JPH08508718A

JPH08508718A - ワクチン組成物および全身的ワクチン接種による粘膜性免疫応答誘導方法

Info

Publication number: JPH08508718A
Application number: JP51820294A
Authority: JP
Inventors: デイネス，レイモンド・エイ; アラネオ，バーバラ・エイ
Original assignee: ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデイション
Priority date: 1993-02-04
Filing date: 1994-02-03
Publication date: 1996-09-17
Also published as: EP0686042A4; AU679215B2; KR960700744A; FI953608A0; HUT72404A; HU9502105D0; NO953049D0; US5518725A; EP0686042A1; PL310112A1; NZ262597A; NO953049L; AU6234894A; CZ197595A3; FI953608L; SK97395A3; CA2153794A1; WO1994017823A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、抗原およびリンパ系器官調節剤からなるワクチンに関する。適当なリンパ系器官調節剤は、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃ならびに細胞内ビタミンＤ₃受容体を活性化しうるビタミンＤ₃誘導体、全トランス−レチノイン酸、レチノイン酸誘導体、レチノール、レチノール誘導体およびグルココルチコイドを包含するが、これらに限定されない。該ワクチン組成物は、さらに免疫応答増強剤からなっていてもよい。免疫応答増強剤は、Ｔ細胞のリンホカイン産生を促進する。適当な免疫応答増強剤は、ＤＨＥＡおよびＤＨＥＡ誘導体を包含するが、これらに限定されない。ＤＨＥＡ誘導体の例は、ＤＨＥＡ硫酸（ＤＨＥＡ−Ｓ）、１６−α−ブロモ−ＤＨＥＡ、７−オキソ−ＤＨＥＡ、１６−α−ブロモ−ＤＨＥＡ−Ｓおよび７−オキソ−ＤＨＥＡ−Ｓを包含するが、これらに限定されない。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ワクチン組成物および全身的ワクチン接種による粘膜性免疫応答誘導方法技術分野本発明は、ワクチン組成物および粘膜性免疫応答の誘導を提供するワクチン接種方法に関する。発明の背景粘膜性免疫応答脊椎動物における大多数の感染要因は、一般的には、消化管（口腔粘膜を含む）、気道（嗅覚および結膜の粘膜を含む）、乳腺、および性尿器管をはじめとする粘膜表面を通過して宿主中に入る。通常の粘膜性免疫系は、分泌性免疫グロブリン応答により、脊椎動物の粘膜表面を通過した感染に対する最初の抵抗を行う（ジェイ・メステキー（J.Mestecky）（１９８７年）ジャーナル・オブ・クリニカル・イミュノロジー（J.Clin.Immunol.）第７巻：２６５〜２７５頁）。分泌性免疫応答は、他の状況において、抗原特異的Ｂ細胞のクローンの増殖およびＢ細胞の子孫によるすべてのサブクラスのＩｇＧならびにＩｇＡ分泌細胞への進行性のイソタイプのスイッチングを伴う。免疫部位と出会う微生物、蛋白、多糖などのごとき抗原は、当該部位の粘膜表面ならびに他の粘膜部位を覆う局所的抗体を産生させ分泌を誘導しうる。ヒトを含む多くの種において、分泌性と循環性ＩｇＡとの常に一緒になった産生は、他の免疫グロブリンイソタイプの産生を上回ることがよく知られている。分泌性ＩｇＡならびにＩｇＭおよびすべてのサブクラスのＩｇＧは、涙、唾液、初乳および乳をはじめとする実質的にすべての外分泌物において、そして気道、消化管および性尿器管の粘膜分泌物において見いだされている。大部分の種において、免疫グロブリンの全身性および分泌性産生は、かなりの程度の独立性を維持している。例えば、ヒトにおいては、血清ＩｇＡの大部分は、骨髄において産生され、分泌物中には見られない。分泌性ＩｇＡの大部分は、体の通常の粘膜上皮の固有層中に分配されている形質細胞により産生される。さらにそのうえ、局所的に産生された分泌性ＩｇＡは、ＩｇＡの循環プールに有意には貢献しない。分泌された体液のＩｇＡは、外部表面への選択的輸送の前に、多量体としてＩｇＡ産生細胞中に集合することが知られている。血漿中および脳脊髄液中に存在するＩｇＡは、構造上主として単量体で存在する（すなわち、約７〜８Ｓ）が、一方では、大部分の分泌形態のＩｇＡは二量体である。分泌性ＩｇＡの防御的役割は、臨床系および実験系の両方において十分に示されている。感染性疾患の予防および粘膜表面におけるアレルギー疾患の抑制のための有効な機構として、分泌性ＩｇＡは、生物学的に活性のある抗原を中和し、消化管からの抗原の取り込みを防止し、上皮表面への細菌の付着を抑制し、生得の防御系の抗細菌効果を高める（ジェイ・メステキー（J.Mestecky）（１９８７年）,上記参照）。多くの研究は、外分泌物に対する免疫応答を誘導し調節する特殊なリンパ組織が粘膜にあることを確認している。腸に関連したリンパ網状組織（「ＧＡＬＴ」）は、小腸にある特徴的なリンパ小節であるパイエル板および孤立性リンパ小節の双方を包含する。リンパ小節は、立方体の上皮細胞および細かく折り畳まった細胞（「Ｍ細胞」）からなる上皮を伴った特徴的な組織学的器官を有する。Ｍ細胞は、ドームと呼ばれる下層領域中のリンパ網状細胞を取り囲んでいる多くの細胞質小胞および細胞質伸長を有する。Ｍ細胞は、内腔の抗原の取り込みおよびその上皮を通過するインタクトな輸送に関する抗原サンプリング機構として役立つ。ドーム領域はＭＨＣクラスII⁺細胞（マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞）に富み、それらは、抗原提示の重要な機能のためのすばらしい環境を作り出すであろう。ドーム下部に、ＩｇＡ産生に貢献するようになりうるＢ細胞に富むＢ細胞ゾーンを示す２個の小胞部位がある。しかしながら、他の２次リンパ組織における胚中心とは異なり、Ｂ細胞の形質細胞への増殖および分化は、この組織においては、稀にしか起こらない。いったん抗原が粘膜上皮細胞を貫通すると、パイエル板における副皮質性Ｔ細胞および胚中心Ｂ細胞の抗原提示性で細胞依存性の活性化が観察される。しかしながら、ＩｇＡ産生に貢献するＢ細胞の分化に必要な誘導性の刺激は、Ｂ細胞が、パイエル板を出発して遠心性リンパ管を通って腸間膜リンパ節中に移行してしまうまで遅延される。最終的には、ＩｇＡ産生に貢献し、抗原に敏感になったＢ細胞は、リンパ液を通した循環系に入り、全身の種々の外分泌腺および粘膜上皮に定着する。ヘルパーＴ細胞により提供される情報を包含する局所的影響下で、抗原および他の生物学的調停器によって、ＩｇＡ分泌性形質細胞への最終分化が起こる。ＩｇＡ産生に貢献するＢ細胞の発達に適したパイエル板の微小環境は、粘膜性免疫系に関する研究の焦点であった（ジェイ・ビエネンストック（J.Bienenstoc k）ら（１９８３年）フェデ・プロシ（Fed.Proc.）第４２巻：３２１５〜３２１７頁；ジェイ・メステキー（J.Mestecky）（１９８７年）,上記）。パイエル板のＢ細胞にＩｇＡ産生させるイソタイプのスイッチングの過程は、Ｔ細胞および特別なＴ細胞エフェクター機能の調節下にあることが知られている（ジェイ・ビエネンストック（J.Bienenstock）ら,上記）。別個のリンパコンパートメント中のＴ細胞によるサイトカインのパターンの天然の分配が、最近の研究に現れている（アール・デインズ（R.Daynes）ら（１９９０年）ジャーナル・イクスペ・メデイ（J.Exp.Med.）第１７１巻：９７９〜９９６頁；ビー・アラネオ（B.Araneo ）ら（１９９３年）ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジーズ（J.Inf. Disease）第１６７巻：８３０〜８４０頁）。皮膚から（すなわち末梢リンパ節から）の排液を受け取るリンパ組織に心材するＴ細胞は、活性化された場合、高レベルのＩＬ−２おいびＩＦＮ−γを産生する。粘膜表面（粘膜リンパ節）からの最初の排液を受け取る、パイエル板をはじめとするリンパ組織から単離されたＴ細胞は、活性化の後、ＩＬ−４およびＩＬ−５に富むがＩＬ−２およびＩＦＮ −γレベルが低いサイトカインのパターンを作り出す。活性化されたＢ細胞による免疫グロブリンのクラスのスイッチングを指令するサイトカインの能力は、十分に研究され、十分に受け入れられている現象である。例えば、フィンケルマン（Finkelman）ら（１９９０年）アニュアル・レビュー・オブ・イミュノロジー（Ann.Rev.Immunol.）第８巻：３０３〜３３４頁参照。いくつかの場合において、免疫グロブリンスイッチングを調節している分子機構が明らかにされた（フィンケルマン（Finkelman）ら（１９９０年）上記）。キヨノ（Kiyono）ら（１９８４年）.ジャーナル・イクスペ・メディ（Jour.Exp.Med.）第１５９巻：７９８〜８１１頁、およびエイチ・カワニシ（H.Kawanishi）ら（１９８３年）ジャーナル・イクスペ・メディ（Jour.Exp.Med.）第１５７巻：４３３〜４５０頁による研究は、パイエル板のＴ細胞がＩｇＭ産生Ｂ細胞のＩｇＡ産生細胞へのスイッチングを引き起こすことを示している。これらの「スイッチング」を起こさせるＴ細胞は、ＩｇＧ産生Ｂ細胞のＩｇＡ産生へのクラスのスイッチングを容易ならしめるのではない。重要なことに、抗原特異的なパイエル板由来のＴ細胞クローンは、ＩｇＡ産生Ｂ細胞のＩｇＡ分泌性細胞への成熟および分化を媒介しうる。キヨノ（Kiyono）ら,上記は、抗原特異的パイエル板のＴ細胞により作られた増殖および分化因子が、腸粘膜表面におけるＩｇＡの選択的増強の原因であると結論した。粘膜性免疫プロセスの開始におけるパイエル板のＴ細胞の特殊な機能およびリンホカイン産生能を強調する結果として、この重要な分野における研究は、粘膜性免疫が必須である感染性要因に対する上手なワクチン摂取に対する要求としての、粘膜表面を通過する抗原の送達に重点を置くようになった。それゆえ、研究努力は、ほとんどすべて、抗原を提供することによる粘膜性免疫応答の誘導および局所的な粘膜排液性リンパ系器官における細胞に対する刺激に向けられることとなった。生物学的応答調節物質Ｂ細胞の分化は、脊椎動物体内の器官および組織中での細胞情報伝達手段として役立つ生物学的に活性なポリペプチドであるサイトカインにより影響されうる。サイトカインは、さらにインターロイキンおよび種々のタイプの形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）ならびに血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）のごとき増殖因子をも包含する生物学的応答調節物質の族である。インターロイキンは、イソタイプのスイッチングおよび抗原により活性化されたＢ細胞による抗体分泌において重要な役割を果たすことが知られており（フィンケルマンら,上記）；ＴＧＦ−βはＩｇＡイソタイプの発現に必須である（ピー・ヴァン・ヴラッセラエル（P.Van Vlasselaer）（１９９２年）ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Jour.Immunol.）第１４８巻：２０６２〜２０６７頁；ディー・レブマン（D.Lebman）（１９９０年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）第８７巻：３９６２〜３９６６頁）。１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃）は、ラット細胞における生物学的に活性な形態のＴＧＦ−βの合成を促進することが示されている（ディー・エム・ペトコビッチ（D.M.Petkovich）ら（１９８７年）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）第２６２巻：１３４２４〜１３４２８頁；ジェイ・プファイルシュリフター（J.Pfeilschrifter）ら（１９８７年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）第８４巻：２０２４〜２０２８頁）。