JP3533012B2 - プロテインｃ／プロテインｓ系の障害を検出する方法 - Google Patents
プロテインｃ／プロテインｓ系の障害を検出する方法Info
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Description
【０００１】本発明はプロテインＣ／プロテインＳ系の
障害を検出する方法に関する。
障害を検出する方法に関する。
【０００２】プロテインＣ／プロテインＳ系は重要な抗
凝固機構である。正常例においては血液凝固の凝固機構
と抗凝固機構の間には平衡関係が成立している。
凝固機構である。正常例においては血液凝固の凝固機構
と抗凝固機構の間には平衡関係が成立している。
【０００３】血液凝固を活性化するとプロ酵素プロトロ
ンビンが活性なプロテアーゼ、トロンビンへ変換する。
トロンビン自体は、タンパク分解的切断によりコファク
ター、第Ｖ因子および第VIII因子を活性化することによ
ってその産生速度を増大する。これらの活性化コファク
ターは、プロテアーゼ、第Ｘａ因子および第IXａ因子と
ともにリン脂質表面上に活性酵素／コファクター複合体
を形成し、その活性はプロテアーゼ単独の場合の約１０
００倍になる。この陽性のフィードバックにより、大量
のトロンビンのほとんど爆発的な産生が起こる。トロン
ビンはフィブリノーゲンをフィブリンに変換し、これが
正常時には、創傷の閉鎖および創傷の治癒を導くことに
なる。生体において循環系の遮断、すなわち血栓を生じ
ることになる血液凝固の致命的な拡散を防止するために
は、活性プロテアーゼとプロテアーゼの再供給を共に阻
害することが必要である。活性プロテアーゼは生体内に
おいてはプロテアーゼインヒビターにより共有結合複合
体の形成によって中和される。補充の停止はトロンビン
自体によって開始される。この目的ではトロンビンが膜
タンパク質、トロンボモジュリンに結合し、プロ酵素プ
ロテインＣ（ＰＣ）を活性プロテアーゼ、プロテインＣ
ａ（ＡＰＣ）に変換する。ＡＰＣはついでコファクタ
ー、プロテインＳ（ＰＳ）と複合体を形成し、これが活
性コファクター第VIIIａおよび第Ｖａ因子をタンパク分
解によって切断し、不活性化する。ＡＰＣはこのように
して、これらのコファクターによる強力な刺激を停止さ
せる。
ンビンが活性なプロテアーゼ、トロンビンへ変換する。
トロンビン自体は、タンパク分解的切断によりコファク
ター、第Ｖ因子および第VIII因子を活性化することによ
ってその産生速度を増大する。これらの活性化コファク
ターは、プロテアーゼ、第Ｘａ因子および第IXａ因子と
ともにリン脂質表面上に活性酵素／コファクター複合体
を形成し、その活性はプロテアーゼ単独の場合の約１０
００倍になる。この陽性のフィードバックにより、大量
のトロンビンのほとんど爆発的な産生が起こる。トロン
ビンはフィブリノーゲンをフィブリンに変換し、これが
正常時には、創傷の閉鎖および創傷の治癒を導くことに
なる。生体において循環系の遮断、すなわち血栓を生じ
ることになる血液凝固の致命的な拡散を防止するために
は、活性プロテアーゼとプロテアーゼの再供給を共に阻
害することが必要である。活性プロテアーゼは生体内に
おいてはプロテアーゼインヒビターにより共有結合複合
体の形成によって中和される。補充の停止はトロンビン
自体によって開始される。この目的ではトロンビンが膜
タンパク質、トロンボモジュリンに結合し、プロ酵素プ
ロテインＣ（ＰＣ）を活性プロテアーゼ、プロテインＣ
ａ（ＡＰＣ）に変換する。ＡＰＣはついでコファクタ
ー、プロテインＳ（ＰＳ）と複合体を形成し、これが活
性コファクター第VIIIａおよび第Ｖａ因子をタンパク分
解によって切断し、不活性化する。ＡＰＣはこのように
して、これらのコファクターによる強力な刺激を停止さ
せる。
【０００４】プロテインＣ／プロテインＳ系の重要性
は、プロテインＣおよび／またはプロテインＳの遺伝的
または後天的欠乏または欠陥があるヒトでは血栓とくに
再発性静脈血栓症を起こす確率が高い（Esmon, C.T., T
CM 2：214〜219, 1992）という事実によって確認されて
いる。プロテインＣおよびプロテインＳのほかに、この
系の活性は他の因子、たとえばフォンビルブラント因子
および第IXａ因子によっても影響を受けることが可能で
（Rick, M. E. ら, J. Lab. Clin．Med．115：415〜42
1，1990）、これらは第VIIIａ因子をタンパク分解によ
る崩壊から保護できる。ループス抗凝固物質の産生から
後天的障害が誘導されることもある。これらはリン脂質
に対する抗体であり、その機能に必須のリン脂質表面へ
のプロテアーゼ／コファクター複合体の結合を妨害する
（Amer，L．ら，Thomb．Res．57：247〜258，1990）。
さらに最近、第Ｖ因子の突然変異が報告されている。こ
れはＡＰＣにより、全くではないにしてもきわめて僅か
しか不活性化され得ない（Bertina，R．M．ら，Nature
369：64〜67，1994）。
は、プロテインＣおよび／またはプロテインＳの遺伝的
または後天的欠乏または欠陥があるヒトでは血栓とくに
再発性静脈血栓症を起こす確率が高い（Esmon, C.T., T
CM 2：214〜219, 1992）という事実によって確認されて
いる。プロテインＣおよびプロテインＳのほかに、この
系の活性は他の因子、たとえばフォンビルブラント因子
および第IXａ因子によっても影響を受けることが可能で
（Rick, M. E. ら, J. Lab. Clin．Med．115：415〜42
1，1990）、これらは第VIIIａ因子をタンパク分解によ
る崩壊から保護できる。ループス抗凝固物質の産生から
後天的障害が誘導されることもある。これらはリン脂質
に対する抗体であり、その機能に必須のリン脂質表面へ
のプロテアーゼ／コファクター複合体の結合を妨害する
（Amer，L．ら，Thomb．Res．57：247〜258，1990）。
さらに最近、第Ｖ因子の突然変異が報告されている。こ
れはＡＰＣにより、全くではないにしてもきわめて僅か
しか不活性化され得ない（Bertina，R．M．ら，Nature
369：64〜67，1994）。
【０００５】その抗血栓作用により重要なプロテインＣ
／プロテインＳ系には多くの障害の可能性があるので、
この系の障害を一般的に指示するスクリーニング試験を
用いることは臨床診断上価値がある。ある種の障害が、
フォンビルブラント因子、第IXａ因子、ループス抗凝固
物質または第Ｖ因子の突然変異によるこの場合のよう
に、臨床検査室での著しい出費と特異的経験によっての
み解析可能である場合には、上記試験はとくに有用であ
る。さらに、プロテインＣ／プロテインＳ系の作用原理
を利用するスクリーニング試験により、いまだに原因不
明の障害を指摘することも可能である。
／プロテインＳ系には多くの障害の可能性があるので、
この系の障害を一般的に指示するスクリーニング試験を
用いることは臨床診断上価値がある。ある種の障害が、
フォンビルブラント因子、第IXａ因子、ループス抗凝固
物質または第Ｖ因子の突然変異によるこの場合のよう
に、臨床検査室での著しい出費と特異的経験によっての
み解析可能である場合には、上記試験はとくに有用であ
る。さらに、プロテインＣ／プロテインＳ系の作用原理
を利用するスクリーニング試験により、いまだに原因不
明の障害を指摘することも可能である。
【０００６】今日まで、プロテインＣまたはプロテイン
Ｓは、個々の因子としての機能性が検討されてきた。こ
の目的では、サンプルまたはサンプルから単離されたプ
ロテインＣは最初に過剰のプロテインＣ欠乏血漿に添加
される。プロテインＣはついで、トロンビンもしくはト
ロンビンおよびトロンボモジュリンの添加、あるいは登
録商標名Protac（Pentapharm, Basel, Switzerland）で
知られるマムシ（Agkistrodon contortrix）からのヘビ
毒の添加によって活性化される。サンプル中に存在する
プロテインＣは、サンプル中に存在するプロテインＣの
抗凝固作用による血液凝固時間の延長に基づき、または
トロンビンに特異的な基質の変換によって検出される。
別法として、トロンビンまたはProtac（登録商標）での
活性化後にＡＰＣに特異的な基質を用いることによるプ
ロテインＣ活性の直接色素原測定も可能である。
Ｓは、個々の因子としての機能性が検討されてきた。こ
の目的では、サンプルまたはサンプルから単離されたプ
ロテインＣは最初に過剰のプロテインＣ欠乏血漿に添加
される。プロテインＣはついで、トロンビンもしくはト
ロンビンおよびトロンボモジュリンの添加、あるいは登
録商標名Protac（Pentapharm, Basel, Switzerland）で
