JPH08508637A - 酸プロテアーゼを用いた核酸の調製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、所望の核酸を分解可能な内因性ヌクレアーゼが不活性であるｐＨにまで生物学的試料を酸性化し、該生物学的試料を該ｐＨで活性な外因性酸プロテアーゼに接触させ、該試料を内因性ヌクレアーゼ活性が有意でないレベルまで減少するまでインキュベートし、該生物学的試料のｐＨを、外因性プロテアーゼを活性が低くするのに十分なｐＨまで上昇させる工程よりなることを特徴とする、生物学的試料に含まれる所望の核酸を使用可能にする方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 酸プロテアーゼを用いた核酸の調製発明の分野 本発明は病気の診断及び他の目的のための核酸ハイブリダイゼーション分析、 およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）または他の標的増幅手段による核酸の増幅 のごとき様々な目的に用いることができる核酸を作るための生物学的な試料を処 理する方法に関する。具体的には、本発明は生物学的試料内に存在する内因性の ヌクレアーゼによる核酸の分解を予防することを可能にする、核酸を作るための 簡便な方法に関する。発明の背景 多くの診断方法が生物学的試料内に存在する特異的な核酸（ＤＮＡまたはＲＮ Ａ）配列の検出に基づいている。例えば、該試料は細菌、その他その存在が感染 症の原因を決定するために確認されるべき微生物を含有するであろう。他の例で は、癌または遺伝子病に関連した変異の存在を確立するために、核酸配列がヒト の白血球中に求められる。 このような診断分析のためには、試料中に存在するであろう入手可能で特異的 な核酸を作ることが必要である。しばしば、核酸は細菌、カビ、ウイルス、また は他の微生物、あるいは白血球のごときヒトの細胞中に含まれているであろう。 核酸は、さらに、リボゾーム、プラスミド、またはクロモゾーマルＤＮＡのごと き他の構造内に含まれるであろう。ハイブリダイゼーション反応を行って特異的 な核酸を検出するためあるいはそれらをＰＣＲまたは他の標的増幅方法を用いて 増幅するためには、核酸はこれらの生物および／または構造から放出されなけれ ばならない。 不運なことに、このような放出は核酸を試料中に存在する内因性のヌクレアー ゼによる分解にさらし、該ヌクレアーゼはそのように多量に存在するであろうか ら、核酸はほとんど瞬間に破壊される。 この問題は、具体的な核酸がＲＮＡである場合には特に深刻である。というの は、ＲＮａｓｅはほとんどの生物学的試料内に豊富にあり、しばしば多くの他の 酵素を容易に不活性化する処置に対して非常に耐性だからである。 この問題を取り扱うために、生物学的試料から核酸を精製する様々な手段を用 いることは当業者にとって普通である。例えば、グアニジニウム塩のごときアニ オン界面活性剤およびカオトロピック薬剤は、ヌクレアーゼ活性を不活性化また は阻害し、また核酸を細胞内から、および細胞下構造から放出させるのに用いら れてきた。不運にも、これらの薬剤は標的増幅過程においてまたは多くのハイブ リダイゼーション検出法において用いられる酵素の潜在的な阻害剤であり、ある いはカオトロープの場合においては、ハイブリダイゼーション自体を妨げる。そ れゆえ、これらの薬剤を除去し核酸を回収するのに付加的な工程が必要であった 。 最も頻繁に用いられる方法は様々な塩およびエタノールを用いて核酸を試料か ら沈澱させることである。多くの場合において核酸の高い収率を達成するために は試料を低い温度（通常−２０℃またはそれ以下）でかなりの時間保ち、高速で 遠心しなければならない。 他の巨大分子もこれらの条件下で沈澱し、核酸を捕捉する粘着性で御しにくい 塊を生じるので、エタノール沈澱前にフェノール、クレゾール、および／または クロロホルムを含有する有害な有機溶媒によって試料を抽出する手段に訴える必 要がしばしばあった。アニオン界面活性剤が使用されるいくつかの場合において 、プロテイナーゼＫ（proteinase K）またはプロナーゼ（pronase）のごときこ れらの界面活性剤の存在下で活性であるプロテアーゼが、試料の蛋白質成分を部 分的に分解して有機溶媒抽出中の捕捉を最低限にするか、および／または該溶媒 処理では抽出できないであろう成分を分解するために使用される。 これらの方法は複雑で、長くて退屈で、また遅いことは容易に認識されるであ ろう。この方法を行う際に非常な注意を払わないならば、ヌクレアーゼによる残 渣のコンタミネーションが起こり兼ねず、試料の核酸は分解するか失われるであ ろう。このような試料で行われる診断テストは誤った陰性の結果を与えるであろ う。残存するアニオン界面活性剤、カオトロピック塩、またはエタノールが試料 中に依然存在し、ハイブリダーゼションおよび／または標的増幅手段を阻害した 場合にも、誤った陰性の結果が得られるであろう。