JPH08208514A - Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分とする慢性関節リウマチ治療剤 - Google Patents
Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分とする慢性関節リウマチ治療剤Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 滑膜細胞増殖抑制剤、又は滑膜細胞増殖抑制
に基く慢性関節リウマチ治療剤の提供。 【構成】 ＩＬ−６アンタゴニスト、例えばＩＬ−６抗
体、ＩＬ−６Ｒ抗体等を有効成分とする慢性関節リウマ
チ治療剤又は滑膜細胞増殖抑制剤。
に基く慢性関節リウマチ治療剤の提供。 【構成】 ＩＬ−６アンタゴニスト、例えばＩＬ−６抗
体、ＩＬ−６Ｒ抗体等を有効成分とする慢性関節リウマ
チ治療剤又は滑膜細胞増殖抑制剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はインターロイキン−
６アンタゴニストを有効成分とする慢性関節リウマチ治
療剤又は滑膜細胞増殖抑制剤に関する。
６アンタゴニストを有効成分とする慢性関節リウマチ治
療剤又は滑膜細胞増殖抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】慢性関節リウマチは、関節内において滑
膜組織などの結合織の異常な増殖がみられる全身性の慢
性炎症疾患である（Ｍｅｌｎｙｋら、Ａｒｔｈｒｉｔｉ
ｓ Ｒｈｅｕｍ．３３：４９３−５００，１９９０）。
慢性関節リウマチ患者の関節では、滑膜細胞の著明な増
殖、滑膜細胞の異常な増殖による多層構造の形成（ｐａ
ｎｎｕｓ形成）、滑膜細胞の軟骨組織や骨組織への侵
潤、滑膜組織への血管新生およびリンパ球やマクロファ
ージといった炎症細胞の浸潤などが認められる。慢性関
節リウマチの発症の機序として、これまで遺伝、細菌感
染あるいは各種のサイトカインや成長因子の関与が報告
されているが、いまだその発症のメカニズムは不明であ
る。
膜組織などの結合織の異常な増殖がみられる全身性の慢
性炎症疾患である（Ｍｅｌｎｙｋら、Ａｒｔｈｒｉｔｉ
ｓ Ｒｈｅｕｍ．３３：４９３−５００，１９９０）。
慢性関節リウマチ患者の関節では、滑膜細胞の著明な増
殖、滑膜細胞の異常な増殖による多層構造の形成（ｐａ
ｎｎｕｓ形成）、滑膜細胞の軟骨組織や骨組織への侵
潤、滑膜組織への血管新生およびリンパ球やマクロファ
ージといった炎症細胞の浸潤などが認められる。慢性関
節リウマチの発症の機序として、これまで遺伝、細菌感
染あるいは各種のサイトカインや成長因子の関与が報告
されているが、いまだその発症のメカニズムは不明であ
る。
【０００３】最近では、慢性関節リウマチ患者の滑膜お
よび滑液中にはインターロイキン−１（ＩＬ−１）、イ
ンターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子α（Ｔ
ＮＦα）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ
β）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）および血小板由来
成長因子（ＰＤＧＦ）等のサイトカインまたは成長因子
が検出されたとの報告があり（Ｎｏｕｒｉら、Ｃｌｉ
ｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：２９５−３０２，
１９８４，Ｔｈｏｒｎｔｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．８６：７９−８６，１９９１，Ｓａｘｎ
ｅら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３１：１０４
１−１０４５，１９８８，Ｓｅｉｔｚら、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：４６３−４６９，１９９１，
Ｌａｆｙａｔｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１
１４２−１１４８，１９８９，Ｍｅｌｎｙｋら、Ａｒｔ
ｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３３：４９３−５００，１
９９０）、
よび滑液中にはインターロイキン−１（ＩＬ−１）、イ
ンターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子α（Ｔ
ＮＦα）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ
β）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）および血小板由来
成長因子（ＰＤＧＦ）等のサイトカインまたは成長因子
が検出されたとの報告があり（Ｎｏｕｒｉら、Ｃｌｉ
ｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：２９５−３０２，
１９８４，Ｔｈｏｒｎｔｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．８６：７９−８６，１９９１，Ｓａｘｎ
ｅら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３１：１０４
１−１０４５，１９８８，Ｓｅｉｔｚら、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：４６３−４６９，１９９１，
Ｌａｆｙａｔｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１
１４２−１１４８，１９８９，Ｍｅｌｎｙｋら、Ａｒｔ
ｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３３：４９３−５００，１
９９０）、
【０００４】特に、ＩＬ−１，ＴＮＦαおよびＰＤＧＦ
が有力な滑膜増殖因子であると考えられている（Ｔｈｏ
ｒｎｔｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８
６：７９−８６，１９９１，Ｌａｆｙａｔｉｓら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１１４２−１１４８，１９８
９，Ｇｉｔｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６６：１
９６−２００，１９８９）。また、ＩＬ−１やＴＮＦの
刺激により滑膜細胞がインターロイキン−６（ＩＬ−
６）を産生することが示唆されている（Ｉｔｏら、Ａｒ
ｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３５：１１９７−１２０
１，１９９２）。
が有力な滑膜増殖因子であると考えられている（Ｔｈｏ
ｒｎｔｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８
６：７９−８６，１９９１，Ｌａｆｙａｔｉｓら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１１４２−１１４８，１９８
９，Ｇｉｔｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６６：１
９６−２００，１９８９）。また、ＩＬ−１やＴＮＦの
刺激により滑膜細胞がインターロイキン−６（ＩＬ−
６）を産生することが示唆されている（Ｉｔｏら、Ａｒ
ｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３５：１１９７−１２０
１，１９９２）。
【０００５】ＩＬ−６はＢ細胞刺激因子２あるいはイン
ターフェロンβ２と呼称されたサイトカインである。Ｉ
Ｌ−６はＢリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子
として発見され（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ
３２４，７３−７６，１９８６）、その後、種々の細
胞の機能に影響を及ぼす多機能をサイトカインであると
が明らかになった（Ａｋｉｒａ，Ｓ．ら，Ａｄｖ．ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５４，１−７８，１９９
３）。ＩＬ−６は、細胞上で二種のタンパク質を介して
その生物学的活性を伝達する。一つは、ＩＬ−６が結合
する分子量約８０KDのリガンド結合性タンパク質、ＩＬ
−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）である。
ターフェロンβ２と呼称されたサイトカインである。Ｉ
Ｌ−６はＢリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子
として発見され（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ
３２４，７３−７６，１９８６）、その後、種々の細
胞の機能に影響を及ぼす多機能をサイトカインであると
が明らかになった（Ａｋｉｒａ，Ｓ．ら，Ａｄｖ．ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５４，１−７８，１９９
３）。ＩＬ−６は、細胞上で二種のタンパク質を介して
その生物学的活性を伝達する。一つは、ＩＬ−６が結合
する分子量約８０KDのリガンド結合性タンパク質、ＩＬ
−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）である。
【０００６】ＩＬ−６Ｒは、細胞膜を貫通して細胞膜上
に発現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からな
る可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）としても存在す
る。もう一つは非リガンド結合性のシグナル伝達に係わ
る分子量約１３０KDのｇｐ１３０である。ＩＬ−６とＩ
Ｌ−６ＲはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を形成し、次い
でもう一つの膜タンパク質ｇｐ１３０と結合することに
より、ＩＬ−６の生物学的活性が細胞に伝達される（Ｔ
ａｇａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：９６７，１９
８７）。
に発現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からな
る可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）としても存在す
る。もう一つは非リガンド結合性のシグナル伝達に係わ
る分子量約１３０KDのｇｐ１３０である。ＩＬ−６とＩ
Ｌ−６ＲはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を形成し、次い
でもう一つの膜タンパク質ｇｐ１３０と結合することに
より、ＩＬ−６の生物学的活性が細胞に伝達される（Ｔ
ａｇａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：９６７，１９
８７）。
【０００７】慢性関節リウマチ患者の血清あるいは滑液
には、過剰な量のインターロイキン−６（ＩＬ−６）と
可溶性ＩＬ−６レセプター（ｓＩＬ−６Ｒ）が存在する
ことが報告され（Ｈｏｕｓｓｉａｕら、Ａｒｔｈｒｉｔ
ｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３１：７８４−７８８，１９８８，
Ｈｉｒａｎｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：
１７９７−１８０１，１９８８，Ｙｏｓｈｉｏｋａら、
Ｊａｐｎ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．ｉｎ ｐｒｅｓ
ｓ）、関節リウマチモデル動物でも同様の結果が得られ
ている（Ｔａｋａｉら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕ
ｍ．３２：５９４−６００，１９８９，Ｌｅｉｓｔｅｎ
ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ
ｏｌ．５６：１０８−１１５，１９９０）ことからＩＬ
−６が慢性関節リウマチとなんらかの係わりを有すると
推察されている。
には、過剰な量のインターロイキン−６（ＩＬ−６）と
可溶性ＩＬ−６レセプター（ｓＩＬ−６Ｒ）が存在する
ことが報告され（Ｈｏｕｓｓｉａｕら、Ａｒｔｈｒｉｔ
ｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３１：７８４−７８８，１９８８，
Ｈｉｒａｎｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：
１７９７−１８０１，１９８８，Ｙｏｓｈｉｏｋａら、
Ｊａｐｎ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．ｉｎ ｐｒｅｓ
ｓ）、関節リウマチモデル動物でも同様の結果が得られ
ている（Ｔａｋａｉら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕ
ｍ．３２：５９４−６００，１９８９，Ｌｅｉｓｔｅｎ
ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ
ｏｌ．５６：１０８−１１５，１９９０）ことからＩＬ
−６が慢性関節リウマチとなんらかの係わりを有すると
推察されている。
【０００８】さらに、特開平４−８９４３３には、ＩＬ
−６産生を強く促進するペプチドが慢性関節リウマチの
治療に有効であることが開示されている。一方、Ｈｉｇ
ａｋｉらは、慢性関節リウマチ患者由来の滑膜細胞はＩ
Ｌ−６に対する増殖反応が低く、ＩＬ−６が滑膜の増殖
に対して抑制的に働くとしている（臨床免疫、２２：８
８０−８８７，１９９０）。このように、ＩＬ−６と慢
性関節リウマチの関係については相反する結果が報告さ
れており、未だその関係は解明されていない。
−６産生を強く促進するペプチドが慢性関節リウマチの
治療に有効であることが開示されている。一方、Ｈｉｇ
ａｋｉらは、慢性関節リウマチ患者由来の滑膜細胞はＩ
Ｌ−６に対する増殖反応が低く、ＩＬ−６が滑膜の増殖
に対して抑制的に働くとしている（臨床免疫、２２：８
８０−８８７，１９９０）。このように、ＩＬ−６と慢
性関節リウマチの関係については相反する結果が報告さ