粘膜性免疫学的記憶近年、免疫化の分野における研究者は、一般的に、粘膜表面における永続的な免疫学的記憶の確立は、粘膜表面を通って体内に侵入する感染要因の負荷に対する宿主の防御を改善するための重要な手段を提供しうるということに同意している。粘膜性免疫学的免疫性を確立するための満足な手段は得られていない。全身の免疫化は、抗原の全身投与、例えば、ワクチンの非経口的投与により誘導される可能性があり、かかる免疫化は全身感染に対して有効でありうる。しかしながら、非経口的に投与されたワクチンは、粘膜表面における分泌性抗体の力価を少ししか上昇させないかまたは上昇させない。粘膜表面の抗原（Ａｇ）への直接的曝露が、粘膜性免疫応答の誘導手段、すなわち、粘膜表面における抗原特異的な分泌性免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）応答の実質的増大を起こす手段として提唱されている。かかるアプローチによれば、粘膜表面を覆うに十分量の抗原が経口的に投与される（消化管粘膜の抗原への曝露のため）かまたは鼻孔内投与される。ある粘膜部位において生じる抗原特異的ｓＩｇＡ応答は、他の粘膜関連リンパ部位に広まると言われている。ある提案された免疫化方法において、経口的および鼻孔内ワクチン接種は、インフルエンザのごときウイルス性呼吸器感染に対する肺の免疫化の改善に有用である可能性がある。数年来、種々の抗原物質および標的としての種々の粘膜上皮を用いて、粘膜表面を直接通過させる免疫化のアプローチが試みられている（メステキーら（１９８７年）上記）。大部分の、生きていない、または非感染性の可溶性抗原は、鼻孔内または経口的投与が行われた場合、免疫原として貧弱である。それゆえ、粘膜表面を経口的または鼻孔内経路により投与された抗原に曝露することによる粘膜性免疫学的応答および免疫学的記憶の確立は、典型的には、処置すべき各対象につきミリグラム量の抗原を必要とし、かかるアプローチはコスト高となる。所望の応答を生じさせるのに必要なＡｇ量を減少させるために種々の努力がなされてきた。あるアプローチにおいては、粘膜性アジュバントが免疫性応答に必要とされる免疫原とともに投与される。例えば、エム・バジー（M.Vadjy）ら,（１９９２年）イミュノロジー（Immunilogy）第７５巻：４８８〜４９２頁には、キーホルリムペット（keyhole limpet）のヘモシアニン（ＫＬＨ）をコレラトキソイド（ＣＴ）アジュバントと混合して経口的に免疫を開始することによる、マウスの小腸固有層におけるＫＬＨに対する永続的な免疫学的記憶が記載されている。腸においてＫＬＨに対して誘導された記憶応答は、これらの実験において、血清中のＫＬＨ−特異的抗体（Ａｂ）力価のスイッチングには反映されなかった。ＣＴは、さらに関連ならびに関連しない抗原の対する強力な粘膜性アジュバントとして作用する能力を有する既知の能力の高い粘膜性免疫原であり；それはまた非常に毒性がある。イー・エイブラハム（E.Abraham）ら（１９９２年）ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Jour.Immunol.）第１４９巻：３７１９〜３７２６頁には、Ｂ細胞増殖および免疫グロブリン（Ｉｇ）産生の進行を促進することが知られているサイトカインであるインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含有するリポソームをシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）またはアエロバクター・レバニクム（Aerobacter levanicum）由来の細菌多糖とともに鼻孔内投与することによる、マウスの肺における細菌多糖特異的ｓＩｇＡ応答の実質的増加；およびそれらのマウスにおける感染に対する耐性の増大が記載されている。対照的に、ＩＬ−２およびピー・アエルギノザの細菌多糖の両方を含有するリポソームで免疫したマウスの血清における細菌多糖特異的Ｉｇの有意な変化はなかった。ＩＬ−２のリポソームへの封入は、このサイトカインの高い全身レベルから生じる毒性を回避すると考えられた。抗原特異的粘膜性抗体応答ならびに抗原特異的血清抗体応答を引き起こすための方法を提供することが本発明の１つの目的である。少量の抗原でこれらの応答を引き起こすことが、本発明のさらなる目的である。発明の概要本発明は、抗原およびリンパ系器官調節剤からなるワクチンに関する。適当なリンパ系器官調節剤は、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃、細胞内ビタミンＤ₃ 受容体を活性化することのできる生物学的に活性のあるビタミンＤ₃誘導体、全トランス−レチノイン酸、レチノイン酸誘導体、レチノールおよびグルココルチコイドを包含するが、これらに限定されない。該ワクチン組成物は、さらに、免疫応答増強剤からなっていてもよい。該免疫応答増強剤は、Ｔ細胞のリンホカイン産生を増大させる。適当な免疫応答増強剤は、ＤＨＥＡおよびＤＨＥＡ誘導体を包含するが、これらに限定されない。ＤＨＥＡ誘導体の例は、ＤＨＥＡ硫酸（ＤＨＥＡ−Ｓ）、１６−α−ブロモ−ＤＨＥＡ、７−オキソ−ＤＨＥＡ、１６− α−Ｂｒ−ＤＨＥＡ−Ｓおよび７−オキソ−ＤＨＥＡ−Ｓを包含する。さらに本発明は、抗原およびリンパ系器官調節剤からなるワクチンを末梢リンパコンパートメント（peripheral lymph compartment）中に排液している部位に投与することからなる、対象脊椎動物における抗原特異的粘膜性免疫応答を誘導するための方法に関する。また、リンパ系器官調節剤および抗原を含有するワクチンを、別個に同一部位に投与することからなる方法にも関する。当該方法は、さらに、免疫応答増強剤をさらに投与することからなっていてもよい。免疫応答増強剤を、リンパ系器官調節剤に続けて、あるいはこれと同時に投与してもよい。図面の簡単な説明図１Ａ〜１Ｅは、局所的に適用された１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の、マウスの末梢リンパ節におけるＴ細胞サイトカイン産生に及ぼす影響を示す棒グラフである。棒は、マウスの処理および未処理部位から単離されたリンパ節細胞からの示されたサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０）の放出をμｇ／ｍｌで示す。図２Ａ〜２Ｄは、マウスにおけるジフテリアトキソイド（Ｄｔ）での皮下免疫化に対する１次および２次血清抗体の応答に対する、局所的に適用された１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の影響を示すグラフである。Ｄｔ特異的ＩｇＧ（図２Ａ、２Ｃ）およびＩｇＡ（図２Ｂ、２Ｄ）に対するＤｔ特異的定量的ＥＬＩＳＡから得た結果を、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を１次免疫から０日目に与えられた処理マウス（データ点●）、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を１次免疫から５日目に与えられた処理マウス（データ点▲）、および１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を与えられなかった未処理マウス（データ点■）について示す。図３Ａ〜３Ｄは、マウスにおける、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型多糖ワクチン（ＨｉｂＣＶ）（ＨｉｂはＤｔに結合している）での１次（図３Ａ、３Ｂ）および２次（図３Ｃ、３Ｄ）皮下免疫に対する血清抗体の応答に対する、局所的に適用された１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の影響を示すグラフである。Ｄｔ特異的ＩｇＧ（図３Ａ、３Ｃ）およびＩｇＡ（図３Ｂ）３Ｄ）に対するＤｔ特異的定量的ＥＬＩＳＡから得た結果を、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を１次免疫から０日目に与えられた処理マウス（データ点●）、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を１次免疫から５日目に与えられた処理マウス（データ点▲）、および１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を与えられなかった未処理マウス（データ点■）について示す。図４Ａ〜４Ｄは、マウスにおける、ＨｉｂＣＶでの１次（図４Ａ）４Ｂ）および２次（図４Ｃ、４Ｄ）皮下免疫に対する分泌性抗体の応答に対する、局所的に適用された１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の影響を示すグラフである。Ｄｔ特異的ＩｇＧ（図４Ａ、４Ｃ）およびＩｇＡ（図４Ｂ、４Ｄ）に対するＤｔ特異的定量的ＥＬＩＳＡから得た結果を、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を１次免疫から０日目に与えられた処理マウス（データ点●）、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を１次免疫から５日目に与えられた処理マウス（データ点▲）、および１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を与えられなかった未処理マウス（データ点■）について示す。図５Ａ〜５Ｄは、マウスにおける、ＨｉｂＣＶでの１次（図５Ａ）５Ｂ）および２次（図５Ｃ、５Ｄ）皮下免疫に対する血清抗体の応答に対する、局所的に適用された１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の影響を示すグラフである。ＩｇＧ（図５Ａ、５Ｃ）およびＩｇＡ（図５Ｂ、５Ｄ）に対するＨｉｂ特異的定量的ＥＬＩＳＡから得た結果（平均値±標準偏差）を、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を１次免疫から０日目に与えられた処理マウス（データ点●）、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を１次免疫から５日目に与えられた処理マウス（データ点▲）、および１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を与えられなかった未処理マウス（データ点■）について示す。図６Ａ〜６Ｄは、マウスにおける、ＨｉｂＣＶでの１次（図５Ａ）５Ｂ）および２次（図５Ｃ、５Ｄ）皮下免疫に対する分泌性抗体の応答に対する、局所的に適用された１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の影響を示すグラフである。ＩｇＧ（図５Ａ、５Ｃ）およびＩｇＡ（図５Ｂ）５Ｄ）に対するＨｉｂ特異的定量的ＥＬＩＳＡから得た結果を、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を１次免疫から０日目に与えられた処理マウス（データ点●）、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を１次免疫から５日目に与えられた処理マウス（データ点▲）、および１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を与えられなかった未処理マウス（データ点■）について示す。図７Ａおよび７Ｂは、マウスにおける、ウイルスワクチン（インフルエンザＡ／ベイジング（Beijing）；１.５μｇ）での免疫に対する血清抗体の応答に対する、局所的に適用された１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の影響を示すグラフである。