JPH08500015A

JPH08500015A - ポリフルクタン（レバン）を生成するｄｎａ配列、この配列を含むプラスミド並びにトランスジェニック植物の製造方法

Info

Publication number: JPH08500015A
Application number: JP6505845A
Authority: JP
Inventors: マヌエラレーバー，; ゲプハルトガイアー，; クラウスガイダー，; ロタールヴィルミッツァー，
Original assignee: インスティトゥートフュアゲンビオロギッシェフォルシュングベルリンゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1992-08-12
Filing date: 1993-08-09
Publication date: 1996-01-09
Anticipated expiration: 2020-04-27
Also published as: IL106646A0; CA2142308A1; KR950703059A; EP0663956A1; US6028249A; AU682472B2; US5792923A; DE69333833D1; EP0663956B1; DE69333833T2; JP3643591B2; CA2142308C; HUT70977A; AU4946893A; ATE297998T1; US6501005B1; DE4227061A1; UA40598C2; WO1994004692A1

Abstract

(57)【要約】ポリフルクタン（レバン）を形成するＤＮＡ配列、これらＤＮＡ配列を有するプラスミド、並びにポリフルクタン（レバン）発現を行うトランスジェニック植物の製造のためのこれらのプラスミドの使用方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】ポリフルクタン（レバン）を生成するＤＮＡ配列、この配列を含むプラスミド並びにトランスジェニック植物の製造方法技術分野本発明は、ポリフルクタン（レバン）を生成するＤＮＡ配列、これらの配列が配置されたプラスミドを使用するトランスジェニック植物の製造方法に関する。背景技術高分子量で、水溶性の線状ポリマー、例えばポリアクリレート又はポリメタアクリレートに基づくものは、鉱油の生産物であり、多くの重要な用途を有する。特に、水性系の粘度を増大させる、懸濁化させる又は沈降促進及び複合化させる等のこれらの特性は技術観点から殊に価値がある。これらの生成物は、さらに、例外的に水結合のためのスーパー吸収剤及び水で希釈可能なラッカーとして大量に使用される。このすぐれた有用な特性にもかかわらず、かかる生成物は処理が困難であり、かつ、生物分解性でないため、それらの使用は益々批判を受けるようになってきている。再生可能な未処理材料に基づく代替物、殊に澱粉及びセルロースは、これらのポリサッカライドの巨大分子構造のゆえに、限定された価値を有することが判明している。非生物分解性で、化学的に誘導されたポリマーの代替物として、多くの誘導体化高分子量ポリサッカライドが検討されてきた。今日まで、かかるポリサッカライドは、適当な発酵及びグリコシル転移方法を介してバイオテクノロジー的にのみ得ることができた。こうして得られた、デキストラン及びポリフルクタン（レバン）のような生成物は、大量生産物に対する未処理原料としては競合しえない。ポリフルクタンは、多くの単子葉及び双子葉性の高等植物、緑藻並びに多くのグラム陽性及びグラム陰性菌において見い出されている（メイアー（Meier）及びレイド（Reid），（１９８２）エンサイクロペディアオブプラントフィジオロジー，ニューシリーズ，１３Ａ．４１８−４７１）。植物の進化及び植物の成長のためのフルクタンの役割は完全には理解されていない。今まで提案されたフルクタンの機能は、低温での凍結に対する保護、限定された澱粉生合成による代替炭水化物の保存、並びに光同化のための応用された中間保存物としてのものであり、種子に移動する間隙には、草の茎に存在している。すべてのフルクタンは重合化反応のための出発分子として、ショ糖（グルコース−フルクトース）分子を含有しており、これにフルクトースポリマーが結合している。フルクトース分子のカップリングに依存して、植物起源のフルクタンは４種に分類することができる（メイアー及びレイド（１９８２），エンサイクロペディアオブプラントフィジオロジー，ニューシリーズ，１３Ａ，４１８−４７１）：ａ）（２−１）結合β−Ｄ−フルクタン（イヌリン型）ｂ）（２−６）結合β−Ｄ−フルクタン（フレイン（phlein）又はレバン型）ｃ）２−１及び２−６結合体の混合物を有する高度に分枝したフルクタンｄ）ａ〜ｃ項の型のものとは対照的に、グルコース及びポリフルトース残基からのフルクトース残基の両方から重合させたフルクトース残基より完全に添加された、（２−１）結合したβ−Ｄ−フルクタン（ネオケストース型）。