知られるマムシ（Agkistrodon contortrix）からのヘビ
毒の添加によって活性化される。サンプル中に存在する
プロテインＣは、サンプル中に存在するプロテインＣの
抗凝固作用による血液凝固時間の延長に基づき、または
トロンビンに特異的な基質の変換によって検出される。
別法として、トロンビンまたはProtac（登録商標）での
活性化後にＡＰＣに特異的な基質を用いることによるプ
ロテインＣ活性の直接色素原測定も可能である。
【０００７】プロテインＳの測定はサンプルをＰＳ−欠
乏血漿と混合することによって行われる。ＡＰＣの抗凝
固活性に及ぼすプロテインＳの刺激作用は血液凝固時間
の延長を量定することによって測定される。これに必要
なＡＰＣを添加するか、またはＰＳ−欠乏血漿中のプロ
テインＣをProtac（登録商標）を用いて活性化する（総
説が、Bertina，R．M.，Res．Clin．Lab．20：127〜13
8，1990に記載されている）。
乏血漿と混合することによって行われる。ＡＰＣの抗凝
固活性に及ぼすプロテインＳの刺激作用は血液凝固時間
の延長を量定することによって測定される。これに必要
なＡＰＣを添加するか、またはＰＳ−欠乏血漿中のプロ
テインＣをProtac（登録商標）を用いて活性化する（総
説が、Bertina，R．M.，Res．Clin．Lab．20：127〜13
8，1990に記載されている）。
【０００８】現在までに報告されている方法は、それぞ
れの場合に検討された単一の因子によるプロテインＣま
たはプロテインＳの障害の検出のみに適している。した
がって、それらはスクリーニング試験としては不適当で
ある。
れの場合に検討された単一の因子によるプロテインＣま
たはプロテインＳの障害の検出のみに適している。した
がって、それらはスクリーニング試験としては不適当で
ある。
【０００９】他の方法（Amer，L．ら，Thomb．Res．5
7：247〜258，1990）においては、活性化部分トロンボ
プラスチン時間（ＡＰＴＴ）の改良が行われている。Ａ
ＰＴＴは、血液凝固障害の検出のための標準方法であ
り、すなわち、出血傾向の検出に使用される。サンプル
血漿を活性化表面を用いて活性化したのち、Amerらの方
法では、カルシウムイオンとＡＰＣの同時添加により血
液凝固を開始させる。血液凝固時間は外因性に添加され
たＡＰＣの抗凝固作用によって延長される。したがっ
て、この試験では、プロテインＣ／プロテインＳ系のあ
る種の障害が直ちに検出される。しかしながら、外因性
に添加されたＡＰＣがあるので、サンプル中のプロテイ
ンＣの欠陥または欠乏を検出することは不可能である。
7：247〜258，1990）においては、活性化部分トロンボ
プラスチン時間（ＡＰＴＴ）の改良が行われている。Ａ
ＰＴＴは、血液凝固障害の検出のための標準方法であ
り、すなわち、出血傾向の検出に使用される。サンプル
血漿を活性化表面を用いて活性化したのち、Amerらの方
法では、カルシウムイオンとＡＰＣの同時添加により血
液凝固を開始させる。血液凝固時間は外因性に添加され
たＡＰＣの抗凝固作用によって延長される。したがっ
て、この試験では、プロテインＣ／プロテインＳ系のあ
る種の障害が直ちに検出される。しかしながら、外因性
に添加されたＡＰＣがあるので、サンプル中のプロテイ
ンＣの欠陥または欠乏を検出することは不可能である。
【００１０】血液凝固診断のもう一つの標準方法である
プロトロンビン時間に基づいてDuchemin，J．ら（Throm
b．Haemost．71：331〜338，1994）は、サンプルにおけ
る血液凝固をトロンボプラスチンとカルシウムの添加に
より活性化している。生成したトロンビンはトロンボモ
ジュリンの同時添加によりサンプル中のプロテインＣ
（内因性）を活性化する。プロテインＣ／プロテインＳ
系の作動に依存して、ＡＰＣはトロンビンの産生に対抗
する。１５分後に、カルシウムイオンをキレート化し
て、さらなる血液凝固活性を停止させ、得られたトロン
ビンを特異的な色素原基質の変換によって測定する。産
生するトロンビンの量はプロテインＣ／プロテインＳ系
の作動に間接的に依存する。内因性プロテインＣが活性
化されるので、サンプル中のプロテインＣ／プロテイン
Ｓ系の障害はすべて検出できる。しかしながら、１６分
という長い総測定時間は著しい欠点である。このように
長時間を要する試験はスクリーニング試験として定常的
に使用するには不利である。しかも、２種の膜タンパク
質、トロンボプラスチンとトロンボモジュリンを必要と
し、それらは、とくにトロンボモジュリンの場合、調製
が繁雑で、また安定性に限界がある。最後に、血餅は最
初の工程でもサンプル中に生成し、そのためこの方法
は、血餅が存在しても生成したトロンビンによる変換を
測定できる色素原測定法との組み合わせでのみ可能であ
る。したがって、フィブリン血餅の生成を測定する旧来
の測定方法を使用することはできない。
プロトロンビン時間に基づいてDuchemin，J．ら（Throm
b．Haemost．71：331〜338，1994）は、サンプルにおけ
る血液凝固をトロンボプラスチンとカルシウムの添加に
より活性化している。生成したトロンビンはトロンボモ
ジュリンの同時添加によりサンプル中のプロテインＣ
（内因性）を活性化する。プロテインＣ／プロテインＳ
系の作動に依存して、ＡＰＣはトロンビンの産生に対抗
する。１５分後に、カルシウムイオンをキレート化し
て、さらなる血液凝固活性を停止させ、得られたトロン
ビンを特異的な色素原基質の変換によって測定する。産
生するトロンビンの量はプロテインＣ／プロテインＳ系
の作動に間接的に依存する。内因性プロテインＣが活性
化されるので、サンプル中のプロテインＣ／プロテイン
Ｓ系の障害はすべて検出できる。しかしながら、１６分
という長い総測定時間は著しい欠点である。このように
長時間を要する試験はスクリーニング試験として定常的
に使用するには不利である。しかも、２種の膜タンパク
質、トロンボプラスチンとトロンボモジュリンを必要と
し、それらは、とくにトロンボモジュリンの場合、調製
が繁雑で、また安定性に限界がある。最後に、血餅は最
初の工程でもサンプル中に生成し、そのためこの方法
は、血餅が存在しても生成したトロンビンによる変換を
測定できる色素原測定法との組み合わせでのみ可能であ
る。したがって、フィブリン血餅の生成を測定する旧来
の測定方法を使用することはできない。
【００１１】したがって本発明は、プロテインＣ／プロ
テインＳ系の機能性の完全な測定に適し、旧来の測定技
術―フィブリン血餅生成の測定―および色素原基質の補
助による両方法で定量できる方法を提供するという技術
的問題に基づくものである。
テインＳ系の機能性の完全な測定に適し、旧来の測定技
術―フィブリン血餅生成の測定―および色素原基質の補
助による両方法で定量できる方法を提供するという技術
的問題に基づくものである。
【００１２】この技術的問題の解決は、特許請求の範囲
に開示された実施態様の各条項に含まれている。
に開示された実施態様の各条項に含まれている。
【００１３】驚くべきことに、プロテインＣ／プロテイ
ンＳ系の障害は、サンプル中の内因性プロテインＣを、
正常例においては活性化されたコファクター、第Ｖａ因
子および第VIIIａ因子の分解によると推定される血液凝
固時間の延長を招くプロテインＣアクティベーターをサ
ンプル中へ添加することによって活性化した場合、機能
性血液凝固試験で検出できることが見いだされたのであ
る。血液凝固時間が著しく延長されないことはこの自然
の抗凝固系の障害を指示し、この理由からこの試験はと
くにスクリーニング試験としても適している。
ンＳ系の障害は、サンプル中の内因性プロテインＣを、
正常例においては活性化されたコファクター、第Ｖａ因
子および第VIIIａ因子の分解によると推定される血液凝
固時間の延長を招くプロテインＣアクティベーターをサ
ンプル中へ添加することによって活性化した場合、機能
性血液凝固試験で検出できることが見いだされたのであ
る。血液凝固時間が著しく延長されないことはこの自然
の抗凝固系の障害を指示し、この理由からこの試験はと
くにスクリーニング試験としても適している。
【００１４】本発明の方法においては、サンプル中の内
因性プロテインＣがプロテインＣ／プロテインＳ系の機
能性のチェックに利用される。この試験はＡＰＴＴの改
良に基づくものである。プロテインＣアクティベータ
ー、接触相アクティベーター、リン脂質およびサンプル
を最初に試験容器中で混合し、ついでインキュベートす
る。この相では、ＡＰＴＴに通常みられるように、プロ
テアーゼの第XII因子、プレカリクレインおよび第XI因