ＩｇＧ（図７Ａ）およびＩｇＡ（図７Ｂ）に対するインフルエンザウイルス特異的定量的ＥＬＩＳＡから得た結果を、１次免疫から５日目に１.０μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を与えられた処理マウス（データ点●）、および１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃ を与えられなかった未処理マウス（データ点■）について示す。図８Ａ〜８Ｄは、マウスにおける、インフルエンザウイルスワクチン（インフルエンザＡ／ベイジング）での免疫に対する２つの異なる粘膜性コンパートメントにおける粘膜性免疫応答に対する局所的に適用された１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の影響を示す棒グラフである。膣洗浄物（図８Ａ、８Ｂ）および肺洗浄物（図８Ｃ、８Ｄ）からのＩｇＧ（図８Ａ、８Ｃ）およびＩｇＡ（図８Ｂ、８Ｄ）に対するインフルエンザＡ／ベイジング特異的定量的ＥＬＩＳＡの結果を、免疫から５日目に１.０μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を与えられた処理マウスに関して、および１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を与えられなかった未処理マウスに関して示す。図９Ａは、ワクチン中に含有された１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の投与により粘膜組織においてＩｇＡ産生が誘導されることを示す。ＩｇＡ応答を、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃処理されなかったマウス（■）、および１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃処理されたマウス（●）について示す。図９Ｂは、ワクチン中に含有された１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の投与により粘膜組織においてＩｇＧ産生が誘導されることを示す。ＩｇＧ応答を、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃処理されなかったマウス（■）、および１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃処理されたマウス（●）について示す。図１０Ａは、ワクチン接種後５日目の１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃局所投与により血清においてＩｇＧ産生が誘導されることを示す。ＩｇＧ応答を、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃処理されなかったマウス（■）、および１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃処理されたマウス（●）について示す。図１０Ｂは、ワクチン接種後５日目の１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃局所投与により血清においてＩｇＡ産生が誘導されることを示す。ＩｇＡ応答を、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃処理されなかったマウス（■）、および１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃処理されたマウス（●）について示す。図１１Ａは、ワクチン接種後５日目の１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃局所投与により粘膜組織においてＩｇＡ産生が誘導されることを示す。ＩｇＡ応答を、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃処理されなかったマウス（■）、および１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃処理されたマウス（●）について示す。図１１Ｂは、ワクチン接種後５日目の１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃局所投与により粘膜組織においてＩｇＧ産生が誘導されることを示す。ＩｇＧ応答を、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃処理されなかったマウス（■）、および１,２５（ＯＨ）2Ｄ3処理されたマウス（●）について示す。図１２は、ｒＨＢＳＡｇ接種後の老齢マウスにおける抗体応答が、ＤＨＥＡまたはＤＨＥＡ−Ｓ処理により増強されることを示す。無処理老齢マウス（■）、局所的ＤＨＥＡで処理した老齢マウス（●）、ワクチン中に含有されたＤＨＥＡで処理した老齢マウス（▲）、およびワクチン中に含有されたＤＨＥＡ−Ｓで処理した老齢マウス（◆）について、抗体応答を示す。図１３Ａは、インフルエンザ−Ａベイジング株でのワクチン接種後の成熟マウスにおける血清（全身的）抗体応答が、ＤＨＥＡおよび１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃での処理により相乗的に増強されることを示す。無処理マウス（■）、ワクチン中２μｇのＤＨＥＡで処理したマウス（●）、ワクチン中０.１μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃で処理したマウス（▲）、およびワクチン中２μｇのＤＨＥＡおよび０.１μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃で処理したマウス（◆）について、２８日目の抗体応答を示す。図１３Ｂは、インフルエンザ−Ａベイジング株でのワクチン接種後の成熟マウスにおける粘膜性抗体応答が、ＤＨＥＡおよび１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃での処理により相乗的に増強されることを示す。無処理マウス（■）、ワクチン中２μｇのＤＨＥＡで処理したマウス（●）、ワクチン中０.１μｇの１,２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃で処理したマウス（▲）、およびワクチン中２μｇのＤＨＥＡおよび０.１μ ｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃で処理したマウス（◆）について、２８日目の抗体応答を示す。図１４Ａは、ｒＨＢＳＡｇ接種後の成熟マウスにおける血清（全身的）抗体応答が、ＤＨＥＡおよび１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃での処理により相乗的に増強されることを示す。免疫されていないマウス（★）、無処理マウス（●）、ワクチン中２μｇのＤＨＥＡで処理したマウス（◆）、ワクチン中０.１μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃で処理したマウス（▲）、およびワクチン中２μｇのＤＨＥＡおよび０.１μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃で処理したマウス（■）について、２１日目の抗体応答を示す。図１４Ｂは、ｒＨＢＳＡｇ接種後の成熟マウスにおける粘膜性抗体応答が、ＤＨＥＡおよび１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃での処理により相乗的に増強されることを示す。免疫されていないマウス（★）、無処理マウス（●）、ワクチン中２μｇのＤＨＥＡで処理したマウス（◆）、ワクチン中０.１μｇの１,２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃で処理したマウス（▲）、およびワクチン中２μｇのＤＨＥＡおよび０.１μ ｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃で処理したマウス（■）について、２１日目の抗体応答を示す。図１５Ａは、ｒＨＢＳＡｇ接種後の成熟マウスにおける血清（全身的）抗体応答が、ＤＨＥＡおよび全トランス−レチノイン酸での処理により相乗的に増強されることを示す。免疫されていないマウス（■）、無処理マウス（●）、ワクチン中５.０μｇの全トランス−レチノイン酸で処理したマウス（▲）、およびワクチン中２μｇのＤＨＥＡおよび５.０μｇの全トランス−レチノイン酸で処理したマウス（◆）について、２１日目の抗体応答を示す。図１５Ａは、ｒＨＢＳＡｇ接種後の成熟マウスにおける粘膜性抗体応答が、ＤＨＥＡおよび全トランス−レチノイン酸での処理により相乗的に増強されることを示す。免疫されていないマウス（■）、無処理マウス（●）、ワクチン中５. ０μｇの全トランス−レチノイン酸で処理したマウス（▲）、およびワクチン中２μｇのＤＨＥＡおよび５.０μｇの全トランス−レチノイン酸で処理したマウス（◆）について、２１日目の抗体応答を示す。好ましい具体例の詳細な説明本発明は、抗原およびリンパ系器官調節剤からなるワクチンに関する。適当なリンパ系器官調節剤は、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃、細胞内ビタミンＤ₃ 受容体を活性化することのできる生物学的に活性のあるビタミンＤ₃誘導体、全トランス−レチノイン酸、レチノイン酸誘導体、レチノール、レチノール誘導体およびグロココルチコイドを包含するが、これらに限定されない。該ワクチン組成物は、さらに、免疫応答増強剤からなっていてもよい。該免疫応答増強剤は、Ｔ細胞のリンホカイン産生を増大させる。適当な免疫応答増強剤は、ＤＨＥＡおよびＤＨＥＡ誘導体を包含するが、これらに限定されない。ＤＨＥＡ誘導体の例は、ＤＨＥＡ硫酸（ＤＨＥＡ−Ｓ）、１６−α−ブロモ−ＤＨＥＡ、７−オキソ−ＤＨＥＡ）１６−α−Ｂｒ−ＤＨＥＡ−Ｓおよび７−オキソ−ＤＨＥＡ−Ｓを包含する。さらに本発明は、抗原およびリンパ系器官調節剤からなるワクチンを末梢リンパコンパートメント中に排液している部位に投与することからなる、対象脊椎動物における抗原特異的粘膜性免疫応答を誘導するための方法に関する。また、リンパ系器官調節剤および抗原を含有するワクチンを、別個に同一部位に投与することからなる方法にも関する。当該方法は、さらに、免疫応答増強剤をさらに投与することからなっていてもよい。免疫応答増強剤を、リンパ系器官調節剤に続けて、あるいはこれと同時に投与してもよい。本明細書において「リンパ系器官調節剤」と称する生物学的応答調節物質は同定されている。これらの生物学的応答調節物質は、粘膜性リンパ系器官の微小環境を模倣し、それゆえ、「治療されるべき」リンパ系器官中に排液している部位への抗原の投与に応答したＡｇ特異的粘膜性抗体応答ならびにＡｇ特異的血清抗体の産生の誘導を促進するやり方で、末梢リンパ節のＴ細胞機能に影響しうる。特別には、例えば、適切に免疫された動物に関して、リンパ系器官調節剤として役立つ局所適用された１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を、血清におけるＩｇＡおよびＩｇＧ産生を増大させると同時に粘膜分泌物中の分泌性抗体の産生を促進するために治療的に使用することができるということが見いだされている。排液性末梢リンパ節からのＴ細胞の単離およびインビトロでの活性化の前に、動物に１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を皮膚上に投与すると、上昇したＩＬ−４、ＩＬ− ５およびＩＬ−１０産生、ならびに抑制されたＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生を示すサイトカインのパターンが活性化後にリンパ節Ｔ細胞において現れる。