もしアニオン界面活性剤およ びプロテアーゼを用いるならば、残存する蛋白質分解活性により、標的増幅およ び／またはハイブリダイゼーション検出反応で用いられる酵素をやはり分解し、 誤った陰性の結果を与えるであろう。他方で、これらの方法での不適当な処理も 、変性した蛋白質または他の巨大分子の単離に帰し、これらは標識されたプロー ブを捕捉し、核酸ハイブリダイゼーションを含む診断テストにおいて誤った陽性 の結果を招くであろう。従って、これらの方法はいかなる量の臨床的実験室で受 け取られる生物学的試料の日常の処置にも十分には適さない。 特に、望む核酸の種類がＲＮＡである場合において多くの生物学的試料でトラ ブルに出くわし、試料はかなりの量の「膵臓の（pancreatic）」型のＲＮａｓｅ （しばしば「リボヌクレアーゼＡ（ribonuclease A）」とも呼ばれる）を含む。 膵臓ヌクレアーゼは血清、血漿、および体の多くの組織に存在する。これらは熱 および酸による変性に耐性であり、１Ｎ塩酸中で１０分間沸騰した場合さえも活 性の損失がなく耐える。これらはアニオン界面活性剤、カオトロープ、およびフ ェノールのごとき有機溶媒により阻害されるが、これらの薬剤によって不可逆的 に不活化されることはなく；従って、界面活性剤、カオトロープ、または溶媒が 除去されれば、（もし注意深い抽出により除去されていなければ）ＲＮａｓｅは 望むＲＮＡの分解を進行するであろう。 強いアルカリへの暴露は不可逆的にこれらのＲＮａｓｅを不活化する；しかし ながら、このような条件はＲＮＡ自体の分解という結果を招く。 本発明は、ハイブリダイゼーション分析、標的増幅手段、または他の使用のた めに使用できる試料核酸を作りつつ、生物学的試料中のヌクレアーゼを簡便に阻 害し不活化するための方法を供給することによりこの問題を扱う。阻害的な界面 活性剤またはカオトロープは試料内に要求されず、残存するタンパク質分解活性 はない。該方法は単純で、同時に多数の試料を処理するのに適用できる。エタノ ール沈澱法と異なり、危害な有機溶媒を使用せず、また試料を冷却するあるいは 遠心によって沈澱を回収するための装置も必要としない。発明の要約 本発明は、試料中に存在する内因性ヌクレアーゼが活性であるｐＨより下にｐ Ｈを下げ、そのｐＨで活性であって低いｐＨへの暴露によって不可逆的に不活化 されなかったいずれのヌクレアーゼをも分解するプロテアーゼを添加し、次いで ｐＨを上げることによってプロテアーゼを（その働きを終えた後に）不活化する ことにより生物試料中の内因性ヌクレアーゼを不可逆的に不活化する方法をその 要旨とする。高いｐＨにおいて、選択されたプロテアーゼは不活性であるか不可 逆的に不活化される。もし可能ならば、該プロテアーゼは、試料の意図された使 用を妨げる試料中の他の巨大分子の消化の助けとなるように選択され、望む核酸 を含む微生物の細胞壁、ウイルス粒子、リボゾーム、および／または他の構造を 分解することによって望む核酸を使用可能にする助けになるように選択される。 他の方法として、一度試料ヌクレアーゼ活性が効率的に制御され、減少され、ま たは除去されれば、これらの構造の可溶化および核酸の放出は界面活性剤、熱、 または他の方法によって行うことができる。 一般的に、生物学的試料は、内因性ヌクレアーゼが不可逆的に不活化されるか 効率的に阻害される低いｐＨに調整される。ペプシンのごとき外部の酸プロテア ーゼを次いで添加するか、あるいはｐＨを低下させる溶液と同時に添加してもよ い。酸プロテアーゼの作用は、試料中に存在する内因性ヌクレアーゼを消化し、 ｐＨが引き続いて上昇した場合に試料である核酸を分解しないようにそれらを不 可逆的に不活化する。加えて、プロテアーゼは核酸を微生物、ヒト細胞、または リボゾームまたは核のごとき細胞下成分から放出するように通常は作用するであ ろう。それはまた、ハイブリダイゼーション分析および／または標的増幅法のた めの試料の引き続いての使用を妨げるものを含めた、生物学的試料中の多くの蛋 白質成分を分解するであろう。 選択された酸プロテアーゼは酸性ｐＨ、ｐＨ１.０ないしｐＨ４.０において活 性を有し、他の望まない成分と同様試料中に見い出されるヌクレアーゼを含めた 広い範囲の蛋白質を消化できなければならない。加えて、理想的には、所望の核 酸を含む成分を消化することができるべきである。いくつかの場合において、（ 試料中のその存在が遊離型である核酸は望ましくない）核酸がその成分構造か ら遊離されないように、より限定された特異性のプロテアーゼを選択することが 望ましいであろう。 また、酸プロテアーゼそれ自体も、選択された酸性ｐＨにおいて活性であるか または選択された酸性プロテアーゼによる分解または不活化に耐性であるヌクレ アーゼ活性を有さないかどうかを確実にするためチェックしなければならない。 酸プロテアーゼの商業的調製物はこのような酵素が混入しており、もし必要な らば、それらを除去するために精製しなければならない。以下の実施例において 、ペプシン消化では除去できない残存ＲＮａｓｅ活性を除去するための商業的に 入手可能なペプシン調製物を精製するための方法を挙げる。同等の方法を他のプ ロテアーゼに対して使用することができる。 