JPH0879B2 - 第ｖｉｉｉ因子活性を測定するための試薬 - Google Patents
第ｖｉｉｉ因子活性を測定するための試薬Info
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Description
【０００１】本発明は、第VIII因子活性を測定するため
の試薬、及び試料中の第VIII因子活性を測定する方法に
関する。第VIII因子活性を測定するための臨床用の検定
法は、R.J.Wagenvoordらに記載されている[Haemostasis
19,196-204(1989)]。この方法によれば、第IXa因子、
トロンビン、カルシウムイオン及びリン脂質の混合物を
試薬１として第VIII因子含有試料に加え、それにより測
定すべき第VIII因子を活性化させる。その後、活性化第
VIII因子は第IXa因子、リン脂質及びカルシウムイオン
と一緒になって、第Ｘ因子を活性化できる複合体を形成
するが、その第Ｘ因子は複合体形成後に別個の試薬(試
薬２)として添加しなければならない。既に知られてい
るように活性化第Ｘ因子は発色基質を分解することがで
きるので、検定試料の第VIII因子活性は、分光学的に測
定される形成する基質の量から計算することができる。
この複合体形成試薬に含有される第IXa因子及びそこに
含有されるトロンビンならびに活性化第Ｘa因子の形成
に使用される第Ｘ因子はすべてウシ起源である。
の試薬、及び試料中の第VIII因子活性を測定する方法に
関する。第VIII因子活性を測定するための臨床用の検定
法は、R.J.Wagenvoordらに記載されている[Haemostasis
19,196-204(1989)]。この方法によれば、第IXa因子、
トロンビン、カルシウムイオン及びリン脂質の混合物を
試薬１として第VIII因子含有試料に加え、それにより測
定すべき第VIII因子を活性化させる。その後、活性化第
VIII因子は第IXa因子、リン脂質及びカルシウムイオン
と一緒になって、第Ｘ因子を活性化できる複合体を形成
するが、その第Ｘ因子は複合体形成後に別個の試薬(試
薬２)として添加しなければならない。既に知られてい
るように活性化第Ｘ因子は発色基質を分解することがで
きるので、検定試料の第VIII因子活性は、分光学的に測
定される形成する基質の量から計算することができる。
この複合体形成試薬に含有される第IXa因子及びそこに
含有されるトロンビンならびに活性化第Ｘa因子の形成
に使用される第Ｘ因子はすべてウシ起源である。
【０００２】市販されている検定「ＤadeR第VIII因子ク
ロモゲン」[製造元；バキシター(Baxter)]は、上記の方
法と同様の態様で実施するものである。この場合も、別
のピペッティング工程で試料に第Ｘ因子を添加しなけれ
ばならない。この検定法の欠点は、ピペッティング工程
を数回行うことからその実施が比較的複雑になると思わ
れる点である。この欠点は、関連する実施操作のための
時間(インキュベート時間：約９０秒、測定時間：約６
０秒)がほんの僅かしか残らないので、スクリーニング
において特に影響を与える。
ロモゲン」[製造元；バキシター(Baxter)]は、上記の方
法と同様の態様で実施するものである。この場合も、別
のピペッティング工程で試料に第Ｘ因子を添加しなけれ
ばならない。この検定法の欠点は、ピペッティング工程
を数回行うことからその実施が比較的複雑になると思わ
れる点である。この欠点は、関連する実施操作のための
時間(インキュベート時間：約９０秒、測定時間：約６
０秒)がほんの僅かしか残らないので、スクリーニング
において特に影響を与える。
【０００３】第IXa因子はカルシウムイオンの存在下で
それが無い場合よりも速く第Ｘ因子を活性化するので
[J.Biol.Chem.256,3433-3442(1981)]、別のピペッティ