ＩＬ −５およびＩＬ−１０は、ＴＧＦ−βと相乗的にＩｇＡ産生に貢献するＢ細胞の分化を誘導することが知られている（アール・コフマン（R.Coffman）（１９８９年）ジャーナル・イクスペ・メディ（J.Exp.Med.）第１７０巻：１０３９〜１０４４頁；ティー・デフランス（T.Defrance）ら（１９９２年）ジャーナル・イクスペ・メディ第１７５巻：６７１〜６８２頁）。ＩＬ−４は、Ｂ細胞イソタイプのＩｇＧ１イソタイプへのスイッチングに直接影響を及ぼすことが示されている（フィンケルマン（Finkelman）,上記）。リンパ節において抗原によりＢ細胞がいったん活性化されると、ＩＬ−４およびＩＬ−５は両方とも、Ｂ細胞の抗体の分泌を刺激することにおいて重要な役割を果たしうる（ジェイ・パーカーソン（J.Purkerson）（１９９２年）．ジャーナル・イクスペ・メディ第１７５巻：９７３〜９８２頁）。さらにそのうえ、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃投与部位に排液している末梢リンパ節におけるインビボでの抗原の攻撃に先立って１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃が動物に投与された場合、Ａｇ特異的な血清の免疫学的応答のみならず粘膜におけるＡｇ特異的な分泌性の免疫学的応答が起こりうる。明らかに、同一の末梢リンパ節における１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃およびインビボでの抗原の攻撃の結果は、分泌性ＩｇＡ産生に貢献し分泌性ＩｇＧ産生に貢献するＢ細胞を伴った固有層を粘膜全体の部位において「撒種」するものである。１の態様において、一般的に、本発明は、対象の末梢リンパ系器官中に排液している部位への有効量のリンパ系器官調節剤の投与、および対象の末梢リンパ系器官中に排液している部位への有効量の特異的抗原の投与による、対象脊椎動物における抗原特異的粘膜性免疫を誘導するための方法を特徴とする。該方法はさらに、米国特許出願第０７／７７９,４４９記載のごとくＴ細胞のリンホカイン産生を増大させる有効量の免疫応答増強剤を投与することを特徴とする。参照により、該特許出願を本明細書の一部とする。本明細書に用いる「個体」なる語は、脊椎動物、好ましくは、もともと、ＤＨＥＡおよびＤＨＥＡ−Ｓを産生しＤＨＥＡ−Ｓスルファターゼ活性を有している種のメンバーをいい、競技用動物およびヒトをはじめとする霊長類を包含するが、これらに限定しない。「抗原」なる語は、宿主の免疫系を刺激して分泌性の体液性および／または細胞性の抗原特異的応答を引き起こす１個またはそれ以上のエピトープを有する分子をいう。該用語のかわりに「免疫原」を用いることもある。特異的抗原は、蛋白、多糖、リポ多糖またはリポペプチドであってよく；あるいは、これらのいかなる混合物であってもよい。詳細には、特異的抗原は、ネイティブな蛋白もしくは蛋白フラグメント、または合成蛋白もしくは蛋白フラグメント、あるいはペプチドを包含しうる。特異的抗原は、糖蛋白、糖ペプチド、リポ蛋白、リポペプチド、核蛋白、核ペプチドを包含しうる。特異的抗原は、ペプチド−ペプチド抱合体を包含しうる。特異的抗原は、組み換え核酸発現産物を包含しうる。抗原の例は、ウイルス性または細菌性の肝炎、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、麻疹、おたふくかぜ、風疹、ポリオ、肺炎球菌、ヘルペス、呼吸器合胞体ウイルス、ｂ型ヘモフィルス・インフルエンザ、クラミジア、水痘帯状ヘルペスウイルスまたは狂犬病に対する免疫応答を誘導しうるものを包含する。「処理」は、防御的免疫応答を生じる組成物を個体に投与することをいい、予防および／または治療を包含する。「ワクチン組成物」または「ワクチン」は、個体の免疫系を刺激して、生じている害を改善し、あるいは将来の該に対する防御を提供する薬剤を意味する。「免疫化」は、当該生物がかつて曝露されていた抗原に対して指向されている継続した抗体および／または細胞性免疫応答の継続した防御的レベルを誘導する方法をいう。本明細書で用いる「免疫応答増強剤」は、インビボにおいて脊椎動物に投与した場合、Ｔ細胞依存性抗原に対する正常なＴ細胞の応答性を回復させうる薬剤を意味する。免疫応答増強剤は、Ｔ細胞のリンホカイン産生、特に、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＮＦ−γおよびＧＭ−ＣＳＦの産生を増大させることができる。実施例によれば、免疫応答増強剤は、Ｔ細胞のリンホカイン産生を増大させるＤＨＥＡまたはＤＨＥＡ誘導体のごとき物質であってよい。本明細書に用いる「ＤＨＥＡ」または「ＤＨＥＡ誘導体」は、式：［式中、Ｒ¹は＝ＯまたはＯＨ；Ｒ²はＨまたはハロゲン；Ｒ³は５位−６位の二重結合を伴ったＨ、または＝Ｏ；Ｒ⁴はＯＲ⁵；Ｒ⁵はＨ、ＳＯ₂ＯＭ、ＰＯ₂ＯＭ、脂肪酸、または式：のグルクロニド基；Ｒ⁶およびＲ⁷は同じであっても異なっていてもよく、直鎖状または分枝Ｃ_1〜1 ₄ アルキルを意味する］を有する化合物をいう。本明細書で用いる「リンパ系器官調節剤」は、インビボにおいて脊椎動物の末梢部位に投与した場合、投与部位から排液している末梢リンパ系器官の微小環境を変化させて、リンパ系器官中に存在する活性化されたリンパ球およびマクロファージが、粘膜性リンパコンパートメントのリンパ系器官の微小環境のより典型的なサイトカインのパターンを示すようにすることのできる調節剤を意味する。詳細には、粘膜性リンパコンパートメントのリンパ系器官の微小環境のより典型的なサイトカインのパターンは、１種またはそれ以上の活性なＴＧＦ−β、ＩＬ− ４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０の相対的に増加した産生と、１種またはそれ以上のＩＬ−２およびＩＦＮ−γの相対的に減少した産生（少なくとも相対的に産生が増加しない）により特徴づけられる。好ましい具体例において、リンパ系器官調節剤は、末梢リンパ系器官に投与した場合、粘膜性リンパ系器官のより典型的なサイトカインのパターンを示すリンパ系器官を生じさせうる生物学的応答調節剤またはそれらの組み合わせを包含する。実施例によれば、リンパ系器官調節剤は、例えば、レチノイン酸、レチノイン酸誘導体、レチノールまたはレチノール誘導体のごとき活性なＴＧＦ−βであってよく；あるいは、１,２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃またはその生物学的に活性な誘導体であってよく；また、グルココルチコイドであってもよい。好ましくは、リンパ系器官調節剤を、末梢の解剖学的部位（ヒト対象については、例えば、腕または臀部もしくは脚のごとき部位）の皮膚上に投与し；特異的抗原を同じ解剖学的部位、またはリンパ系器官調節剤の投与部位からの排液を受け取る同じリンパ系器官中に排液していることが知られている部位に投与する。投与の１の様式において、リンパ系器官調節剤を、同じ部位に同時投与するための特異的抗原と組み合わせることができる。リンパ系器官調節剤ならびに特異的抗原、あるいはそれらを両方を、注射により投与することができる。リンパ系器官調節剤を、特異的抗原投与と同時、これより前、または後に投与することができる。特異的抗原およびリンパ系器官調節剤を投与前の混合して一緒に投与することができ、あるいはそれらを順次投与することもできる。しかしながら、好ましくは、リンパ系器官調節剤を特異的抗原と同時投与するかまたは、より好ましくは、特異的抗原投与後の時点で投与する。特異的抗原の投与は、最初に、投与部位に排液しているリンパ系器官中のＴ細胞およびＢ細胞のクローンの膨張（増殖）を引き起こし、次いで、該細胞がリンパ系器官中に隔離され；その後、該細胞が全身的循環に入る。かくして、さらにリンパ系器官調節剤は、Ｂ細胞の粘膜組織への回帰およびすべての粘膜部位における粘膜性免疫の発生を容易にする。それゆえ、特別には、リンパ系器官調節剤を、１次免疫後、すなわち、生じたＴ細胞およびＢ細胞の増殖が十分に広まり、その一方では、抗原により活性化された細胞の多くがリンパ系器官に残存している場合に投与するのが好ましいであろう。一般的には、Ｔ細胞およびＢ細胞の増殖は、特異的抗原での１次免疫の約２日または３日後には十分となることが予想できる。そして、該細胞の全身的循環への実質的な移行は、特異的抗原での１次免疫の約５日後またはそれよりいくらか後に起こると予想できる。特異的抗原での１次免疫後であるが、得られた膨張したＢ細胞およびＴ細胞の集団の実質的な部分が全身的循環に移行する前の時点で、リンパ系器官調節剤が排液性リンパ系器官に到達するのが特に好ましい。例えば、まず、抗原を投与し、その後（好ましくは、抗原投与後約２日または３日たってからであるが、抗原投与後約５日をこえてはならない）、リンパ系器官調節剤を投与することにより、これを行うことができる。あるいは、リンパ系器官調節剤を、投与後その放出を遅延させるための手段と調合し、次いで、調合され放出が遅延されたリンパ系器官調節剤を、同時投与用の組成物中で特異的抗原と混合することにより、これを行うことができる。放出遅延のための手段はよく知られており、当該手段の化学および構造を調節して遅延のための適当な時間を提供するようにすることができる。リンパ系器官調節剤のリポソーム中、または生分解性マトリックスへの封入は、例えば、リンパ系器官調節剤の投与部位からリンパ系器官への送達を遅延（抗原の送達と比較して）させる効果を有る可能性がある。リンパ系器官調節剤の「有効量」は、排液性リンパ系器官に存在する活性化細胞により産生されうるサイトカインおよび増殖因子のタイプを定性的に変化させ、変化したリンパ系器官において産生される代表的な種が１種またはそれ以上の活性なＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＬ−４およびＩＬ−５となるようにすることのできる、投与されるリンパ系器官調節剤の量である。リンパ系器官調節剤の皮膚上への適用に関しては、量は、ヒト対象には、約０.１〜５００μｇ、好ましくは０.５〜２５０μｇの範囲であってよく、あるいは対象動物の体重ｋｇあたり約０.０１〜５.０μｇの範囲であってよい。皮下、筋肉内または皮内投与についての有効量は、ある程度変更してもよいが、皮膚上への適用についての一般的範囲と同じ範囲であってよい。抗原の有効量は、リンパ系器官調節剤なしで投与された場合、はっきりとわかる程度の体液性免疫応答を誘導しうる量と同じ量である。多くの抗原について、該有効量は、ヒト対象に関しては約５〜１００μｇの範囲である。免疫応答増強剤の有効量は、年齢またはストレスから生じる免疫不全のごとき免疫不全の固体におけるＴ細胞の応答性を回復させる量である。免疫応答増強剤の量は、注射により投与する場合には、ヒト対象については、約１０〜１０００ μｇ、好ましくは２０〜２００μｇの範囲であってよく、あるいは対象動物の体重ｋｇあたり約０.２〜１０μｇの範囲であってよい。経口的に投与する場合には、該量の範囲は、ヒト対象については、約１０〜１００ｍｇ／日、あるいは動物対象については約０.５〜５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってよい。もう１つの一般的態様において、本発明は、医薬上許容される担体中のリンパ系器官調節剤および特異的抗体を含有している、抗原特異的粘膜性免疫応答を誘導するための組成物を特徴とする。該組成物がさらに、免疫応答増強剤を含有していてもよい。好ましい具体例において、リンパ系器官調節剤は、１種またはそれ以上のグルココルチコイド、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃、または全トランス−レチノイン酸のごときレチノイドを包含する。細胞内ビタミンＤ₃受容体を活性化することのできる生物学的に活性なビタミンＤ₃誘導体およびレチノイン酸誘導体、レチノールならびにレチノール誘導体は、リンパ系器官調節剤として使用されうる。免疫応答増強剤は、１種またはそれ以上のＤＨＥＡまたはＤＨＥＡ誘導体を包含する。組成物が少なくとも１種のリンパ系器官調節剤および少なくとも１種の免疫応答増強剤を含有する場合に、免疫応答に対する相乗効果が達成される。