスミドも、同様に、ＰＴＡ２９プロモーター
と以下の周知のフラグメントを組立てることによって構
築される；

【００９５】１．ペニシリナーゼ遺伝子が欠失している
ｐＧＳＣ１７００〔Cornelissen 及びVandewiele（1989
年）Nar 17 (1) 19-29〕から誘導された、Ｔ−ＤＮＡボ
ーダー配列を含み、そのボーダー配列間には以下のＤＮ
Ａフラグメント２〜４があるような、ベクターフラグメ
ント；２．ｐＳＳＵプロモーター、ｎｅｏ遺伝子、及びＯＣＳ
遺伝子の３′末端を含む、例１のキメラ配列（No.
３）；３．ＰＮＯＳプロモーター、ｈｐｈ遺伝子、及びＮＯＳ
遺伝子の３′末端を含むキメラ配列；及び４．Ｍｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（「Ｍｎ−Ｓ
ＯＤ」）〔Bowler他（1989年）EMBO J. 8,31-38 〕のト
ランジットペプチド（「ＴＰ」）をコードする遺伝子フ
ラグメントとフレーム内で融合された、例１からのｐＴ
Ａ２９プロモーターカセットを含むキメラ配列；欧州特
許出願明細書８７４０２３４８．４号に記されているよ
うな部位特異的突然変異誘発を用いてクローニングする
目的でフラグメントを単離するため、トランジットペプ
チド配列内に以下の変更を行なう：

【００９６】ｉ．ＡＴＧ開始コドンの上流の位置−２及
び−１にあるＡＡヌクレオチドをＣＣヌクレオチドに変
更し、開始コドンにＮｃｏＩ部位を作り出し、以下のヌ
クレオチド配列、を生み出す：

【００９７】ii．トランジットペプチドのプロセッシン
グ部位のすぐ近くにあるＣＴＴＧヌクレオチドをＧＧＴ
ＡＣに変更し、プロセッシング部位にＫｐｎＩ部位を作
り出し、以下のヌクレオチド配列を生成する：

【００９８】

【表３】

【００９９】なお、ここで矢印はトランジットペプチド
配列のプロセッシング部位を示し、上線はＭｎ−ＳＯＤ
コード配列に対応するアミノ酸配列を示す；KlenowＤＮ
ＡポリメラーゼでＫｐｎＩを処理した後、ｐＴＶＥ７３
の構築において用いられたようなＥｃｏＲＩメチラーゼ
コード配列の平滑ＦｓｐＩＮ末端に対してＮｃｏＩ−
ＫｐｎＩフラグメントをフレーム内で融合させ、例１の
ＮＯＳ遺伝子の３′末端と融合させる。

【０１００】ｐＴＶＥ７６は、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列
内に、３つのキメラ配列、すなわち：独自の第２プロモ
ーターの制御下にある第１の標識ＤＮＡであるＰＳＳＵ
−ｎｅｏ及びＰＮＯＳ−ｈｐｈ、及びＰＴＡ２９の第１
プロモーターの制御下にある稔性回復ＤＮＡであるＰＴ
Ａ２９−ＴＰ−ＥｃｏＲＩメチラーゼ遺伝子、を含むバ
イナリータイプのＴ−ＤＮＡベクターである。そうでな
ければ雄性不稔である植物のタペタム細胞内でのＭｎ−
ＳＯＤのトランジットペプチドに融合されたＥｃｏＲＩ
メチラーゼの発現、及びこれらの細胞のミトコンドリア
に対するタペタムタンパク質のターゲティング（ミトコ
ンドリアにタペタムタンパク質を輸送させること）は、
欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号の例１６に
記されているようにトランジットペプチドに融合されタ
ペタム特異的プロモーターの制御下にある相当する不稔
性ＤＮＡによりコードされたＥｃｏＲＩのこのような細
胞内での活性を中和することになる。