プロテアーゼはｐＨを上昇させる単純な行動によって不活化される。幾つかの 酸プロテアーゼについては、これは、完全にさらなる蛋白質分解消化を停止させ るのに十分であり、酵素を不可逆的に変性または不活化する。他のプロテアーゼ については、試料を加熱してプロテアーゼの完全不活化を達成する手段に訴える 必要があるかもしれない。中性ｐＨにおける熱への短時間の暴露によりヌクレア ーゼは破壊され、かつ核酸は損傷を受けないので、核酸はこの方法を無傷で生き 残るであろう。 従って、本発明はｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸を抽出するための単純な方法を提供 する。この方法は、Ｃ型肝炎ウイルスのごときウイルスを含有するものを含めた 多くの生物学的な試料を処理するために用いることができるが、それは開きにく いＲＮＡ含有ウイルスであるので特有の困難を生じ、試料はかなりの量の膵臓型 ＲＮａｓｅ活性を有する血清または血漿であり、ウイルスはしばしば非常に少量 しか存在しないので、エタノール沈澱技術による核酸の回収を困難としている。 従って、第一の態様において、本発明は、（所望の核酸を分解可能な）内因性 ヌクレアーゼの活性が低いｐＨ、例えば、１.０から４.０の間のｐＨに生物学的 試料を酸性化し；該生物学的試料をそのｐＨで活性な外因性の酸プロテアーゼに 接触させ；試料を、内因性のヌクレアーゼが有意でないレベル（試料中の核酸の レベルに対する影響が有意でないレベル、例えば、標準の塩溶液中で３７℃にお いて６０分にわたり５％より少ない核酸が分解されるレベル）にまで分解される までインキュベートし；生物学的試料のｐＨを、塩基で、外因性のプロテアーゼ がもはや活性でないようにするのに十分なｐＨ、例えば、プロテアーゼがもはや 活性でないｐＨまで上昇させることによって、生物学的試料から核酸を精製する かまたは使用可能にするための方法をその要旨とする。 「使用可能にする」とは、核酸がハイブリダイゼーションまたは増幅のごとき 後の分析に利用できることを意味する。 「活性が低い」とは、内因性ヌクレアーゼに関して、（同じ条件下で）治療前 よりもヌクレアーゼ活性が低いことを意味する。「活性が低い」とは、外因性プ ロテアーゼに関して、治療前よりもプロテアーゼ活性が低いことを意味する。好 ましくは、低い外因性プロテアーゼ活性は、単離した核酸を含む後の過程で用い られる酵素の活性を引き下げるのには不十分である。 「分解された」とは、ヌクレアーゼの活性が、単離した核酸の後の実験または 操作を可能にするレベルにまで減少することを意味する。 「所望の核酸」とは、本発明により恐らくは他の核酸と共に得られる核酸を意 味し、その後具体的に同定することができる。 好ましい具体例において、生物学的試料は組織細胞、血液成分、および感染病 薬剤を含有していてもよい他のヒトの生物学的物質から選択され；生物学的試料 はヒト白血球、ガン細胞、または他の細胞であって遺伝的分析のためのヒトの細 胞核酸の簡便な源を提供するもの、体液、分泌物、もしくは組織からなり；「酸 プロテアーゼ」はペプシンであり；インキュベーションの後の試料のｐＨは、外 因性プロテアーゼの存在下では好ましくはｐＨ４またはそれ以下であるが、次の 使用に適したレベルまで引き上げられるが、外因性プロテアーゼが完全に阻害さ れるか不活化されるレベルよりは下であり；酸性化工程においてｐＨは１.０な いし４.０に調整され；該上昇させる工程においてｐＨは６.０より大きくなるよ う調整され；上昇させる工程に続いて試料を加熱して試料中に存在する酸性プロ テアーゼおよび／または他の酵素活性の不活化を助け；界面活性剤を試料に添加 して他の試料成分からの所望の核酸の放出を助け；インキュベーションの時間は 、 試料成分の溶解および／または他の試料成分の分解を成し遂げるように、有意で ないレベルにまで外因性ヌクレアーゼレベルを減少させるのに必要な時間よりは 長い。 関連する態様において、本発明は、本発明の方法を実施するのに必要な成分を 含有するキット、およびこの方法で使用するＲＮａｓｅからペプシンを精製する 方法をその要旨とする。このような精製はマカロイド（Macaloid）またはベント ナイトのごとき、プロテアーゼは吸着しないＲＮａｓｅ吸着剤を使用する。マカ ロイドはその表面にＲＮａｓｅを吸着する特性を有する天然の粘土鉱物産物であ る。ベントナイトは、主にモンモリロナイトからなるコロイド状の天然の水和し たケイ酸アルミニウムの粘土である類似の物質である。両方とも様々な生物学的 物質からＲＮａｓｅを除去するためにしばしば交換可能に用いられる。他のより 多いまたはより少ない特異的な吸着剤が使用される。但し、ＲＮａｓｅは吸着す るが所望のプロテアーゼは吸着しないものとする。好ましい具体例の記述 本発明は、核酸の分解が最小化される酸性条件下で様々な型の生物学的試料か ら核酸を単離する方法を提供する。この過程は内因性ヌクレアーゼによる核酸の 有意な分解の危険がある場合に試料から核酸を獲得するために特に有用である。 