いくつかの好ましい具体例において、組成物中のリンパ系器官調節剤が、リポソームまたは生分解性マトリックス中への封入のごとき、投与後のその放出を遅延するための手段と調合されて、送達部位から排液性リンパ系器官へのリンパ系器官調節剤の移行が抗原の移行に比べて遅延される。本発明方法は通常の粘膜性免疫応答を引き起こすことができるので、すべての粘膜表面において免疫グロブリンが生じるであろう。本発明により処理された乳を分泌する哺乳動物は、抗原特異的免疫グロブリンを乳腺分泌物中に産生するであろう。妊娠期間中または妊娠前に本発明により処理され、次いで、妊娠期間中に特異的抗原に曝露されたメスの哺乳動物は、初乳および乳中に抗原特異的免疫グロブリンを産生するであろう。このことは、母体を感染させることなく、メスの哺乳動物において特異的な粘膜性免疫応答を生じさせ、次いで、該メスの哺乳動物からの特異的受動免疫を、乳飲み新生児または乳児に移行させるための手段を提供する。かくして、もう１つの一般的態様において、本発明は、有効量のリンパ系器官調節剤をメスの哺乳動物の末梢リンパ系器官中に排液している部位に投与し、有効量の特異的抗原をメスの哺乳動物の末梢リンパ系器官中に排液している部位に投与することからなる、メスの哺乳動物の乳分泌物中における抗原特異的抗体の産生を誘導するための方法を特徴とする。さらに、別の一般的態様において、本発明は、そのように処理されたメスからの乳分泌物を乳飲み哺乳動物に消費させることにより、乳飲み哺乳動物に特異的な受動免疫を付与するための方法を特徴とする。本発明は、いかなる脊椎動物の免疫法にも使用することができ、ヒト対象における抗原特異的粘膜性免疫応答の誘導において特に有用である。本発明によれば、特異的抗原を投与する前に、または特異的抗原を投与した後、あるいは該抗原と同時にリンパ系器官調節剤を投与することができ；また、該抗原およびリンパ系器官調節剤を少なくとも部分的に同時に投与することもできる。動物においてはっきりとわかる程度の体液性応答を誘導するのに適したやり方、および量として、動物に抗原を投与することができる。該抗原を、経皮投与のために皮膚上に適用することができ、あるいは注射または輸液、皮下、筋肉内もしくは皮内投与することもできる。リンパ系器官調節剤を、全身および局所または部位制限的投与をはじめとする種々の投与様式に処方することができる。方法および処方は、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Reminton's Pharmaceutical Sciences） ,マック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publishing Co.），ペンシルバニア州イーストン（Easton）の最新版に見いだされる。リンパ系器官調節剤の有効量を、投与様式により、および処理すべき動物の種類により変更することができる。一般的には、有効量は、約０.０１〜１.０μｇのリンパ系器官調節剤／ｋｇ体重の範囲、あるいは、ヒト対象については約０.１〜５００μｇ、好ましくは０.５〜２５０μｇである。本発明によれば、リンパ系器官調節剤および抗原は同一部位または同じ末梢リンパコンパートメント中に排液している部位に適用される。かかる部位の解剖学的位置はよく知られている。経皮投与のために、リンパ系器官調節剤を皮膚上に適用することができる。皮膚障壁に適する浸透剤を処方中に用いることができる。リンパ系器官調節剤を、当該分野で知られているような軟膏、ゲルまたはクリームに処方することができる。別法として、リンパ系器官調節剤を、注射または輸液と同様に、皮下、筋肉内または皮内経路により投与することもできる。注射用には、本発明リンパ系器官調節剤を溶液中、好ましくは、ハンク溶液（Hank's solution）またはリンゲル溶液（Ringer's solution）のごとき生理学的に矛盾しない緩衝液中に処方することができる。さらに、リンパ系器官調節剤を、固形に処方し、使用直前に再溶解または懸濁してもよい。リンパ系器官調節剤が粘膜性免疫応答を誘導するためには、免疫系が、正常な成体におけるのと同様に機能すべきであることが見いだされている。免疫系が十分には有効でなく、あるいは、非常に若い個体、老齢の個体、ストレス下の個体等のように、個体が免疫学的に不完全である場合には（例えば、米国特許出願第０７／７７９,４９９号参照）、リンパ系器官調節剤の正常な機能のためには免疫系の増強が必要である。米国出願第０７／７７９,４４９号および「ワクチン組成物および免疫応答増強方法」と題された米国出願第０８／１２３,８４３号記載のようにして、免疫応答増強剤を投与することにより免疫系を増強する。参照により、両方の出願を本明細書に取り入れる。リンパ系器官調節剤の投与前、または同時、もしくは投与後に、免疫応答増強剤を投与してよい。免疫応答増強剤を、注射または輸液と同様、皮膚上、皮下、筋肉内または皮内経路で投与することができ、あるいは、経口的に投与することもできる。別法として、上記粘膜性免疫応答の誘導前に、個体を免疫応答増強剤で処理してもよい。免疫応答増強剤を上記のごとく処方してよい。一般的には、免疫応答増強剤の有効量は、ヒト対象には、注射により投与する場合、約１０〜１０００μｇ、好ましくは約２０〜２００μｇであってよい。経口的に投与する場合には、免疫応答増強剤の有効量は、約１０〜１００ｍｇ／日、好ましくは２０〜５０ｍｇ／日である。必要に応じて、ワクチン接種の前または後１ないし３週間の時点もしくはそれより長い時点において、免疫応答増強剤を経口投与することができる。以下に、説明の目的のみの実施例を記載するが、本発明の範囲を限定するものではない。本開示を考慮すれば、請求の範囲にある多くの具体例は、当業者にとり明らかであろう。実施例１材料および方法マウス．もともとナショナル・キャンサー・インスティチュート（National Cancer Institute）から購入したブリーディング・ストック（breeding stock ）からのメスのＣ３Ｈ／ＨｅＮＭＴＶ^-マウスに餌を与え、ユニバーシティ・オブ・ユタ・ビバリウム（University of Utah Vivarium）において飼育した。抗体．本研究において使用したモノクローナル抗体試薬を、無血清条件下での増殖に適応した適当なＢ細胞ハイブリドーマの培養上清から調製した。ラット・抗ネズミＩＬ−２を分泌するハイブリドーマクローン（Ｓ４Ｂ６）、およびラット・抗γＩＦＮ（ＸＭＧ１.２）を、ＤＮＡＸ（カリフォルニア州のパロ・アルト（Palo Alto）から得た。ネズミ・ＩＬ−４に特異的なラット抗体を産生するハイブリドーマ細胞クローン（１１Ｂ１１）、またはネズミ・ＩＦＮ−γに特異的なラット抗体を産生するハイブリドーマ細胞クローン（Ｒ４６Ａ２）を、ＡＴＣＣから購入した。次いで、精製抗サイトカイン抗体を、培養上清におけるネズミ・サイトカインの捕捉ＥＬＩＳＡによる定量のために使用した。さらに、以下のラット・抗ネズミサイトカイン抗体を、カリフォルニア州サン・ジエゴ（San Diego）のファーミジェン（PharMigen）から得、次いで、捕捉ＥＬＩＳＡによる特異的ネズミ・サイトカインの定量のために使用した。該ＥＬＩＳＡには、ビオチン化抗ＩＬ−４（ＢＶＤ６−２４Ｇ２）および抗ネズミＩＬ−１０抗体（カタログ番号１８１４１および１８１５２）、ならびに２種の抗ネズミＩＬ−２モノクローナル抗体のセットを使用した。生物学的応答調節物質．ネズミ・組み換え型ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γを、ジェンザイム（Genzyme）（マサチューセッツ州ケンブリッジ（Cambridge））から得、単一特異性ＥＬＩＳＡアッセイにおける対照として用いた。さらに、ネズミ・組み換え型ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−５を、単一のネズミ・インターロイキン遺伝子の多コピーで形質転換したＸ６３Ａｇ８ −６５３細胞の培養上清から得た。培養上清中の各インターロイキンの相対濃度を、既知の組み換え型標準物質と比較することにより決定した後、これらの試薬を適当なアッセイにおける対照リンホカインとして使用した。ＩＬ−１０標準物質は、ファーミジェンから得た。１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を、注文により、ミラン・ウスココビッツ（Milan Uskokovic）（ニュージャージー州ナトレイ（Nutley ）のホフマン−ラロッシュ（Hodffman-LaRoche））から得、９５％エタノールに溶解して１０^-3Ｍストック溶液とし、次いで、−２０℃で保存した。局所的な使用には、エタノール中１〜２μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を、免疫するのと同じ部位（後ろ足の甲）に投与した。リンホカイン定量のための捕捉ＥＬＩＳＡアッセイ．指示した場合、試験上清中のリンホカイン量を捕捉ＥＬＩＳＡにより測定した。簡単に説明すると、１００μｌの適当な捕捉モノクローナル抗体を、０.５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９.６）中１〜２μｇ／ｍｌとなるように９６ウェルマイクロテストプレート（コーニング（Corning）＃２５８１）のウェルに添加した。さらなる洗浄およびプラスチック上の反応部位をＰＢＳ／１０％ＦＣＳでブロッキングした後、試験上清および対照リンホカインの２倍系列希釈物（１００μｌ／ウェル）を分注した。十分なインキュベーションおよび洗浄後、１００μｌのビオチン化検出抗体（１〜２μｇ／ｍｌ）を各ウェル中に分注した。さらに十分洗浄を行った後、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼに抱合したアビジンおよびＡＢＴＳ−基質を用いてＥＬＩＳＡを発色させた。Ｖｍａｘ９６ウェルマイクロテストプレート分光計（カリフォルニア州メンロ・パーク（Menlo Park）のモレキュラー・デバイス（Molecular Device）製）を用いてＯ.Ｄ.を４０５ｎｍにおいて読んだ。各サイトカインの分析結果を、ｐｇ／ｍｌ±標準偏差で表す。抗体応答．精製ジフテリア・トキソイド（Ｄｔ）を、コンノー・ラボラトリーズ（Connaught Laboratories）（カナダのオンタリオ州のロンドン（London））から贈呈された。体積２５μｌの水酸化アルミニウム（２７３μｇ／ｍｌ）中に入れた１０μｇの精製蛋白を足の甲に１回注射した後、Ｄｔに対する抗体応答をマウスから誘導した。免疫に使用した、ジフテリア・トキソイドに化学的に結合したＨｉｂ多糖からなるヘモフィルス・インフルエンザｂ型複合ワクチン（ＨｉｂＣＶ）を、ユニバーシティー・オブ・ユタ・ホスピタル・ファーマシー（Un iversity of Utah hospital pharmacy）から購入した。１μｇのジフテリア・トキソイドと混合された５００のエイチ・インフルエンザｂ型多糖（ＨｉｂＣＶ）を免疫原として使用した。この免疫原を、体積２５μｌの水酸化アルミニウム（２７３μｇ／ｍｌ）中に混合した。血清試料中の特異的抗体の定量を、間接的ＥＬＩＳＡ法を用いて行い、その試薬はサザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ（Southern Biotechnology Associates）（バーミンガム（Birmingham）,AL）およびザイムド・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド（Zymed Laboratories Inc.）（カリフォルニア州サンフランシスコ）から購入したものであった。ジフテリア・トキソイド特異的抗体の検出のために、精製Ｄｔを、濃度が２.０μ ｇ／ｍｌとなるように０.０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９.６）中に希釈し、次いで、９６ウェルプレート中に分注した。Ｈｉｂ−特異的抗体の検出のために、０.