【０１０１】例４−タバコ及びナタネへの例３のキメラ
ＤＮＡ配列の導入組換え型Agrobacterium 菌株は、大腸菌からｐＭＰ９０
を含むAgrobacteriumＣ５８Ｃ１Ｒｉｆ^R 〔Koncz 及
びSchell（1986年）Mol. Gen. Genetics 204,383-396
〕へ例３のｐＴＶＥ７３及びｐＴＶＥ７６を可動化
（授動）することによって構築される。結果として得ら
れる、それぞれｐＭＰ９０及びｐＴＶＥ７３ならびにｐ
ＭＰ９０及びｐＴＶＥ７６を宿す菌株は、例２に示され
ているようにタバコのリーフディスクの形質転換及びナ
タネの形質転換のために用いられる。形質転換されたカ
ルス及び苗条は、１００μg/mlのカナマイシンを含む基
質上で選択される。

【０１０２】形質転換された菌条を発根させ、温室の土
壌に移し、着花するまで栽培する。タバコ及びナタネの
両方の花を検査したところ、両方共天然の形態を示して
いた。これらの花の花粉は、それぞれベクターｐＴＶＥ
６３及びｐＴＶＥ６２での形質転換により得られた（欧
州特許出願明細書８９４０１１９４．９号の例１７に記
されているように）核雄性不稔のタバコ及びナタネ植物
を受粉するのに用いられる。なおこれらのベクター内
で、ＥｃｏＲＩ遺伝子はＰＴＡ２９不稔性プロモーター
の制御下にある不稔性ＤＮＡであり、ｐＴＶＥ６２にお
いてはＥｃｏＲＩ遺伝子は同様に、Ｍｎ−ＳＯＤのトラ
ンジットペプチドをコードするＤＮＡにも融合されてい
る。これらの雄性不稔性植物の子孫を分析したところ、
その花の７５％が雄性不稔表現型（すなわち、その花の
雄ずい内の正常なタペタム層の欠如）を示していなかっ
た。

【０１０３】言うまでもないことであるが、本発明は、
何らかの特定の植物の形質転換に限られているわけでは
ない。本発明は、植物が自家受粉及び他家受粉の両方を
受けうるように、植物の花、特に少なくとも１つのその
雄器又は雌器、及び／又は種子及び／又は胚の細胞内で
選択的に稔性回復ＤＮＡの発現を誘導できる第１のプロ
モーターの制御下にある稔性回復ＤＮＡで形質転換され
うる核ゲノムをもつあらゆる植物に関する。例えば本発
明は、トウモロコシ、ナタネ、小麦、米、ヒマワリ、テ
ンサイ、トマト、レタス、コショウ、モロコシ類、大
豆、エンドウマメ、アルファルファ、イネ科牧草、クロ
ーバー、ニンジン、キャベツ、ニラネギ、タマネギ、タ
バコ、ツクバネアサガオ（ペチュニア）、カカオ及びカ
ンキツ属の木等の植物に関する。

【０１０４】同様に、本発明は前述の例に記されている
特定のプラスミド及びベクターに制限されるものではな
く、むしろ第１のプロモーターの制御下にある稔性ＤＮ
Ａを含むあらゆるプラスミド及びベクターを包含する。

【０１０５】さらに、本発明は、ＰＴＡ２９プロモータ
ー等の前述の例に記されている特定の第１のプロモータ
ーに制限されず、少なくとも、そうでなければ不稔性Ｄ
ＮＡの発現により雄性又は雌性不稔になると思われる植
物の花、種子及び／又は胚の細胞内で、稔性回復ＤＮＡ
の発現を誘導することのできる第１のプロモーターをコ
ードするあらゆるＤＮＡ配列を包括する。この点におい
て、本発明は、雄性不稔にされるべき植物の雄ずい細胞
内で選択的に不稔性ＤＮＡの発現を制御する上で使用す
るための欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号に
記載のプロモーター、ならびに雌性不稔にされるべき植
物の花、種子又は胚の細胞内で選択的に不稔性ＤＮＡの
発現を制御する上で使用するための欧州特許出願明細書
９０４０２１９６．１号に記載のプロモーターを包含し
ている。代替的には、第１のプロモーターは、第１のＲ
ＮＡ、タンパク質又はポリペプチドが、不稔性ＤＮＡの
発現が無い場合にそれが中で発現される細胞の機能、代
謝又は発生を不利な形で著しく妨げないことを条件とし
て、その植物のための構造プロモーターであってもよ
い。