子の活性化が起こる。さらに、サンプル中のプロテイン
ＣがプロテインＣアクティベーターによって活性化さ
れ、サンプル中のプロテインＳとともに、リン脂質表面
上に活性なＡＰＣ／プロテインＳ複合体を形成する。イ
ンキュベーション後、カルシウムイオンを添加して血液
凝固を誘導すると、生成したＡＰＣ／プロテインＳ複合
体が既に上述したように血餅の形成を遅延させる。
因性プロテインＣがプロテインＣ／プロテインＳ系の機
能性のチェックに利用される。この試験はＡＰＴＴの改
良に基づくものである。プロテインＣアクティベータ
ー、接触相アクティベーター、リン脂質およびサンプル
を最初に試験容器中で混合し、ついでインキュベートす
る。この相では、ＡＰＴＴに通常みられるように、プロ
テアーゼの第XII因子、プレカリクレインおよび第XI因
子の活性化が起こる。さらに、サンプル中のプロテイン
ＣがプロテインＣアクティベーターによって活性化さ
れ、サンプル中のプロテインＳとともに、リン脂質表面
上に活性なＡＰＣ／プロテインＳ複合体を形成する。イ
ンキュベーション後、カルシウムイオンを添加して血液
凝固を誘導すると、生成したＡＰＣ／プロテインＳ複合
体が既に上述したように血餅の形成を遅延させる。
【００１５】本発明の方法は、プロテインＣがサンプル
中のトロンビンによるのではなくプロテインＣアクティ
ベーターを添加することによって活性化される点で、Du
cheminらの方法とは異なる。これにより、測定時間をか
なり短縮することが可能になる。すなわち、実施例１に
詳述するように、プロテインＣ／プロテインＳ系の作動
についての情報を獲得するには２分という短いインキュ
ベーション時間で完全に十分である。最後に、検出は血
液凝固時間の測定によって行われ、したがって旧来の方
法（血餅形成開始の測定）または色素原測定法（色素原
基質の変換）のいずれかの測定装置の使用が可能であ
る。
中のトロンビンによるのではなくプロテインＣアクティ
ベーターを添加することによって活性化される点で、Du
cheminらの方法とは異なる。これにより、測定時間をか
なり短縮することが可能になる。すなわち、実施例１に
詳述するように、プロテインＣ／プロテインＳ系の作動
についての情報を獲得するには２分という短いインキュ
ベーション時間で完全に十分である。最後に、検出は血
液凝固時間の測定によって行われ、したがって旧来の方
法（血餅形成開始の測定）または色素原測定法（色素原
基質の変換）のいずれかの測定装置の使用が可能であ
る。
【００１６】プロテインＣまたはプロテインＳを測定す
る従来の方法とは異なり、サンプルは相当する欠乏血漿
とは混合されないので、サンプル自体中の因子のみが測
定に関与することになる。最後に、実施例２は外因性の
ＡＰＣを添加するAmerら（1990）の方法においてはプロ
テインＣの欠乏は検出されないことを示している。一
方、本発明の方法を用いた実施例１ではその検出が可能
である。
る従来の方法とは異なり、サンプルは相当する欠乏血漿
とは混合されないので、サンプル自体中の因子のみが測
定に関与することになる。最後に、実施例２は外因性の
ＡＰＣを添加するAmerら（1990）の方法においてはプロ
テインＣの欠乏は検出されないことを示している。一
方、本発明の方法を用いた実施例１ではその検出が可能
である。
【００１７】血流の停止という観点からは、生体は、血
液がその臓器としての機能を停止することになる２つの
危険にさらされている。一つは血液の喪失であり、他は
血管内の血液凝固である。したがって、出血傾向の検出
と血液凝固傾向の検出に用いられる診断方法がある。プ
ロテインＣ／プロテインＳ系の障害を検出する本発明の
方法は、血液凝固傾向を検出する方法の部類に属する。
しかしながら、本発明の方法は驚くべきことに、出血傾
向の検出のための標準方法である活性化部分トロンボプ
ラスチン時間（ＡＰＴＴ）の改良に基づくものである。
使用できる血液凝固系の接触相の表面アクティベーター
はすべて現在の技術水準における材料、たとえばカオリ
ン、シリカ、ガラスまたはエラグ酸である。
液がその臓器としての機能を停止することになる２つの
危険にさらされている。一つは血液の喪失であり、他は
血管内の血液凝固である。したがって、出血傾向の検出
と血液凝固傾向の検出に用いられる診断方法がある。プ
ロテインＣ／プロテインＳ系の障害を検出する本発明の
方法は、血液凝固傾向を検出する方法の部類に属する。
しかしながら、本発明の方法は驚くべきことに、出血傾
向の検出のための標準方法である活性化部分トロンボプ
ラスチン時間（ＡＰＴＴ）の改良に基づくものである。
使用できる血液凝固系の接触相の表面アクティベーター
はすべて現在の技術水準における材料、たとえばカオリ
ン、シリカ、ガラスまたはエラグ酸である。
【００１８】サンプル中のプロテインＣは適当な酵素で
の蛋白分解によって活性化される。好ましい酵素はプロ
テインＣ以外の血液凝固系における他の因子を、活性化
せずまた影響を与えない酵素である。したがって、たと
えばAgkistrodon contortrixcontortrix, Agkistrodon
bilineatusまたはAgkistrodon halys halysのようなヘ
ビ毒からのプロテインＣアクティベーターがとくに好ま
しい。
の蛋白分解によって活性化される。好ましい酵素はプロ
テインＣ以外の血液凝固系における他の因子を、活性化
せずまた影響を与えない酵素である。したがって、たと
えばAgkistrodon contortrixcontortrix, Agkistrodon
bilineatusまたはAgkistrodon halys halysのようなヘ
ビ毒からのプロテインＣアクティベーターがとくに好ま
しい。
【００１９】さらに、プロテインＣアクティベーターの
濃度は、プロテインＣ活性化の作用持続時間（インキュ
ベーション時間）との関連で、試験において血漿の凝固
時間の適当な延長を生じるように選択される。プロテイ
ンＣアクティベーターの不存在下における血液凝固時間
と比較した血液凝固時間の適当な延長は、使用した装置
の種類を基に、正常血漿から有意差が検出されるもので
ある。その延長は好ましくは少なくとも３０％、とくに
好ましくは少なくとも１００％、最も好ましくは少なく
とも２００％である。
濃度は、プロテインＣ活性化の作用持続時間（インキュ
ベーション時間）との関連で、試験において血漿の凝固
時間の適当な延長を生じるように選択される。プロテイ
ンＣアクティベーターの不存在下における血液凝固時間
と比較した血液凝固時間の適当な延長は、使用した装置
の種類を基に、正常血漿から有意差が検出されるもので
ある。その延長は好ましくは少なくとも３０％、とくに
好ましくは少なくとも１００％、最も好ましくは少なく
とも２００％である。
【００２０】サンプル中のプロテインＣは、プロテイン
Ｃアクティベーターと予めインキュベーションすること
によって完全に活性化することも考えられる。この場合
にはしかしながら、サンプルがなお凝固可能であるよう
にサンプルを適当に希釈することが必要であり、あるい
はごく少量のサンプルを使用できる。
Ｃアクティベーターと予めインキュベーションすること
によって完全に活性化することも考えられる。この場合
にはしかしながら、サンプルがなお凝固可能であるよう
にサンプルを適当に希釈することが必要であり、あるい
はごく少量のサンプルを使用できる。
【００２１】用いられたプロテインＣアクティベーター
がプロテインＣの活性化にリン脂質を必要としない場合
には、表面アクティベーター、サンプルおよびプロテイ
ンＣアクティベーターのインキュベーションをリン脂質
の不存在下に行い、リン脂質は単に後から添加すること
も可能である。表面アクティベーター、サンプル、プロ
テインＣアクティベーターおよび、必要に応じてリン脂
質の添加順序は変えることができる。活性化表面、リン
脂質およびプロテインＣアクティベーターを含有する試
剤がしたがって好ましい（実施例３参照）。試剤中の他
の添加物としては、血液凝固時間の色素原測定も可能な
ように、トロンビンに対する色素原基質がとくに好まし
い（実施例４参照）。
がプロテインＣの活性化にリン脂質を必要としない場合
には、表面アクティベーター、サンプルおよびプロテイ
ンＣアクティベーターのインキュベーションをリン脂質
の不存在下に行い、リン脂質は単に後から添加すること
も可能である。表面アクティベーター、サンプル、プロ
テインＣアクティベーターおよび、必要に応じてリン脂
質の添加順序は変えることができる。活性化表面、リン
脂質およびプロテインＣアクティベーターを含有する試
剤がしたがって好ましい（実施例３参照）。試剤中の他
の添加物としては、血液凝固時間の色素原測定も可能な