０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９.６）中多糖が２００ｎｇ／ｍｌとなるよう希釈した１００μｌのＨｉｂ−メニンゴコッカス蛋白（meningococcal protein ）抱合体を９６ウェルプレート中に分注した。最短でも室温で２時間または４℃ で一晩インキュベーションした後、すべてのプレートをＰＢＳ−０.０５％ツイン２０／１.０％ウシ・血清アルブミン（ＢＳＡ）でさらに２時間室温でブロッキングした。試験試料を添加する前に、蒸留水で３回、そしてＰＢＳ／０.０５％ツイン２０で１回プレートを洗浄し、ブロッキング緩衝液を除去した。まず、個々の試料を、ＰＢＳ０.０５％ツイン２０／１.０％ＢＳＡで希釈し、次いで、１００μｌを、抗原被覆したプレートの適当なウェル中に分注した。各プレートにＩｇ標準物質：２倍希釈系列の精製ＩｇＧ（すべてのサブクラス）またはＩｇＡ（対照標準物質）のいずれかを含有させた。対照Ｉｇは、すべてのネズミ・Ｉｇイソタイプに結合することが知られているヤギ・抗ネズミＩｇにより捕捉された。これらのプレートを室温で一晩インキュベーションし、次いで、蒸留水で３回洗浄し、さらにＰＢＳ／０.０５％ツイン２０で１回洗浄した。検出抗体（ＩｇＧおよびＩｇＡに特異的なＨＲＰ結合ヤギ・抗マウスＩｇ）を、製造者推奨の希釈倍率でＰＢＳ／ツイン／１０％正常ヤギ血清中に希釈した。最終インキュベーションおよび一連の洗浄後、ＡＢＴＳ−基質を用いてＥＬＩＳＡを発色させた。Ｖｍａｘ９６ウェルマイクロテストプレート分光計（カリフォルニア州メンロ・パークのモレキュラー・デバイシズ製）を用いて４０５ｎｍにおいてＯ.Ｄ.を読んだ。Ｉｇ力価単の純線形回帰分析により、試験試料中に含まれる特異的抗体量を計算するための検量線を得た。データをｎｇ／ｍｌ±標準偏差として示す。実施例２１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃投与は末梢リンパ系器官におけるサイトカイン産生を変化させるマウスにおける１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃のリンパ系器官調節効果、すなわち、末梢リンパ系器官におけるサイトカイン産生パターンに対するその影響を示すために、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を各マウスの右前足（処理部位）に局所的に投与し、エタノール担体を各マウスの左前足に投与した。３時間後、マウスを屠殺し、実験マウスの処理および未処理両部位からの排液性リンパ節からリンパ節細胞を取り出し、次いで、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３εを用いてインビトロにおいて残留している細胞を解離させ、活性化してサイトカイン産生を刺激した。培養上清を２４時間後に集め、次いで、単一特異性捕捉ＥＬＩＳＡを用いて個々のサイトカインをアッセイした。結果を図１Ａ〜１Ｅに示す。図中、棒は、マウスの処理および未処理部位から単離されたリンパ節細胞からの示されたサイトカイン（ＩＬ −２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０）の放出を表す。結果は、２μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を用いたインビボでのマウスの上皮処理は、排液性リンパ節における活性化Ｔ細胞により産生されるサイトカインのパターンを変化（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生は抑制され、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０産生は促進された）させるに十分であることを示す。実施例３１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の投与は血清中のＩｇＡ産生を促進するマウスにおける特異的抗原に対する免疫応答に対する、皮膚上への１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃投与の効果についての最初のデモンストレーションにおいて、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ系のメスのマウスの右足の甲に、実施例１に示すように調製し混合された水酸化アルミニウム中の１０μｇのＤｔを皮下注射して１次免疫した。免疫０日および５日後に、これらのマウスの２つの異なるサブセット（処理マウス）に、２μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃をその右足の甲の皮膚上に投与した。残りのマウス（未処理マウス）には等量のエタノール担体を与えた。血清を毎週サンプリングした後、マウスを皮下的に骨盤内経路を通してＤｔで２次免疫したが、さらに１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃には曝露しなかった。マウスの処理および未処理群からの血清試料を集め、次いで、すべての１次および２次試料を、ＩｇＧおよびＩｇＡに関して、Ｄｔ特異的な定量的ＥＬＩＳＡを用いて個々にアッセイした。結果を図２Ａ〜２Ｄに示す。図中、各群マウスの平均抗ジフテリアトキソイド抗体応答（ｎｇ／ｍｌ）を図式的に示す。結果は、蛋白抗原に対するＩｇＧ応答はＤｔ −免疫マウスの血清中において優勢であることを示す。ＩｇＡ応答は、血清におけるＤｔに対する応答のずっと弱い構成成分であるが、マウスを１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃で処理することにより、実質的に増強された。これらの増強は、２次免疫投与時にさらなるホルモン処理を行わなくても、２次免疫後も同様に継続した。実施例４１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃投与は血清および粘膜組織における免疫グロブリン産生を誘導するさらなるデモンストレーションにおいて、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ系のメスのマウスの群に、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型多糖混合ワクチン、すなわちＤｔと混合されたＨｉｂ（ＨｉｂＣＶ）を１次免疫として投与した。５日目に、これらのマウスのサブセットを、免疫したのと同じ部位に２μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃ を皮膚上に投与して処理した。１次応答の期間中血清試料および膣洗浄物を毎週集め、次いで、Ｄｔ特異的かつＨｉｂ特異的な定量的ＥＬＩＳＡを用いてすべての試料をＩｇＧおよびＩｇＡイソタイプに関してそれぞれアッセイした。各免免疫法についての結果を図３Ａ〜３Ｄ（Ｄｔ［すなわち蛋白成分］特異的血清抗体）；４Ａ〜４Ｄ（Ｄｔ特異的分泌性抗体）；５Ａ〜５Ｄ（Ｈｉｂ［すなわち多糖成分］特異的血清抗体）、および６Ａ〜６Ｄ（Ｈｉｂ［すなわち多糖成分］特異的分泌性抗体）に示す。図中、結果生じた抗体量（平均値±標準偏差）を図式的に示す。結果は、免疫されたマウスを免疫５日後に少量の１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃ で処理した場合、ＨｉｂＣＶの蛋白および多糖成分双方に対するＩｇＡおよびＩｇＧ応答は、血清および膣分泌物において増強されたことを示す。最も注目すべきことには、膣洗浄物において、ワクチンの多糖および蛋白部分双方に特異的な検出可能なＩｇＡおよびＩｇＧが変化した。そのうえ、ＨｉｂＣＶの多糖成分は血清におけるＩｇＡ応答を刺激し、該ＩｇＡ応答はＩｇＧ応答と同じほど強力で、分泌物におけるＩｇＧ応答よりも強力であった。かくして、ＩｇＡは、Ｈｉｂ多糖に対する抗体応答における優勢なイソタイプを示すと思われる。ＨｉｂＣＶでの１次免疫から５日後の１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の局所投与は、ワクチンの多糖および蛋白トキソイド両成分に特異的な抗体力価の著しい増強を引き起こした。さらに、ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体の力価に対する有意な評価が、ホルモン処理動物の膣分泌物において見いだされた。同様に、肺洗浄物についても同様の結果が得られた。実施例５１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃投与は血清および粘膜組織における免疫グロブリン産生を誘導するさらなるデモンストレーションにおいて、正常な成体Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ株の動物を、標準的な水酸化アルミニウムアジュバントを伴った１.５μｇのインフルエンザウイルス１価Ａ／ベイジング（ペンシルバニア州マリエッタ（Marietta）のワイエス−エイヤースト・ラブズ（Wyeth-Ayerst Labs）から得た）で皮下注射により免疫した。１次免疫の５日後、エタノール中の１〜２μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を、処理群の免疫部位の皮膚上に適用し、残りのマウス（未処理マウス）にはエタノール担体のみを与えた。その後、１週間間隔で、各動物から血清試料を集め、インフルエンザウイルス抗原に特異的なＩｇＧおよびＩｇＡ抗体のレベルをＥＬＩＳＡにより分析した。インフルエンザＡ／ベイジングウイルス抗体のＥＬＩＳＡ分析には、インフルエンザウイルス蛋白をマイクロタイタープレートの被覆に使用した以外は、ジフテリア・トキソイド抗体の定量について上記した標準的プロトコールと同じプロトコールを用いた。結果を図７Ａおよび７Ｂに示す。１次免疫後２１日目に、処理群および未処理群の何匹かの動物を屠殺し、気管中に０.７ｍｌのＰＢＳを注入することにより肺洗浄物を得、５〜７回肺に出し入れし、最終的に洗浄物をシリンジに入れた。ＥＬＩＳＡによるＩｇＧおよびＩｇＡ抗体量の定量分析の前に、遠心分離により試料を清澄化した。２次免疫（されにリンパ系器官調節剤での処理をしなかった）の１４日後に残りの動物を屠殺し、肺洗浄物を集め、同様の方法で分析した。図８Ａ〜８Ｄに示す結果は、２つの異なる粘膜コンパートメント（尿性器管および肺）における粘膜性応答を示す。実施例６１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃投与は粘膜組織における免疫グロブリン産生を誘導する１０匹の成体ＣＢＡマウスを、２５μｌアラム（alum）（２７３μｇ／ｍｌ）中の０.１μｇの不活性化インフルエンザ−Ａベイジン株で、後ろ足の甲に免疫した。この場合、０.１μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃がワクチンに含有されていた。１次免疫応答の期間中、１週間ごとに個々の試料を集めた。すべての動物に、２５μｌのアラム中の０.１μｇの不活性化インフルエンザＡ型ウイルスを後ろ足の甲に追加免疫した。１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃でのさらなる処理なしに、再度の応答が刺激された。１次および２次応答両方の期間中の粘膜分泌物中に検出された抗体の平均量を、ＩｇＡについては図Ａに、ＩｇＧについては図９Ｂに示す。それらは、粘膜組織における免疫グロブリン産生の誘導を示す。実施例７１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の局所投与は粘膜組織における免疫グロブリン産生を誘導する１０匹の成体ＣＢＡマウスを、２５μｌアラム（alum）（２７３μｇ／ｍｌ）中の０.１μｇの不活性化インフルエンザ−Ａベイジン株で、後ろ足の甲に免疫した。５日後、免疫されたマウスのうち半分に、免疫したのと同じ部位に２μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を局所投与した。