バクテリア起源のフルクタンは、レバン又はイヌリン型のいずれかに相当する（カールソン（Carlsson）（１９７０）Caries Research ４，９７〜１１３）及びデドンダー（Dedonder）（１９６６）Methods Enzymoーlogy ８，５００〜５０５）。植物及びバクテリア中のフルクタンの生合成に関する実験によれば、生合成は種々の経路により進行すると結論される。バクテリア及び植物フルクタンは、さらに、その一次構造のみならず、主にその分子量において区別される。植物から分離されたフルクタンは５０００及び５０，０００ｄの間の分子量を有することが示されているのに対して（ポロック（Pollock）及びチャタートン（Chatterton）（１９８８）： The Bi ochemistry of plants １４，１０９−１４０）、バクテリアから分離されたフルクタンは２，０００，０００ｄまでの分子量であることが記載されている（クルーク（Clarke）ら（１９９１）：Carbohydrates as Organic Raw Materials,V CH Weinheim １６９−１８２）。バシラス種並びにストレプトコッカス種のグループの種々の微生物はポリフルクトースを生成しており、その中にはレバン型のフルクタン及びイヌリン型のフルクタンが記載されている（カールソン１９７０）Carise Research４，９７〜１１３及びデドンダー（１９６６） Methods Enzymology８，５００〜５０５）。生合成の経路に関する実験によれば、高等植物での生合成経路に比較してより単純なパターンがあり、唯一の酵素が共有されていることが明らかである。レバンシュクラーゼ（levan sucrase）という平凡な名前を有するこの酵素は、トランスフルクトシラーゼ（ショ糖：β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ，Ｅ．Ｃ．２．４．１．１０．）であり、これは次の反応の触媒作用を行う：ショ糖＋受容体→グルコース＋フルクトシル受容体代表的な受容体は、水、アルコール、砂糖又はポリフルクトースである。唯一種の酵素がこの反応を触媒するという説は、一方では蛋白化学的精製酵素の試験に基づくものであり、他方では、レバンシュクラーゼに関する遺伝子が種々のバシラス種及びストレプトコッカス種から分離され、E. coliに転移させた後にE . coliでレバンが形成されるという事実に基づくものである（Gay et al. （１９８３）J. Bacteriology １５３，１４２４−１４３１及びトーら（１９８６） Infection and Immunity５２，１６６〜１７０）。今日まで、バシラス・アミロリクファシエンス（Tang)et al.,（１９９０）Ge ne ９６，８９〜９３）及びバシラス・サチリス（Steinmetz et al. （１９８５） Mol. Gen. Genetics ２００，２２０〜２２８）からのレバンシュクラーゼに関する遺伝子が記載されており、これは互いに比較的高い相同性を示し、そのいずれもレバン型のフルクタンの合成を触媒する。さらに、ストレプトコッカスミュータンス（Shiroza et al.（１９８８） J.Bacteriology１７０，８１０−８１６）からのフルクトシルトランスフェラーゼが記載されている。これはバシラス種からのレバンシュクラーゼにはほとんど相同性を示さない。ストレプトコッカスミュータンスで形成されるフルクタンはイヌリン型のものである。ＷＯ８９／１２３８６号において、トランスジェニック植物、特にトランスジェニック植物の果実の中においてデキストラン又はレバンのような炭水化物ポリマーを生成する可能性を記載している。これらの植物を製造するために、アエロバクター・レバニクム（Aerobacter levanicum ）、ストレプトコッカス・サリバリウス及びバシラス・サチリスからのレバン・シュクラーゼを使用すること及びリューコノストク・メゼンテロイデスからのデキストラン・シュクラーゼを使用することが記載されている。さらに、バシラス・サチリスからのレバン・シュクラーゼ及びリューコノストク・メゼンテロイデスからのシュクラーゼをトランスジェニック植物中で発現させるのに適したキメラ遺伝子の構築が記載されている。また、これらの構築体を含むトランスジェニック植物の製造も記載されている。