れており、未だその関係は解明されていない。
【０００９】最近、Ｗｅｎｄｌｉｎｇらは、抗ＩＬ−６
抗体を慢性関節リウマチ患者に投与し、一時的に臨床
的、生物学的な症状が改善されると同時に、血清中のＩ
Ｌ−６レベルが上昇することを報告している（Ｊ．Ｒｈ
ｅｕｍａｔｏｌ．２０：２５９−２６２，１９９３）。
これらの報告では、ＩＬ−６が慢性関節リウマチ滑膜細
胞の増殖を促進しているか、あるいは抑制的に作用する
のかについてはなんらデータもなく、慢性関節リウマチ
患者の滑膜細胞に対してＩＬ−６が直接関与しているか
否かは依然として不明であった。
抗体を慢性関節リウマチ患者に投与し、一時的に臨床
的、生物学的な症状が改善されると同時に、血清中のＩ
Ｌ−６レベルが上昇することを報告している（Ｊ．Ｒｈ
ｅｕｍａｔｏｌ．２０：２５９−２６２，１９９３）。
これらの報告では、ＩＬ−６が慢性関節リウマチ滑膜細
胞の増殖を促進しているか、あるいは抑制的に作用する
のかについてはなんらデータもなく、慢性関節リウマチ
患者の滑膜細胞に対してＩＬ−６が直接関与しているか
否かは依然として不明であった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】これまで関節リウマチ
の治療には、抗炎症剤であるコルチコステロイドなどの
ステロイド剤が使用されていたが、これらを長期的に使
用すると皮膚組織の損傷や副腎皮質の機能抑制といった
好ましくない副作用が生ずることから副作用が少ない薬
剤の登場が待たれていた。本発明の目的は、前記の欠点
を有さない新しい慢性関節リウマチ治療剤を提供するこ
とである。より詳しくは、本発明はインターロイキン−
６アンタゴニストを有効成分とし、慢性関節リウマチの
滑膜細胞の異常増殖抑制剤、及びこの作用を有する慢性
関節リウマチ治療剤を提供する。
の治療には、抗炎症剤であるコルチコステロイドなどの
ステロイド剤が使用されていたが、これらを長期的に使
用すると皮膚組織の損傷や副腎皮質の機能抑制といった
好ましくない副作用が生ずることから副作用が少ない薬
剤の登場が待たれていた。本発明の目的は、前記の欠点
を有さない新しい慢性関節リウマチ治療剤を提供するこ
とである。より詳しくは、本発明はインターロイキン−
６アンタゴニストを有効成分とし、慢性関節リウマチの
滑膜細胞の異常増殖抑制剤、及びこの作用を有する慢性
関節リウマチ治療剤を提供する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＩＬ−６
の関節リウマチ由来の滑膜細胞に対する役割を鋭意研究
してきたが、ＩＬ−６だけでは関節リウマチ由来滑膜細
胞の増殖が認められなかったことから、ＩＬ−６以外の
因子について検索した結果、ＩＬ−６単独では滑膜細胞
の増殖作用をほとんど示さないのに対し、ＩＬ−６と可
溶性ＩＬ−６Ｒの共存下では、強力な滑膜細胞増殖作用
を持つこと、さらには、この滑膜細胞増殖作用がＩＬ−
６抗体あるいはＩＬ−６Ｒ抗体といったＩＬ−６活性を
阻害するアンタゴニストを添加することにより抑制され
ることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明
はＩＬ−６アンタゴニストを有効成分として含有する慢
性関節リウマチ治療剤に関する。より詳しくは、本発明
はＩＬ−６アンタゴニストを有効成分として含有する滑
膜細胞の異常な増殖を抑制する慢性関節リウマチ治療剤
に関する。本発明はさらに、ＩＬ−６アンタゴニストを
有効成分とする滑膜細胞増殖抑制剤に関する。
の関節リウマチ由来の滑膜細胞に対する役割を鋭意研究
してきたが、ＩＬ−６だけでは関節リウマチ由来滑膜細
胞の増殖が認められなかったことから、ＩＬ−６以外の
因子について検索した結果、ＩＬ−６単独では滑膜細胞
の増殖作用をほとんど示さないのに対し、ＩＬ−６と可
溶性ＩＬ−６Ｒの共存下では、強力な滑膜細胞増殖作用
を持つこと、さらには、この滑膜細胞増殖作用がＩＬ−
６抗体あるいはＩＬ−６Ｒ抗体といったＩＬ−６活性を
阻害するアンタゴニストを添加することにより抑制され
ることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明
はＩＬ−６アンタゴニストを有効成分として含有する慢
性関節リウマチ治療剤に関する。より詳しくは、本発明
はＩＬ−６アンタゴニストを有効成分として含有する滑
膜細胞の異常な増殖を抑制する慢性関節リウマチ治療剤
に関する。本発明はさらに、ＩＬ−６アンタゴニストを
有効成分とする滑膜細胞増殖抑制剤に関する。
【００１２】
【具体的な説明】本発明の慢性関節リウマチ治療剤と
は、慢性関節リウマチ患者に投与することにより、関節
の滑膜細胞の増殖を抑制し、症状の緩和および治療効果
を有する薬剤である。本発明で使用されるＩＬ−６アン
タゴニストは、ＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断し、
ＩＬ−６の生物学的活性を阻害するものであれば、その
由来を問わない。ＩＬ−６アンタゴニストとしては、Ｉ
Ｌ−６抗体、ＩＬ−６Ｒ抗体、ｇｐ１３０抗体、ＩＬ−
６改変体、ＩＬ−６ＲのアンチセンスあるいはＩＬ−６
またはＩＬ−６Ｒの部分ペプチド等が挙げられる。
は、慢性関節リウマチ患者に投与することにより、関節
の滑膜細胞の増殖を抑制し、症状の緩和および治療効果
を有する薬剤である。本発明で使用されるＩＬ−６アン
タゴニストは、ＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断し、
ＩＬ−６の生物学的活性を阻害するものであれば、その
由来を問わない。ＩＬ−６アンタゴニストとしては、Ｉ
Ｌ−６抗体、ＩＬ−６Ｒ抗体、ｇｐ１３０抗体、ＩＬ−
６改変体、ＩＬ−６ＲのアンチセンスあるいはＩＬ−６
またはＩＬ−６Ｒの部分ペプチド等が挙げられる。
【００１３】本発明でアンタゴニストとして使用される
抗体、たとえば、ＩＬ−６抗体、ＩＬ−６Ｒ抗体、ある
いはｇｐ１３０抗体はその由来および種類（モノクロー
ナル、ポリクローナル）を問わないが、特に哺乳動物由
来のモノクローナル抗体が好ましい。これら抗体はＩＬ
−６，ＩＬ−６Ｒあるいはｇｐ１３０と結合することに
より、ＩＬ−６とＩＬ−６ＲまたはＩＬ−６Ｒとｇｐ１
３０の結合を阻害してＩＬ−６のシグナル伝達を遮断
し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害する抗体である。
抗体、たとえば、ＩＬ−６抗体、ＩＬ−６Ｒ抗体、ある
いはｇｐ１３０抗体はその由来および種類（モノクロー
ナル、ポリクローナル）を問わないが、特に哺乳動物由
来のモノクローナル抗体が好ましい。これら抗体はＩＬ
−６，ＩＬ−６Ｒあるいはｇｐ１３０と結合することに
より、ＩＬ−６とＩＬ−６ＲまたはＩＬ−６Ｒとｇｐ１
３０の結合を阻害してＩＬ−６のシグナル伝達を遮断
し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害する抗体である。
【００１４】モノクローナル抗体の産生細胞の動物種は
哺乳類であれば特に制限されず、ヒト抗体またはヒト以
外の哺乳動物由来であってよい。ヒト以外の哺乳動物由
来のモノクローナル抗体としては、その作成の簡便さか
らウサギあるいはげっ歯類由来のモノクローナル抗体が
好ましい。げっ歯類としては、特に制限されないが、マ
ウス、ラット、ハムスターなどが好ましく例示される。
哺乳類であれば特に制限されず、ヒト抗体またはヒト以
外の哺乳動物由来であってよい。ヒト以外の哺乳動物由
来のモノクローナル抗体としては、その作成の簡便さか
らウサギあるいはげっ歯類由来のモノクローナル抗体が
好ましい。げっ歯類としては、特に制限されないが、マ
ウス、ラット、ハムスターなどが好ましく例示される。
【００１５】このような抗体は、ＩＬ−６抗体として
は、ＭＨ１６６（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１８：９５１−９５６，１９８８）やＳＫ
２抗体（Ｓａｔｏら、第２１回日本免疫学会総会、学術
記録、２１：１１６，１９９１）等が挙げられる。ＩＬ
−６Ｒ抗体としては、ＰＭ−１抗体（Ｈｉｒａｔａら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２９００−２９０６，１
９８９）、ＡＵＫ１２−２０抗体、ＡＵＫ６４−７抗体
あるいはＡＵＫ１４６−１５抗体（国際特許出願公開番
号ＷＯ９２−１９７５９）などが挙げられる。ｇｐ１３
０抗体としては、ＡＭ６４抗体（特開平３−２１９８９
４）が挙げられる。これらのうちでも特に、ＰＭ−１抗
体が好ましい。
は、ＭＨ１６６（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１８：９５１−９５６，１９８８）やＳＫ
２抗体（Ｓａｔｏら、第２１回日本免疫学会総会、学術
記録、２１：１１６，１９９１）等が挙げられる。ＩＬ
−６Ｒ抗体としては、ＰＭ−１抗体（Ｈｉｒａｔａら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２９００−２９０６，１
９８９）、ＡＵＫ１２−２０抗体、ＡＵＫ６４−７抗体
あるいはＡＵＫ１４６−１５抗体（国際特許出願公開番
号ＷＯ９２−１９７５９）などが挙げられる。ｇｐ１３
０抗体としては、ＡＭ６４抗体（特開平３−２１９８９
４）が挙げられる。これらのうちでも特に、ＰＭ−１抗
体が好ましい。
【００１６】モノクローナル抗体は、基本的には公知技
術を使用し、以下のようにして作成できる。すなわち、
ＩＬ−６，ＩＬ−６Ｒあるいはｇｐ１３０を感作抗原と
して使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫
し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知
の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、
モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングするこ
とによって作成できる。
術を使用し、以下のようにして作成できる。すなわち、
ＩＬ−６，ＩＬ−６Ｒあるいはｇｐ１３０を感作抗原と
して使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫
し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知
の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、
モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングするこ
とによって作成できる。
【００１７】より具体的には、モノクローナル抗体を作
成するには次のようにすればよい。例えば、前記感作抗
原としては、ヒトＩＬ−６の場合、Ｈｉｒａｎｏら、Ｎ
ａｔｕｒｅ，３２４：７３，１９８６に開示されたヒト
ＩＬ−６の遺伝子配列を用いることによって得られる。
ヒトＩＬ−６の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿
入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細
胞中または、培養上清中から目的のＩＬ−６タンパク質
を精製し、この精製ＩＬ−６タンパク質を感作抗原とし
て用いればよい。
成するには次のようにすればよい。例えば、前記感作抗
原としては、ヒトＩＬ−６の場合、Ｈｉｒａｎｏら、Ｎ
ａｔｕｒｅ，３２４：７３，１９８６に開示されたヒト
ＩＬ−６の遺伝子配列を用いることによって得られる。
ヒトＩＬ−６の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿
入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細
胞中または、培養上清中から目的のＩＬ−６タンパク質
を精製し、この精製ＩＬ−６タンパク質を感作抗原とし
て用いればよい。
【００１８】ヒトＩＬ−６Ｒの場合、欧州特許出願公開
番号ＥＰ３２５４７４号に開示された遺伝子配列を用い
て上記ヒトＩＬ−６と同様の方法に従えばＩＬ−６Ｒタ
ンパク質を得ることができる。ＩＬ−６Ｒは細胞膜上に
発現しているものと細胞膜より離脱している可溶性のも
の（ｓＩＬ−６Ｒ）との二種類がある。ｓＩＬ−６Ｒは
細胞膜に結合しているＩＬ−６Ｒの主に細胞外領域から
構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領
域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型ＩＬ−６Ｒ
と異なっている。
番号ＥＰ３２５４７４号に開示された遺伝子配列を用い
て上記ヒトＩＬ−６と同様の方法に従えばＩＬ−６Ｒタ
ンパク質を得ることができる。ＩＬ−６Ｒは細胞膜上に
発現しているものと細胞膜より離脱している可溶性のも
の（ｓＩＬ−６Ｒ）との二種類がある。ｓＩＬ−６Ｒは
細胞膜に結合しているＩＬ−６Ｒの主に細胞外領域から
構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領
域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型ＩＬ−６Ｒ
と異なっている。
【００１９】ヒトｇｐ１３０の場合、欧州特許出願公開
番号ＥＰ４１１９４６に開示されている遺伝子配列を用
いて上記ＩＬ−６と同様の方法に従えば、ｇｐ１３０タ
ンパク質を得ることができる。感作抗原で免疫される哺
乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞
融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するの
が好ましく、一般的にはマウス、ラット、ハムスター、
ウサギ等が使用される。
番号ＥＰ４１１９４６に開示されている遺伝子配列を用
いて上記ＩＬ−６と同様の方法に従えば、ｇｐ１３０タ
ンパク質を得ることができる。感作抗原で免疫される哺
乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞
融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するの
が好ましく、一般的にはマウス、ラット、ハムスター、
ウサギ等が使用される。
【００２０】感作抗原を動物に免疫するには、公知の方
法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、
感作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射するこ
とにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）
や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望に
より通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジ
ュバントを適量併用して、哺乳動物に４−２１日毎に数
回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当
な担体を使用することができる。このように免疫し、血
清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、
哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付され
るが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げら
れる。
法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、
感作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射するこ
とにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）
や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望に
より通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジ
ュバントを適量併用して、哺乳動物に４−２１日毎に数
回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当
な担体を使用することができる。このように免疫し、血
清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、
哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付され
るが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げら
れる。
【００２１】前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と
しての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種
々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５
３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１２３：１５４８，１９７
８），ｐ３−Ｕ１（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉ
ｎ Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ ８１：１−７，１９７８），ＮＳ−１（Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９
７６），ＭＰＣ−１１（Ｃｅｌｌ，８：４０５−４１
５，１９７６），ＳＰ２／０（Ｎａｔｕｒｅ，２７６：
２６９−２７０，１９７８），ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈ．３５：１−２１，１９８０），Ｓ１９４
（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８：３１３−３２３，１９
７８），Ｒ２１０（Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１３１−１
３３，１９７９）等が好適に使用される。前記免疫細胞
とミエローマ細胞との細胞融合は基本的には公知の方
法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４
６，１９８１）等に準じて行うことができる。
しての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種
々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５
３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１２３：１５４８，１９７
８），ｐ３−Ｕ１（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉ
ｎ Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ ８１：１−７，１９７８），ＮＳ−１（Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９
７６），ＭＰＣ−１１（Ｃｅｌｌ，８：４０５−４１
５，１９７６），ＳＰ２／０（Ｎａｔｕｒｅ，２７６：
２６９−２７０，１９７８），ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈ．３５：１−２１，１９８０），Ｓ１９４
（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８：３１３−３２３，１９
７８），Ｒ２１０（Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１３１−１
３３，１９７９）等が好適に使用される。前記免疫細胞
とミエローマ細胞との細胞融合は基本的には公知の方
法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４
６，１９８１）等に準じて行うことができる。
【００２２】より具体的には、前記細胞融合は例えば、
細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施さ
れる。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用
され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチル
スルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミ
エローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが
好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例え
ば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６
４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養
に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、
牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもで
きる。
細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施さ
れる。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用
され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチル
スルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミ
エローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが
好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例え
ば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６
４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養
に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、
牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもで
きる。
【００２３】細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細
胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７
℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０
００−６０００程度のＰＥＧを通常、培養液に３０−６
０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって
目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。
続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除
去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育
に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７
℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０
００−６０００程度のＰＥＧを通常、培養液に３０−６
０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって
目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。
続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除
去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育
に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
【００２４】当該ハイブリドーマは、通常の選択培養
液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプ
テリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することに
より選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的と
するハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅す
るのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。つい
で、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生
するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クロー
ン化が行われる。
液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプ
テリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することに
より選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的と
するハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅す
るのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。つい
で、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生
するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クロー
ン化が行われる。
【００２５】このようにして作成されるモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継
代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期
保存することが可能である。当該ハイブリドーマからモ
ノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマ
を通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得
る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある
哺乳動物に移植して増殖させ、その腹水として得る方法
などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得る
のに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産
に適している。
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継
代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期
保存することが可能である。当該ハイブリドーマからモ
ノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマ
を通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得
る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある
哺乳動物に移植して増殖させ、その腹水として得る方法
などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得る
のに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産
に適している。
【００２６】さらに、前記の方法により得られるモノク
ローナル抗体は、塩析法、ゲル漉過法、アフィニティー
クロマトグラフィー法等の通常の精製手段を利用して高
純度に精製することができる。このようにして、作成さ
れるモノクローナル抗体は、放射免疫測定法（ＲＩ
Ａ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗
体法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ）等の通常の免疫学的手段により抗原を高感
度かつ高精度で認識することを確認することができる。
ローナル抗体は、塩析法、ゲル漉過法、アフィニティー
クロマトグラフィー法等の通常の精製手段を利用して高
純度に精製することができる。このようにして、作成さ
れるモノクローナル抗体は、放射免疫測定法（ＲＩ
Ａ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗
体法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ）等の通常の免疫学的手段により抗原を高感
度かつ高精度で認識することを確認することができる。
【００２７】本発明に使用されるモノクローナル抗体
は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限
られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下さ
せること等を目的として人為的に改変したものであって
よい。例えば、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスの
モノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域と
からなるキメラ抗体を使用することができ、このような
キメラ抗体は、既知のキメラ抗体の製造方法、特に遺伝
子組換技法を用いて製造することができる。
は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限
られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下さ
せること等を目的として人為的に改変したものであって
よい。例えば、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスの
モノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域と
からなるキメラ抗体を使用することができ、このような
キメラ抗体は、既知のキメラ抗体の製造方法、特に遺伝
子組換技法を用いて製造することができる。
【００２８】さらに、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）した
ヒト抗体を本発明に用いることができる。これはヒト以
外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域を
ヒト抗体の相補性決定領域へ置換したものであり、その
一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法
を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型抗体を得ること
ができる。例えば、このような再構成ヒト抗体として、
ｈＰＭ−１が好ましい（国際特許出願公開番号ＷＯ９２
−１９７５９を参照）。
ヒト抗体を本発明に用いることができる。これはヒト以
外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域を
ヒト抗体の相補性決定領域へ置換したものであり、その
一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法
を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型抗体を得ること
ができる。例えば、このような再構成ヒト抗体として、
ｈＰＭ−１が好ましい（国際特許出願公開番号ＷＯ９２
−１９７５９を参照）。
【００２９】なお、必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補
性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体
の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を
置換してもよい（Ｓａｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
５３：８５１−８５６，１９９３）。さらには抗原に結
合し、ＩＬ−６の活性を阻害するかぎり抗体の断片、た
とえば、ＦａｂあるいはＦｖ、Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを一本
鎖となるよう適当なリンカーで連結させたシングルチェ
インＦｖ（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子を構築し、こ
れを適当な宿主細胞で発現させ、前述の目的に使用する
ことができる。（例えば、Ｂｉｒｄら、ＴＩＢＴＥＣ
Ｈ，９：１３２−１３７，１９９１；Ｈｕｓｔｏｎら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
５：５８７９−５８８３，１９８８を参照）。
性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体
の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を
置換してもよい（Ｓａｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
５３：８５１−８５６，１９９３）。さらには抗原に結
合し、ＩＬ−６の活性を阻害するかぎり抗体の断片、た
とえば、ＦａｂあるいはＦｖ、Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを一本
鎖となるよう適当なリンカーで連結させたシングルチェ
インＦｖ（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子を構築し、こ
れを適当な宿主細胞で発現させ、前述の目的に使用する
ことができる。（例えば、Ｂｉｒｄら、ＴＩＢＴＥＣ
Ｈ，９：１３２−１３７，１９９１；Ｈｕｓｔｏｎら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
５：５８７９−５８８３，１９８８を参照）。
【００３０】本発明で使用されるＩＬ−６改変体として
はＢｒａｋｅｎｈｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６９：８６−９３，１９９４あるいはＳａｖｉｎｏ
ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：１３５７−１３６７，１９９
４に開示されたものが挙げられる。ＩＬ−６改変体とし
ては、ＩＬ−６のアミノ酸配列中に置換、欠失、挿入と
いった変異を導入することにより、ＩＬ−６Ｒとの結合
活性を維持したまま、ＩＬ−６のシグナル伝達作用がな
いものが使用される。さらにその由来となるＩＬ−６は
上記の性質を有する限り、その動物種を問わないが、抗
原性を考慮すればヒト由来のものを使用するのが好まし
い。
はＢｒａｋｅｎｈｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６９：８６−９３，１９９４あるいはＳａｖｉｎｏ
ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：１３５７−１３６７，１９９
４に開示されたものが挙げられる。ＩＬ−６改変体とし
ては、ＩＬ−６のアミノ酸配列中に置換、欠失、挿入と
いった変異を導入することにより、ＩＬ−６Ｒとの結合
活性を維持したまま、ＩＬ−６のシグナル伝達作用がな
いものが使用される。さらにその由来となるＩＬ−６は
上記の性質を有する限り、その動物種を問わないが、抗
原性を考慮すればヒト由来のものを使用するのが好まし
い。
【００３１】具体的には、ＩＬ−６のアミノ酸配列を公
知の分子モデリングプログラム、たとえば、ＷＨＡＴＩ
Ｆ（Ｖｒｉｅｎｄら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ，
８：５２−５６，１９９０）を用いてその二次構造を予
測し、さらに変異アミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評
価することにより行われる。適当な変異アミノ酸残基を
決定した後、ヒトＩＬ−６遺伝子をコードする塩基配列
を含むベクターを鋳型として、通常行われるＰＣＲ（ポ
リメレースチェインリアクション）法により変異を導入
することにより、ＩＬ−６改変体をコードする遺伝子が
得られる。これを必要に応じて適当な発現ベクターに組
み込み、大腸菌細胞や哺乳類細胞で発現させ、培養上清
中に含まれたまま、あるいは通常の手法により、これを
単離精製し、ＩＬ−６Ｒに対する結合活性およびＩＬ−
６のシグナル伝達の中和活性を評価することができる。
知の分子モデリングプログラム、たとえば、ＷＨＡＴＩ
Ｆ（Ｖｒｉｅｎｄら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ，
８：５２−５６，１９９０）を用いてその二次構造を予
測し、さらに変異アミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評
価することにより行われる。適当な変異アミノ酸残基を
決定した後、ヒトＩＬ−６遺伝子をコードする塩基配列
を含むベクターを鋳型として、通常行われるＰＣＲ（ポ
リメレースチェインリアクション）法により変異を導入
することにより、ＩＬ−６改変体をコードする遺伝子が
得られる。これを必要に応じて適当な発現ベクターに組
み込み、大腸菌細胞や哺乳類細胞で発現させ、培養上清
中に含まれたまま、あるいは通常の手法により、これを
単離精製し、ＩＬ−６Ｒに対する結合活性およびＩＬ−
６のシグナル伝達の中和活性を評価することができる。
【００３２】本発明で使用されるＩＬ−６部分ペプチド
あるいはＩＬ−６Ｒ部分ペプチドは、各々ＩＬ−６Ｒあ
るいはＩＬ−６に結合し、ＩＬ−６の活性伝達作用がな
いものであれば、その配列を問わない。ＩＬ−６部分ペ
プチドおよびＩＬ−６Ｒ部分ペプチドについては、米国
特許公報ＵＳ５２１００７５を参照のこと。ＩＬ−６Ｒ
アンチセンスオリゴヌクレオチドについては特願平５−
３００３３８を参照のこと。本発明のＩＬ−６アンタゴ
ニストを有効成分とする慢性関節リウマチ治療剤は、Ｉ
Ｌ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６により惹起さ
れた滑膜細胞の異常な増殖が抑制される限り、これが関
与する慢性関節リウマチの治療に有効である。
あるいはＩＬ−６Ｒ部分ペプチドは、各々ＩＬ−６Ｒあ
るいはＩＬ−６に結合し、ＩＬ−６の活性伝達作用がな
いものであれば、その配列を問わない。ＩＬ−６部分ペ
プチドおよびＩＬ−６Ｒ部分ペプチドについては、米国
特許公報ＵＳ５２１００７５を参照のこと。ＩＬ−６Ｒ
アンチセンスオリゴヌクレオチドについては特願平５−
３００３３８を参照のこと。本発明のＩＬ−６アンタゴ
ニストを有効成分とする慢性関節リウマチ治療剤は、Ｉ
Ｌ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６により惹起さ
れた滑膜細胞の異常な増殖が抑制される限り、これが関
与する慢性関節リウマチの治療に有効である。
【００３３】すなわち実施例１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで
のリウマチ患者由来滑膜細胞の増殖抑制効果を示す。実
施例２のデータは、II型コラーゲンを免疫したマウス関
節炎モデルにおいてＩＬ−６レセプター抗体を投与し、
（１）関節炎点数を指標とした関節炎発症の抑制（図
４）、（２）コラーゲン免疫マウスの血中の抗II型コラ
ーゲン抗体価の抑制（図５）、及び（３）ＩＬ−６レセ
プター抗体を投与した関節炎モデルマウスの後肢関節に
おける軟骨、骨への肉芽組織の侵潤（慢性増殖性滑膜
炎）の抑制（図６）について検討したものである。
のリウマチ患者由来滑膜細胞の増殖抑制効果を示す。実
施例２のデータは、II型コラーゲンを免疫したマウス関
節炎モデルにおいてＩＬ−６レセプター抗体を投与し、
（１）関節炎点数を指標とした関節炎発症の抑制（図
４）、（２）コラーゲン免疫マウスの血中の抗II型コラ
ーゲン抗体価の抑制（図５）、及び（３）ＩＬ−６レセ
プター抗体を投与した関節炎モデルマウスの後肢関節に
おける軟骨、骨への肉芽組織の侵潤（慢性増殖性滑膜
炎）の抑制（図６）について検討したものである。
【００３４】その結果、上記（１）及び（２）について
は、マウスモデルでの関節炎発症の、特にその初期にＩ
Ｌ−６レセプター抗体の抑制効果が認められた。また、
（３）の結果は、軟骨、骨組織への肉芽組織の侵潤が抑
制され、これは実施例１（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの滑膜細
胞の増殖抑制）の結果を支持することが明らかになっ
た。（１）及び（２）の実験結果は、本願発明の慢性関
節リウマチ治療剤が初期の関節リウマチに優れた効果を
有することを示すものである。
は、マウスモデルでの関節炎発症の、特にその初期にＩ
Ｌ−６レセプター抗体の抑制効果が認められた。また、
（３）の結果は、軟骨、骨組織への肉芽組織の侵潤が抑
制され、これは実施例１（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの滑膜細
胞の増殖抑制）の結果を支持することが明らかになっ
た。（１）及び（２）の実験結果は、本願発明の慢性関
節リウマチ治療剤が初期の関節リウマチに優れた効果を
有することを示すものである。
【００３５】本発明の慢性関節リウマチ治療剤は、好ま
しくは非経口的に、たとえば、静脈内注射、筋肉内注
射、腹腔内注射、皮下注射等により全身あるいは局部的
に投与することができる。さらに、少なくとも一種の医
薬用担体または希釈剤とともに医薬組成物やキットの形
態をとることができる。本発明の慢性関節リウマチ治療
剤のヒトに対する投与量は患者の病態、年齢あるいは投
与方法により異なるが、適宜適当な量を選択することが
必要である。例えば、およそ１−１０００mg／患者の範
囲で４回以下の分割容量を選択することができる。しか
しながら、本発明の関節リウマチ治療剤はこれらの投与
量に制限されるものではない。
しくは非経口的に、たとえば、静脈内注射、筋肉内注
射、腹腔内注射、皮下注射等により全身あるいは局部的
に投与することができる。さらに、少なくとも一種の医
薬用担体または希釈剤とともに医薬組成物やキットの形
態をとることができる。本発明の慢性関節リウマチ治療
剤のヒトに対する投与量は患者の病態、年齢あるいは投