ように、トロンビンに対する色素原基質がとくに好まし
い（実施例４参照）。
【００２２】見いだされる欠陥をさらに詳細に特定化し
うる付加的試剤との組み合わせも可能である。すなわ
ち、プロテインＣの欠乏または欠陥が疑われる場合に
は、サンプルをプロテインＣ含有溶液と混合することが
できる。プロテインＣの欠乏または欠陥が実際に本発明
の方法における異常に短い血液凝固時間の原因であった
場合には、その添加によって中和される（実施例５参
照）。同様に、プロテインＳの欠乏もしくは欠陥の疑い
がある場合にはプロテインＳを添加することが可能であ
り、第Ｖ因子もしくはリン脂質の異常が疑われる場合に
は第Ｖ因子（Ｆ.Ｖ）もしくは第Ｖ因子濃縮溶液を添加
して抑制抗体（「ループス抗凝固物質」）を中和するこ
とができる。これらの添加物は、それぞれの場合、試験
混合物がその特定の付加成分を正常血漿でも生じる機能
量で含有するようになる量を添加するのが好ましい。こ
れらの添加はプロテインＣアクティベーターの添加前に
行うことが賢明である。サンプルと添加物を予めインキ
ュベートすることが好ましい。この種のプレインキュベ
ーションは、抑制抗体を中和するためにリン脂質を添加
する場合とくに好ましい。
うる付加的試剤との組み合わせも可能である。すなわ
ち、プロテインＣの欠乏または欠陥が疑われる場合に
は、サンプルをプロテインＣ含有溶液と混合することが
できる。プロテインＣの欠乏または欠陥が実際に本発明
の方法における異常に短い血液凝固時間の原因であった
場合には、その添加によって中和される（実施例５参
照）。同様に、プロテインＳの欠乏もしくは欠陥の疑い
がある場合にはプロテインＳを添加することが可能であ
り、第Ｖ因子もしくはリン脂質の異常が疑われる場合に
は第Ｖ因子（Ｆ.Ｖ）もしくは第Ｖ因子濃縮溶液を添加
して抑制抗体（「ループス抗凝固物質」）を中和するこ
とができる。これらの添加物は、それぞれの場合、試験
混合物がその特定の付加成分を正常血漿でも生じる機能
量で含有するようになる量を添加するのが好ましい。こ
れらの添加はプロテインＣアクティベーターの添加前に
行うことが賢明である。サンプルと添加物を予めインキ
ュベートすることが好ましい。この種のプレインキュベ
ーションは、抑制抗体を中和するためにリン脂質を添加
する場合とくに好ましい。
【００２３】この方法は出血の危険を確認するための標
準方法の改良に基づくものであるから、ＡＰＴＴのほか
に、他の慣用の血液凝固方法、たとえばプロトロンビン
時間（ＰＴ；実施例６参照）またはラッセルのクサリヘ
ビ毒時間（ＲＶＶＴ；実施例７参照）を使用することも
できる。プロトロンビン時間は、リン脂質および塩化カ
ルシウムのほかに、血液凝固のいわゆる外性経路を活性
化する組織因子（トロンボプラスチン；「組織因子」）
を含有する試剤の使用に基づくものである。ＲＶＴＴに
おいては、ヘビ毒、好ましくは種Vipera russelliiのヘ
ビ毒が凝固第Ｘ因子および第Ｖ因子の活性化に使用され
る。これらはついで直接、さらに中間工程を行うことな
く、プロトロンビンからトロンビンを生成する。第VIII
因子依存性血液凝固カスケードは両方法において迂回さ
れる。第VIII因子の濃度の変動はＡＰＴＴによる結果に
最大の影響を与える。これは一つには第VIII因子がコフ
ァクターとして血液凝固過程を約１０００倍にまで加速
するからであり、他方では第VIII因子の濃度が患者で通
常きわめて広範囲に変動するからである。すなわち、Ａ
ＰＴＴと比較することにより、ＰＴまたはＰＶＶＴの使
用は、血液凝固促進因子に対する依存性は低く、逆に、
プロテインＣ／プロテインＳ系の因子にのみ依存するさ
らに特異的な方法が達成される（実施例８）。
準方法の改良に基づくものであるから、ＡＰＴＴのほか
に、他の慣用の血液凝固方法、たとえばプロトロンビン
時間（ＰＴ；実施例６参照）またはラッセルのクサリヘ
ビ毒時間（ＲＶＶＴ；実施例７参照）を使用することも
できる。プロトロンビン時間は、リン脂質および塩化カ
ルシウムのほかに、血液凝固のいわゆる外性経路を活性
化する組織因子（トロンボプラスチン；「組織因子」）
を含有する試剤の使用に基づくものである。ＲＶＴＴに
おいては、ヘビ毒、好ましくは種Vipera russelliiのヘ
ビ毒が凝固第Ｘ因子および第Ｖ因子の活性化に使用され
る。これらはついで直接、さらに中間工程を行うことな
く、プロトロンビンからトロンビンを生成する。第VIII
因子依存性血液凝固カスケードは両方法において迂回さ
れる。第VIII因子の濃度の変動はＡＰＴＴによる結果に
最大の影響を与える。これは一つには第VIII因子がコフ
ァクターとして血液凝固過程を約１０００倍にまで加速
するからであり、他方では第VIII因子の濃度が患者で通
常きわめて広範囲に変動するからである。すなわち、Ａ
ＰＴＴと比較することにより、ＰＴまたはＰＶＶＴの使
用は、血液凝固促進因子に対する依存性は低く、逆に、
プロテインＣ／プロテインＳ系の因子にのみ依存するさ
らに特異的な方法が達成される（実施例８）。
【００２４】以下の実施例は単に本発明の説明を意図す
るものであり、いかなる意味においても本発明を限定す
るものではない。
るものであり、いかなる意味においても本発明を限定す
るものではない。
【００２５】実施例１
内因性プロテインＣの活性化による血液凝固時間の測定
凝固時間は、Schnitger & Grossの機械凝固計（Amelung
製）を用いて測定した。試剤はすべて、Behringwerke A
Gの市販製品かまたは通常の臨床検査試薬とした。以下
のサンプルについて検討した。すなわち正常血液ドナー
からのプール（標準ヒト血漿）、プロテインＣ欠乏血
漿、プロテインＳ欠乏血漿および第Ｖ因子の遺伝的欠陥
があるため生成された第Ｖａ因子はＡＰＣによって僅か
しか不活性化されない血漿である。
製）を用いて測定した。試剤はすべて、Behringwerke A
Gの市販製品かまたは通常の臨床検査試薬とした。以下
のサンプルについて検討した。すなわち正常血液ドナー
からのプール（標準ヒト血漿）、プロテインＣ欠乏血
漿、プロテインＳ欠乏血漿および第Ｖ因子の遺伝的欠陥
があるため生成された第Ｖａ因子はＡＰＣによって僅か
しか不活性化されない血漿である。
【００２６】Berichrom（登録商標）プロテインＣ（Agk
istrodon contortrix contortrixの毒からのプロテイン
Ｃアクティベーター含有）のプロテインＣアクティベー
ターの容器の内容物を１０mlの生理的食塩水に溶解し
た。ヒト胎盤からのリン脂質混合物であるPathromtin
（登録商標）を、表面アクティベーターとしてのカオリ
ン懸濁液５mlに溶解した。塩化カルシウム溶液（２５m
M）およびプロテインＣアクティベーター溶液は使用前
に＋３７℃に加温した。
istrodon contortrix contortrixの毒からのプロテイン
Ｃアクティベーター含有）のプロテインＣアクティベー
ターの容器の内容物を１０mlの生理的食塩水に溶解し
た。ヒト胎盤からのリン脂質混合物であるPathromtin
（登録商標）を、表面アクティベーターとしてのカオリ
ン懸濁液５mlに溶解した。塩化カルシウム溶液（２５m
M）およびプロテインＣアクティベーター溶液は使用前
に＋３７℃に加温した。
【００２７】
１００μｌのプロテインＣアクティベーター溶液
１００μｌのPathromtin（登録商標）
１００μｌの血漿サンプル
を順次ピペットで測定チューブ中に加えた。ついで、＋
３７℃で２分間インキュベーションを行い、１００μｌ
の塩化カルシウム溶液を加えることにより血液凝固時間
をスタートさせた。同時に積算ストップウオッチのスイ
ッチを入れて、血餅が検出されるまでの時間を測定し
た。
３７℃で２分間インキュベーションを行い、１００μｌ
の塩化カルシウム溶液を加えることにより血液凝固時間
をスタートさせた。同時に積算ストップウオッチのスイ
ッチを入れて、血餅が検出されるまでの時間を測定し
た。
【００２８】プロテインＣを活性化しない、すなわちプ
ロテインＣアクティベーター溶液の代わりに１００μｌ
の生理的食塩水を添加したサンプルの血液凝固時間も測
定した。
ロテインＣアクティベーター溶液の代わりに１００μｌ
の生理的食塩水を添加したサンプルの血液凝固時間も測
定した。
【００２９】表１には得られた血液凝固時間（２回の測
定値の平均）をまとめる。正常血液ドナーからの加クエ
ン酸血漿プール（ＳＨＰ）について、ＰＣアクティベー
ターを加えない場合の血液凝固時間約４２秒、ＰＣアク
ティベーターを添加した場合の血液凝固時間約１４５秒
が得られた。プロテインＣ／プロテインＳ系の活性によ
って達成された約１０３秒のこの延長はプロテインＣ欠
乏血漿（ＰＣ―ＤＰ）またはプロテインＳ欠乏血漿（Ｐ