さらに、これらの構築体を含むトランスジェニック植物の製造が記載されている。ポリフルクタンが現実に記載された方法で製造し得るか否かは未知である。バイオテクノロジー方法により、トランスジェニック植物における炭水化物の濃度を修飾し、及び／又は炭水化物の濃度を上げる一連の方法も記載されている。このように澱粉の濃度を増大させ、かつ、物理的及び化学的観点から澱粉を改変することがすでに知られているという事実からみて、ＡＤＰ−グルコースーピロホスホリラーゼ活性を上昇させる又は低下させることによりジャガイモの炭水化物濃度を改変することは達成可能である（ヨーロッパ特許第４５５３１６号）。ヨーロッパ特許第４４２５９２号から、サイドゾリック（cytosolic）及びアポプラスチック（apoplastic）インベルターゼにより光同化体（photoassimil ates）の分布を修飾することが可能であること及びポテト植物中の異種ピロホスファターゼの発現を通してポテト植物の収率並びに千魁及び霜抵抗性を修飾しうることもすでに知られている。ポリサッカライドのように益々その使用が増大している未処理材料の物理−化学的パラメータを化学産業の要求に適合させるため、並びにこれらの生成物を得るコストを最少にするために、トランスジェニック植物の製造方法を発展させ、既知の方法に比較して、良好な、より高い収率をもつ植物を得なければならない。発明の開示ところで、驚くべきことに、次のヌクレオチド配列（配列−ＩＤＮＯ１）：を有するエルウニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）属のグラム陰性バクテリアからのレバン・シュクラーゼのＤＮＡ配列がトランスジェニック植物内で大量のポリフルクタン（レバン）を形成可能であり、これが再使用可能な未精製材料という観点で化学産業の必要性に決定的に合致するということを見い出した。ＤＮＡ配列を植物ゲノムに組み込み、上記のＤＮＡ配列を存在させることにより、植物、殊に葉及び塊茎におけるポリフルクタン（レバン）の発現が可能である。本発明のレバン・シュクラーゼは、ＤＮＡレベルでは既知のレバンシュクラーゼに有意の相同性を示さない。本発明は、さらに以下の工程を含む、葉及び塊茎においてポリフルクタン（レバン）発現を行うトランスジェニック植物の製造方法を提供する：（ａ）以下の部分配列を有するＤＮＡ配列を製造する：ｉ）植物内で活性であり、そして意図したターゲット組織又はターゲット細胞内でＲＮＡの形成を保証するプロモーター、 ii）レバンシュクラーゼのＤＮＡ配列、及び iii）植物細胞内で転写及びＲＮＡの３′−末端へのポリＡ残基の付加を終止させる３′−非−翻訳配列、（ｂ）プラスミドを使用して、植物細胞から組換え二重鎖ＤＮＡ分子の植物ゲノムでＤＮＡ配列を移入（ transfer）し、かつ組み込む、及び（ｃ）形質乾燥した植物の細胞からの完全な全植物体を再生する。工程（ａ），ii）で得られたレバンショ糖は、好適には配列ＩＣＮｏ１．で記載したタクレオチド配列を示す。レバンシュクラーゼは次の反応の触媒を行う：ショ糖−（フルクトース）_n＋ショ糖→ ショ糖−（フルクトース）_n+1＋グルコース基本的にこの方法を使用して、ポリフルクタン（レバン）発現に関して、すべての植物、好適には、トウモロコシ、米、小麦、大麦、テンサイ、サトウキビ、タバコ及びジャガイモのような作物を改質することができる。工程（ｂ）において、基本的には配列ＩＤＮｏ１で記載されたＤＮＡ配列を有するすべてのプラスミドが使用できる。好適には、プラスミドｐ３５ｓ−ＣＷ −ＬＥＶ（ＤＳＭ７１８６）、プラスミドｐ３５ｓ−ＣＹ−ＬＥＶ（ＤＳＭ７１８７）又はプラスミドｐ３３−ＣＷ−ＬＥＶ（ＤＳＭ７１８８）が使用される。ショ糖はレバン・シュクラーゼに対する基質であるから、大量のショ糖を蓄積する器官では特にポリフルクタンの製造が有利である。かかる器官は、例えばテンサイの根又はサトウキビの茎である。遺伝的に改質したポテトにおいては、澱粉の生合成を抑止することによりその塊茎にショ糖を蓄積するので、特に有利である。ショ糖の生合成はサイトゾルで起こるのに対して、蓄積は空胞で行う。サトウキビ又はポテトの蓄積組織への輸送又は種子の内胚乳への輸送の間に、ショ糖は細胞間隙を横断しなければならない。ポリフルクタンの製造において、３個のすべての細胞分画、即ち、サイトゾル、空胞及び細胞間隙が適切である。ヌクレオチド配列ＩＤＮｏ１のレバンショ糖のコード配列、形成される酵素をコードするコード配列にセンス・オリエンテーション（コード配列の５′− 末端へのプロモーターの３′−末端）で結合する特定の順序の転写を保証するプロモーターを提供することができる。