ング工程により第Ｘ因子を添加することが必須である
が、このことは当然に望ましいことではない。即ち、こ
こに記載の検定法では、最初にすべての成分を混合する
ことにより試料に添加するための試薬をその後において
のみ形成させることは原理的に不可能である。
それが無い場合よりも速く第Ｘ因子を活性化するので
[J.Biol.Chem.256,3433-3442(1981)]、別のピペッティ
ング工程により第Ｘ因子を添加することが必須である
が、このことは当然に望ましいことではない。即ち、こ
こに記載の検定法では、最初にすべての成分を混合する
ことにより試料に添加するための試薬をその後において
のみ形成させることは原理的に不可能である。
【０００４】別の試験である「ＣＯＡＴＥＳＴR：第VII
IＣ因子」[製造元：Ｋabi Ｖitrum]によれば、検定前に
新たに調製しなければならないウシ第IXa因子及び第Ｘ
因子とリン脂質との混合物をまず初めに試料に加える。
この混合物は第IXa因子に加えて第Ｘ因子を含有してい
るが、第Ｘ因子の望ましくない早期の活性化を誘発しな
いようカルシウムイオンを含有していてはならない。従
って、カルシウムは、その混合物に混合する試料をイン
キュベートした後、別のピペッティング工程で当該試料
に導入しなければならない。この反応はカルシウムを添
加することによってのみ開始する。別に５−１０分イン
キュベートした後、発色基質を加える。このようにこの
試験でさえも、反応を開始するため、欠如した成分を別
の工程において加えなければならない。複合体の形成及
び活性化は２工程で行われる。
IＣ因子」[製造元：Ｋabi Ｖitrum]によれば、検定前に
新たに調製しなければならないウシ第IXa因子及び第Ｘ
因子とリン脂質との混合物をまず初めに試料に加える。
この混合物は第IXa因子に加えて第Ｘ因子を含有してい
るが、第Ｘ因子の望ましくない早期の活性化を誘発しな
いようカルシウムイオンを含有していてはならない。従
って、カルシウムは、その混合物に混合する試料をイン
キュベートした後、別のピペッティング工程で当該試料
に導入しなければならない。この反応はカルシウムを添
加することによってのみ開始する。別に５−１０分イン
キュベートした後、発色基質を加える。このようにこの
試験でさえも、反応を開始するため、欠如した成分を別
の工程において加えなければならない。複合体の形成及
び活性化は２工程で行われる。
【０００５】本発明はひとつの態様として、可能な限り
少ないピペッティング工程により、最初に規定した種類
の単純な検定法を行うための試薬を提供するものであ
る。本発明の試薬は、第VIII因子活性について体液を検
定し、また高度に精製した第VIII因子調製物を自動的に
調査するための両方法に使用することができる。
少ないピペッティング工程により、最初に規定した種類
の単純な検定法を行うための試薬を提供するものであ
る。本発明の試薬は、第VIII因子活性について体液を検
定し、また高度に精製した第VIII因子調製物を自動的に
調査するための両方法に使用することができる。
【０００６】本発明の第VIII因子活性を測定するための
試薬は、第IXaβ因子、第Ｘ因子、カルシウムイオン、
トロンビン、リン脂質、及び所望により第XIa因子及び
第XIIa因子を含有しているのが特徴である。
試薬は、第IXaβ因子、第Ｘ因子、カルシウムイオン、
トロンビン、リン脂質、及び所望により第XIa因子及び
第XIIa因子を含有しているのが特徴である。
【０００７】本発明は、第IXaβ因子(水溶液中)がカル
シウムイオンの存在下でさえも数時間第Ｘ因子を活性化
することができないという発見を基礎としている。従っ
て、単一の試薬での複合体形成及び活性化に必要なすべ
ての成分を合体させ、それを単一のピペッティング工程
で試料と混合することを可能にするものである。本発明
の試薬は数時間安定状態を保つので、スクリーニングを