Ｓ―ＤＰ）を有するサンプルでは明らかに低かった。突
然変異第Ｖ因子（Ｆ.ＶＤ）を有する血漿もまた明らか
に少ない凝固時間の延長を示した。
定値の平均）をまとめる。正常血液ドナーからの加クエ
ン酸血漿プール（ＳＨＰ）について、ＰＣアクティベー
ターを加えない場合の血液凝固時間約４２秒、ＰＣアク
ティベーターを添加した場合の血液凝固時間約１４５秒
が得られた。プロテインＣ／プロテインＳ系の活性によ
って達成された約１０３秒のこの延長はプロテインＣ欠
乏血漿（ＰＣ―ＤＰ）またはプロテインＳ欠乏血漿（Ｐ
Ｓ―ＤＰ）を有するサンプルでは明らかに低かった。突
然変異第Ｖ因子（Ｆ.ＶＤ）を有する血漿もまた明らか
に少ない凝固時間の延長を示した。
【表１】
【００３０】実施例２
内因性プロテインＣの存在下における血液凝固時間の測
定 凝固時間は、Schnitger & Grossの機械凝固計（Amelung
製）を用いて測定した。試剤はすべて、Behringwerke A
Gの市販製品かまたは通常の臨床検査試薬とした。サン
プルは例１の場合と同様であった。
定 凝固時間は、Schnitger & Grossの機械凝固計（Amelung
製）を用いて測定した。試剤はすべて、Behringwerke A
Gの市販製品かまたは通常の臨床検査試薬とした。サン
プルは例１の場合と同様であった。
【００３１】ＡＰＣ感受性試剤（ヒト活性化プロテイン
Ｃおよび塩化カルシウムを含有）のＡＰＣ試剤の容器の
内容物を５mlの蒸留水に溶解した。表面アクティベータ
ーとリン脂質の混合物としては例１の場合と同様にPath
romtin（登録商標）を使用した。ＡＰＣ試剤は使用前に
＋３７℃に加温した。
Ｃおよび塩化カルシウムを含有）のＡＰＣ試剤の容器の
内容物を５mlの蒸留水に溶解した。表面アクティベータ
ーとリン脂質の混合物としては例１の場合と同様にPath
romtin（登録商標）を使用した。ＡＰＣ試剤は使用前に
＋３７℃に加温した。
【００３２】１００μｌのPathromtin（登録商標）
１００μｌの血漿サンプル
を順次ピペットで測定チューブ中に加えた。ついで、＋
３７℃で２分間インキュベーションを行い、ついでＡＰ
Ｃ試剤１００μｌを加えることにより血液凝固時間をス
タートさせた。同時に積算ストップウオッチのスイッチ
を入れて、血餅が検出されるまでの時間を測定した。
３７℃で２分間インキュベーションを行い、ついでＡＰ
Ｃ試剤１００μｌを加えることにより血液凝固時間をス
タートさせた。同時に積算ストップウオッチのスイッチ
を入れて、血餅が検出されるまでの時間を測定した。
【００３３】プロテインＣを活性化しなかった、すなわ
ちＡＰＣ試剤の代わりに１００μｌの塩化カルシウム溶
液を添加したサンプルの血液凝固時間も測定した。
ちＡＰＣ試剤の代わりに１００μｌの塩化カルシウム溶
液を添加したサンプルの血液凝固時間も測定した。
【００３４】表２には得られた血液凝固時間（２回の測
定値の平均）をまとめる。正常血液ドナーからの加クエ
ン酸血漿プール（ＳＨＰ）について、外因性ＡＰＣを加
えない場合に得られた血液凝固時間は約３７秒、外因性
ＡＰＣの存在下に得られた血液凝固時間は約１７０秒で
あった。この場合に得られたこの１３３秒の延長は、プ
ロテインＳ欠乏血漿（ＰＳ―ＤＰ）では明らかに低かっ
たが、突然変異第Ｖ因子(Ｆ.ＶＤ）を有する血漿でとく
に低かった。一方、プロテインＣの欠乏はこの方法で
は、本発明の方法とは異なり、検出されなかった。逆
に、ある程度延長したＡＰＴＴ（＝ＡＰＣを添加しない
場合の血液凝固時間）から明らかな軽度の因子欠乏によ
って、ＡＰＣの存在下における血液凝固時間はＳＨＰの
場合よりもさらに明瞭に延長した。この方法は本発明の
方法とは異なり、プロテインＣ／プロテインＳ系におけ
るすべての欠陥を検出するためには不適当である。
定値の平均）をまとめる。正常血液ドナーからの加クエ
ン酸血漿プール（ＳＨＰ）について、外因性ＡＰＣを加
えない場合に得られた血液凝固時間は約３７秒、外因性
ＡＰＣの存在下に得られた血液凝固時間は約１７０秒で
あった。この場合に得られたこの１３３秒の延長は、プ
ロテインＳ欠乏血漿（ＰＳ―ＤＰ）では明らかに低かっ
たが、突然変異第Ｖ因子(Ｆ.ＶＤ）を有する血漿でとく
に低かった。一方、プロテインＣの欠乏はこの方法で
は、本発明の方法とは異なり、検出されなかった。逆
に、ある程度延長したＡＰＴＴ（＝ＡＰＣを添加しない
場合の血液凝固時間）から明らかな軽度の因子欠乏によ
って、ＡＰＣの存在下における血液凝固時間はＳＨＰの
場合よりもさらに明瞭に延長した。この方法は本発明の
方法とは異なり、プロテインＣ／プロテインＳ系におけ
るすべての欠陥を検出するためには不適当である。
【表２】
【００３５】実施例３
モノ試剤を用いる内因性プロテインＣの活性化による血
液凝固時間の測定 凝固時間は、Schnitger & Grossの機械凝固計（Amelung
製）を用いて測定した。試剤はすべて、Behringwerke A
Gによって供給された。実施例１に相当するサンプルに
加えて、第Ｖ因子欠乏血漿（Ｆ.Ｖ−ＤＰ）および第VII
I因子欠乏血漿（Ｆ.VIII−ＤＰ）についても検討した。
液凝固時間の測定 凝固時間は、Schnitger & Grossの機械凝固計（Amelung
製）を用いて測定した。試剤はすべて、Behringwerke A
Gによって供給された。実施例１に相当するサンプルに
加えて、第Ｖ因子欠乏血漿（Ｆ.Ｖ−ＤＰ）および第VII
I因子欠乏血漿（Ｆ.VIII−ＤＰ）についても検討した。
【００３６】Berichrom（登録商標）プロテインＣのプ
ロテインＣアクティベーターの２個の容器の内容物をそ
れぞれ２.５ｍｌのカオリン懸濁液に溶解した。これら
の溶液（５ml）はついで、Pathromtin（登録商標）の１
個の容器の内容物の溶解に用いた。このモノ試剤はした
がって、リン脂質、表面アクティベーターとしてのカオ
リンおよびプロテインＣのアクティベーターを含有す
る。塩化カルシウム溶液（２５mM）およびモノ試剤は使
用前に＋３７℃に加温した。
ロテインＣアクティベーターの２個の容器の内容物をそ
れぞれ２.５ｍｌのカオリン懸濁液に溶解した。これら
の溶液（５ml）はついで、Pathromtin（登録商標）の１
個の容器の内容物の溶解に用いた。このモノ試剤はした
がって、リン脂質、表面アクティベーターとしてのカオ
リンおよびプロテインＣのアクティベーターを含有す
る。塩化カルシウム溶液（２５mM）およびモノ試剤は使
用前に＋３７℃に加温した。
【００３７】１００μｌのモノ試剤
１００μｌの血漿サンプル
を順次ピペットで測定チューブ中に加えた。ついで、＋
３７℃で２分間インキュベーションを行い、１００μｌ
の塩化カルシウム溶液を加えることにより血液凝固時間
をスタートさせた。同時に積算ストップウオッチのスイ
ッチを入れて、血餅が検出されるまでの時間を測定し
た。
３７℃で２分間インキュベーションを行い、１００μｌ
の塩化カルシウム溶液を加えることにより血液凝固時間
をスタートさせた。同時に積算ストップウオッチのスイ
ッチを入れて、血餅が検出されるまでの時間を測定し
た。
【００３８】プロテインＣを活性化しなかった。すなわ
ち市販のPathromtin（登録商標）を使用したサンプルの
血液凝固時間も測定した。
ち市販のPathromtin（登録商標）を使用したサンプルの
血液凝固時間も測定した。
【００３９】表３には各種血漿で得られた血液凝固時間
（二回の測定値の平均）をまとめる。正常血液ドナーか
らの加クエン酸血漿プール（ＳＨＰ）について得られた
血液凝固時間は、ＡＰＴＴ試剤中にＰＣアクティベータ
ーを含まない場合に３７.６秒、ＰＣアクティベーター
を含有した場合に１３１.７秒であった。実施例１にお
いて詳述した結果と同様、血液凝固時間の延長はプロテ
インＣ欠乏血漿（ＰＣ―ＤＰ）、プロテインＳ欠乏血漿
（ＰＳ―ＤＰ）または突然変異第Ｖ因子（Ｆ.ＶＤ）を
有する血漿で明らかに小さかった。本実施例はまた、主
としてプロテインＣ／プロテインＳ系ではなくトロンビ
ンの生成に関連する因子の欠乏、たとえば第Ｖ因子また
は第VIII因子の欠乏が、プロテインＣアクティベーター
の存在下に血液凝固時間の短縮ではなく、逆にその延長
を招くことを示している。これらの血漿はもはや凝固せ
ず、つまり測定は３００秒後に中止した（表３中の「＞
３００」）。
（二回の測定値の平均）をまとめる。正常血液ドナーか
らの加クエン酸血漿プール（ＳＨＰ）について得られた
血液凝固時間は、ＡＰＴＴ試剤中にＰＣアクティベータ
ーを含まない場合に３７.６秒、ＰＣアクティベーター
を含有した場合に１３１.７秒であった。実施例１にお
いて詳述した結果と同様、血液凝固時間の延長はプロテ