ｍＲＮＡ合成の終止を決定する終止シグナルは、コード配列の３′−末端に付着している。葉緑体、アミロプラスト、ミトコンドリア、空胞、アイトゾル又は細胞間隙のような特定の細胞下分画で発現される酵素を指令するために、いわゆるシグナル配列又は遷移ペプチドコード配列をプロモーターとコード配列の間に位置させることができる。この配列は、酵素のコード配列と同一の読み取りフレームの中になければならない。高等植物における本発明のＤＮＡ配列の導入のために、大量のクローニングベクターが利用され、これは E.Coliに対する複製シグナル及びマーカーを有しており、形質転換された細胞の選択を可能とする。ベクターの例は、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ−シリーズのもの、Ｍ１３ｍｐ−シリーズのもの、ｐＡＣＹＣ１８４；ＥＭＢＬ３等である。所望の遺伝子を植物に導入する方法によっては、他のＤＮＡ配列も適切かもしれない。もしＴｉ−又はＲｉ−プラスミドが例えば、植物細胞の形質転換のために使用されなければならない場合には、フランキング領域として、Ｔｉ−及びＲｉ−プラスミドＴ−ＤＮＡの少くとも右境界、しかしながら、しばしば左右両方の境界が導入される遺伝子に付着される。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は広く研究されており、ヨーロッパ特許第１２０５１６号；Ｈoekama,“The B inary PLant Vector System"Offset-drukkerij Kanters B.V.Alblasserdam, （１９８５），第５章； Fraley,et al.,“Crit.Rev.Plant Sci.,４：１〜４６及びAn et al.,（１９８５）ＥＭＢＯＪ．４：２７７〜２８７に十分に記載されている。導入されたＤＮＡがゲノムに組み込まれると、一般には安定であり、元の形質転換された細胞の子孫にも維持される。これは通常、選択マーカーを含有しており、これは殺生物剤又はカナマイシン、Ｇ４１８，ブレオマイシン、ヒグロマイシン又はホスホリノトリシン等のような抗生物質に対する抵抗性を形質転換された植物にもたらす。使用された個々のマーカーは、それゆえ、導入されたＤＮＡに欠けている細胞から形質転換された細胞を選択することを可能とする。アグロバクテリアを使用する形質転換のほかに、ＤＮＡを植物に導入するために、多くの他の利用しうる方法がある。これらの方法には、プロトプラストの融合、ＤＮＡのマイクロインジェクション及びエレクトロポレーション並びにミサイル方法及びウイルス感染が含まれる。選択のための抗生質又は殺生物剤を含有する適当な媒質中で、形質転換した植物材料から、全植物を再生させることができる。次いで生成した植物について、導入したＤＮＡの存在を試験することができる。注入及びエレクトロポレーションにおいてプラスミドには特別の要求は存在しない。例えば、ｐＵＣ−誘導体のような単純なプラスミドを使用しうる。しかしながら、もし全植物がかかる形質転換した細胞から再生される場合には、選択可能なマーカー遺伝子の存在が必要である。形質転換した細胞は通常の態様で植物内で成長する（McCormick et al.,（１９８６）Plant Cell Reports５：８１〜８４も参照）。これらの植物は普通成育でき、かつ植物と交雑でき、これは同一の又は異なる形質転換した遺伝子を有する。得られたハイブリッドの個体は相応の表現型特性を有する。寄託以下のプラスミドを１９９２年７月１６日にドイツ、ブラウンシュバイツにあるドイツ微生物収集所（Deutschen Sammlung von Mik roorganismen：ＤＳＭ）に寄託した（寄託番号）：プラスミドｐ３５ｓ−ＣＷ−ＬＥＶ（ＤＳＭ７１８６）、プラスミドｐ３５ｓ−ＣＹ−ＬＥＶ（ＤＳＭ７１８７）、プラスミドｐ３３−ＣＷ−ＬＥＶ（ＤＳＭ７１８８）図面の簡単な説明第１図は、ｐ３５−ＣＷ−ＬＥＶプラスミドの構造を示す。これは、３個のフラグメントＡ，Ｂ及びＣを含む。フラグメントＡは、カリフラワー（cauliflowe r）モザイクウイルス（CaMV）の３５ｓプロモーター、ヌクレオチド６９０６ −７４３７を含有する。フラグメントＢは、エルウィニアアミロボーラからのレバンシュクラーゼのヌクレオチド６８９−２１２２の配列を有する（配列ＩＤＮｏ．１）。フラグメントＣは、Ｔｉ−プラスミドのｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデニール化シグナル、ヌクレオチド１１７４９−１１９３９を含有する。第２図は、ｐ３５ｓ−ＣＹ−ＬＥＶプラスミドの構造を示す。