行う前に時間を気にすることなく調製することができ
る。さらなる凝固因子である第XIa因子及び第XIIa因子
を存在させれば、形成される複合体が安定化される。
シウムイオンの存在下でさえも数時間第Ｘ因子を活性化
することができないという発見を基礎としている。従っ
て、単一の試薬での複合体形成及び活性化に必要なすべ
ての成分を合体させ、それを単一のピペッティング工程
で試料と混合することを可能にするものである。本発明
の試薬は数時間安定状態を保つので、スクリーニングを
行う前に時間を気にすることなく調製することができ
る。さらなる凝固因子である第XIa因子及び第XIIa因子
を存在させれば、形成される複合体が安定化される。
【０００８】第IXaβ因子は、セライトR[製造元：Johns
-Manville Corp.]で処理することにより、既知の方法で
ヒト血漿から得ることができる。検定の間、血餅の生成
を回避するため、ある物質(例えば、テトラプペチド)を
試薬に加えるのが適当である。さらに、適切に行うに
は、検定試料のヘパリン含量に影響されることなく第VI
II因子の測定を行うため、試薬にヘパリン中和剤（例え
ば、ポリブレン）を加える。
-Manville Corp.]で処理することにより、既知の方法で
ヒト血漿から得ることができる。検定の間、血餅の生成
を回避するため、ある物質(例えば、テトラプペチド)を
試薬に加えるのが適当である。さらに、適切に行うに
は、検定試料のヘパリン含量に影響されることなく第VI
II因子の測定を行うため、試薬にヘパリン中和剤（例え
ば、ポリブレン）を加える。
【０００９】本発明はまた、第IXaβ因子、第Ｘ因子、
トロンビン、カルシウムイオン、及び所望により第XIa
因子及び第XIIa因子を含有する試薬成分Ａ、ならびにリ
ン脂質を含有する試薬成分Ｂという、本発明の試薬を調
製するための２つの試薬成分からなるキットを提供す
る。
トロンビン、カルシウムイオン、及び所望により第XIa
因子及び第XIIa因子を含有する試薬成分Ａ、ならびにリ
ン脂質を含有する試薬成分Ｂという、本発明の試薬を調
製するための２つの試薬成分からなるキットを提供す
る。
【００１０】本発明はさらに、第IXaβ因子、第Ｘ因
子、カルシウムイオン、及び所望により第XIa因子及び
第XIIa因子を含有する試薬成分Ｃ、ならびにトロンビン
及びリン脂質を含有する試薬成分Ｄという、本発明の試
薬を調製するための２つの試薬成分からなるキットをも
提供するものである。
子、カルシウムイオン、及び所望により第XIa因子及び
第XIIa因子を含有する試薬成分Ｃ、ならびにトロンビン
及びリン脂質を含有する試薬成分Ｄという、本発明の試
薬を調製するための２つの試薬成分からなるキットをも
提供するものである。
【００１１】本発明の試薬の好ましい態様は、トロンビ
ンが０．０１から２．０Ｕ／ml の濃度範囲で存在し、
リン脂質が０．０１から１００nmol／ml の範囲で存在
し、カルシウムイオンが１から５０μmol／ml の範囲で
存在し、第IXaβ因子が０．０５から５Ｕ／ml の範囲で
存在し、第Ｘ因子が０．０１から１０Ｕ／ml の範囲で
存在し、所望により、第XIa因子及び第XIIa因子がそれ
ぞれ０．０１から２．０Ｕ／ml の範囲で存在する試薬
である。
ンが０．０１から２．０Ｕ／ml の濃度範囲で存在し、
リン脂質が０．０１から１００nmol／ml の範囲で存在
し、カルシウムイオンが１から５０μmol／ml の範囲で
存在し、第IXaβ因子が０．０５から５Ｕ／ml の範囲で
存在し、第Ｘ因子が０．０１から１０Ｕ／ml の範囲で
存在し、所望により、第XIa因子及び第XIIa因子がそれ
ぞれ０．０１から２．０Ｕ／ml の範囲で存在する試薬
である。
【００１２】ヒト第VIII因子活性を本発明の試薬によっ
て測定する場合には、本発明の試薬に含有される因子群