インＣ欠乏血漿（ＰＣ―ＤＰ）、プロテインＳ欠乏血漿
（ＰＳ―ＤＰ）または突然変異第Ｖ因子（Ｆ.ＶＤ）を
有する血漿で明らかに小さかった。本実施例はまた、主
としてプロテインＣ／プロテインＳ系ではなくトロンビ
ンの生成に関連する因子の欠乏、たとえば第Ｖ因子また
は第VIII因子の欠乏が、プロテインＣアクティベーター
の存在下に血液凝固時間の短縮ではなく、逆にその延長
を招くことを示している。これらの血漿はもはや凝固せ
ず、つまり測定は３００秒後に中止した（表３中の「＞
３００」）。
【表３】
【００４０】実施例４
トロンビンに対する色素原基質を用いた内因性プロテイ
ンＣの活性化による血液凝固時間の測定 血液凝固時間は，Behring凝固タイマー（BCT；Behringw
erke）、比色凝固計で測定した。試剤はすべてBehringw
erke AGによって供給された。サンプルは実施例１のサ
ンプルと同一とした。
ンＣの活性化による血液凝固時間の測定 血液凝固時間は，Behring凝固タイマー（BCT；Behringw
erke）、比色凝固計で測定した。試剤はすべてBehringw
erke AGによって供給された。サンプルは実施例１のサ
ンプルと同一とした。
【００４１】Berichrom（登録商標）プロテインＣのプ
ロテインＣアクティベーターの容器内容物を１０mlの生
理的食塩水に溶解した。Pathromtin（登録商標）SLをＡ
ＰＴＴアクティベーター試剤として使用した。これは大
豆からのリン脂質と、表面アクティベーターとしてのシ
リカ粒子との懸濁液である。塩化カルシウム溶液（２５
mM）および０.２mM ＢＣＰ―１００、色素原トロンビン
基質の混合物を開始試剤として使用した。
ロテインＣアクティベーターの容器内容物を１０mlの生
理的食塩水に溶解した。Pathromtin（登録商標）SLをＡ
ＰＴＴアクティベーター試剤として使用した。これは大
豆からのリン脂質と、表面アクティベーターとしてのシ
リカ粒子との懸濁液である。塩化カルシウム溶液（２５
mM）および０.２mM ＢＣＰ―１００、色素原トロンビン
基質の混合物を開始試剤として使用した。
【００４２】ピペットによる添加は装置によって自動的
に実施した。開始試剤とプロテインＣアクティベーター
溶液は装置により使用直前に＋３７℃に加温した。
に実施した。開始試剤とプロテインＣアクティベーター
溶液は装置により使用直前に＋３７℃に加温した。
【００４３】７０μｌのPathromtin（登録商標）SL
１０μｌのプロテインＣアクティベーター溶液または生
理的食塩水のみ ７０μｌのサンプル を順次ピペットで測定キューベット中に加えた。つい
で、＋３７℃で２分間インキュベーションを行い、７０
μｌの開始試剤を加えることにより測定を開始した。４
０５nmにおける吸光度に０.３の上昇が認められるまで
の時間を記録した。
理的食塩水のみ ７０μｌのサンプル を順次ピペットで測定キューベット中に加えた。つい
で、＋３７℃で２分間インキュベーションを行い、７０
μｌの開始試剤を加えることにより測定を開始した。４
０５nmにおける吸光度に０.３の上昇が認められるまで
の時間を記録した。
【００４４】表４には各種血漿について得られた時間を
掲げる。古典的な血液凝固法（フィブリン血餅形成の測
定）と同様に、プロテインＣ／プロテインＳ系の障害を
有する血漿はすべて、色素原基質の使用においても、正
常血漿プールよりも短い血液凝固時間を示すことが明ら
かである。
掲げる。古典的な血液凝固法（フィブリン血餅形成の測
定）と同様に、プロテインＣ／プロテインＳ系の障害を
有する血漿はすべて、色素原基質の使用においても、正
常血漿プールよりも短い血液凝固時間を示すことが明ら
かである。
【表４】
【００４５】実施例５
スクリーニング方法の改良によるプロテインＣ／プロテ
インＳ系における欠陥の同定 血液凝固時間は実施例３および実施例４に記載したよう
に、モノ試剤での血餅形成を測定することにより１回、
および別個の混合物中でトロンビン形成を測定すること
により決定した。このスクリーニング試験は鑑別診断に
も適している。この目的のため、実施例３および実施例
４に詳述した混合物を以下のように変えた。最初の工程
として、５μｌのプロテインＣ含有溶液をピペットで添
加した。濃度は、得られたプロテインＣ濃度がサンプル
の容量に基づいて１単位となるように選択された。サン
プルおよび試剤の添加は通常の方法で行われた。
インＳ系における欠陥の同定 血液凝固時間は実施例３および実施例４に記載したよう
に、モノ試剤での血餅形成を測定することにより１回、
および別個の混合物中でトロンビン形成を測定すること
により決定した。このスクリーニング試験は鑑別診断に
も適している。この目的のため、実施例３および実施例
４に詳述した混合物を以下のように変えた。最初の工程
として、５μｌのプロテインＣ含有溶液をピペットで添
加した。濃度は、得られたプロテインＣ濃度がサンプル
の容量に基づいて１単位となるように選択された。サン
プルおよび試剤の添加は通常の方法で行われた。
【００４６】表５から明らかなように、測定方法の様々
な方法論的変化を用いることにより、プロテインＣ欠乏
をたとえばプロテインＳ欠乏と明瞭に識別することが可
能である。プロテインＣ欠乏血漿にプロテインＣを添加
すると、プロテインＣアクティベーターを添加した混合
物と添加しなかった混合物での測定値の差は補償される
が、プロテインＳ欠乏血漿ではこのようなことはなかっ
た。すなわち、この方法はわずかな改変により鑑別診断
に使用することもできる。
な方法論的変化を用いることにより、プロテインＣ欠乏
をたとえばプロテインＳ欠乏と明瞭に識別することが可
能である。プロテインＣ欠乏血漿にプロテインＣを添加
すると、プロテインＣアクティベーターを添加した混合
物と添加しなかった混合物での測定値の差は補償される
が、プロテインＳ欠乏血漿ではこのようなことはなかっ
た。すなわち、この方法はわずかな改変により鑑別診断
に使用することもできる。
【表５】
【００４７】実施例６
内因性プロテインＣ活性化による血液凝固時間のトロン
ビン時間を用いた測定 血液凝固時間は、Schnitger & Grossの機械凝固計（Ame
lung製）を用いて測定した。試剤はすべて、Behringwer
ke AGによって供給された。
ビン時間を用いた測定 血液凝固時間は、Schnitger & Grossの機械凝固計（Ame
lung製）を用いて測定した。試剤はすべて、Behringwer
ke AGによって供給された。
【００４８】組織因子／ヒト胎盤からのリン脂質プレパ
レーションThromborel Ｓ（登録商標）を、５０mM Tris
緩衝液、pH ７.４、０.０１％Phospholipon２５中で、
１：１０００に希釈した。この溶液５mlを用いて、実施
例３に記載したBerichromプロテインＣのプロテインＣ
アクティベーターの容器１個の内容物を溶解した。この
溶液を使用前に＋３７℃に加温し、実施例３に記載のＡ
ＰＴＴベースのモノ試剤の代わりに使用した。
レーションThromborel Ｓ（登録商標）を、５０mM Tris
緩衝液、pH ７.４、０.０１％Phospholipon２５中で、
１：１０００に希釈した。この溶液５mlを用いて、実施
例３に記載したBerichromプロテインＣのプロテインＣ
アクティベーターの容器１個の内容物を溶解した。この
溶液を使用前に＋３７℃に加温し、実施例３に記載のＡ
ＰＴＴベースのモノ試剤の代わりに使用した。
【００４９】さらに、プロテインＣの活性化を行わない
サンプルについても、すなわち市販のPathromtin（登録
商標）を使用して、血液凝固時間を測定した。
サンプルについても、すなわち市販のPathromtin（登録
商標）を使用して、血液凝固時間を測定した。
【００５０】表６には様々な血漿で得られた血液凝固時
間（２回の測定値の平均）をまとめる。実施例１に詳述
した結果と同様に、血液凝固時間の延長はプロテインＣ
欠乏血漿（ＰＣ―ＤＰ）、プロテインＳ欠乏血漿（ＰＳ
―ＤＰ）、または突然変異第Ｖ因子（Ｆ.ＶＤ）を有す
る血漿で明らかに小さかった。
間（２回の測定値の平均）をまとめる。実施例１に詳述
した結果と同様に、血液凝固時間の延長はプロテインＣ
欠乏血漿（ＰＣ―ＤＰ）、プロテインＳ欠乏血漿（ＰＳ
―ＤＰ）、または突然変異第Ｖ因子（Ｆ.ＶＤ）を有す
る血漿で明らかに小さかった。
【表６】
【００５１】実施例７
ＲＶＶＴを用いた内因性プロテインＣの活性化による血
液凝固時間の測定 血液凝固時間は、Behring凝固タイマー（ＢＣＴ；Behri
ngwerke）、比色凝固計により測定した。Gradipore LTD
（North Ryde，NSW，Australia）によって供給されたLA