この方法により単離し得る核酸は天然に生じた核酸および合成核酸またはオリゴ ヌクレオチドを含む。 単離すべき核酸を含有する生物学的試料は組織細胞、血液成分、ウイルス、微 生物、病原生物、およびこれらの様々な生物を含む体液を含む。 本発明の方法の最初の工程は、所望の核酸を含む生物学的試料の酸性度のｐＨ ４またはそれより下への調整である。このｐＨにおいて、生物学的試料中に存在 し得るヌクレアーゼは活性でない。酸性条件で緩衝能を有するＫＣｌ−ＨＣｌ緩 衝液、グリシン−ＨＣｌ緩衝液、酢酸緩衝液および様々な他の酸性緩衝液組成物 を、試料のｐＨを引き下げるために使用できる。臨床的試料に存する内因性ヌク レアーゼは十分な酸性のｐＨでは作用しない（即ち、無視できる酵素活性しか有 しない）。というのは、このｐＨはその最適な範囲よりずっと下だからである。 例えば、血清ＲＮａｓｅはその最適ｐＨが約６.５である。それはｐＨ３.０また はそれより下ではほんど活性がない。白血球ＲＮａｓｅは６.０ないし６.５の範 囲の最適ｐＨ範囲を有し、ｐＨ４.０またはそれより下では実質的には酵素活性 を有しない。従って、該混合物のｐＨ４またはそれ以下への酸性度の調整はほと んど公知の内因性ＲＮａｓｅの作用を妨げるであろう。 同様に、血清デオキシリボヌクレアーゼ活性は約５.８ないし７.０においてそ の最適ｐＨを持つが、これは存在する二価の金属の型に依存する。それは、存在 する金属イオンにかかわらず、ｐＨ５.０より下でほとんど活性を有さない。白 血球ＤＮＡｓｅは約４.０ないし５.０の間で最適ｐＨを有し、ｐＨ３.０以下で は実質的には不活性である。臨床試料で見い出されるヌクレアーゼの正確なｐＨ 範囲は、ｐＨを調製するのに用いる緩衝液の種類、金属イオン要求性、および、 もしあるならば温度のような変数に依存するであろう。 本発明の使用のために、当業者は興味のある１またはそれ以上の核酸を分解す る活性をどうやって分析するかを知り、具体的な試料の型に必要な適当なｐＨ、 緩衝液、および温度を容易に決定できる。特に、ＤＮＡを回収することが望まれ る場合は、温度を低くし暴露の時間を最小化することが重要であろう。というの は、ＤＮＡの脱プリンはより高い温度およびより長い温度を用いれば、低いｐＨ で起こり得るからである。しかしながら、いくらかのＤＮＡの脱プリンおよび鎖 の破損が起こり得ることは本発明の重要な特徴であって、いくつかの生物学的試 料（例えば、白血球細胞ペレット）が溶解した場合に産生されるＤＮＡのゼラチ ン状の固まりを破壊するのに役立つ点で有用である。従って、本発明は該方法の 添加された利益としてこの付加的な試料処理問題を扱うことが可能である。 次の工程（もし望めば、最初の工程と同時に、またはその前においてさえも行 える）は、酸性化された生物学的試料への酸プロテアーゼの添加である。反応混 合物中の内因性ヌクレアーゼを消化しこのプロテアーゼによって不可逆的に不活 化する。この工程において、所望の核酸は、生物学的成分、例えば、細胞膜が酸 性プロテアーゼによってまた消化される場合に、生物学的試料から水溶液中に放 出させることができる。ペプシンは、この工程で使用可能な酸性プロテアーゼの 一例である。他のプロテアーゼも、生物学的試料に存在する望まないヌクレアー ゼ活性を不活化する酸性条件下で酵素活性を保持する限り使用可能である。この ようなプロテアーゼは標準的な方法を用いて当業者によって容易に確認される。 上記に記載される工程によって放出される核酸は安定である。なぜならば、（ アルカリの添加によって酸プロテアーゼを不活化した溶液の中和の後さえも）水 溶液がもはや活性なヌクレアーゼを含まないからである。このような中和は次の 酵素反応、例えば、ＰＣＲ、ｃＤＮＡ重合法のごとき核酸増幅方法に適する生理 的条件を供給する。それゆえ、中和した溶液はさらなる処理、例えば、強いアニ オン界面活性剤または他の苛酷な薬剤であって、引き続いての次の過程において 用いられる酵素の活性に影響し得るものを除去することなく直接この方法に使用 してもよい。 本発明は他の核酸単離法よりも非常な利点を供給する。というのは、グアニジ ンイソチオシアナートまたは（他の方法で用いられる）他の変性剤を除去する過 程が必要でないからである。外因性酸プロテアーゼは内因性ヌクレアーゼを不可 逆的に不活化し、一工程で生物学的試料から核酸を放出させる。この方法は、遺 伝的診断のために生物学的試料から核酸を単離するのに容易かつ簡便に用いるこ とができ、従って臨床の実験室において有用である。 以下の実施例は本発明の様々な態様を例示するために記載するが、より具体的 に請求項で表される態様を決して限定しない。実施例１：低ｐＨにおけるヒト血清ＲＮａｓｅの阻害 ヒトの血液試料を健康な志願者から採取した。血液を室温（約２０℃）で放置 し凝固させた。血餅を低速遠心で除去した。得られた血清をヒト血清ＲＮａｓｅ の源として用いた。 血清ＲＮａｓｅ活性を以下の方法で研究した。終濃度が５０ｍＭとなるように ＫＣｌを５マイクロリットルの血清に添加した。ＨＣｌを終濃度が２０ｍＭから ９７ｍＭの範囲になるように添加した。