及びトロンビンはヒト起源であって、ウシ起源でないも
のが適当である。このことは、遺伝的に異なる反応相手
を使用する場合に起こることが証明されている誤差を生
じさせる源を排除するため、必ず考慮すべき、同等なも
のを検定する生化学分析の基本である。この欠点は、検
定する試料が高い第VIII因子活性を有している場合に特
に問題となり、このことは高度に精製した第VIII因子調
製物を産業上品質管理する場合の関心事である。
て測定する場合には、本発明の試薬に含有される因子群
及びトロンビンはヒト起源であって、ウシ起源でないも
のが適当である。このことは、遺伝的に異なる反応相手
を使用する場合に起こることが証明されている誤差を生
じさせる源を排除するため、必ず考慮すべき、同等なも
のを検定する生化学分析の基本である。この欠点は、検
定する試料が高い第VIII因子活性を有している場合に特
に問題となり、このことは高度に精製した第VIII因子調
製物を産業上品質管理する場合の関心事である。
【００１３】ウシ凝固因子を使用する場合はさらに、含
有されるタンパク質が汚染される危険性を有し、そのよ
うな因子の起源について正確かつ複雑な証拠文書の提出
が求められる(ウシ血液から得たウシ血漿の非感染性な
どの、ウシ流行病が免除されていることの証拠)。
有されるタンパク質が汚染される危険性を有し、そのよ
うな因子の起源について正確かつ複雑な証拠文書の提出
が求められる(ウシ血液から得たウシ血漿の非感染性な
どの、ウシ流行病が免除されていることの証拠)。
【００１４】要すれば、本発明の試薬に含有されるタン
パク質に対し、存在し得る感染物質を不活化するための
処理を施しておく。そのような不活化法は、例えばＥＰ
−Ａ０ １５９ ３１１、ならびにＥＰ−Ａ ０ ０５０
０６１及びＥＰ−Ａ ０ １３１ ７４０から知ることが
できる。これらは、濃縮物が感染物質を大いに含んでい
ないことを保証している。
パク質に対し、存在し得る感染物質を不活化するための
処理を施しておく。そのような不活化法は、例えばＥＰ
−Ａ０ １５９ ３１１、ならびにＥＰ−Ａ ０ ０５０
０６１及びＥＰ−Ａ ０ １３１ ７４０から知ることが
できる。これらは、濃縮物が感染物質を大いに含んでい
ないことを保証している。
【００１５】本発明はさらに、本発明の試薬を反応させ
て試料中の第VIII因子活性を測定するための方法であっ
て、第VIII因子含量の関数としてまず始めに活性化第Ｘ
因子(第Ｘa因子)を形成させ、次いで該第Ｘa因子を定量
することを特徴とする方法に関する。この測定法は例え
ば、第Ｘa因子をまず発色基質と反応させて基質を遊離
させ、それを分光測定学的に測定することにより実施す
ることができる。
て試料中の第VIII因子活性を測定するための方法であっ
て、第VIII因子含量の関数としてまず始めに活性化第Ｘ
因子(第Ｘa因子)を形成させ、次いで該第Ｘa因子を定量
することを特徴とする方法に関する。この測定法は例え
ば、第Ｘa因子をまず発色基質と反応させて基質を遊離
させ、それを分光測定学的に測定することにより実施す
ることができる。
【００１６】本発明の方法はインキュベート時間が約５
分であるので、スクリーニングに通常使用される手作業
と自動分析装置の操作の両者を容易に実行できる。さら
に、４分以内で一次関数的に発色が起こるので(発色基
質からのp-ニトロアニリンの遊離)、この時間内でさえ
も分光学的測定を行うことができる。従って、本発明の
試薬は、分光測定学的に測定すべき物質を一定速度で、
かつ４分よりも長い時間遊離させるという好ましい特性
を有している。この時間は、現在知られている試薬(「D
adeR 第VIII因子クロモゲン」(製造元:Baxter)の検定に
よれば、僅かに約１分しかない)に比較して顕著に長い
ものである。以下に実施例を挙げて、本発明をより詳細
に説明する。