-ConfirmをＲＶＶＴ試剤として用いた。他の試剤はすべ
て、Behringwerke AGによって供給された。サンプルは
実施例１のサンプルと同一とした。
液凝固時間の測定 血液凝固時間は、Behring凝固タイマー（ＢＣＴ；Behri
ngwerke）、比色凝固計により測定した。Gradipore LTD
（North Ryde，NSW，Australia）によって供給されたLA
-ConfirmをＲＶＶＴ試剤として用いた。他の試剤はすべ
て、Behringwerke AGによって供給された。サンプルは
実施例１のサンプルと同一とした。
【００５２】Berichrom（登録商標）プロテインＣのプ
ロテインＣアクティベーター容器の内容物を１０mlの生
理的食塩水に溶解した。ＲＶＶＴ試剤は指示書に従って
溶解した。試剤はすべて使用前に装置によって＋３７℃
に加温した。
ロテインＣアクティベーター容器の内容物を１０mlの生
理的食塩水に溶解した。ＲＶＶＴ試剤は指示書に従って
溶解した。試剤はすべて使用前に装置によって＋３７℃
に加温した。
【００５３】５０μｌのサンプル
５０μｌのプロテインＣアクティベーター溶液または生
理的食塩水のみ を順次ピペットで測定キューベット中に加えた。ついで
＋３７℃で２分間インキュベーションを行い、１００μ
ｌのＲＶＶＴ試剤を加えることにより測定を開始した。
４０５nmにおける吸光度に０.３の上昇が認められるま
での時間を記録した。
理的食塩水のみ を順次ピペットで測定キューベット中に加えた。ついで
＋３７℃で２分間インキュベーションを行い、１００μ
ｌのＲＶＶＴ試剤を加えることにより測定を開始した。
４０５nmにおける吸光度に０.３の上昇が認められるま
での時間を記録した。
【００５４】表７には様々な血漿で得られた時間を掲げ
る。他の古典的凝固法（ＡＰＴＴ、ＰＴ）の場合と同
様、ＲＶＶＴ試剤の使用時にもプロテインＣ／プロテイ
ンＳ系障害がある血漿はすべて正常血漿プールより凝固
時間が短いことが見いだされる。
る。他の古典的凝固法（ＡＰＴＴ、ＰＴ）の場合と同
様、ＲＶＶＴ試剤の使用時にもプロテインＣ／プロテイ
ンＳ系障害がある血漿はすべて正常血漿プールより凝固
時間が短いことが見いだされる。
【表７】
【００５５】実施例８
内因性プロテインＣを活性化してＡＰＴＴまたはＰＴを
用いる測定の第VIII因子依存性 標準ヒト血漿を第VIII因子欠乏血漿、すなわちBeritate
（登録商標）と混合し。第VIII因子濃縮物（Behringwer
ke AG）を、内因性プロテインＣの活性化後の凝固時間
の測定に際して第VIII因子の作用を模擬するために添加
した。ＡＰＴＴを用いる測定は実施例１の記載と同様に
行い、ＰＴによる測定は実施例６の記載と同様に実施し
た。
用いる測定の第VIII因子依存性 標準ヒト血漿を第VIII因子欠乏血漿、すなわちBeritate
（登録商標）と混合し。第VIII因子濃縮物（Behringwer
ke AG）を、内因性プロテインＣの活性化後の凝固時間
の測定に際して第VIII因子の作用を模擬するために添加
した。ＡＰＴＴを用いる測定は実施例１の記載と同様に
行い、ＰＴによる測定は実施例６の記載と同様に実施し
た。
【００５６】表８には、ＡＰＴＴまたはＰＴに基づいて
得られた凝固時間を掲げる。プロテインＣ系の機能性の
評価における第VIII因子の望ましくない干渉がＡＰＴＴ
の場合には明白であり、一方、ＰＴベースの方法では実
際に干渉は起こらなかった。
得られた凝固時間を掲げる。プロテインＣ系の機能性の
評価における第VIII因子の望ましくない干渉がＡＰＴＴ
の場合には明白であり、一方、ＰＴベースの方法では実
際に干渉は起こらなかった。
【表８】
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/56
G01N 33/86
ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／Ｗ
ＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (30)
- 【請求項１】 生物学的液体サンプル中の血液凝固のプ
ロテインＣ／プロテインＳ系における機能活性のスクリ
ーニング方法において、以下の工程 ａ）希釈または非希釈サンプルへのプロテインＣのアク
ティベーターの添加（サンプルにプロテインＣ欠乏血漿
またはプロテインＳ欠乏血漿は添加しない） ｂ）所望により接触相アクティベーターの添加 ｃ）反応混合物のインキュベーション ｄ）カルシウムイオンおよび／または血液凝固を誘導す
る他の試剤の添加による血液凝固過程の開始、ならびに ｅ）血液凝固活性の測定を包含する方法。 - 【請求項２】 プロテインＣアクティベーターは優先的
または排他的にプロテインＣを活性化するヘビ毒酵素で
ある請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 血液凝固因子を活性化する試剤または出
血傾向を検出するための血液凝固法は活性化部分トロン
ボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、プロトロンビン時間
（ＰＴ）またはラッセルのクサリヘビ（viper）毒時間
（ＲＶＶＴ）の測定からなる、請求項１〜２の少なくと
も１つに記載の方法。 - 【請求項４】 接触相アクティベーターはカオリン、シ
リカ、ガラスおよびエラジン酸からなる群より選択され
る、請求項１〜３の少なくとも１つに記載の方法。 - 【請求項５】 少なくとも工程ｃ）におけるインキュベ
ーションは３６〜３８℃で行われる、請求項１〜４の少
なくとも１つに記載の方法。 - 【請求項６】 プロテインＣアクティベーターの濃度
は、正常血漿の血液凝固時間が少なくとも３０％以上延
長されるように調整される、請求項１〜５の少なくとも
１つに記載の方法。 - 【請求項７】 工程ｃ）におけるインキュベーション時
間は、正常血漿の血液凝固時間が少なくとも３０％以上
延長されるように調整される、請求項１〜６の少なくと
も１つに記載の方法。 - 【請求項８】 工程ａ）とｂ）の間でさらにインキュベ
ーションが行われる、請求項１〜７の少なくとも１つに
記載の方法。 - 【請求項９】 i）プロテインＣのアクティベーターの
添加、ii）接触相アクティベーターの添加、およびii
i）カルシウムイオンの添加による血液凝固過程の開始
は同時にまたは短時間間隔で連続的に行われる、請求項
１〜８の少なくとも１つに記載の方法。 - 【請求項１０】 血液凝固活性を測定するための色素原
基質を工程ｅ）において使用する、請求項１〜９の少な
くとも１つに記載の方法。 - 【請求項１１】 工程ｃ）の前に、リン脂質を混合物に
添加する、請求項１〜１０の少なくとも１つに記載の方
法。 - 【請求項１２】 工程ｃ）の後に、リン脂質を混合物に
添加する、請求項１〜１０の少なくとも１つに記載の方
法。 - 【請求項１３】 リン脂質は生成した表面への酵素／コ
ファクター複合体の付着をもたらすリン脂質の群から選
択される、請求項１１および１２の少なくとも１つに記
載の方法。 - 【請求項１４】 機械的、機械−光学的または濁度測定
方法によって検出可能な凝血が生成するまでの時間を工
程ｅ）における血液凝固活性の測定に使用する、請求項
１〜１３の少なくとも１つに記載の方法。 - 【請求項１５】 トロンビンに対する色素原基質の変換
を工程ｅ）における血液凝固活性の比色測定に使用す
る、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１６】 試剤がインビトロ診断に慣用される処
方物中にプロテインＣアクティベーター、接触相アクテ
ィベーターおよびリン脂質を含有する、請求項１〜９の
少なくとも１つに記載の方法において使用するための組
成物。 - 【請求項１７】 請求項１６に記載の少なくとも１種の
組成物を含有する請求項１〜１５の少なくとも１つに記
載の方法に用いられるテストキット。 - 【請求項１８】 プロテインＣ／プロテインＳ系におけ
る内因性欠損を補償するためにプロテインＣ、プロテイ
ンＳ、第Ｖ因子またはリン脂質の群から選択される他の
成分を、工程ａ）〜ｅ）の１つにおいて添加する、請求
項１〜３の少なくとも１つに記載の方法。 - 【請求項１９】 使用されるプロテインがヒト起源のプ
ロテインである、請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 使用されるプロテインが動物起源のプ
ロテインである、請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２１】 他の成分の濃度は、サンプルとの適当