与方法により異なるが、適宜適当な量を選択することが
必要である。例えば、およそ１−１０００mg／患者の範
囲で４回以下の分割容量を選択することができる。しか
しながら、本発明の関節リウマチ治療剤はこれらの投与
量に制限されるものではない。
【００３６】本発明の関節リウマチ治療剤は常法にした
がって製剤化することができる。たとえば、注射用製剤
は、精製されたＩＬ−６アンタゴニストを溶剤、たとえ
ば、生理食塩水、緩衝液などに溶解し、それに、吸着防
止剤、たとえば、Ｔｗｅｅｎ８０、ゼラチン、ヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）などを加えたものであり、また
は、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したもので
あってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えば
マンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使
用することができる。
がって製剤化することができる。たとえば、注射用製剤
は、精製されたＩＬ−６アンタゴニストを溶剤、たとえ
ば、生理食塩水、緩衝液などに溶解し、それに、吸着防
止剤、たとえば、Ｔｗｅｅｎ８０、ゼラチン、ヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）などを加えたものであり、また
は、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したもので
あってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えば
マンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使
用することができる。
【００３７】
【実施例】以下、実施例、参考例および実験例により本
発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。参考例１ ．ヒト可溶性ＩＬ−６レセプターの調製 Ｙａｍａｓａｋｉらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：
８２５−８２８，１９８８）に従い得られたヒトＩＬ−
６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）をコードするｃＤＮＡを含
むプラスミドｐＢＳＦ２Ｒ．２３６を用いて、ＰＣＲ
（ポリメレースチェーンリアクション）法により可溶性
ＩＬ−６Ｒを作成した（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１０８：６７３−６７６，１９９０）。
発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。参考例１ ．ヒト可溶性ＩＬ−６レセプターの調製 Ｙａｍａｓａｋｉらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：
８２５−８２８，１９８８）に従い得られたヒトＩＬ−
６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）をコードするｃＤＮＡを含
むプラスミドｐＢＳＦ２Ｒ．２３６を用いて、ＰＣＲ
（ポリメレースチェーンリアクション）法により可溶性
ＩＬ−６Ｒを作成した（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１０８：６７３−６７６，１９９０）。
【００３８】上記プラスミドｐＢＳＦ２Ｒ．２３６を制
限酵素ＳｐｈＩで消化して、ＩＬ−６ＲｃＤＮＡ断片を
得、これをｍｐ１８（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に挿入し
た。ＩＬ−６ＲｃＤＮＡにストップコドンを導入するよ
うにデザインした合成オリゴプライマーＡＴＡＴＴＣＴ
ＣＴＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣＴを用いて、インビトロミュ
ータジェネシスシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）によ
り、ＰＣＲ法でＩＬ−６ＲｃＤＮＡに変異を導入した。
この操作によりストップコドンがアミノ酸３４５の位置
に導入され、可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）をコー
ドするｃＤＮＡが得られた。
限酵素ＳｐｈＩで消化して、ＩＬ−６ＲｃＤＮＡ断片を
得、これをｍｐ１８（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に挿入し
た。ＩＬ−６ＲｃＤＮＡにストップコドンを導入するよ
うにデザインした合成オリゴプライマーＡＴＡＴＴＣＴ
ＣＴＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣＴを用いて、インビトロミュ
ータジェネシスシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）によ
り、ＰＣＲ法でＩＬ−６ＲｃＤＮＡに変異を導入した。
この操作によりストップコドンがアミノ酸３４５の位置
に導入され、可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）をコー
ドするｃＤＮＡが得られた。
【００３９】ｓＩＬ−６ＲｃＤＮＡをＣＨＯ細胞で発現
するために、ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃ
ｔａｓｅ（ｄｈｆｒ）をコードするｃＤＮＡが制限酵素
ＰｖｕＩ切断部位に挿入されたプラスミドｐＥＣＥｄｈ
ｆｒ（Ｃｌａｕｓｅｒら、Ｃｅｌｌ，４５：７２１−７
３５，１９８６）にＨｉｎｄIII −ＳａｌＩで切断した
上記ｓＩＬ−６ＲｃＤＮＡを挿入し、ＣＨＯ細胞発現プ
ラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ３４４を得た。
するために、ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃ
ｔａｓｅ（ｄｈｆｒ）をコードするｃＤＮＡが制限酵素
ＰｖｕＩ切断部位に挿入されたプラスミドｐＥＣＥｄｈ
ｆｒ（Ｃｌａｕｓｅｒら、Ｃｅｌｌ，４５：７２１−７
３５，１９８６）にＨｉｎｄIII −ＳａｌＩで切断した
上記ｓＩＬ−６ＲｃＤＮＡを挿入し、ＣＨＯ細胞発現プ
ラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ３４４を得た。
【００４０】１０μｇのプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ３
４４をｄｈｆｒ- ＣＨＯ細胞株ＤＸＢ−１１（Ｕｒｌａ
ｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ７７，４２１６−４２２０，１９８０）へカルシウム
フォスフェイト沈降法（Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−２７５１，１９８７）に
より、トランスフェクトした。
４４をｄｈｆｒ- ＣＨＯ細胞株ＤＸＢ−１１（Ｕｒｌａ
ｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ７７，４２１６−４２２０，１９８０）へカルシウム
フォスフェイト沈降法（Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−２７５１，１９８７）に
より、トランスフェクトした。
【００４１】トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を１mMグ
ルタミン、１０％透析ＦｅｔａｌＣａｌｆ Ｓｅｒｕｍ
（ＦＣＳ）、１００Ｕ／mlのペニシリンおよび１００μ
ｇ／mlのストレプトマイシンを含むヌクレオシド不含α
ＭＥＭ選択培養液で３週間培養した。選択されたＣＨＯ
細胞を限界希釈法でスクリーニングし、一つの単一ＣＨ
Ｏ細胞クローンを得た。このＣＨＯ細胞クローンを２０
nM〜２００nMの濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ）で増
幅し、ヒトｓＩＬ−６Ｒ産生ＣＨＯ細胞株５Ｅ２７を得
た。
ルタミン、１０％透析ＦｅｔａｌＣａｌｆ Ｓｅｒｕｍ
（ＦＣＳ）、１００Ｕ／mlのペニシリンおよび１００μ
ｇ／mlのストレプトマイシンを含むヌクレオシド不含α
ＭＥＭ選択培養液で３週間培養した。選択されたＣＨＯ
細胞を限界希釈法でスクリーニングし、一つの単一ＣＨ
Ｏ細胞クローンを得た。このＣＨＯ細胞クローンを２０
nM〜２００nMの濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ）で増
幅し、ヒトｓＩＬ−６Ｒ産生ＣＨＯ細胞株５Ｅ２７を得
た。
【００４２】ＣＨＯ細胞株５Ｅ２７を５％ＦＣＳを含む
イスコーブ改変ダルベコ培養液（ＩＭＤＭ，Ｇｉｂｃｏ
製）で培養し、その培養上清を回収し、培養上清中のｓ
ＩＬ−６Ｒの濃度をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎ
ｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法
にて常法にしたがい測定した。
イスコーブ改変ダルベコ培養液（ＩＭＤＭ，Ｇｉｂｃｏ
製）で培養し、その培養上清を回収し、培養上清中のｓ
ＩＬ−６Ｒの濃度をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎ
ｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法
にて常法にしたがい測定した。
【００４３】参考例２．ヒトＩＬ−６抗体の調製 Ｍａｔｓｕｄａらの方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１８：９５１−９５６，１９８８）により、ヒトＩ
Ｌ−６抗体を調製した。１０μｇの組換型ＩＬ−６（Ｈ
ｉｒａｎｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７：４
１，１９８８）をフロイント完全アジュバントとともに
ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、血清中に抗ＩＬ−６抗体
が検出できるまで一週間毎にこれを続けた。
ｌ．１８：９５１−９５６，１９８８）により、ヒトＩ
Ｌ−６抗体を調製した。１０μｇの組換型ＩＬ−６（Ｈ
ｉｒａｎｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７：４
１，１９８８）をフロイント完全アジュバントとともに
ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、血清中に抗ＩＬ−６抗体
が検出できるまで一週間毎にこれを続けた。
【００４４】局部のリンパ節から免疫細胞を摘出し、ポ
リエチレングリコール１５００を用いてミエローマ細胞
株Ｐ３Ｕ１と融合させた。ハイブリドーマをＨＡＴ培養
液を用いるＯｉらの方法（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｓａ
ｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，３５１，１９８０）に従って
選択し、ヒトＩＬ−６抗体を産生するハイブリドーマを
樹立した。ヒトＩＬ−６抗体を産生するハイブリドーマ
は下記のようにしてＩＬ−６結合アッセイをおこなっ
た。
リエチレングリコール１５００を用いてミエローマ細胞
株Ｐ３Ｕ１と融合させた。ハイブリドーマをＨＡＴ培養
液を用いるＯｉらの方法（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｓａ
ｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，３５１，１９８０）に従って
選択し、ヒトＩＬ−６抗体を産生するハイブリドーマを
樹立した。ヒトＩＬ−６抗体を産生するハイブリドーマ
は下記のようにしてＩＬ−６結合アッセイをおこなっ
た。
【００４５】すなわち、柔軟なポリビニル製の９６ウェ
ルマイクロプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ，Ｖ
Ａ）を０．１Ｍのｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｈｙｄｒｏｇｅ
ｎ ｃａｒｂｏｎａｔｅ緩衝液（pH９．６）中で１００
μｌのヤギ抗マウスＩｇ抗体（１０μｌ／ml，Ｃｏｏｐ
ｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ製 Ｍａｌｖｅｒ
ｎ，ＰＡ）により４℃で一晩コートした。次いで、プレ
ートを１００μｌの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を含むＰＢＳにより室温で２時間処理した。これをＰＢ
Ｓで洗浄した後、１００μｌのハイブリドーマ培養上清
を各ウェルへ加え、４℃にて一晩インキュベートした。
ルマイクロプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ，Ｖ
Ａ）を０．１Ｍのｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｈｙｄｒｏｇｅ
ｎ ｃａｒｂｏｎａｔｅ緩衝液（pH９．６）中で１００
μｌのヤギ抗マウスＩｇ抗体（１０μｌ／ml，Ｃｏｏｐ
ｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ製 Ｍａｌｖｅｒ
ｎ，ＰＡ）により４℃で一晩コートした。次いで、プレ
ートを１００μｌの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を含むＰＢＳにより室温で２時間処理した。これをＰＢ
Ｓで洗浄した後、１００μｌのハイブリドーマ培養上清
を各ウェルへ加え、４℃にて一晩インキュベートした。
【００４６】プレートを洗浄して、２０００cpm ／０．
５ng／ウェルとなるように 125Ｉ標識組換型ＩＬ−６を
各ウェルへ添加し、洗浄した後各ウェルの放射活性をガ
ンマカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇａｍｍａ ９００
０，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌ
ｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で測定した。２１６個のハイブリ
ドーマクローンのうち３２個のハイブリドーマクローン
がＩＬ−６結合アッセイにより陽性であった。これらの
クローンのなかで最終的に安定なＭＨ１６６．ＢＳＦ２
が得られた。該ハイブリドーマが産生するＩＬ−６抗体
ＭＨ１６６はＩｇＧ１κ型のサブタイプを有する。
５ng／ウェルとなるように 125Ｉ標識組換型ＩＬ−６を
各ウェルへ添加し、洗浄した後各ウェルの放射活性をガ
ンマカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇａｍｍａ ９００
０，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌ
ｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で測定した。２１６個のハイブリ
ドーマクローンのうち３２個のハイブリドーマクローン
がＩＬ−６結合アッセイにより陽性であった。これらの
クローンのなかで最終的に安定なＭＨ１６６．ＢＳＦ２
が得られた。該ハイブリドーマが産生するＩＬ−６抗体
ＭＨ１６６はＩｇＧ１κ型のサブタイプを有する。
【００４７】ついで、ＩＬ−６依存性マウスハイブリド
ーマ細胞株ＭＨ６０．ＢＳＦ２（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：９５１−９５６，１
９８８）を用いてＭＨ１６６抗体によるハイブリドーマ
の増殖に関する中和活性を調べた。ＭＨ６０．ＢＳＦ２
細胞を１×１０4 ／２００μｌ／ウェルとなるように分
注し、これにＭＨ１６６抗体を含むサンプルを加え、４
８時間培養し、１５．１Ｃｉ／mmolの 3Ｈチミジン（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏ
ｎ，ＭＡ）を加えた後、更に６時間培養を続けた。
ーマ細胞株ＭＨ６０．ＢＳＦ２（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：９５１−９５６，１
９８８）を用いてＭＨ１６６抗体によるハイブリドーマ
の増殖に関する中和活性を調べた。ＭＨ６０．ＢＳＦ２
細胞を１×１０4 ／２００μｌ／ウェルとなるように分
注し、これにＭＨ１６６抗体を含むサンプルを加え、４
８時間培養し、１５．１Ｃｉ／mmolの 3Ｈチミジン（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏ
ｎ，ＭＡ）を加えた後、更に６時間培養を続けた。
【００４８】細胞をグラスフィルターペーパー上にお
き、自動ハーベスター（Ｌａｂｏ Ｍａｓｈ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で処理し
た。コントロールとしてウサギ抗ＩＬ−６抗体を用い
た。その結果、ＭＨ１６６抗体はＩＬ−６により誘導さ
れるＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞の 3Ｈチミジンの取込みを
容量依存的に阻害した。このことより、ＭＨ１６６抗体
はＩＬ−６の活性を中和することが明らかとなった。
き、自動ハーベスター（Ｌａｂｏ Ｍａｓｈ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で処理し
た。コントロールとしてウサギ抗ＩＬ−６抗体を用い
た。その結果、ＭＨ１６６抗体はＩＬ−６により誘導さ
れるＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞の 3Ｈチミジンの取込みを
容量依存的に阻害した。このことより、ＭＨ１６６抗体
はＩＬ−６の活性を中和することが明らかとなった。
【００４９】参考例３．ヒトＩＬ−６レセプター抗体の
調製 Ｈｉｒａｔａらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４
３：２９００−２９０６，１９８９）により作成した抗
ＩＬ−６Ｒ抗体ＭＴ１８をＣＮＢｒにより活性化させた
セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と
添付の処方にしたがって結合させ、これを用いてＩＬ−
６Ｒ（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：
８２５−８２８，１９８８）を精製した。
調製 Ｈｉｒａｔａらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４
３：２９００−２９０６，１９８９）により作成した抗
ＩＬ−６Ｒ抗体ＭＴ１８をＣＮＢｒにより活性化させた
セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と
添付の処方にしたがって結合させ、これを用いてＩＬ−
６Ｒ（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：
８２５−８２８，１９８８）を精製した。
【００５０】ヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を１％ジギ
トニン（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）、１０mMト
リエタノールアミン（pH７．８）および０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む１mM ｐ−パラアミノフェニルメタンスル
フォニルフルオライドハイドロクロリド（Ｗａｋｏ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ製）（ジギトニン緩衝液）で可溶化
し、セファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体
と混合した。その後、ビーズをジギトニン緩衝液で６回
洗浄し、免疫に用いる部分精製ＩＬ−６Ｒとした。
トニン（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）、１０mMト
リエタノールアミン（pH７．８）および０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む１mM ｐ−パラアミノフェニルメタンスル
フォニルフルオライドハイドロクロリド（Ｗａｋｏ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ製）（ジギトニン緩衝液）で可溶化
し、セファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体
と混合した。その後、ビーズをジギトニン緩衝液で６回
洗浄し、免疫に用いる部分精製ＩＬ−６Ｒとした。
【００５１】ＢＡＬＢ／ｃマウスを３×１０9 個のＵ２
６６細胞から得た上記部分精製ＩＬ−６Ｒで１０日おき
に４回免疫し、その後常法によりハイブリドーマを作成
した。成長陽性ウェルからのハイブリドーマ培養上清を
下記の方法にてＩＬ−６Ｒへの結合活性を調べた。５×
１０7 個のＵ２６６細胞を35Ｓ−メチオニン（２．５ｍ
Ｃｉ）で標識し、上記ジギトニン緩衝液で可溶化した。
可溶化したＵ２６６細胞を０．０４ml容量のセファロー
ス４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合し、その
後、ジギトニン緩衝液で６回洗浄し、０．２５mlのジギ
トニン緩衝液（pH３．４）により35Ｓ−メチオニン標識
ＩＬ−６Ｒを流出させ、０．０２５mlの１Ｍ Ｔｒｉｓ
（pH７．４）で中和した。
６６細胞から得た上記部分精製ＩＬ−６Ｒで１０日おき
に４回免疫し、その後常法によりハイブリドーマを作成
した。成長陽性ウェルからのハイブリドーマ培養上清を
下記の方法にてＩＬ−６Ｒへの結合活性を調べた。５×
１０7 個のＵ２６６細胞を35Ｓ−メチオニン（２．５ｍ
Ｃｉ）で標識し、上記ジギトニン緩衝液で可溶化した。
可溶化したＵ２６６細胞を０．０４ml容量のセファロー
ス４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合し、その
後、ジギトニン緩衝液で６回洗浄し、０．２５mlのジギ
トニン緩衝液（pH３．４）により35Ｓ−メチオニン標識
ＩＬ−６Ｒを流出させ、０．０２５mlの１Ｍ Ｔｒｉｓ
（pH７．４）で中和した。
【００５２】０．０５mlのハイブリドーマ培養上清を
０．０１mlのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇセファロース（Ｐｈｒ
ａｍａｃｉａ製）と混合した。洗浄した後、セファロー
スを上記で調製した０．００５mlの35Ｓ標識ＩＬ−６Ｒ
溶液とともにインキュベートした。免疫沈降物質をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分析し、ＩＬ−６Ｒと反応するハイブリ
ドーマ培養上清を調べた。その結果、反応陽性ハイブリ
ドーマクローンＰＭ−１を樹立した。ハイブリドーマＰ
Ｍ−１から産生されるＩＬ−６Ｒ抗体ＰＭ−１は、Ｉｇ
Ｇ１κ型のサブタイプを有する。
０．０１mlのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇセファロース（Ｐｈｒ
ａｍａｃｉａ製）と混合した。洗浄した後、セファロー
スを上記で調製した０．００５mlの35Ｓ標識ＩＬ−６Ｒ
溶液とともにインキュベートした。免疫沈降物質をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分析し、ＩＬ−６Ｒと反応するハイブリ
ドーマ培養上清を調べた。その結果、反応陽性ハイブリ
ドーマクローンＰＭ−１を樹立した。ハイブリドーマＰ
Ｍ−１から産生されるＩＬ−６Ｒ抗体ＰＭ−１は、Ｉｇ
Ｇ１κ型のサブタイプを有する。
【００５３】ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体の
ヒトＩＬ−６Ｒに対するＩＬ−６の結合阻害活性をヒト
ミエローマ細胞株Ｕ２６６を用いて調べた。ヒト組換型
ＩＬ−６を大腸菌より調製し（Ｈｉｒａｎｏら、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７：４１，１９８８）、ボル
トン−ハンター試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃ
ｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）により 125Ｉ標識した
（Ｔａｇａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：９６７，
１９８７）。
ヒトＩＬ−６Ｒに対するＩＬ−６の結合阻害活性をヒト
ミエローマ細胞株Ｕ２６６を用いて調べた。ヒト組換型
ＩＬ−６を大腸菌より調製し（Ｈｉｒａｎｏら、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７：４１，１９８８）、ボル
トン−ハンター試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃ
ｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）により 125Ｉ標識した
（Ｔａｇａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：９６７，
１９８７）。
【００５４】４×１０5 個のＵ２６６細胞を１００倍量
の過剰な非標識ＩＬ−６の存在下で室温にて、１時間、
７０％（ｖ／ｖ）のハイブリドーマＰＭ−１の培養上清
および１４０００cpm の 125Ｉ標識ＩＬ−６とともに培
養した。７０μｌのサンプルを、４００μｌのマイクロ
フユージポリエチレンチューブに入れた３００μｌのＦ
ＣＳ上に重層し、遠心の後、細胞上の放射活性を測定し
た。その結果、ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体
は、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒに対する結合を阻害すること
が明らかとなった。
の過剰な非標識ＩＬ−６の存在下で室温にて、１時間、
７０％（ｖ／ｖ）のハイブリドーマＰＭ−１の培養上清
および１４０００cpm の 125Ｉ標識ＩＬ−６とともに培
養した。７０μｌのサンプルを、４００μｌのマイクロ
フユージポリエチレンチューブに入れた３００μｌのＦ
ＣＳ上に重層し、遠心の後、細胞上の放射活性を測定し
た。その結果、ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体
は、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒに対する結合を阻害すること
が明らかとなった。
【００５５】参考例４．マウスＩＬ−６レセプター抗体
の調製 特願平６−１３４６１７に記載の方法でマウスＩＬ−６
レセプターに対するモノクローナル抗体を調製した。Sa
ito らの方法（J. Immunol. ，１４７，１６８−１７
３，１９９３）に従い、マウス可溶性ＩＬ−６レセプタ
ーを産生するＣＨＯ細胞を１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ
培養液で培養し、その培養上清からマウス可溶性ＩＬ−
６レセプター抗体ＲＳ１２（上記 Saitoら参照) とＡｆ
ｆｉｇｃｌ １０ゲル（Ｂｉｏｒａｄ）に固定したアフ
ィニティーカラムを用いてマウス可溶性ＩＬ−６レセプ
ターを精製した。
の調製 特願平６−１３４６１７に記載の方法でマウスＩＬ−６
レセプターに対するモノクローナル抗体を調製した。Sa
ito らの方法（J. Immunol. ，１４７，１６８−１７
３，１９９３）に従い、マウス可溶性ＩＬ−６レセプタ
ーを産生するＣＨＯ細胞を１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ
培養液で培養し、その培養上清からマウス可溶性ＩＬ−
６レセプター抗体ＲＳ１２（上記 Saitoら参照) とＡｆ
ｆｉｇｃｌ １０ゲル（Ｂｉｏｒａｄ）に固定したアフ
ィニティーカラムを用いてマウス可溶性ＩＬ−６レセプ
ターを精製した。
【００５６】得られたマウス可溶性ＩＬ−６レセプター
５０μｇをフロイント完全アジュバントと混合しウィス
ターラット（日本チャールズリバー）の腹部皮下に注射
した。２週間後からはフロイント不完全アジュバントで
追加免疫した。４５日目にラットを屠殺し、その脾細胞
約２×１０8 個を１×１０7 個のマウスミエローマ細胞