これは、３個のフラグメントＡ，Ｂ及びＣを含む。フラグメントＡは、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）の３５ｓプロモーター、ヌクレオチド６９０９−７４３７を含む。フラグメントＢは、エルウィニア・アミロボーラからのレバンシュクラーゼのヌクレオチド配列８６４−２１２２を含有する（配列ＩＤＮｏ．１）。フラグメントＣは，Ｔｉ−プラスミドのｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデニール化シグナルを含む。第３図は、ｐ３３−ＣＷ−ＬＥＶプラスミドの構造を示す。これは、３個のフラグメントＡ，Ｂ及びＣを含む。フラグメントＡは、パタチン（Patatin）遺伝子Ｂ３３のプロモーター領域のＤｒａＩ−ＤｒａＩ−フラグメント（−１５１２の位置から＋１４の位置）を含む。フラグメントＢは、エルウィニア・アミロボーラからのレバンシュクラーゼのヌクレオチドの配列６８９−２１２２を含む（配列ＩＤＮｏ．１）。フラグメントＣは、Ｔｉ−プラスミドのｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデニール化シグナルのヌクレオチド１１７４９−１１９３９を含む。第４図は、形質転換したタバコ植物におけるポリフルクタンの検出を示す（Ｎｏ．２，３及び１３）。ここで、Ｆｔｕ＝フルクトース，Ｓｕｃ＝ショ糖，Ｋｅｓ＝ケストース，Ｃ１＝コントロール１，Ｃ２＝コントロール２，Ｍ＝マーカーである。本発明の基礎をなす実施例を理解するために、これらの試験に必要なそれ自体既知のすべての方法を最初に掲げる：１．クローニングプロセスクローニングのためにベクターｐＵＣ１８（Yanisch−Perronら，（１９８５）Gene３３：１０３−１１９）を使用した。植物の形質転換のために、遺伝子構築物をバイナリーべクターＢＩＮ１９（Be van（１９８４）Nucl.AcidsRes１２：８７１１−８７２０）にクローン化した。２．菌株 E.Coli 株 BMH ７１−１８（Messing et al.,Proc.Ｎatl.Acad.Sci.USA （１９７７），２４，６３４２−６３４６）又はＴＢ１をｐＵＣベクターに対して使用した。ＴＢ１は，ＪＭ１０１株の組換え−ネガティヴ、テトラサイクリン− 抵抗性誘導体である（YanischーPerron ら．，Gene（１９８５），３３，１０３ −１１９）。ＴＢ１株の遺伝子型は、（Bart Barrel,Personal communication): F'(tra D36,proAB,lacI, lac ZΔM15），Δ（lac, pro） , SupE, thiS, recA, Srl::Tn10（TcR）である。ポテト植物へのプラスミドの形質転換は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４を使用して実施した（Bevan,（１９８４） , Nucl.Acids Res.１２，８７１１−８７２０）。３．アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換ＢＩＮ１９誘導体の場合、アグロバクテリウムへのＤＮＡの挿入はホルスター（Holsters）ら．，（１９７８）（Mol Gene Genet １６３：１８１−１８７）の方法に従って直接形質転換により実施した。形質転換されたアグロバクテリウムのプラスミドＤＮＡは、バーンボイム（Birnboim）及びドーリー（Doly）（１９７９）（Nucl Acids Res ７：１５１３−１５２３）の方法に従がって分離し、適当な制限切断の後にゲル電気泳動により分析した。４．植物形質転換Ａ）タバコ：選択下に成長させ、一晩培養したアグロバクテリウム・ツメファシェンスの一晩の培養物１０ｍｌを遠心分離し、上澄み液を捨て、そして抗生物質を含有しない同容積の媒質に菌を再懸濁させた。滅菌ペトリ皿上で、中心葉脈の除去され、滅菌された植物の葉のディスクをこの菌の懸濁液に浸した。この葉のディスクを２％のショ糖及び０．８％のバクト寒天を有するＭＳ媒質含有のペトリ皿内に、緊密に充填した形態で載置した（Murashige et sl., （１９６２）Physiologia Plantarum１５，４７３−４９７）。暗所で２５℃にて２日間培養した後、これらを１００ｍｇ／ｌカナマイシン，５００ｍｇ／ｌクラフォラン（claforan），１ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン（ＢＡＰ），０．２ｍｇ／ｌのナフチル酢酸（ＮＡＡ）及び０．