分であるので、スクリーニングに通常使用される手作業
と自動分析装置の操作の両者を容易に実行できる。さら
に、４分以内で一次関数的に発色が起こるので(発色基
質からのp-ニトロアニリンの遊離)、この時間内でさえ
も分光学的測定を行うことができる。従って、本発明の
試薬は、分光測定学的に測定すべき物質を一定速度で、
かつ４分よりも長い時間遊離させるという好ましい特性
を有している。この時間は、現在知られている試薬(「D
adeR 第VIII因子クロモゲン」(製造元:Baxter)の検定に
よれば、僅かに約１分しかない)に比較して顕著に長い
ものである。以下に実施例を挙げて、本発明をより詳細
に説明する。
【００１７】試薬の調製 (１) 第IXaβ因子溶液：ヒト血清を調製するため、ク
エン酸処理血漿１リットルを１モル濃度ＣaＣl2溶液２
５ml と混合し、室温で一晩放置した。生成した血餅を
絞り出して(squeezedout)廃棄した。得られた血清を濾
過し、冷凍した。
エン酸処理血漿１リットルを１モル濃度ＣaＣl2溶液２
５ml と混合し、室温で一晩放置した。生成した血餅を
絞り出して(squeezedout)廃棄した。得られた血清を濾
過し、冷凍した。
【００１８】ヒト血清由来の第IXaβ因子を吸着させる
ため、血清を３７℃で解凍し、それに０．５mｇ/ml セ
ファデックスR Ａ ５０(製造元：ファルマシア)を加
え、撹拌し、濾過した。次いで、得られたゲルを緩衝液
(２．５％血清容量；３０ｇ／lＮaＣl、４ｇ／l Ｎa3ク
エン酸・２Ｈ2Ｏ，pＨ７．０)中に溶出した。溶出液を
第IXaβ因子の溶液として使用した。
ため、血清を３７℃で解凍し、それに０．５mｇ/ml セ
ファデックスR Ａ ５０(製造元：ファルマシア)を加
え、撹拌し、濾過した。次いで、得られたゲルを緩衝液
(２．５％血清容量；３０ｇ／lＮaＣl、４ｇ／l Ｎa3ク
エン酸・２Ｈ2Ｏ，pＨ７．０)中に溶出した。溶出液を
第IXaβ因子の溶液として使用した。
【００１９】(２) 第Ｘ因子溶液：プロトロンビン複合
体 第II因子、第IX因子、第Ｘ因子の濃縮溶液をデキス
トラン硫酸セファロースに充填し、イオン強度グラジエ
ント(０．１−１Ｉ)で溶出した。得られた画分を第Ｘ因
子含量について検定した。第Ｘ因子を含有する画分をプ
ールし、限外濾過により濃縮し、冷凍した。濃度：約３
０Ｕ第Ｘ因子／ml。
体 第II因子、第IX因子、第Ｘ因子の濃縮溶液をデキス
トラン硫酸セファロースに充填し、イオン強度グラジエ
ント(０．１−１Ｉ)で溶出した。得られた画分を第Ｘ因
子含量について検定した。第Ｘ因子を含有する画分をプ
ールし、限外濾過により濃縮し、冷凍した。濃度：約３
０Ｕ第Ｘ因子／ml。
【００２０】(３) セライト溶出液：クエン酸処理血漿
を２重量％セライトと混合し、振盪しながら３７℃でイ
ンキュベートした。次いで、３０００rpmで５から１０
分遠心した(室温)。上清を廃棄した。得られたセライト
沈殿物を生理食塩水で３回洗浄し、次いで１０％食塩水
(出発血漿の１／４容量)で溶出し、遠心した。得られた
上清を透析膜に充填し、少なくとも２０倍容量の生理食
塩水溶液に対して透析にかけ(４℃、一晩)、次いで冷凍
した。
を２重量％セライトと混合し、振盪しながら３７℃でイ
ンキュベートした。次いで、３０００rpmで５から１０
分遠心した(室温)。上清を廃棄した。得られたセライト
沈殿物を生理食塩水で３回洗浄し、次いで１０％食塩水
(出発血漿の１／４容量)で溶出し、遠心した。得られた
上清を透析膜に充填し、少なくとも２０倍容量の生理食
塩水溶液に対して透析にかけ(４℃、一晩)、次いで冷凍
した。
【００２１】試薬成分Ａを調製するため、以下の成分を
混合した： イミダゾール緩衝液 １５．６ ml (１．５ｇ/ｌイミダゾール；９ｇ/ｌＮaＣl；０．１％