ＲＮＡをＲＮａｓｅ基質として添加した 。容量を１０マイクロリットルに調整した。溶液の酸性度は、溶液に含まれるＨ Ｃｌの量に応じてｐＨ１.５からｐＨ５.０の間で変化した。溶液を３７℃にお いて２０分間インキュベートし、血清ＲＮａｓｅによってＲＮＡを分解させた。 残存するＲＮＡの量をアーノルド（Arno1d）によってＥＰ３０９２３０に記載 されたごとく化学発光的に標識したプローブによるハイブリダイゼーション分析 により決定した。手短かに言えば、反応混合物を、反応を完結させる際に９５℃ における加熱によって変性させた。（上記の混合物中のＲＮＡに相補的な）化学 発光標識プローブを含む溶液を添加し、得られた混合物を６０℃にて２０分間イ ンキュベートした。試薬を添加してハイブリダイズしなかったプローブの化学発 光標識を選択的に不活化し、６０℃で４分間インキュベートした。室温まで冷却 した後、ハイブリダイズしたプローブの化学発光をルミノメーター（luminomete r）を用いて相対的光単位（ＲＬＵ）で測定した。 反応溶液に添加したＲＮＡの約５０％をｐＨ４.０での処理後回収した。添加 したＲＮＡの１００％がｐＨ３.５またはそれ以下で回収された。血清のＲＮａ ｓｅ活性は約ｐＨ４.０またはそれより下でかなり低下し、その酵素活性はｐＨ ３.５またはそれより下で完全に失われた。これらの結果を表１に示す。 実施例２：ヒト白血球ＲＮａｓｅ 健康な志願者の血液をサポニンで処理して赤血球を溶解した。白血球を低速遠 心で収集した。白血球を次いで生理的食塩水で洗浄し、トリトン Ｘ−１００ Triton X-100）を含む緩衝液中に溶解した。得られた溶液をヒト白血球ＲＮａｓ ｅ溶液として用いた。 ヒト白血球ＲＮａｓｅのｐＨ依存度を、次いで、実施例１と類似の方法で実験 した。手短かに言えば、ＲＮａｓｅ溶液を１２.２５ｍＭ ＮａＣｌと１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂とを含むｐＨ４.０の酢酸カリウム緩衝液に添加した。ＲＮＡを溶液 に添加し、全体の体積を１０マイクロリットルに合わせた。反応溶液を３７℃で ２０分間インキュベートしてヒト白血球ＲＮａｓｅでＲＮＡを消化した。反応を 完結する際に、残存するＲＮＡの量を、実施例１に記載した標識プローブハイブ リダイゼーションによって測定した。 対照として、反応混合物を調製するために酢酸カリウム緩衝液の代わりに３０ ｍｌのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.７）を用いた。５マイクロリットルの血 液から調製したヒト白血球ＲＮａｓｅ溶液を添加し、上記記載の方法と類似の反 応方法を行った。ｐＨ７.７に緩衝化した反応混合物中で、添加されたＲＮＡは 、これらの条件下で５マィクロリットルのヒト血液から得られた白血球ＲＮａｓ ｅによって消化されて検出不能なレベルになった。対照的に、ｐＨ４.０におい て反応混合物に１００マイクロリットルの血液由来のヒト白血球ＲＮａｓｅ溶液 を添加した場合に、もとのＲＮａｓｅの約８５％が回収された。従って、ヒト白 血球ＲＮａｓｅ活性はｐＨ４.０において実質的に減少した。二組の試験の結果 を表２に示す。 実施例３：添加したＲＮＡの回収 健康な志願者からの血清を常法によって単離した。５マイクロリットルの血清 に対し、ＫＣｌ、ＮａＣｌおよびＭｇＣｌ₂をそれぞれ終濃度が５０ｍＭ、８６ ｍＭ、１０ｍＭおよび２５ｍＭとなるように添加した。溶液の酸性度をｐＨ２. ５から１.０に調整して混合物中のＲＮａｓｅを不活化した。ＲＮＡを基質とし て添加し、水で１０マイクロリットルとした。ペプシンを次いで最終的に量が２ .５ないし２００単位となるように添加した。この混合物を３７℃にて５分間イ ンキュベートした。反応の完結の際に、トリス塩基を反応混合物に終濃度５０ｍ Ｍとなるように添加し、混合物の体積を２０マイクロリットルとした。この塩基 は混合物の酸性度を中和しｐＨを約７.０に調整した。この混合物を３７℃でさ らに２０分間インキュベートした。反応の完結の際に、混合物中に残存するＲＮ Ａを９５℃で加熱することにより変性し、標識したプローブ（上記混合物中のＲ ＮＡに相補的）を添加した。混合物を６０℃で２０分間インキュベーションし上 記で示されるようにいかなる残存するＲＮＡをも分析した。 １００％の外因性ＲＮＡが２.５ュニットまたはそれ以上のペプシン存在下こ れらの条件で回収された。この実施例は血清ＲＮａｓｅがペプシンによって不可 逆的に不活化され、反応混合物の中の外因性ＲＮＡを血清ヌクレアーゼによって 影響を受けずに回収できることを示す。これらの結果を表３に示す。 実施例４：ＨＣＶ試験試料 本発明の方法を、Ｃ型肝炎ウイルスを含む試料血清を用いて評価した。用いた 試料血清はＣ型肝炎ウイルスに感染した患者から得られ、商業的なＣ型肝炎抗体 検出キットにより陽性であることを確認した。 内因性血清ＲＮａｓｅによる分解のないＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの回収を確認 するためには、かかる試料に存在する痕跡量のＲＮＡを試料からの抽出後に増幅 しなければならない。