８％バクト寒天を含有するＭＳ媒質に移しかえた。生育物を２５０ｍｇ／ｌのクラフォランを含有し、ホルモン不含のＭＳ媒質に移した。Ｂ）ジャガイモ：メスで傷つけた滅菌ポテトの培養物の１０枚の小さな葉を，３０〜５０μｌのアグロバクテリウム・ツメファシエンスを含有し２％のショ糖を有する１０ｍｌのＭＳ媒質中に載置し、選択しながら１晩培養した。３〜５分軽く振った後で、この葉を、１．６グルコース，２ｍｇ／ｌのゼアチンリボース，０．０２ｍｇ／ｌのナフチル酢酸，０．０２ｍｇ／ｌのジベレリン酸，５００ｍｇ／ｌのクラフォラン，５０ｍｇ／ｌのカナマイシン及び０．８％のバクト寒天を有するＭＳ媒質上に置いた。２５℃及び３０００ルクスで１週間培養した後で、媒質中のクラフォラン濃度を半分に下げた。その後、Rocha-Sosa et al., （１９８９）EMBO Journal ８，２９により記載された方法を使用して培養を
実施した。５．形質転換した植物からのゲノムＤＮＡの分析ゲノム植物ＤＮＡの分離は， Rogers et al., （１９８５）Plant Mol Biol ５，６９−７６に従い実施した。ＤＮＡ分析に関して、適当な制限切断の後で、サザーン・ブロット方法により、検討すべきＤＮＡ配列の組み込みについて１０〜２０μ_gのＤＮＡを分析した。６．形質転換植物からの全ＲＮＡの分析植物の全ＲＮＡの分離は、（Logemann et al. （１９８７），Analytical Bio chem.１６３，１６−２０に従って実施した。分析に関して、ノーガンブロット方法により、求めるトランスクリプトの存在について合計５０μ_gのＲＮＡを研究した。７．植物体内のポリフルクトースの抽出及び測定抽出及び測定をPortis H.G.（１９９０），Meth.Plant Biochem.２，３５３− ３６９の方法に従って実施した。実施例１プラスミドｐ３５ｓ−ＣＭ−ＬＥＶの調製及びタバコ並びにポテトのゲノムへのプラスミドの挿入プラスミドｐ３５ｓ−ＣＭ−ＬＥＶは３個のフラグメントＡ，Ｂ及びＣを有しており、これらをｐＵＣ１８からのポリリンカーの制限酵素に対する切断個所でクローン化した（第１図参照）。フラグメントＡは、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の３５Ｓプロモーターを含む。これはＣａＭＶ（Franckら．，（１９８０）Cell ２１，２８５−２９４）のヌクレオチド６９０９から７４３７を含むフラグメントを含有し、プラスミドｐＤＨ５１（Pietrzak et al.,Nucleic Acids Research １４，５８５７−５８６８）からのEco RI- Kpn I フラグメントとして分離し、そしてプラスミドｐＵＣ１８のポリリンカーの Eco RI-Kpn Ｉ切断部位の間でクローン化した。フラグメントＢは、エルウィニア・アミロボーラからのレバンシュクラーゼ遺伝子（配列、ＩＤＮｏ．１）のヌクレオチド６８９−２１２２の配列を有しており、これをｐＵＣ１８のポリリンカーのBamHI／Sal Ｉ切断部位の間でクローン化した。フラグメントＣは、プラスミドｐＡＧＶ４０（Herrera-Estrella et al., （１９８３）Nature ３０３，２０９−２１３）からＰｖｕ II−Hind IIIフラグメントとして分離されたＴｉ−プラスミド，ｐＴｉＡＣＨ５（Gielen ら（１９８４）；EMBO Ｊ．３，８３５−８４６）のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデニル化シグナル，ヌクレオチド１１７４９−１１９３９を有しており，ＰｖｕII切断部分にＳｐｈＩリンカーを添加した後で，ｐＵＣ１８．von pＵＣ１８のポリリンカーのＳｐｈＩ−Hind III 切断部位の間でクローン化した。プラスミドｐ３５ｓ−ＣＷ−ＬＥＶは２１５１塩素対の大きさを有している。フラグメントＡ，Ｂ及びＣを有するプラスミドｐ３５ｓ−ＣＷ−ＬＥＶの部分がバイナリーベクターに導入され、アグロバクテリアシステムを使用してタバコ及びポテト植物に導入した。完全な植物が形質転換した細胞から再生された。この遺伝子で形質転換した一連のタバコ植物からの葉の分析は、遺伝子３５ｓ−ＣＷ−ＬＥＶの発現に起源を有するポリフルクタン（レバン）の存在を明らかに示した。（第４参照）実施例２プラスミドｐ３５ｓ−ＣＷ−ＬＥＶの調製及びタバコ並びにポテトへのこのプラスミドの挿入フラグメントＢ（レバンシュクラーゼをコードする）を５′−末端でヌクレオチドを短かくするという修飾を行った他は、実施例１で記載したのと同様にして、本実施例を実施した。この結果、トランスジェニック植物のサイトゾール内で蛋白質の発現が生じた。