アルブミン，pＨ８．３) セライト溶出液 １．０５ml 第IXaβ因子溶液 １．２ ml 第Ｘ因子溶液 ０．３ ml ２０％ヒトアルブミン ０．９ ml ＣaＣl2 ２５mmol／ｌ １８．０ ml トロンビン ０．１２ｍｌ
混合した： イミダゾール緩衝液 １５．６ ml (１．５ｇ/ｌイミダゾール；９ｇ/ｌＮaＣl；０．１％
アルブミン，pＨ８．３) セライト溶出液 １．０５ml 第IXaβ因子溶液 １．２ ml 第Ｘ因子溶液 ０．３ ml ２０％ヒトアルブミン ０．９ ml ＣaＣl2 ２５mmol／ｌ １８．０ ml トロンビン ０．１２ｍｌ
【００２２】この混合物を緩衝液（１．３６ｇ/ｌイミ
ダゾール、２．３４ｇ/ｌＮaＣl、１．４７ｇ/ｌクエン
酸ナトリウム、１３ml １mol/ｌＣaＣl2)に対して４℃
で一晩透析し、次いで濾過した。凝固活性リン脂質濃縮
物を透析緩衝液で１：２００に希釈し、この溶液(試薬
成分Ｂ)１容量を濾過混合物３容量と混合した。０．１
９％Ｔween２０(ポリオキシエチレン ソルビタン モノ
ラウリン酸塩)及びテトラペプチド ＡcＯＨ−Ｇly−Ｐr
o−Ａrg−Ｐro−ＯＨ ５mｇを加えた後、試薬を各２ml
容量の容器に充満させた。
ダゾール、２．３４ｇ/ｌＮaＣl、１．４７ｇ/ｌクエン
酸ナトリウム、１３ml １mol/ｌＣaＣl2)に対して４℃
で一晩透析し、次いで濾過した。凝固活性リン脂質濃縮
物を透析緩衝液で１：２００に希釈し、この溶液(試薬
成分Ｂ)１容量を濾過混合物３容量と混合した。０．１
９％Ｔween２０(ポリオキシエチレン ソルビタン モノ
ラウリン酸塩)及びテトラペプチド ＡcＯＨ−Ｇly−Ｐr
o−Ａrg−Ｐro−ＯＨ ５mｇを加えた後、試薬を各２ml
容量の容器に充満させた。
【００２３】試料中の第VIII因子の測定：まず、第Ｘa
因子基質の溶液[ＣＨ3ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇly−Ａrg
−pＮＡ・ＡcＯＨ、４mmol／ｌ]１容量を反応緩衝液
(６．０６ｇ/ｌトリス；３．０３ｇ/ｌＥＤＴＡ；２５
ｇ/ｌＮaＣl；４ＡＴＵ/ml ヒルジン；pＨ８．２)２容
量と混合した[基質緩衝混合物]。
因子基質の溶液[ＣＨ3ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇly−Ａrg
−pＮＡ・ＡcＯＨ、４mmol／ｌ]１容量を反応緩衝液
(６．０６ｇ/ｌトリス；３．０３ｇ/ｌＥＤＴＡ；２５
ｇ/ｌＮaＣl；４ＡＴＵ/ml ヒルジン；pＨ８．２)２容
量と混合した[基質緩衝混合物]。
【００２４】ピペッティング方法： 第VIII因子含有試料５０μl 及び試薬２５０μl を３７
℃で５分間インキュベートし、基質緩衝混合物３００μ
l と混合した。第VIII因子の分光学的測定はそれ自体既
知の方法により行い、溶液の測定は４０５nmで３分後に
行った(３７℃)。１ＩＵ第VIII因子／ml を含有する凍
結乾燥正常血漿のプールを蒸留水で再構成し、それによ
り既知の方法によって同様に標準曲線を作成した。
℃で５分間インキュベートし、基質緩衝混合物３００μ
l と混合した。第VIII因子の分光学的測定はそれ自体既
知の方法により行い、溶液の測定は４０５nmで３分後に
行った(３７℃)。１ＩＵ第VIII因子／ml を含有する凍
結乾燥正常血漿のプールを蒸留水で再構成し、それによ
り既知の方法によって同様に標準曲線を作成した。
【００２５】本発明の検定方法は、単位時間当たりの消
光の増大と濃度２ ＩＵ／ml から０．００２ ＩＵ／ml
の範囲内の第VIII因子含量との間に一次相関関係を示す
ことが証明された。本発明の検定方法は高い感度を示
し、そのため、第VIII因子(活性化又は活性化されてい
ない第VIII因子)と反応するタンパク質を間接的に算定
するのにも適している。即ち、前もって量を測定してお