この実施例では、ＲＮＡ標的を、逆転写酵素を用いて核酸 を増幅する方法によってＤＮＡ標的を作るために使用する。得られたＤＮＡ産物 を、次いで、ＰＣＲ法により二度増幅した。ランダムプライマーを逆転写反応に 用い、２つのプラィマーを各ＰＣＲ法に用いた。この方法を以下に詳細に説明す る。 ５マイクロリットルのＨＣＶ陽性血清を採取し、５マイクロリットルのＨＣｌ 緩衝液（８６ｍＭ ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および ２５ｍＭ ＮａＣｌ）を添加した。２５ユニットのペプシン（マカロイドで処理 した）を次いで添加した。混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。ＨＣ Ｖ試料を、５μｌの１７２ｍＭ ＫＯＨの添加によりｐＨ７.０まで中和した。 混合物を９５℃で２分間加熱し、室温（約２０℃）まで冷却し、０.５マイクロ グラム（２５０ｐｍｏｌ）のランダムプライマー（Ｔａｋａｒａ（タカラ）、日 本）、１３.３ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８.３）、０．７ｍＭ ＭｇＣｌ₂、お よび各０.２７ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ（ファル マシア（Pharmacia））を含む反応プレミックス（premix）７５μｌを次いで添 加し、全体の容量を９０マイクロリットルにした。混合物を６５℃で５分加熱し 、室温まで冷却した。２００ユニット／μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ）を 含有する１μｌを反応混合物に添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベー トした。ＰＣＲ反応をマリス（Mullis）の、米国特許出願第４,６８３,１９５号 で明示する条件に従い行った。手短に言えば、逆転写反応を完結する際に、ＨＣ ＶのＮＳ５領域に対応する１００ｐｍｏｌの２つのプライマーを添加した。２. ５ユニットのタック（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼを添加し、全体の容量を１０ ０ μｌとした。反応産物を９２℃で２分加熱することにより変性した。加熱と冷却 の循環を４０回繰り返した。（各循環は９２℃で１.５分の加熱、５３℃で１.５ 分の加熱、および７０℃で２分の加熱を含む）。得られた混合物を次いで７０℃ で９分インキュベートした。 混合物のうち１０μｌを、次いで、第一のＰＣＲ反応で用いられた第一の一組 のプライマーの内部の位置にハイブリダイズするよう設計された第二の一組のプ ライマーと混合した。（これらの実施例で用いた現実のプライマーは本発明には 必須でない。）混合物の容量を１００マイクロリットルとし、第二のＰＣＲ反応 を、第一のＰＣＲ反応で用いたのと同じ条件で行った。（具体的には、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.３、１００ｐｍｏｌ プライマー、１．５ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、０.２ｍＭ 各ｄＮＴＰ、および２.５ユニットのタ ック（Ｔａｑ）ポリメラーゼを使用した。） これらの増幅から得られた核酸を９５℃で５分加熱することにより変性した。 ９０μｌの標識したプローブを、実施例１で記載した方法を用いて核酸の分析の ために添加した。結果を表４に示す。 これらのデータは、ＨＣＶ陽性血清のシグナルの強度が、健康な血清のそれよ りも８から１５倍大きいことを示す。従って、ＨＣＶ ＲＮＡは内因性ＲＮａｓ ｅにより影響を受けずにこの方法により遊離された。本実施例はまた、本発明の 方法により単離されたＲＮＡは、さらに他の精製または単離過程を経ずに酵素反 応の基質として用いることができることも示す。従って、本発明の方法は、これ ら 自体で、または他の増幅方法と組み合わせて、診断テストで特異的な核酸を検出 するのに広く用いることができることが期待される。実施例５：ＨＣＶ試験試料。ＰＣＲ増幅無し 以下はＨＣＶ試料中の核酸の検出のためのもう一つのプロトコールである。緩 衝液（ＫＣｌ／ＨＣｌまたはグリシン／ＨＣｌ）中の５μｌのペプシン溶液を適 当な試験管に入れた（ペプシンはシグマ（Sigma）から得た）。ＫＣｌ／ＨＣｌ 緩衝液のためのペプシン溶液は１００ｍＭ ＫＣｌ−１７２ｍＭ ＨＣｌ中に２ ５Ｕのペプシンを含み；グリシン／ＨＣｌ緩衝液のためには４０ＯｍＭ グリシ ン−４００ｍＭ ＨＣｌ中に２５Ｕのペプシンを含む。 ５μｌの血清試料（健康またはＨＣＶに感染した患者のもの）をこれらの試験 管に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。 １０μｌの中和溶液を添加した（ＫＣｌ／ＨＣｌ緩衝液のためには中和溶液は １７２ｍＭ ＫＯＨ−１２８ｍＭ ＫＣｌ；そしてグリシン／ＨＣｌ緩衝液のた めには２００ｍＭ ＫＯＨ）。試料を次いで実質的にはカシアンおよびフルツ（ Kacian and Fultz）の、転写複合体を使用した核酸配列増幅方法（NUCLEIC ACID SEQUENCE AMPLIFICATION METHODS UTILIZING A TRANSCRIPTION COMPLEX）、Ｐ ＣＴ／ＵＳ９０／０３９０７に記載されたように増幅した。この混合物を３７℃ で４時間インキュベートし、１０μｌの増幅した試料を、ＡＥ−ＣＰ−６２７８ プローブ（ＮＳ５領域）を使用してＨＰＡに付した。結果を表５に示す。 これらの結果は、ＨＣＶが、本発明と組み合わせたＰＣＲ増幅無しの系を用い て検出可能なことを示す。実施例６：マカロイド（Maca1oid）によるペプシン精製方法 以下は潜在的に有害な酵素活性を有しないペプシンの調製方法である。 Ａ． マカロイド懸濁液の原液の調製（１６ｍｇ／ｍｌ）：（この方法はモレキ ュラー・クローニング第一版（Molecu1ar Cloning lst Edition）（マニアティ ス（Maniatis）ら、１９８２、ｐ４５２）に記載された方法と同じである）。 １． ０.２５ｇのマカロイドを量る。 ２． ０.２５ｇのマカロイドを２５ｍｌの５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、 ｐＨ７.５に懸濁する。 ３． 常に攪拌しながら懸濁液を１００℃で５分沸騰させる。 ４． マカロイド懸濁液を４℃にて２５００×ｇで遠心する。 ５． 上清を捨てる。 ６． 沈澱を２０ｍｌの５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５に再懸濁 する。 ７． マカロイド懸濁液を４℃にて２５００×ｇで遠心する。 ８． ５から７までの方法（洗浄方法）をさらに４回繰り返す。 ９． 粘着性のペレットを１５ｍｌの５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７ .５に再懸濁する。 １０．マカロイド溶液を４℃ないし−２０℃に保存する。 Ｂ． ペプシン中に混入したＲＮａｓｅの吸着のための実際に役立つマカロイド 懸濁液の調製： ペプシンは中性ｐＨで容易に不活化される。従って、マカロイドを懸濁さ せる緩衝液は、ペプシン調製での使用の際に酸性ｐＨの緩衝液で置換する必要が ある。 １． ５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ中のマカロイド懸濁液をエッペンドルフ （EPPEND0RF）試験管に入れる。 ２． マカロイド懸濁液を微量高速遠心機で５０００ｒｐｍ遠心する（５ 分）。 ３． 上清を捨てる。 ４． １５０ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５ .２を添加する。 ５． マカロイド懸濁液を数時間４℃で放置する。 ６． 試験管を微量高速遠心機で５０００ｒｐｍで遠心する（５分）。 ７． 上清を捨てる。 ８． マカロイド懸濁液のｐＨが５.５より下になるまで４から７までの 方法を繰り返す（一般的には、これには緩衝液の４回または５回の置換を有する ）。 ９． マカロイドを１５０ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩 衝液、ｐＨ５.２に再懸濁する（最初の体積と同じ体積）。 Ｃ． マカロイドによるペプシン中に混入したＲＮａｓｅの吸着： １． ペプシン（シグマ（Sigma）カタログ番号６８８７）を１０ｍＭ ＨＣｌ−５０％ グリセロール中に３４５Ｕ／μｌになるよう溶解する。 ２． １５０μｌのペプシンをエッペンドルフ（EPPENDORF）試験管に入 れる。 ３． １５０ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５ .２中の５０μｌのマカロイド懸濁液を添加し混合する。 ４． 試験管を氷水中に２分放置する。 ５． 試験管を４℃にて１０分微量高速遠心機で７５００ｒｐｍで遠心す る。 ６． １５０μｌの上清をもう一本の試験管に移す（上清のｐＨは約４. ５である）。 ７． 工程３のマカロイド懸濁液５０μｌを再び添加し混合する。 ８． 試験管を４℃で１５分保つ。 ９． 試験管を４℃、１０分、微量高速遠心機で７５００ｒｐｍで遠心す る。 １０．１５０μｌの上清をもう一本の試験管に移す（上清のｐＨは約４. ５である）。 １１．工程３のマカロイド懸濁液５０μｌを添加し混合する。 １２．試験管を４℃で１５分放置する。 １３．試験管を微量高速遠心機で７５００ｐｍで遠心する（１０分）。 １４．上清をもう一本の試験管に移し−２０℃に保つ（上清のｐＨは４. ５−５.０（４.５に近い））。 Ｄ． ペプシン活性の分析： マカロイドへの吸収方法の後のペプシン活性を、各吸収段階の後の標準的 な方法により試験した。