このプラスミドｐ３５ｓ−ＣＹ−ＬＥＶは，３個のフラグメントＡ，Ｂ及びＣを含有し、これらはｐＵＣ１８からのポリリンカーの制限酵素に対する切断個所でクローン化した（第２図参照）。フラグメントＡは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを有する。これは、ＣａＭＶ（Franck ら、（１９８０）Cell ２１，２８５−２９４）のヌクレオチド６９０９−７４３７を有するフラグメントを含有し、プラスミドｐＤＨ５１（Pietrzak et al., Nucleic Acids Research １４，５８５７−５８６８）からＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして分離し、そしてプラスミドｐＵＣ１８のポリリンカーのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ切断部位の間でクローン化した。フラグメントＢは、エルウィニア・アミロボーラからのレバンシュクラーゼの遺伝子（配列、ＩＤＮｏ．１）のヌクレオチド８６４−２１２２の配列を有しており、そして，ｐＵＣ１８のポリリンカーの SmaI／ＳａｌＩ切断部分の間でクローン化した。フラグメントＣは、プラスミドｐＡＧＶ４０（Herrera−Estrella et al., （１９８３） Nature ３０３，２０９−２１３）からＰｖｕII−Ｈｉｎｄ III フラグメントとして分離した、Ｔｉ−プラスミド，ｐＴｉＡＣＨ５（Gielenら（１９８４）；ＥＭＢＯＪ．３．８３５−８４６）のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデニル化シグナル、ヌクレオチド１１７４９−１１９３９を含有し、そして、ｐｖｕ II 切断部位へＳｐｈＩリンカーを添加した後で，ｐＵＣ１８．von ｐＵＣ１８のポリリンカーのＳｐｈＩ−Ｈｉｎｄ III 切断分位の間でクローン化した。プラスミドｐ３５ｓ−ＣＹ−ＬＥＶは１９７６個の塩基対を有している。フラグメントＡ，Ｂ及びＣを含有するプラスミドｐ３５ｓ−ＣＹ−ＬＥＶの部分がバイナリーベクターに導入され、そしてアグロバクテリアシステムを使用してタバコ及びポテト植物に導入された。形質転換した細胞から完全な植物が再生した。実施例３プラスミドｐ３５ｓ−ＣＹ−ＬＥＶの調製及びタバコ及びポテトのゲノムへのこのプラスミドの挿入３５ｓプロモーターをクラスＩパタチン遺伝子Ｂ３３のプロモーター（Rocha- Sosa et al.,（１９８９）EMBO J ８，２３−２９）で置き代えた外は、実施例１記載されたのと同様の態様で本実施例を実施した。プラスミドｐ３３−ＣＷ−ＬＥＶは，３個のフラグメントＡ，Ｂ及びＣを含み、これらはｐＵＣ１８からのポリリンカーの制限酵素に対する切断部位でクローン化した（第３図参照）。フラグメントＡは、パタチン遺伝子Ｂ３３（Rocha-Sosa et.al.,（１９８９） EMBO J ８，２３−２９）のプロモーター領域のＤｒａＩ−ＤｒａＩフラグメント（−１５１２部位から＋１４部位）を有しており、これはｐＵＣ１１８のポリリンカーのＳｍａＩ部位でクローン化した。フラグメントＢは、エルウィニアアミロボーラのレバンシュクラーゼ遺伝子（配列、ＩＤＮｏ１）のヌクレオチド６８９−２１２２を含有し，ｐＵＣ１８のポリリンカーのＢａｍＨＩ／Ｓａ１Ｉ切断部位の間でクローン化した。フラグメントＣは、プラスミドｐＡＧＶ４０（Herrera-Estrella et al., （１９８３） Nature３０３，２０９−２１３）からＰｖｕ II −Ｈｉｎｄ III フラグメントとして分離されたＴｉ−プラスミド，ｐＴｉＡＣＨ５（Gielen ら（１９８４）；ＥＭＢＯＪ．３，８３５−８４６）のＴ−ＤＮＡの遺伝子３のポリアデニル化シグナル、ヌクレオチド１１７４９−１１９３９を有しており、ＰｖｕII切断部分にＳｐｈＩリンカーを添加した後で、ｐＵＣ１８．ｖｏｎｐＵＣ１８のポリリンカーのＳｐｈＩ−Ｈｉｎｄ III 切断部位の間でクローン化した。このプラスミドｐ３３−ＣＭ−ＬＥＶは，３１４９の塩基対の大きさを有している。フラグメントＡ，Ｂ及びＣを有するプラスミドｐ３３−ＣＭ−ＬＥＶの部分がバイナリーベクターに導入され、これはアグロバクテリアシステムを使用してタバコ並びにポテト植物へ導入された。形質転換した細胞から完全な植物が再生された。この遺伝子で形質転換した一連のタバコ植物から得た葉を分析すると、遺伝子３３−ＣＭ−ＬＥＶの発現に起源をもつポリフルクタン（レバン）の存在が明らかに示された。