１次応答の期間中、１週間ごとに個々の血清および膣洗浄試料を集めた。すべての動物に、２５μｌのアラム中の０. １μｇの不活性化インフルエンザＡ型ウイルスを後ろ足の甲に追加免疫した。１ ,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃でのさらなる処理なしに、再度の応答が刺激された。１次および２次応答両方の期間中の粘膜分泌物中に検出された抗体の平均量を、図１０および図１１に示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、ＩｇＧおよびＩｇＡ産生をそれぞれ示す。図１１Ａおよび１１Ｂは、粘膜性ＩｇＡおよびＩｇＧ産生をそれぞれ示す。実施例８局所投与される、あるいはワクチン成分としてのＤＨＥＡまたはＤＨＥＡ−Ｓは、抗体産生を増大させた２４月齢以上の性別および齢を合わせたマウスの群［（Ｃ３ＨｘＣ５７ＢＬ／６）Ｆ１］を、ｒＨＢＳＡｇ（２５μｌのアラム（２７３μｇ／ｍｌ）中１.０ μｇ）を皮下注射して免疫した。ワクチン接種３時間前に、動物に１０μｇのＤＨＥＡを局所投与した。別法として、免疫する前に、１０μｇのＤＨＥＡまたはＤＨＥＡ−Ｓをワクチン／アラム混合物に含有させた。未処理老齢マウスにＤＨＥＡを含まないエタノール担体を投与した。複数の時点において血清試料を個々のマウスから集め、上記のごとく定量的ＥＬＩＳＡにより評価してＨｂＳＡｇ特異的抗体量を決定した。平均抗体応答を図１２に示す。結果は、老齢マウスにおいて、ワクチン接種前に局所的にＤＨＥＡ（●）で、またはワクチン中に含有されたＤＨＥＡ（▲）もしくはＤＨＥＡ−Ｓ（◆）で処理した場合、血清抗体応答が増強されたことを示す。実施例９ＤＨＥＡの局所投与はワクチン接種された老齢マウスにおける血清抗体産生を増大させるこの実施例は、ワクチン接種前のＤＨＥＡの局所投与が、数種の異なる抗原に対して、老齢マウスにおける血清抗体産生を増大させることを示す。約２２〜２７月齢の老齢マウス［Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ］に、標準的なアラムアジュバント中のジフテリア・トキソイド（Ｄｔ,１.０μｇ）、破傷風トキソイド（Ｔｔ,１.０μｇ）、またはＤｔと結合されたヘモフィルス・インフルエンザｂ型混合ワクチン（５００ｎｇのＨｉｂ多糖を１.２５μｇのＤｔに化学的に結合させたもの）でのワクチン接種の３時間前に、１０μｇのＤＨＥＡを局所的に適用した。未処理老齢マウスおよび１７〜２４月齢の未処理成体マウス［Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ］に、ＤＨＥＡを含まないエタノール担体を投与した。１次応答期間中、複数の時点において血清試料を個々のマウスから集めた。精製Ｄｔ（濃度２.０μｇ／ｍｌとなるよう０.０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９.６）中に希釈）、精製Ｔｔ（濃度２μｇ／ｍｌとなるよう０.０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９.６）中に希釈）、またはＨｉｂ−メニンゴコッカス蛋白抱合体（濃度２００ｎｇ／ｍｌの多糖となるよう０.０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９.６）中に希釈）を用いて、個々の血清試料を上記のごとく低調的ＥＬＩＳＡにより評価した。２８日目における平均１次抗体応答を表１に示す。結果は、ワクチン接種前にＤＨＥＡを局所投与された老齢マウスにおいて、これらの抗原に対する血清抗体応答が増強されたことを示す。ＤＨＥＡがワクチンに含有されている場合にも同様の結果が得られる。実施例１０ワクチン中のＤＨＥＡ−Ｓの投与は老齢マウスにおける血清抗体産生を増大させる実施例９は、免疫前のＤＨＥＡの局所投与が、老齢マウスにおける血清抗体の産生を増大させたことを示すものである。本実施例は、抗原担体中のＤＨＥＡ− Ｓもまた、老齢マウスにおける血清抗体産生を増大させることを示す。２２〜２７月齢の老齢マウス［Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ］に、１０μｇのＤＨＥＡ−Ｓを含有する標準的なアラムアジュバント（２５μｌ；２７３μｇアラム／ｍｌ）中の不活性化インフルエンザ−Ａベイジング株（０.１μｇ）を接種した。未処理老齢マウスおよび１７〜２４月齢の未処理成熟成体マウス［Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ］に、ＤＨＥＡ−Ｓを含まないワクチンを投与した。１次応答の期間中複数の時点において、血清試料を個々のマウスから集めた。精製不活性化インフルエンザＡ（濃度０.１μｇ／ｍｌとなるよう０.０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９.６）中に希釈）を用いて、上記のごとく定量的ＥＬＩＳＡにより、個々の血清試料を評価した。２８日目の平均１次抗体応答を表２に示す。結果は、老齢マウスにおいて、この抗原に対する血清抗体応答が、ワクチン中に含有されたＤＨＥＡ−Ｓにより増強されたことを示す。実施例１１１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃投与は種々の抗原でのワクチン接種に対する抗体応答を増強する性別および齢を合わせたマウス［ＣＦ−１］に、アラム（２７３μｇ／ｍｌ）中の以下の抗原：クラミジア・トラコマトゥス（Chlamydia trachomatus）のペプチド（５μｇ）ヘモフィルス・インフルエンザの型分類できないもの（１.０μｇ）Ｄｔ（５００ｎｇのＨｉｂ多糖を１.２５μｇのＤｔに化学結合させたもの）に化学結合したヘモフィルス・インフルエンザｂ型混合ワクチン（５００ｎｇのＨｉｂ多糖を１.２５μｇのＤｔに化学結合させたもの）呼吸器合胞体ウイルスのペプチド（１μｇ）Ｂ型肝炎表面抗原（１μｇ）ＨＩＶｇｐ１２０（０.５μｇ）ネイセリア・ゴノラエアエ（Neisseria gonorhaeae）のピリン蛋白（１μｇ）ジフテリア・トキソイド（１μｇ）を皮下注射して免疫した。０日目において、１つの群のマウスに、２μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を同じ部位の上皮に投与した。未処理マウスに１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を含まないエタノール担体を与えた。１次応答の期間中、複数の時点において、個々のマウスから血清試料および粘膜試料（膣洗浄物試料（７５μｌの生理食塩水））を集めた。適当な抗原を用いて、個々の血清および粘膜試料を上記のごとく定量的ＥＬＩＳＡにより評価した。２８日目における平均１次抗体応答を、血清（全身または体液性）抗体について表３に、粘膜性抗体について表４に示す。結果は、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を局所的投与されたマウスにおいて、血清および粘膜性抗体の応答が増強されたことを示す。粘膜性抗体（ＩｇＧおよびＩｇＡの両方）が、さらに、涙、直腸、口腔および肺をはじめとする他の粘膜分泌物中に検出された。全トランス−レチノイン酸を１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃のかわりに使用した場合にも同様の結果が得られる。１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の局所投与のかわりに、ワクチン中０.１μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃（アラム（２５０μｇ／ｍｌ）を伴って全体積２５μｌ）を用いて、上記実施例を繰り返した。表３および４に示すのと同様の結果が得られた。実施例１２インフルエンザ特異的抗体および抗体分泌細胞の分析１７〜２４月齢の性別および齢を合わせたマウス［Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ］の群を、体積２５μｌのアラム（２７３μｇ／ｍｌ）中の０.１μｇの１価不活性化インフルエンザ−Ａウイルス（ベイジング株）で後ろ足の甲に免疫した。免疫５日後に、免疫したマウスのうち半分を、免疫したのと同じ部位に、１μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃を局所適用して処理した。免疫２１日後、それぞれ２匹のマウスの脾臓および肺をバランス塩溶液中に切り取った。デイビス，エム・ディー・ジェイ（Davis,M.D.J.）およびパーソト,ディー・エム（Parsot,D.M.）（１９８１年）ガット（Gut）第２２巻：４８１〜４８８頁の方法の変法を用いて、肺組織をさらにコラゲナーゼ中に切り取った。抗原で被覆され、ニトロセルロースで裏打ちされた９６ウェルマイクロタイタープレート上で、ビオチン化ヤギ・抗マウス重鎖特異的抗体、アビジン−アルカリホスファターゼ、およびＢＣＩＰならびにＮＢＴ基質を用いて、抗体分泌細胞の検出を行った（セドグウィック，ジェイ・ディー（Sedgwick,J.D.）およびホルト，ピー・ジー（Holt,P.G.）（１９８６年）ジャーナル・オブ・イミュノロ・メソ（J.Immunol.Meth.）第８７巻：３７〜４４頁）。１０⁶個の細胞あたりのスポット形成細胞数の平均値（±標準偏差）を表５に示す。さらに、免疫後２８日目に、涙、口腔、膣および結腸直腸の粘膜を、あらかじめ湿らせた綿スポンジ（直径１〜２ｍｍ）でこすり取った。次いで、こすり取ったものを少量（５０μｌ）の緩衝液中で濯ぎ、吸収された免疫グロブリンを放出させた。評価するまで試料を−２０℃で保存した。ヤギ・抗マウス重鎖特異的抗体を用いるマイクロドットブロット（micro dot-blot）分析を用いて免疫グロブリンを検出した。ニトロセルロースに結合した抗原（インフルエンザ）に対する各試料の反応性は、ネズミ・ＩｇＧおよびＩｇＡ標準物質の検出と同等視された。陰性の反応は、検出不可能な結合（予想値＜１０ｐｇ／ｍｌ）を与えた。陽性の検出は、＋ないし＋＋＋の範囲であり、＋は約５０〜１００ｐｇ／ｍｌの値を有し、＋＋は約２００ｐｇ／ｍｌの値を有し、＋＋＋は約５００〜１０００ｐｇ／ｍｌの値を有していた。すべての試験粘膜試料における分泌性免疫グロブリンの産生を示す表６に、この分析の結果を示す。実施例１３免疫グロブリン産生に対する１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃および全トランス−レチノイン酸の影響の比較１７〜２４月齢の性別および齢を合わせたマウスの群を、２５μｌのアラム中の１.０μｇのＨＢＳＡｇで免疫した。各群のマウスは、ワクチンのみ、０.１μ ｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃含有ワクチン、または５μｌの全トランス−レチノイン酸含有ワクチンのいずれかで免疫された。薬剤をワクチン混合物中に直接混入させた。１次応答期間中、１週間ごとに、個々の血清（全身的）試料および粘膜試料（膣洗浄物試料（７５μｌの生理食塩水））を集めた。１回の免疫から２８日後の血清および粘膜分泌物中に検出された平均抗体量を表７に示す。結果は、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃および全トランス−レチノン酸は、血清および粘膜抗体応答の双方をを増強することを示す。実施例１４ワクチン中のＤＨＥＡおよび１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の投与は、血清および粘膜性抗体応答を増強する５匹の成熟成体Ｃ３Ｈマウスからなる群を、その後ろ足の甲に、２５μｌのアラム（２７３μｇ／ｍｌ）中の０.１μｇの不活性化インフルエンザ−Ａベイジング株で免疫した。各群のマウスは、ワクチンのみ、２μｇのＤＨＥＡ含有ワクチン、０.１μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃含有ワクチン、または２μｇのＤＨＥＡおよび０.１μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の両方を含有するワクチンのいずれかで免疫した。薬剤をワクチン混合物中に直接混合した。っこの血清（全身性）試料および粘膜性試料（膣洗浄物（７５μｌの生理食塩水））を、１次応答の期間中、１週間ごとに集めた。図１３Ａおよび１３Ｂは、１回の免疫から２８日後の血清および粘膜性分泌物中に検出された平均抗体量を示す。結果は、ワクチン中のＤＨＥＡおよび１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の同時投与は、血清および粘膜性抗体応答の双方を相乗的に増強することを示す。実施例１５ワクチン中のＤＨＥＡおよび１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の投与は、血清および粘膜性抗体応答を増強する５匹の成熟成体ＣＦ１マウスからなる群に、２５μｌのアラム（２７３μｇ／ｍｌ）中の１.０μｇのｒＨＢＳＡｇで、その後ろ足の甲に免疫した。各群のマウスは、ワクチンのみ、２μｇのＤＨＥＡ含有ワクチン、０.１μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃含有ワクチン、または２μｇのＤＨＥＡおよび０.１μｇの１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の両方を含有するワクチンのいずれかで免疫した。薬剤を、ワクチン混合物に直接含有させた。１次応答の期間中、１週間間隔で個々の血清（全身性）試料および粘膜性試料（膣洗浄物（７５μｌの生理食塩水））を集めた。図１４Ａおよび１４Ｂは、１回の免疫から２１日目の血清および粘膜分泌物中に検出された抗体の平均量を示す。結果は、ワクチン中におけるＤＨＥＡおよび１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の同時投与は、血清および粘膜性抗体応答の両方を、相乗的に増強することを示す。実施例１６ワクチン中のＤＨＥＡおよび全トランス−レチノイン酸の投与は、血清および粘膜性抗体応答を増強する５匹の成熟成体ＣＦ１マウスからなる群に、２５μｌのアラム（２７３μｇ／ｍｌ）中の１.０μｇのｒＨＢＳＡｇで、その後ろ足の甲に免疫した。各群のマウスは、ワクチンのみ、５.０μｇの全ントランス−レチノイン酸含有ワクチン、または２μｇのＤＨＥＡおよび５.０μｇの全トランス−レチノイン酸の両方を含有するワクチンのいずれかで免疫した。薬剤をワクチン混合物に直接含有させた。１次応答の期間中、１週間間隔で個々の血清（全身性）試料および粘膜性試料（膣洗浄物（７５μｌの生理食塩水））を集めた。図１５Ａおよび１５Ｂは、１回の免疫から２１日目の血清および粘膜分泌物中に検出された抗体の平均量を示す。結果は、ワクチン中におけるＤＨＥＡおよび全ントランス−レチノイン酸の同時投与は、血清および粘膜性抗体応答の両方を、相乗的に増強することを示す。本発明の好ましい具体例の詳細を参照することにより、本発明は本願中に開示されているが、本開示が限定的な意味を持つのではなく、むしろ説明的なものであることを意図されていることが理解されるべきである。また、当業者にはその修飾が容易であろうが、それは本発明の精神の範囲内であり、添付した請求の範囲の範囲内であることが考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者アラネオ，バーバラ・エイアメリカ合衆国84117ユタ州、ソルト・レイク・シティ、ケンタッキー・アベニュー 2434番

Claims

【特許請求の範囲】１．対象脊椎動物における抗原特異的粘膜性免疫応答を誘導する方法であって、対象の末梢リンパ系器官またはコンパートメント（compartment）に排液している部位への有効量のリンパ系器官調節剤の投与、および対象の末梢リンパ系器官またはコンパートメントに排液している部位への有効量の特異的抗原の投与からなる方法。２．該リンパ系器官調節剤が、全トランス−レチノイン酸、レチノイン酸誘導体、レチノール、レチノール誘導体、グルココルチコイド、１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃ または生物学的に活性のあるビタミンＤ₃誘導体のうちの少なくとも１つからなる請求項１記載の方法。３．該リンパ系器官調節剤が１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃からなる請求項１記載の方法。４．該リンパ系器官調節剤が全トランス−レチノイン酸からなる請求項１記載の方法。５．該リンパ系器官調節剤が皮膚上に投与される上記請求項１〜５のいずれかに記載の方法。６．該リンパ系器官調節剤が筋肉内投与される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。７．該リンパ系器官調節剤が皮内投与される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。８．該リンパ系器官調節剤が皮下投与される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。９．該リンパ系器官調節剤の該有効量が０.０１〜５.０μｇ／ｋｇ体重である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。１０．該リンパ系器官調節剤の該有効量が０.１〜５００μｇの範囲内である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。１１．該リンパ系器官調節剤投与段階が、該特異的抗原投与段階が開始するよりも早い時点に開始する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。１２．該リンパ系器官調節剤投与段階が、該特異的抗原投与段階が開始するのとほぼ同時に開始する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。１３．該リンパ系器官調節剤投与段階が、該特異的抗原投与段階が開始するよりも遅い時点に開始する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。１４．該リンパ系器官調節剤投与段階および該特異的抗原投与段階が少なくとも部分的に同時に行われる請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。１５．該特異的抗原および該リンパ系器官調節剤が、該投与段階以前に混合される請求項１〜１０のいずれか1項記載の方法。１６．さらに有効量の免疫応答増強剤を投与することからなる、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。１７．該免疫応答増強剤が、式：［式中、Ｒ¹は＝ＯまたはＯＨ；Ｒ²はＨまたはハロゲン；Ｒ³は５位−６位の二重結合を伴ったＨ、または＝Ｏ；Ｒ⁴はＯＲ⁵；Ｒ⁵はＨ、ＳＯ₂ＯＭ、ＰＯ₂ＯＭ、脂肪酸、または式：のグルクロニド基；Ｒ⁶およびＲ⁷は同じであっても異なっていてもよく、直鎖状または分枝Ｃ₁〜₁ ₄ アルキルを意味する］を有する請求項１６記載の方法。１８．Ｒ¹が＝Ｏ、Ｒ²およびＲ³がＨ、Ｒ⁴がＯＨである請求項１７記載の方法。１９．Ｒ¹が−ＯＨ、Ｒ²およびＲ³がＨ、Ｒ⁴がＯＨである請求項１７記載の方法。２０．Ｒ¹が＝Ｏ、Ｒ²がＢｒ、Ｒ³がＨ、Ｒ⁴がＯＨである請求項１７記載の方法。２１．Ｒ¹が＝Ｏ、Ｒ²およびＲ³がＨ、Ｒ⁴がＯＳＯ₂Ｍである請求項１７記載の方法。２２．Ｒ¹が＝Ｏ、Ｒ²およびＲ³がＨ、Ｒ⁴がＯＰＯ₂Ｍである請求項１７記載の方法。２３．注射により投与される場合、免疫応答増強剤の該有効量が１０〜１０００μｇであり、経口的に投与される場合、１０〜１００ｍｇ／日である請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の方法。２４．該免疫応答増強剤が、該リンパ系器官調節剤と別個に投与される請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。２５．該免疫応答増強剤が、該リンパ系器官調節剤に先立って投与される請求項２４記載の方法。２６．該、免疫応答増強剤が、該リンパ系器官調節剤と同時に投与される請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。２７．該免疫応答増強剤が、該リンパ系器官調節剤および該抗原と別個に投与される請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。２８．該免疫応答増強剤が、該リンパ系器官調節剤および該抗原に先立って投与される請求項２７記載の方法。２９．該免疫応答増強剤が、該リンパ系器官調節剤および該抗原の後に投与される請求項１６〜２３のいずれか１項記載の方法。３０．該抗原、リンパ系器官調節剤および該免疫応答増強剤が、投与前に混合される請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。３１．請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法に従ってメスの哺乳動物を処理することからなる、メスの哺乳動物の乳分泌物中における抗原特異的抗体の産生を誘導する方法。３２．請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法に従って処理したメスの哺乳動物からの乳分泌物を乳飲み哺乳動物に消費させることからなる、乳飲み哺乳動物に特異的受動免疫を付与する方法。３３．医薬上許容される担体中の有効量のリンパ系器官調節剤および有効量の特異的抗原からなるワクチン組成物。３４．該リンパ系器官調節剤が、全トランス−レチノイン酸、レチノイン酸誘導体、レチノール、レチノール誘導体、グルココルチコイド、１,２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃または生物学的に活性のあるビタミンＤ₃誘導体のうちの少なくとも１つからなるワクチン組成物。３５．該リンパ系器官調節剤が１,２５（ＯＨ）₂Ｄ₃からなる請求項３３記載のワクチン組成物。３６．該リンパ系器官調節剤が全トランスレチノイン酸からなる請求項３３記載のワクチン組成物。３７．さらに有効量の免疫応答増強剤からなる請求項３３〜３６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。３８．該免疫応答増強剤が式：［式中、Ｒ¹は＝ＯまたはＯＨ；Ｒ²はＨまたはハロゲン；Ｒ³は５位−６位の二重結合を伴ったＨ、または＝Ｏ；Ｒ⁴はＯＲ⁵；Ｒ⁵はＨ、ＳＯ₂ＯＭ、ＰＯ₂ＯＭ、脂肪酸、または式：のグルクロニド基；Ｒ⁶およびＲ⁷は同じであっても異なっていてもよく、直鎖状または分枝Ｃ_1〜1 ₄ アルキルを意味する］を有する請求項３７記載のワクチン組成物。３９．Ｒ¹が＝Ｏ、Ｒ²およびＲ³がＨ、Ｒ⁴がＯＨである請求項３８記載の方法。４０．Ｒ¹が−ＯＨ、Ｒ²およびＲ³がＨ、Ｒ⁴がＯＨである請求項３８記載の方法。４１．Ｒ¹が＝Ｏ、Ｒ²がＢｒ、Ｒ³がＨ、Ｒ⁴がＯＨである請求項３８記載の方法。４２．Ｒ¹が＝Ｏ、Ｒ²およびＲ³がＨ、Ｒ⁴がＯＳＯ₂Ｍである請求項３８記載の方法。４３．Ｒ¹が＝Ｏ、Ｒ²およびＲ³がＨ、Ｒ⁴がＯＰＯ₂Ｍである請求項３８記載の方法。４４．該抗原が、ウイルス性または細菌性の肝炎、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、麻疹、おたふくかぜ、風疹、ポリオ、肺炎球菌、ヘルペス、呼吸器合胞体ウイルス、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型、クラミジア、水痘帯状ヘルペスウイルスまたは狂犬病に対する免疫応答を誘導しうる請求項３３〜４３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。