結果を表６に示す。 吸着後のペプシン活性をペプシン原液から描いた標準的な曲線を用いて計算し た。 このデータはペプシン活性がマカロイド吸着方法により影響されなかったこと を示す。 Ｅ． ペプシン中における混入したＲＮａｓｅ活性の分析： ペプシン中に混入したＲＮａｓｅの活性は、アクリジニウムエステルで標 識したＤＮＡプローブがＲＮＡ基質にハイブリダイズする能力の損失をモニター することにより測定した。用いられたＲＮＡは、クラミジア・トラコーマティス （Chlamydia trachomatis）のリボゾームＲＮＡの部分に見い出される配列のin vitroで合成された転写物であった。ペプシン溶液の原液（吸収無し）および３ 度の吸着後のペプシン調製物の両方における混在するＲＮａｓｅの活性を試験し た。 反応は、各反応試験管が、ＤＮＡプローブとアニールした場合に、ＲＮａｓｅ 、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２５ｍＭ ＮａＣｌ、および２％グリセロールの不存在下で４０，０００の相対的光単位（ ＲＬＵ）シグナルを産生するＲＮＡ転写物の量を含むように整えられた。０Ｕ、 ３４５Ｕまたは６９０ユニット当量のペプシン調製物を添加した。全体の容量は ２０μｌであった。ペプシンのマカロイド処理後、無視出来るまたは検出不可能 な量のＲＮａｓｅ活性が検出できた。 本明細書中に引用される本開示および特許出願は当業者の技術の範囲を示す。 当業者にとっては、様々な変化、修飾、および変種を、発明の請求項によって定 義される発明の精神および態様から離れずに行ってもよいことが明らかであろう 。 他の具体例は以下の請求項の中にある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 生物学的試料を、所望の核酸を分解可能な内因性ヌクレアーゼが不活性な ｐＨまで酸性化し、 該生物学的試料を該ｐＨで活性な外因性酸プロテアーゼに接触させ、 該生物学的試料を、内因性ヌクレアーゼ活性が有意なレベルまで低下する までインキュベートし、 次いで、 該外因性プロテアーゼを活性が低くするのに十分なｐＨまで該生物学的試 料のｐＨを上昇させる工程よりなることを特徴とする、生物学的試料に含有され た所望の核酸を利用できるようにする方法。 ２． 該生物学的試料がヒトの生物学的試料であって、感染病の薬剤を含んでい てもよい請求項１記載の方法。 ３． 該生物学的試料がヒト細胞核酸を含む細胞である請求項１記載の方法。 ４． 該酸プロテアーゼがペプシンである請求項１記載の方法。 ５． 該インキュベーションの後、試料のｐＨを引き続いての使用に適するレベ ルまでのみ上昇させ、外因性プロテアーゼが完全に阻害されるかまたは不活化さ れるレベルまでは上昇させない請求項１記載の方法。 ６． 該酸性化工程においてｐＨを１.０ないし４.０の間に調製する請求項１記 載の方法。 ７． 該上昇工程においてｐＨを６.０より大きく調製する請求項１記載の方法 。 ８． 以下の酸性プロテアーゼの該上昇工程不活化が、該試料の加熱により援助 される請求項１記載の方法。 ９． 界面活性剤を試料に添加して、所望の核酸の他の試料成分からの遊離を援 助する請求項１記載の方法。 １０．該インキュベーション時間を、内因性ヌクレアーゼレベルを有意でないレ ベルまで減少させるのに必要な時間より長くすることによって、試料成分からの 該核酸の遊離を援助する請求項１記載の方法。 １１．生物学的試料のｐＨをｐＨ４.０またはそれより下に減少させるのに適し た酸、および該生物学的試料中の細胞物質を消化して、該試料中の核酸を遊離さ せ、かつ存在するかもしれない内因性ヌクレアーゼを不活化するのに適した酸プ ロテアーゼを別々の区画に入れてなるキット。 １２．さらに、別の区画中の、蛋白質分解消化の完結に続く試料のｐＨの上昇に 適した塩基からなる請求項１１記載のキット。 １３．吸着剤が溶液中のＲＮａｓｅを吸着し、プロテアーゼを吸着しない条件で 該プロテアーゼの溶液を該ＲＮａｓｅ吸着剤で処理し、該吸着剤を該プロテアー ゼから分離する工程よりなることを特徴とする、プロテアーゼを精製して残存す るのＲＮａｓｅを除去する方法。 １４．該プロテアーゼがペプシンである請求項１３記載の方法。 １５．該ヒト生物学的試料が組織細胞、または血液成分のいずれかである請求項 ２記載の方法。 １６．該細胞がヒト全血細胞または癌細胞のいずれかである請求項３記載の方法 。 １７．該生物学的試料がヒト血清である請求項１記載の方法。 １８．所望の核酸を分解可能な内因性ヌクレアーゼの活性を有意でないレベルに まで減少させるｐＨまで生物学的試料を酸性化し、 該ｐＨで活性な外因性酸プロテアーゼに該生物学的試料を接触させ、 該生物学的試料を、内因性ヌクレアーゼ活性が不可逆的に有意でないレベ ルまで減少するまでインキュベートし、 次いで、 該生物学的試料のｐＨを、該外因性プロテアーゼが活性が低くするのに十 分なｐＨまで上昇させる工程よりなることをことを特徴とする、試料中に含まれ る所望の核酸を使用できるようにする方法。