な混合物中においてこれらの他の成分の欠損または欠陥
に基づくプロテインＣ／プロテインＳ系における障害を
補償するように選択される、請求項１８〜２０の少なく
とも１つに記載の方法。 - 【請求項２２】 他の成分の濃度は、混合後、サンプル
が正常血漿中に認められる物質の機能量を含有するよう
に選択される、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 他の成分は第Ｖ因子であり、そして第
Ｖ因子の濃度は混合後、サンプルが正常血漿中に認めら
れる機能性第Ｖ因子の量の少なくとも２倍過剰量を含有
するように選択される、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２４】 １または２種以上の他の成分とサンプ
ルの混合はプロテインＣアクティベーター添加前に行わ
れ、サンプルはプロテインＣアクティベーター添加前に
１または２種以上の他の成分と１〜１０分間インキュベ
ートする、請求項１８〜２３の少なくとも１つに記載の
方法。 - 【請求項２５】 接触相アクティベーターを使用せず、
そしてプロトロンビン時間に基づく血液凝固は組織因子
およびリン脂質を含有する試剤で誘導できる、請求項１
〜３の少なくとも１つに記載の方法。 - 【請求項２６】 組織因子が天然または組換え起源の因
子であってよい、請求項２５に記載の方法。 - 【請求項２７】 組織因子含有試剤は既にプロテインＣ
アクティベーターを含有しているか、または組織因子の
添加はプロテインＣアクティベーターの添加とは別々に
行われる、請求項２５および２６の少なくとも１つに記
載の方法。 - 【請求項２８】 接触相アクティベーターを使用せず、
そしてＲＶＶＴに基づく血液凝固はヘビ毒からの第Ｘ因
子および第Ｖ因子活性化因子ならびにリン脂質を含有す
る試剤によって行う、請求項１〜３の少なくとも１つに
記載の方法。 - 【請求項２９】 第Ｘ因子および第Ｖ因子活性化因子は
精製されるかまたは未分画ヘビ毒の添加により試剤に添
加される、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項３０】 第Ｘ因子および第Ｖ因子活性化因子含
有試剤は既にプロテインＣアクティベーターを含有して
いるか、または第Ｘ因子および第Ｖ因子活性化因子の添
加はプロテインＣアクティベーターの添加とは別々に行
われる、請求項２８および２９の少なくとも１つに記載
の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4427785A DE4427785A1 (de) | 1994-08-08 | 1994-08-08 | Verfahren zum Nachweis von Störungen des Protein C/Protein S-Systems |
| DE4427785:7 | 1994-08-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0889293A JPH0889293A (ja) | 1996-04-09 |
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ID=6525023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20078395A Expired - Fee Related JP3533012B2 (ja) | 1994-08-08 | 1995-08-07 | プロテインｃ／プロテインｓ系の障害を検出する方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0696642B1 (ja) |
| JP (1) | JP3533012B2 (ja) |
| KR (1) | KR960007789A (ja) |
| AT (1) | ATE220112T1 (ja) |
| AU (1) | AU694931B2 (ja) |
| CA (1) | CA2155503C (ja) |
| DE (2) | DE4427785A1 (ja) |
| DK (1) | DK0696642T3 (ja) |
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| PT (1) | PT696642E (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0711838B2 (de) * | 1994-11-10 | 2007-06-20 | Dade Behring Marburg GmbH | Verfahren zum spezifischen Nachweis eines aktivierten Gerinnungsfaktors V mit einer erhöhten Stabilität gegenüber aktiviertem Protein C |
| ATE200710T1 (de) † | 1994-12-23 | 2001-05-15 | Diagnostic Reagents Ltd | Verfahren zur diagnose von blutgerinnungsstörungen |
| US5780255A (en) * | 1995-06-09 | 1998-07-14 | Instrumentation Laboratory, S.P.A. | Protein C pathway screening test |
| US6379975B1 (en) | 1996-11-27 | 2002-04-30 | T.A.C. Thrombosis And Coagulation Aktiebolag | Methods and reagents for determining protein S |
| EP0977995B1 (de) * | 1997-04-25 | 2005-03-02 | Pentapharm AG | Verfahren zum funktionellen nachweis von störungen im protein c-system |
| DE19734648A1 (de) * | 1997-08-11 | 1999-02-18 | Dade Behring Marburg Gmbh | Verwendung von Annexinen als Lupus Antikoagulans Kontrolle oder Standard in Gerinnungstesten |
| DE19749197A1 (de) * | 1997-11-07 | 1999-05-12 | Dade Behring Marburg Gmbh | Verfahren zur Bestimmung des antikoagulatorischen Potentials einer Probe |
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| US6743596B1 (en) | 2000-10-27 | 2004-06-01 | Biomerieux, Inc. | Method of determining global coagulability hemostatic potential |
| US6645768B1 (en) * | 2000-10-27 | 2003-11-11 | Biomerieux, Inc. | Reagent and kit for determining global coagulability and hemostatic potential |
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| US6855509B2 (en) | 2000-12-19 | 2005-02-15 | Instrumentation Laboratory Company | Protein S functional assay and kit therefor |
| JP2009198506A (ja) * | 2009-04-10 | 2009-09-03 | Shino Test Corp | 血液凝固反応抑制血漿タンパク質の活性測定方法及び活性測定試薬 |
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|---|---|---|---|---|
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