く過剰量の(活性化又は活性化されていない)第VIII因子
を加え、活性化プロテインＣ及びその共同因子又は第VI
II因子インヒビターによって阻害されていない第VIII因
子部分を算定することにより、例えば活性化プロテイン
Ｃ及びその共同因子(プロテインＳ)又は第VIII因子イン
ヒビターを間接的に算定することが可能である。従っ
て、本発明の方法は、第VIII因子阻害活性を間接的に検
定するためにも適用することができる。
光の増大と濃度２ ＩＵ／ml から０．００２ ＩＵ／ml
の範囲内の第VIII因子含量との間に一次相関関係を示す
ことが証明された。本発明の検定方法は高い感度を示
し、そのため、第VIII因子(活性化又は活性化されてい
ない第VIII因子)と反応するタンパク質を間接的に算定
するのにも適している。即ち、前もって量を測定してお
く過剰量の(活性化又は活性化されていない)第VIII因子
を加え、活性化プロテインＣ及びその共同因子又は第VI
II因子インヒビターによって阻害されていない第VIII因
子部分を算定することにより、例えば活性化プロテイン
Ｃ及びその共同因子(プロテインＳ)又は第VIII因子イン
ヒビターを間接的に算定することが可能である。従っ
て、本発明の方法は、第VIII因子阻害活性を間接的に検
定するためにも適用することができる。
【００２６】活性化プロテインＣ(aＰＣ)の測定 試薬成分Ａ及びＢを試薬の調製について既述したように
して使用した。第VIII因子溶液(５Ｕ／ml)７５μl を、
トロンビン溶液(０．５Ｕ／ml)３５μl を加え、３７℃
で５分間インキュベートすることにより活性化した。種
々のaＰＣ含量(０．０３、０．１０、０．３０、１．０
０Ｕ／ml)を有する試料５０μl を緩衝混合物(トリス緩
衝液５ml、pＨ７．４；ヒルジン１００μl；およびリン
脂質試薬成分Ｂ ２５μl)２００μl の存在下にインキ
ュベート混合物１００μl と混合し、３７℃で２分間イ
ンキュベートした。試薬成分Ａ ２００μl をインキュ
ベート試料溶液に加えた後、インキュベートし(３７
℃、５分)、aＰＣによって阻害されていない第VIII因子
部分を分光学的に測定した。得られた試料を上記の基質
緩衝混合物と混合した。４０５nmにおける消光を３７℃
で３分間測定した。経時的な消光の増加(Ｅ／分)と試料
溶液中のaＰＣ濃度との間には、一次相関性がある。aＰＣ濃度(Ｕ／ml) Ｅ／分 ０ ０．２４５ ０．０３ ０．２４３ ０．１０ ０．２３９ １．００ ０．１１９
して使用した。第VIII因子溶液(５Ｕ／ml)７５μl を、
トロンビン溶液(０．５Ｕ／ml)３５μl を加え、３７℃
で５分間インキュベートすることにより活性化した。種
々のaＰＣ含量(０．０３、０．１０、０．３０、１．０
０Ｕ／ml)を有する試料５０μl を緩衝混合物(トリス緩
衝液５ml、pＨ７．４；ヒルジン１００μl；およびリン
脂質試薬成分Ｂ ２５μl)２００μl の存在下にインキ
ュベート混合物１００μl と混合し、３７℃で２分間イ
ンキュベートした。試薬成分Ａ ２００μl をインキュ
ベート試料溶液に加えた後、インキュベートし(３７
℃、５分)、aＰＣによって阻害されていない第VIII因子
部分を分光学的に測定した。得られた試料を上記の基質
緩衝混合物と混合した。４０５nmにおける消光を３７℃
で３分間測定した。経時的な消光の増加(Ｅ／分)と試料
溶液中のaＰＣ濃度との間には、一次相関性がある。aＰＣ濃度(Ｕ／ml) Ｅ／分 ０ ０．２４５ ０．０３ ０．２４３ ０．１０ ０．２３９ １．００ ０．１１９
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マンフレート・オーバーライター オーストリア、アー−1190ヴィーン、パラ ディスガッセ61番 (72)発明者 オルガ・ルーカス オーストリア、アー−1220ヴィーン、レン クガッセ１−３番 (56)参考文献 ＨＡＥＭＯＳＴＡＳＩＳ，17（１− ２）、Ｐ．14−24，1987 ＡＲＣＨ ＢＩＯＣＨＥＭ ＢＩＯＰＨ ＹＳ，268（２）、Ｐ．485−501，1989