【０１０６】さらに、本発明は前述の例に記されている
特定の稔性回復ＤＮＡに制限されるものではなく、むし
ろ、不稔性プロモーターの制御下にある不稔性ＤＮＡに
よりコードされ、そうでなければその植物の花、種子又
は胚の細胞の代謝、機能及び／又は発生を不利な形で著
しく妨げるような第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペ
プチドの活性を、稔性回復植物の中で、中和、阻止、相
殺、克服又はその他の形で妨げる第１のＲＮＡ、タンパ
ク質又はポリペプチドをコードするあらゆるＤＮＡ配列
を包括している。

【０１０７】同様に、本発明は前述の例に記されている
特定の第１の標識ＤＮＡに制限されるものではなく、む
しろ、少なくともそのＤＮＡ配列が発現される特定の植
物組織又は特定の植物細胞に対して、このようなＤＮＡ
配列が発現されないかかる特定の植物組織又は植物細胞
に比べて卓越した形質を付与するような第３のＲＮＡ、
タンパク質又はポリペプチドをコードするあらゆるＤＮ
Ａ配列を包括するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】例１のベクターｐＴＶＥ７４の地図である。

【図２】例１で使用されているバルスター遺伝子のＤＮ
Ａ配列を示し、そのＣｌａＩ部位の突然変異配列を表わ
している。

【図３】例３のベクターｐＴＶＥ７３の地図を示す。

【図４】例３のベクターｐＴＶＥ７６の地図を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成９年４月１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１０

【補正方法】変更

【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者レーマンス，ヤンベルギー国、ビー−9831 ドイルレ、ヴィーンガールト７ (72)発明者ドゥ・グリフ，ウィリーベルギー国、ビー−9000 ゲント、クピュール・レヒツ 154