Ｐ３Ｕ１と５０％のＰＥＧ１５００（ベーリンガ−マン
ハイム）を用いて常法により細胞融合させた後、ＨＡＴ
培地にてハイブリドーマをスクリーニングした。
５０μｇをフロイント完全アジュバントと混合しウィス
ターラット（日本チャールズリバー）の腹部皮下に注射
した。２週間後からはフロイント不完全アジュバントで
追加免疫した。４５日目にラットを屠殺し、その脾細胞
約２×１０8 個を１×１０7 個のマウスミエローマ細胞
Ｐ３Ｕ１と５０％のＰＥＧ１５００（ベーリンガ−マン
ハイム）を用いて常法により細胞融合させた後、ＨＡＴ
培地にてハイブリドーマをスクリーニングした。
【００５７】ウサギ抗ラットＩｇＧ抗体（カッペル）を
コートしたイミュノプレートにハイブリドーマ培養上清
を加えた後マウス可溶性ＩＬ−６レセプターを反応さ
せ、次いでウサギ抗マウスＩＬ−６レセプター抗体およ
びアルカリフォスファターゼ標識ヒツジ抗ウサギＩｇＧ
によるＥＬＩＳＡ法によりマウス可溶性ＩＬ−６レセプ
ターに対する抗体を産生するハイブリドーマをスクリー
ニングした。抗体の産生が確認されたハイブリドーマク
ローンは２回のサブスクリーニングを行い、単一のハイ
ブリドーマクローンを得た。このクローンをＭＲ１６−
１と名付けた。
コートしたイミュノプレートにハイブリドーマ培養上清
を加えた後マウス可溶性ＩＬ−６レセプターを反応さ
せ、次いでウサギ抗マウスＩＬ−６レセプター抗体およ
びアルカリフォスファターゼ標識ヒツジ抗ウサギＩｇＧ
によるＥＬＩＳＡ法によりマウス可溶性ＩＬ−６レセプ
ターに対する抗体を産生するハイブリドーマをスクリー
ニングした。抗体の産生が確認されたハイブリドーマク
ローンは２回のサブスクリーニングを行い、単一のハイ
ブリドーマクローンを得た。このクローンをＭＲ１６−
１と名付けた。
【００５８】このハイブリドーマが産生する抗体のマウ
スＩＬ−６の情報伝達における中和活性をＭＨ６０．Ｂ
ＳＦ２細胞（Matsuda ら、J. Immunol.,１８，９５１−
９５６，１９８８）を用いた 3Ｈチミジンの取込みで調
べた。９６ウェルプレートにＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞を
１×１０4 個／２００μｌ／ウェルとなるように調製
し、これにマウスＩＬ−６（１０pg／ml）とＭＲ１６−
Ｉ抗体またはＲＳ１２抗体を１２．３−１０００ng／ml
を加えて３７℃、５％ＣＯ2 で４４時間培養した後、 3
Ｈチミジン（１μＣｉ／ウェル）を加え４時間後の取込
みを測定した。その結果、ＭＲ１６−１抗体はＭＨ６
０．ＢＳＦ２細胞の 3Ｈチミジンの取込みを抑制した。
スＩＬ−６の情報伝達における中和活性をＭＨ６０．Ｂ
ＳＦ２細胞（Matsuda ら、J. Immunol.,１８，９５１−
９５６，１９８８）を用いた 3Ｈチミジンの取込みで調
べた。９６ウェルプレートにＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞を
１×１０4 個／２００μｌ／ウェルとなるように調製
し、これにマウスＩＬ−６（１０pg／ml）とＭＲ１６−
Ｉ抗体またはＲＳ１２抗体を１２．３−１０００ng／ml
を加えて３７℃、５％ＣＯ2 で４４時間培養した後、 3
Ｈチミジン（１μＣｉ／ウェル）を加え４時間後の取込
みを測定した。その結果、ＭＲ１６−１抗体はＭＨ６
０．ＢＳＦ２細胞の 3Ｈチミジンの取込みを抑制した。
【００５９】実験例１．慢性関節リウマチ由来滑膜細胞
の樹立 （１）滑膜細胞の調製 慢性関節リウマチ患者の関節を外科的に処置する際、滑
膜組織を得た。滑膜組織をハサミにより細切し、ついで
５mg／mlのＴＹＰＥ Ｉコラーゲネース（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ製）および０．１５mg／mlのウ
シ膵臓由来ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ製）によりＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培
養液中で、３７℃１時間インキュベートすることで酵素
的に分解し、メッシュを通して単一細胞を得た。得られ
た細胞を細胞培養用のフラスコ中で５％ＦＣＳ添加ＩＭ
ＤＭ培養液を用いて一晩培養した後、非付着性細胞を除
去し滑膜細胞を得た。この滑膜細胞を、三継代から六継
代培養したものを下記の実験に使用した。
の樹立 （１）滑膜細胞の調製 慢性関節リウマチ患者の関節を外科的に処置する際、滑
膜組織を得た。滑膜組織をハサミにより細切し、ついで
５mg／mlのＴＹＰＥ Ｉコラーゲネース（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ製）および０．１５mg／mlのウ
シ膵臓由来ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ製）によりＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培
養液中で、３７℃１時間インキュベートすることで酵素
的に分解し、メッシュを通して単一細胞を得た。得られ
た細胞を細胞培養用のフラスコ中で５％ＦＣＳ添加ＩＭ
ＤＭ培養液を用いて一晩培養した後、非付着性細胞を除
去し滑膜細胞を得た。この滑膜細胞を、三継代から六継
代培養したものを下記の実験に使用した。
【００６０】（２）滑膜細胞によるＩＬ−６産生 上記で得られた滑膜細胞を３×１０3 個／ウェルとなる
ように５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ Ｉｎｃ製）、１０Ｕ／mlのペニシリンＧおよ
び１００μｇ／mlのストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ
培養液で懸濁した後、９６ウェルマイクロタイタープレ
ート（Ｆａｌｃｏｎ製）に分注し、ヒトインターロイキ
ン−１β（ＩＬ−１β）、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ
α）、ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ＡＢおよび
ヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を各々０．
０１または０．１、０．１または１、１または１０、及
び１または１０ng／mlの濃度になるように加え、３７℃
にて７２時間培養し、その培養上清を回収した。
ように５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ Ｉｎｃ製）、１０Ｕ／mlのペニシリンＧおよ
び１００μｇ／mlのストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ
培養液で懸濁した後、９６ウェルマイクロタイタープレ
ート（Ｆａｌｃｏｎ製）に分注し、ヒトインターロイキ
ン−１β（ＩＬ−１β）、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ
α）、ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ＡＢおよび
ヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を各々０．
０１または０．１、０．１または１、１または１０、及
び１または１０ng／mlの濃度になるように加え、３７℃
にて７２時間培養し、その培養上清を回収した。
【００６１】１００μｌの抗ヒトＩＬ−６抗体ＭＨ１６
６（１μｇ／ml）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｉ
ｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ；Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃にて
２４時間インキュベートした。ついで、各ウェルを０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにより洗浄して、１
％ＢＳＡを含むＰＢＳで一晩４℃でブロッキングした。
次いで、上記で得られた培養上清を１％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳで希釈し、各ウェルへ添加した後、室温にて２時間
インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含
むＰＢＳで洗浄の後、１００μｌのプロテインＡカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）で精製した２．５μｇ／mlの
精製ウサギポリクローナル抗ヒトＩＬ−６抗体を加え
た。
６（１μｇ／ml）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｉ
ｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ；Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃にて
２４時間インキュベートした。ついで、各ウェルを０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにより洗浄して、１
％ＢＳＡを含むＰＢＳで一晩４℃でブロッキングした。
次いで、上記で得られた培養上清を１％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳで希釈し、各ウェルへ添加した後、室温にて２時間
インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含
むＰＢＳで洗浄の後、１００μｌのプロテインＡカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）で精製した２．５μｇ／mlの
精製ウサギポリクローナル抗ヒトＩＬ−６抗体を加え
た。
【００６２】室温で２時間インキュベートした後、培養
上清中のＩＬ−６に結合したウサギポリクローナル抗Ｉ
Ｌ−６抗体をアルカリフォスファターゼ結合抗ウサギＩ
ｇＧ抗体（Ｔａｇｏ製）を反応させた後、添付の処方に
したがい１mg／mlのＳｉｇｍａ１０４アルカリフォスフ
ァターゼ基質（Ｓｉｇｍａ製）を加え、マイクロプレー
トリーダーＭＰＲ Ａ４（Ｔｏｓｏｈ Ｃｏ製）により
４０５−６００nmの吸光度を測定した。吸光度のＯＤ値
をヒトＩＬ−６の濃度へ変換するために、各アッセイ時
に組換型ＩＬ−６を用いて検量線を作成した。結果を表
１に示す。
上清中のＩＬ−６に結合したウサギポリクローナル抗Ｉ
Ｌ−６抗体をアルカリフォスファターゼ結合抗ウサギＩ
ｇＧ抗体（Ｔａｇｏ製）を反応させた後、添付の処方に
したがい１mg／mlのＳｉｇｍａ１０４アルカリフォスフ
ァターゼ基質（Ｓｉｇｍａ製）を加え、マイクロプレー
トリーダーＭＰＲ Ａ４（Ｔｏｓｏｈ Ｃｏ製）により
４０５−６００nmの吸光度を測定した。吸光度のＯＤ値
をヒトＩＬ−６の濃度へ変換するために、各アッセイ時
に組換型ＩＬ−６を用いて検量線を作成した。結果を表
１に示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】その結果、ＩＬ−１βは、滑膜細胞のＩＬ
−６産生を強く促進することが明らかとなった。
−６産生を強く促進することが明らかとなった。
【００６５】実施例１． （１）実験例１で得られた滑膜細胞（３×１０3 ／ウェ
ル）を５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ Ｉｎｃ製）、１０Ｕ／mlのペニシリンＧおよ
び１００μｇ／mlのストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ
培養液中で懸濁した後、９６ウェルマイクロタイタープ
レート（＃３０７２；Ｆａｌｃｏｎ製）に分注し、５日
間、各種の濃度のＩＬ−６，ｓＩＬ−６Ｒ各々単独存在
下、あるいはＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒの共存下で培養し
た。培養開始後７２時間後に１μＣｉ／ウェルとなるよ
うに 3Ｈチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ製）を各ウェルに添加し、培養終
了後にシンチレーションカウンターにより細胞内の放射
活性を測定した。結果を図１に示す。
ル）を５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ Ｉｎｃ製）、１０Ｕ／mlのペニシリンＧおよ
び１００μｇ／mlのストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ
培養液中で懸濁した後、９６ウェルマイクロタイタープ
レート（＃３０７２；Ｆａｌｃｏｎ製）に分注し、５日
間、各種の濃度のＩＬ−６，ｓＩＬ−６Ｒ各々単独存在
下、あるいはＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒの共存下で培養し
た。培養開始後７２時間後に１μＣｉ／ウェルとなるよ
うに 3Ｈチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ製）を各ウェルに添加し、培養終
了後にシンチレーションカウンターにより細胞内の放射
活性を測定した。結果を図１に示す。
【００６６】その結果、ＩＬ−６あるいはｓＩＬ−６Ｒ
単独では、滑膜細胞の 3Ｈチミジンとりこみは低く、滑
膜細胞の増殖が認められなかった。これに対し、１０ng
／ml以上の濃度のＩＬ−６と１００ng／mlの濃度のｓＩ
Ｌ−６Ｒの共存下ではコントロール群に比し、顕著な 3
Ｈチミジンとりこみがみられた。したがって、ＩＬ−６
単独では滑膜細胞の増殖作用をほとんど示さないのに対
し、ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒの共存下では、強力な滑膜
細胞増殖作用を持つことが明らかとなった。
単独では、滑膜細胞の 3Ｈチミジンとりこみは低く、滑
膜細胞の増殖が認められなかった。これに対し、１０ng
／ml以上の濃度のＩＬ−６と１００ng／mlの濃度のｓＩ
Ｌ−６Ｒの共存下ではコントロール群に比し、顕著な 3
Ｈチミジンとりこみがみられた。したがって、ＩＬ−６
単独では滑膜細胞の増殖作用をほとんど示さないのに対
し、ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒの共存下では、強力な滑膜
細胞増殖作用を持つことが明らかとなった。
【００６７】（２）滑膜細胞（３×１０3 ／ウェル）