Claims (18)
- 【請求項１】 第IXaβ因子、第Ｘ因子、カルシウムイ
オン、トロンビン及びリン脂質からなる第VIII因子活性
を測定するための試薬。 - 【請求項２】 第XIa因子及び第XIIa因子をさらに含有
している請求項１に記載の試薬。 - 【請求項３】 第IXaβ因子、第Ｘ因子及びカルシウム
イオンからなる請求項１に記載の試薬を製造するための
試薬成分。 - 【請求項４】 第IXaβ因子、第Ｘ因子、トロンビン及
びカルシウムイオンを含有する第１試薬成分Ａ、ならび
にリン脂質を含有する第２試薬成分Ｂからなる、請求項
１に記載の試薬を製造するためのキット。 - 【請求項５】 試薬成分Ａが第XIa因子及び第XIIa因子
をさらに含有している請求項４に記載のキット。 - 【請求項６】 第IXaβ因子、第Ｘ因子及びカルシウム
イオンを含有する試薬成分Ｃ、ならびにトロンビン及び
リン脂質を含有する試薬成分Ｄからなる、請求項１に記
載の試薬を製造するためのキット。 - 【請求項７】 試薬成分Ｃが第XIa因子及び第XIIa因子
をさらに含有している請求項６に記載のキット。 - 【請求項８】 トロンビンが０．０１から２．０Ｕ／ml
の濃度範囲で存在し、リン脂質が０．０１から１００n
mol／ml の範囲で存在し、カルシウムイオンが１から５
０μmol／ml の範囲で存在し、第IXaβ因子が０．０５
から５Ｕ／ml の範囲で存在し、第Ｘ因子が０．０１か
ら１０Ｕ／ml の範囲で存在する、請求項１に記載の試
薬。 - 【請求項９】 第XIa因子及び第XIIa因子がそれぞれ
０．０１から２．０Ｕ／ml の範囲で存在している請求
項２に記載の試薬。 - 【請求項１０】 試薬に含有される因子群及びトロンビ
ンがヒト起源である、請求項１、２、８又は９に記載の
試薬。 - 【請求項１１】 因子群及びトロンビンに対し、存在し
得る感染物質の不活化処理を施しておく請求項１０に記
載の試薬。 - 【請求項１２】 試薬に含有される因子群及びトロンビ
ンがヒト起源である請求項３に記載の試薬成分。 - 【請求項１３】 因子群及びトロンビンに対し、存在し
得る感染物質の不活化処理を施しておく請求項１２に記
載の試薬成分。 - 【請求項１４】 試薬成分に含有される因子群及びトロ
ンビンがヒト起源である請求項４、５、６又は７に記載
のキット。 - 【請求項１５】 因子群及びトロンビンに対し、存在し
得る感染物質の不活化処理を施しておく請求項１４に記
載のキット。 - 【請求項１６】 試料を請求項１に記載の試薬と反応さ
せて該試料中の第VIII因子活性を測定するための方法で
あって、まず始めに試料中に含有される第VIII因子の量
の関数として活性化第Ｘ因子(第Ｘa因子)を形成させ、
次いで該第Ｘa因子を定量することを特徴とする方法。 - 【請求項１７】 請求項１に記載の試薬を使用すること
により、プロテインＣ及びその共同因子プロテインＳ、
第VIII因子抗体及び／又は第VIII因子阻害性タンパク質
などの第VIII因子と反応するタンパク質を測定するため
の方法であって、前もって測定しておいた過剰量の第VI
II因子を試料に加え、これらの物質との反応により第VI
II因子の一部量を阻害させ、残った第VIII因子の残量分
を残し、その第VIII因子の残量分によって第Ｘ因子を活
性化させ、該活性化第Ｘ因子を介して当該第VIII因子を
測定することを特徴とする方法。 - 【請求項１８】 前もって測定しておいた量の第VIII因
子を請求項１に記載の試薬に含有させる請求項１７に記
載の方法。
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