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）リボヌクレアーゼの抑制因子であ
るタンパク質をコードする稔性回復ＤＮＡ；及び（ｂ）
植物の細胞において発現を誘導する第１のプロモーター
を含む、植物の細胞中のリボヌクレアーゼの活性の中和
に用いられる組換えＤＮＡであって、前記回復ＤＮＡ
が、前記第１のプロモーターと同一の転写単位内にあっ
てその制御下にある組換えＤＮＡ。
【請求項２】前記抑制因子が、Bacillus amyloliquef
aciensの細胞外リボヌクレアーゼバルナーゼの活性を中
和することができる、請求項１記載の組換えＤＮＡ。
【請求項３】前記抑制因子が、ヌクレオチド配列： ATGAAAAAAGCAGTCATTAACGGGGAACAAATCAGAAGTATCAGCGACCT CCACCAGACATTGAAAAAGGAGCTTGCCCTTCCGGAATACTACGGTGAAA ACCTGGACGCTTTATGGGATTGTCTGACCGGATGGGTGGAGTACCCGCT CGTTTTGGAATGGAGGCAGTTTGAACAAAGCAAGCAGCTGACTGAAAATG GCGCCGAGAGTGTGCTTCAGGTTTTCCGTGAAGCGAAAGCGGAAGGCTG CGACATCACCATCATACTTTCT によりコードされるアミノ酸配列を有し、バルナーゼの
活性を中和することができるバルスター又はその変異体
である、請求項２記載の組換えＤＮＡ。
【請求項４】前記回復ＤＮＡが、請求項３記載のヌク
レオチド配列を含む、請求項３記載の組換えＤＮＡ。
【請求項５】前記回復ＤＮＡが、Ｃｌａｌ−Ｈｉｎｄ
III フラグメントである、請求項４記載の組換えＤＮ
Ａ。
【請求項６】前記抑制因子を前記植物の細胞の葉緑体
又はミトコンドリアに輸送することができるトランジッ
トペプチドをコードし、前記回復ＤＮＡ及び前記第１の
プロモーターと同じ転写単位内にあって、そして前記回
復ＤＮＡと前記第１のプロモーターとの間に存在する第
１のＤＮＡをも含む、請求項１〜５のいずれか１項記載
の組換えＤＮＡ。
【請求項７】前記第１のプロモーターが、少なくとも
植物の花、種子又は胚の特定の細胞において発現を誘導
する、請求項１〜６のいずれか１項記載の組換えＤＮ
Ａ。
【請求項８】前記第１のプロモーターが、構造プロモ
ーターである、請求項１〜６のいずれか１項記載の組換
えＤＮＡ。
【請求項９】前記第１のプロモーターが、少なくとも
植物の雄器の細胞において発現を誘導する、請求項７記
載の組換えＤＮＡ。
【請求項１０】前記第１のプロモーターが、雄ずい細
胞において発現を誘導する、請求項９記載の組換えＤＮ
Ａ。
【請求項１１】前記第１のプロモーターが、葯、花粉
及び花糸細胞よりなる群から選択される１種以上の雄ず
い細胞において発現を誘導する、請求項９又は１０記載
の組換えＤＮＡ。
【請求項１２】前記第１のプロモーターが、タペタム
細胞のような葯細胞において発現を誘導する、請求項１
１記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１３】前記第１のプロモーターが、タバコか
らのＴＡ２９遺伝子のプロモーターである、請求項１２
記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１４】前記第１のプロモーターが、プラスミ
ッドｐＭＢ３、ＤＳＭ４４７０のＮｃｏｌ−ＨｉｎｄII
I 断片中に含まれるＴＡ２９プロモーターである、請求
項１３記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１５】前記第１のプロモーターが、少なくと
も植物の雌器の細胞において発現を誘導する、請求項７
記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１６】前記第１のプロモーターが、植物の雌
器の細胞において選択的に発現を誘導する、請求項１５
記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１７】前記第１のプロモーターが、子房、胚
珠、花柱、柱頭及び隔膜細胞よりなる群から選択される
１種以上の雌器の細胞において発現を誘導する、請求項
１５又は１６記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１８】前記第１のプロモーターが、花柱及び
／又は柱頭細胞において発現を誘導する、請求項１７記
載の組換えＤＮＡ。
【請求項１９】請求項１〜１８のいずれか１項記載の
組換えＤＮＡを含む植物の細胞。
【請求項２０】植物に再生され得る、請求項１９記載
の細胞。
【請求項２１】請求項１〜１８のいずれか１項記載の
組換えＤＮＡを含む植物。
【請求項２２】請求項１〜１８のいずれか１項記載の
組換えＤＮＡを、その全ての細胞に含む植物。
【請求項２３】前記の種子が、請求項１〜１８のいず
れか１項記載の組換えＤＮＡを含む植物の種子。
【請求項２４】以下の工程：（ａ）請求項１〜１８のいずれか１項記載の組換えＤＮ
Ａで植物の出発細胞を形質転換して、細胞の核ＤＮＡ中
に安定に組み込んだ前記組換えＤＮＡを含む、形質転換
された植物細胞を製造する工程；及び（ｂ）前記形質転
換された細胞から、トランスジェニック植物を再生させ
る工程を含むトランスジェニック植物、又は種子若しく
はその植物的増殖材料の製造方法。
【請求項２５】前記トランスジェニック植物を増殖さ
せて、前記組換えＤＮＡを含む種子又は植物的増殖材料
を得る工程をさらに含む、請求項２４記載の方法。