を、ＩＬ−６を産生させるに十分量のＩＬ−１β（０．
１ng／ml）、１００ng／mlのｓＩＬ−６Ｒおよび２５μ
ｇ／mlのＩＬ−６抗体あるいは２５μｇ／mlのＩＬ−６
Ｒ抗体存在下で培養した。培養開始７２時間後に１μＣ
ｉ／ウェルとなるように 3Ｈチミジンを添加し、培養終
了後にシンチレーションカウンターで細胞内の放射活性
を測定した。結果を図２に示す。ＩＬ−６抗体あるいは
ＩＬ−６Ｒ抗体の添加により、ｓＩＬ−６Ｒにより増強
された滑膜細胞の増殖を完全に抑制した。
を、ＩＬ−６を産生させるに十分量のＩＬ−１β（０．
１ng／ml）、１００ng／mlのｓＩＬ−６Ｒおよび２５μ
ｇ／mlのＩＬ−６抗体あるいは２５μｇ／mlのＩＬ−６
Ｒ抗体存在下で培養した。培養開始７２時間後に１μＣ
ｉ／ウェルとなるように 3Ｈチミジンを添加し、培養終
了後にシンチレーションカウンターで細胞内の放射活性
を測定した。結果を図２に示す。ＩＬ−６抗体あるいは
ＩＬ−６Ｒ抗体の添加により、ｓＩＬ−６Ｒにより増強
された滑膜細胞の増殖を完全に抑制した。
【００６８】（３）滑膜細胞（３×１０3 個／ウェル）
を、１００ng／mlのＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、
上記参考例にて得られた１００ng／mlのｓＩＬ−６Ｒお
よび２５μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体
の存在下で培養した。培養開始後７２時間に１μCi／ウ
ェルとなるように 3Ｈ−チミジンを添加し、培養終了後
にシンチレーションカウンターで細胞内の放射活性を測
定した。結果を図３に示す。ＩＬ−６抗体あるいはＩＬ
−６Ｒ抗体の添加により、ｓＩＬ−６Ｒにより増強され
た滑膜細胞の増殖は完全に抑制された。
を、１００ng／mlのＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、
上記参考例にて得られた１００ng／mlのｓＩＬ−６Ｒお
よび２５μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体
の存在下で培養した。培養開始後７２時間に１μCi／ウ
ェルとなるように 3Ｈ−チミジンを添加し、培養終了後
にシンチレーションカウンターで細胞内の放射活性を測
定した。結果を図３に示す。ＩＬ−６抗体あるいはＩＬ
−６Ｒ抗体の添加により、ｓＩＬ−６Ｒにより増強され
た滑膜細胞の増殖は完全に抑制された。
【００６９】実施例２．マウス関節炎モデルでの関節炎
発症に対するＩＬ−６レセプター抗体の抑制効果を調べ
た。０．１Ｎ酢酸水溶液に溶解したウシII型コラーゲン
（コラーゲン技術研究会）溶液（４mg／ml）と完全アジ
ュバントＨ３７Ｒａ（ＤＩＦＣＯ）を等量ずつ混合し、
アジュバントを作成した。このアジュバント１００μｌ
を８−９週令の雄性ＤＢＡ／１Ｊマウス（日本チャール
ズリバー）の尾根部の皮下に注射した。更に、２１日後
に背部皮下に１００μｌを注射して関節炎を誘導した。
発症に対するＩＬ−６レセプター抗体の抑制効果を調べ
た。０．１Ｎ酢酸水溶液に溶解したウシII型コラーゲン
（コラーゲン技術研究会）溶液（４mg／ml）と完全アジ
ュバントＨ３７Ｒａ（ＤＩＦＣＯ）を等量ずつ混合し、
アジュバントを作成した。このアジュバント１００μｌ
を８−９週令の雄性ＤＢＡ／１Ｊマウス（日本チャール
ズリバー）の尾根部の皮下に注射した。更に、２１日後
に背部皮下に１００μｌを注射して関節炎を誘導した。
【００７０】マウスＩＬ−６レセプター抗体ＭＲ１６−
１は、１回目のコラーゲン感作時にマウス一匹あたり２
mgを静脈内投与し、その後１週間毎に、マウス一匹あた
り０．５mgを７週間皮下注射した（ｎ＝５）。なお、コ
ントロールとして同じアイソタイプの抗ＤＮＰ抗体ＫＨ
−５（中外製薬）を使用した（ｎ＝５）。関節炎発症の
程度は、関節炎点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｉｎｄｅ
ｘ）で評価した。一肢につき４点満点、一個体１６点満
点で評価した。評価の基準は以下のとおりである。０．
５：関節の一箇所に紅斑が観察される。１：関節の二箇
所に紅斑が観察される、または甲が赤変しているが腫張
は認められない。２：軽度の腫張が認められる。３：手
足の甲に重度の腫張が認められるが、全ての指にそれが
至らない。４：手足の甲および指に重度の腫張が認めら
れる。
１は、１回目のコラーゲン感作時にマウス一匹あたり２
mgを静脈内投与し、その後１週間毎に、マウス一匹あた
り０．５mgを７週間皮下注射した（ｎ＝５）。なお、コ
ントロールとして同じアイソタイプの抗ＤＮＰ抗体ＫＨ
−５（中外製薬）を使用した（ｎ＝５）。関節炎発症の
程度は、関節炎点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｉｎｄｅ
ｘ）で評価した。一肢につき４点満点、一個体１６点満
点で評価した。評価の基準は以下のとおりである。０．
５：関節の一箇所に紅斑が観察される。１：関節の二箇
所に紅斑が観察される、または甲が赤変しているが腫張
は認められない。２：軽度の腫張が認められる。３：手
足の甲に重度の腫張が認められるが、全ての指にそれが
至らない。４：手足の甲および指に重度の腫張が認めら
れる。
【００７１】結果を図４に示す。ＩＬ−６レセプター抗
体投与群ではコントロール抗体投与群に比べて関節炎発
症初期から関節炎の発症が明らかに抑制された。一方、
マウスの血中抗II型コラーゲン抗体価を測定した結果、
ＩＬ−６レセプター抗体投与群ではコントロール抗体投
与群に比べて関節炎発症初期から著明に減少していた
（図５）。
体投与群ではコントロール抗体投与群に比べて関節炎発
症初期から関節炎の発症が明らかに抑制された。一方、
マウスの血中抗II型コラーゲン抗体価を測定した結果、
ＩＬ−６レセプター抗体投与群ではコントロール抗体投
与群に比べて関節炎発症初期から著明に減少していた
（図５）。
【００７２】コラーゲン免疫後３５日のマウスを屠殺
し、その後肢を２０％ホルマリンで固定した。これをＥ
ＤＴＡ溶液（pH７．６）中で脱灰し、アルコールにて脱
水した。その後、これをパラフィン包埋し、２μｍ厚の
切片を作成した。この切片をヘマトキシリンとエオジン
で染色し１２５倍にて検鏡した（図６）。その結果、Ｉ
Ｌ−６レセプター抗体投与群ではコントロール抗体投与
群に比べて軟骨や骨への肉芽組織の侵潤すなわち、慢性
増殖性滑膜炎が抑制されていた。
し、その後肢を２０％ホルマリンで固定した。これをＥ
ＤＴＡ溶液（pH７．６）中で脱灰し、アルコールにて脱
水した。その後、これをパラフィン包埋し、２μｍ厚の
切片を作成した。この切片をヘマトキシリンとエオジン
で染色し１２５倍にて検鏡した（図６）。その結果、Ｉ
Ｌ−６レセプター抗体投与群ではコントロール抗体投与
群に比べて軟骨や骨への肉芽組織の侵潤すなわち、慢性
増殖性滑膜炎が抑制されていた。
【００７３】ＩＬ−６は、Ｂ細胞を抗体産生細胞に分化
させるサイトカインである。また、ＩＬ−６は、ＩＬ−
６レセプター存在下で滑膜細胞の増殖も促進する。マウ
スコラーゲン関節炎モデルにおいて、抗ＩＬ−６レセプ
ター抗体は、コラーゲン感作後２１日目および３５日目
では、コントロール抗体投与群に比べて、抗II型コラー
ゲン抗体価を有意に抑制する結果が得られていることか
ら、抗ＩＬ−６レセプター抗体による抗体産生抑制が関
節炎の抑制作用の一因であると考えられる。
させるサイトカインである。また、ＩＬ−６は、ＩＬ−
６レセプター存在下で滑膜細胞の増殖も促進する。マウ
スコラーゲン関節炎モデルにおいて、抗ＩＬ−６レセプ
ター抗体は、コラーゲン感作後２１日目および３５日目
では、コントロール抗体投与群に比べて、抗II型コラー
ゲン抗体価を有意に抑制する結果が得られていることか
ら、抗ＩＬ−６レセプター抗体による抗体産生抑制が関
節炎の抑制作用の一因であると考えられる。
【００７４】一方、コラーゲン感作後４９日以降ではそ
れほど抗体産生抑制効果が観察されないが、この時期で
も関節炎の発症抑制効果が十分発揮されていること、ま
た、足根骨周辺の組織をＨＥ染色すると、抗ＩＬ−６レ
セプター抗体投与群では軟骨や、骨への肉芽組織の浸潤
がコントロール群に比べて抑制されていることから、滑
膜の増殖抑制作用も関節炎の抑制効果に関与しているも
のと思われる。
れほど抗体産生抑制効果が観察されないが、この時期で
も関節炎の発症抑制効果が十分発揮されていること、ま
た、足根骨周辺の組織をＨＥ染色すると、抗ＩＬ−６レ
セプター抗体投与群では軟骨や、骨への肉芽組織の浸潤
がコントロール群に比べて抑制されていることから、滑
膜の増殖抑制作用も関節炎の抑制効果に関与しているも
のと思われる。
【００７５】
【発明の効果】慢性関節リウマチ患者由来滑膜細胞はＩ
Ｌ−６とｓＩＬ−６Ｒが共存する時に増殖する。慢性関
節リウマチ患者の滑液中には滑膜細胞が増殖するのに十
分な量のＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒが存在することから、
ＩＬ−６によるシグナル伝達が慢性関節リウマチの滑膜
細胞の異常な増殖に関与していることが示された。本発
明のＩＬ−６アンタゴニストを有効成分とする慢性関節
リウマチ治療剤はＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒの共存下で慢
性関節リウマチ由来滑膜細胞の増殖を抑制し、慢性関節
リウマチの治療効果を有することが証明される。したが
って、本発明のＩＬ−６アンタゴニストは、滑膜細胞の
異常な増殖がみられる慢性関節リウマチの治療剤として
期待される。
Ｌ−６とｓＩＬ−６Ｒが共存する時に増殖する。慢性関
節リウマチ患者の滑液中には滑膜細胞が増殖するのに十
分な量のＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒが存在することから、
ＩＬ−６によるシグナル伝達が慢性関節リウマチの滑膜
細胞の異常な増殖に関与していることが示された。本発
明のＩＬ−６アンタゴニストを有効成分とする慢性関節
リウマチ治療剤はＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒの共存下で慢
性関節リウマチ由来滑膜細胞の増殖を抑制し、慢性関節
リウマチの治療効果を有することが証明される。したが
って、本発明のＩＬ−６アンタゴニストは、滑膜細胞の
異常な増殖がみられる慢性関節リウマチの治療剤として
期待される。
【図１】図１は、ＩＬ−６またはｓＩＬ−６Ｒ単独存在
下、あるいはＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒ共存下での滑
膜細胞の 3Ｈチミジン取込み量を示す。
下、あるいはＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒ共存下での滑
膜細胞の 3Ｈチミジン取込み量を示す。
【図２】図２は、ＩＬ−１βおよびｓＩＬ−６Ｒ共存下
におけるＩＬ−６抗体あるいはＩＬ−６Ｒ抗体添加時の
滑膜細胞の 3Ｈチミジン取込み量を示す。
におけるＩＬ−６抗体あるいはＩＬ−６Ｒ抗体添加時の
滑膜細胞の 3Ｈチミジン取込み量を示す。
【図３】図３は、ＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒ共存下に
おけるＩＬ−６抗体あるいはＩＬ−６Ｒ抗体添加時の滑
膜細胞の 3Ｈチミジン取込み量を示す。
おけるＩＬ−６抗体あるいはＩＬ−６Ｒ抗体添加時の滑
膜細胞の 3Ｈチミジン取込み量を示す。
【図４】図４は、コラーゲン投与マウス関節炎モデルに
ＩＬ−６レセプター抗体を投与した時の関節炎点数（ａ
ｒｔｈｒｉｔｉｃ ｉｎｄｅｘ）を示す。
ＩＬ−６レセプター抗体を投与した時の関節炎点数（ａ
ｒｔｈｒｉｔｉｃ ｉｎｄｅｘ）を示す。
【図５】図５は、コラーゲンを免疫した後のマウスの血
中抗コラーゲン抗体価の推移を示す。
中抗コラーゲン抗体価の推移を示す。
【図６】図６は、コラーゲン免疫マウスの後肢関節の組
織切片の写真であり、生物の形態を表わす図面代用写真
である。（ａ）はＩＬ−６レセプター抗体投与群マウス
の、（ｂ）コントロール抗体投与群マウスの写真を示
す。ＩＬ−６レセプター抗体投与群では、肉芽組織の軟
骨、骨への侵潤（慢性増殖性滑膜炎）が明らかに抑制さ
れている。
織切片の写真であり、生物の形態を表わす図面代用写真
である。（ａ）はＩＬ−６レセプター抗体投与群マウス
の、（ｂ）コントロール抗体投与群マウスの写真を示
す。ＩＬ−６レセプター抗体投与群では、肉芽組織の軟
骨、骨への侵潤（慢性増殖性滑膜炎）が明らかに抑制さ
れている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 大杉 義征 静岡県御殿場市駒門１丁目135番地 中外 製薬株式会社御殿場研究所内 (72)発明者 岸本 忠三 大阪府富田林市中野町３−５−31
Claims (8)
- 【請求項１】 インターロイキン−６アンタゴニストを
有効成分とする慢性関節リウマチ治療剤。 - 【請求項２】 前記インターロイキン−６アンタゴニス
トが慢性関節リウマチにおいて滑膜細胞の異常な増殖を
抑制することを特徴とする請求項１の慢性関節リウマチ
治療剤。 - 【請求項３】 前記インターロイキン−６アンタゴニス
トがインターロイキン−６に対する抗体であることを特
徴とする請求項１の慢性関節リウマチ治療剤。 - 【請求項４】 前記インターロイキン−６がヒトインタ
ーロイキン−６であることを特徴とする請求項２の慢性
関節リウマチ治療剤。 - 【請求項５】 前記インターロイキン−６アンタゴニス
トがインターロイキン−６レセプターに対する抗体であ
ることを特徴とする請求項１の慢性関節リウマチ治療
剤。 - 【請求項６】 前記インターロイキン−６レセプターが
ヒトインターロイキン−６レセプターであることを特徴
とする請求項２の慢性関節リウマチ治療剤。 - 【請求項７】 インターロイキン−６アンタゴニストを
有効成分とする滑膜細胞増殖抑制剤。 - 【請求項８】 前記インターロイキン−６アンタゴニス
トがインターロイキン−６抗体又はインターロイキン−
６レセプター抗体である、請求項７に記載の滑膜細胞増
殖抑制剤。
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|---|---|---|---|
| JP6-244035 | 1994-10-07 | ||
| JP24403594 | 1994-10-07 | ||
| JP7284364A JP3067987B2 (ja) | 1994-10-07 | 1995-10-06 | Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分とする慢性関節リウマチ治療剤 |
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