実施例４１３Ｃ−ＮＭＲ分光法によるトランスジェニック植物内で合成されたβ２，６− Ｄ−フルクトフラン（レバン）の分析構築物ｐ３３−ＣＷ−ＬＥＶで形質転換されたトランスジェニック植物の分析が実施例として示される。この分析は，ｐ３５ｓ−ＣＷ−ＬＥＶ又はｐ３５ｓ− ＣＹ−ＬＥＶ構築物で形質転換したトンスジェニック植物に同じように適用することができる。ＮＭＲ分光法を実施するためのトンスジェニック植物により合成された十分量のレバンを得るために、約１０_gの葉組織を１０ｍｌの水中ですりつぶした。このホモジネートをベックマンミニ遠心分離機にて４０００rpmで遠心分離を行い、低分子量の化合物を除去するために上澄み液をＰＤ１０カラム（ＬＫＢ−ファルマシア）に適用した。２．５ｍｌの上澄み液が適用される前にカラムを水で平衡化し、次いで、高分子量化合物を水３．５ｍｌで溶出した。この溶出物をさらにイオン交換ビーズ（ＡＧ５０１×８，Biorad）を添加することにより精製し、３０分間振動させた。このビーズを除去するために、４０００rpm（ミニ遠心機、ベックマン）で遠心分離を行い、この上澄み液をセファロース４Ｂカラム（直径１６ｃｍ、分離容積２４ｍｌ）に適用し短鎖シュガーを除去する。溶出物を真空遠心機（ユニベーポ１５０H,Uniquip,Martinsried（FRG））内で真空乾燥し、次いで以下の条件で１３Ｃ−ＮＭＲにより分析した。分析結果を第５図に示す。得られたＮＭＲピークパターンは、グロス（Gross ）らにより発行された（１９９２）， Physiol Mol Plant Pathol ４０：３７１に記載されたレバンに対するものと同一である。このことは、実施例１から３に記載された構築物の１つによる形質転換の後で、形質転換された植物がレバンを合成することを証明している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:18）Ｃ１２Ｒ 1:18） (72)発明者ガイダー，クラウスドイツ連邦共和国Ｄ―69207 ザントハウゼンクライネミュールラッハ 12 (72)発明者ヴィルミッツァー，ロタールドイツ連邦共和国Ｄ―14109 ベルリンアムクライネンヴァンゼー 34

Claims

【特許請求の範囲】１．レバンシュクラーゼの配列がヌクレオチド配列（配列−ＩＤＮｏ１）：を有しエルウイニア・アミロボーラ種のグラム陰性バクテリアに由来しており、それによりこの配列を植物ゲノムに挿入することにより、葉及び塊茎においてポリフルクタン（レバン）発現が可能となることを特徴とする、レバンシュクラーゼの配列が位置しているＤＮＡ配列。２．葉及び塊茎でポリフルクタン（レバン）の発現を行う植物を製造するための、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を有するプラスミド。３．プラスミドｐ３５ｓ−ＣＷ−ＬＥＶ（ＤＳＭ７１８６）。４．プラスミドｐ３５ｓ−ＣＹ−ＬＥＶ（ＤＳＭ７１８７）。５．プラスミドｐ３５ｓ−ＣＷ−ＬＥＶ（ＤＳＭ７１８８）。６．葉及び塊茎でポリフルクタン（レバン）発現を行うトランスジェニック植物を製造する方法において、（ａ）以下の部分配列：ｉ）植物内で活性であり、意図したターゲット組織又はターゲット細胞でＲＮＡの形成を保証するプロモーター、 ii）請求の範囲第１項に記載のレバンシュクラーゼのＤＮＡ配列、及び iii）植物細胞内で転換写及びＲＮＡの３′−末端へのポリＡ残基の付加を終止する、３′−非−翻訳化配列、を有するＤＮＡ配列を製造し、（ｂ）請求の範囲第２項から５項に記載のいずれか１個のプラスミドを使用して、植物細胞から組換え二重鎖ＤＮＡ分子の植物ゲノムでＤＮＡ配列を移入し及び組み込みかつ（ｃ）形質転換した植物細胞からの完全な全植物体を再生することを特徴とする、トランスジェニック植物の製造方法。７．葉及び塊茎でのポリフルクタン（レバン）シュクラーゼ発現が、葉緑体、アミロプラスト、ミトコンドリア、サイトゾル、細胞間隙及び／又は空胞においてポリフルクタン（レバン）シュクラーゼ活性をもたらす、請求の範囲第６項に記載の方法。８．請求の範囲第６項又は第７項に記載の方法で得られる植物。９．農作物植物である、請求の範囲第８項に記載の植物。１０．トウモロコシ、米、小麦、大麦、テンサイ、サトウキビ、タバコ又はポテト植物である、請求の範囲第８項又は第９項に記載の植物。１１．葉及び塊茎でポリフルクタン（レバン）発現を行う植物の製造のための、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列の使用。１２．葉及び塊茎でポリフルクタン（レバン）発現を行う植物の製造のための、請求の範囲第２項から第５項のいずれか１項に記載のプラスミドの使用。