JPH08205893A - Ｈｃｖプロテアーゼ活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 操作性および定量性に優れたＨＣＶプロテア
ーゼ活性の測定法、ならびにＨＣＶプロテアーゼ阻害剤
のスクリーニング法を提供する。 【構成】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）前駆体ポリプロ
テインの非構造タンパク質中のＮＳ３領域およびＮＳ４
Ａ領域、ならびに場合によりそれより下流領域をコード
する遺伝子を大腸菌で発現させ、単離精製して得られる
ＨＣＶプロテアーゼと、合成基質ペプチドとを試験管内
で反応させることからなる、ＨＣＶプロテアーゼ活性の
測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、抗ＨＣＶ剤開発に
不可欠なアッセイ系に関する。より詳しくは、本発明は
ＨＣＶプロテアーゼ活性の測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】本邦に於ける慢性非Ａ非Ｂ型肝炎患者は
１２０万人いると推定されているが、その６割がＣ型肝
炎ウイルス（ＨＣＶ）に因るものであるとされている。
又、慢性Ｃ型肝炎は高い確率で肝硬変、肝細胞癌へ移行
するとされる。しかも、ＨＣＶキャリアーは本邦では人
口の１〜２％を占め、若年層になるにつれて比率は低下
するものの、これらキャリアーは将来肝炎発症のリスク
を負っていることになる。したがって、非Ａ非Ｂ型肝炎
発症時の早い時期にウイルスを排除することが必要であ
る。インターフェロンによる治療は最も一般に行なわれ
る治療であるが、その治癒率は２０〜４０％に過ぎず、
また深刻な副作用や高価な経費の問題を有している。そ
こでより効果的な抗ＨＣＶ剤の開発が望まれている。

【０００３】ＨＣＶは１９８８年に米国Ｃｈｉｒｏｎ社
がウイルスの遺伝子の一部の塩基配列を明かにして以来
（(Q.-L. Choo et al., Science, 244, 359, (1989)、
G. Quo, et al. Science, 244, 362 (1989)））、分子
生物学的手法による遺伝子解明がなされた。その結果Ｈ
ＣＶはフラビウイルス、ペスチウイルスに近似のＲＮＡ
ウイルスであることが明かとなった。これらウイルス
は、遺伝子である一本鎖ＲＮＡをｍＲＮＡとして、宿主
細胞中で一続きの長い蛋白が翻訳される。ウイルス蛋白
はウイルス粒子を構成する構造蛋白とウイルス生活環の
なかで必要な機能を担っている非構造蛋白（ＮＳ）とに
分けられるが、構造蛋白は宿主のエンドペプチダーゼで
切断を受け、非構造蛋白はウイルス遺伝子から翻訳され
るプロテアーゼで切断され、機能型の蛋白となる。ウイ
ルス由来プロテアーゼは他のウイルス例えばＨＩＶ（ヒ
ト免疫不全ウイルス）等のレトロウイルス、ＨＡＶ（Ａ
型肝炎ウイルス）等のピコーナウイルスにも存在が確か
められている（H.-G. Krausslich and E. Wimmer, Ann.
Rev. Biochem. 57, 701, (1988)）。ＨＩＶ、あるいは
フラビウイルスに属する黄熱病ウイルス（T.J.Chambers
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8898 (199
0)）では、ウイルスプロテアーゼ阻害によってウイルス
の感染性が失われことが明かにされている。ＨＣＶに於
ては上記のごとく遺伝子解析によってプロテアーゼの存
在が予測されていたが、実際にプロテアーゼ活性を確か
めたのはウイルス遺伝子ＤＮＡの無細胞転写翻訳実験あ
るいは動物細胞（M.Hijikata et al., J. Virol., 67,
4665 (1993), A. Grakoui et al.,J. Virol., 67, 2832
(1993)）または大腸菌内での一過性の発現系において
である。

【０００４】これに対して、単離精製した酵素を用いて
プロテアーゼ活性を測定する酵素反応系は、操作性の良
さ、定量性が期待できる。特平表５−５０７６１２号に
は、単離精製した酵素を用いたアッセイの可能性が示唆
されているが、内容は予備的であり、新規酵素として必
要な要件を満たしていない。即ち、酵素の物質としての
特性、アミノ酸配列の特定、酵素の作用としての切断部
位の特定、あるいは力価の測定法等も示されていない。

【０００５】本発明者らは先の特許出願（特願平５−１
８８５４号）において、単離精製したＮＳ３酵素を用い
たアッセイの可能性を示すとともに、酵素特性、切断部
位を明かにした。ここでＮＳ３酵素とは、ＨＣＶの非構
造タンパク質領域のNS3領域に存在するプロテアーゼを
いう（図１参照）。しかし、ＮＳ３のみの発現による酵
素は不安定で活性も低く、より安定で切断活性の高い酵
素が望まれている。

【０００６】一方、酵素の活性に寄与する他の蛋白の可
能性として、Failla等は Hela細胞においてＮＳ３のみ
ではなくＮＳ４Ａを発現することがＮＳ３／ＮＳ４Ａ、
ＮＳ４Ｂ／５Ａの切断には必要であり、又、ＮＳ４Ａの
発現によりＮＳ４Ａ／４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／５Ａの切断も加
速されると報告している（J. Virol., 68, 3753 - 376
0 (1994)）。しかしこのような動物細胞発現系では、上
記のごとく操作性や定量性の点で各種の問題を有する。
即ち、細胞培養系によるプロテアーゼ阻害剤のアッセイ
は酵素反応系に比べて、操作性の点で以下の欠点をも
つ： １．Failla等の方法によるアッセイを行うには、 i）Hela細胞を4 x 10⁵ cells / plateまで前培養する
（１日〜７日） ii）Hela細胞にワクシニアウイルスを吸着させる（〜２
時間）。 iii）発現ベクターのトランスフェクションする（〜１
時間） iv）³⁵Sーメチオニンでラベルする(〜１時間） v）３時間後細胞を回収する vi）蛋白をイムノプレシピテイションする、ことが必要
であり、以上の手順で少なくとも２日を要する。 ２．細胞培養用の培地、血清、使い捨て器具を含めて消
耗品に費用がかかる。 ３．無菌操作等の操作が煩雑であり、熟練を要する。 ４．細胞の操作にクリーンベンチ、組換え実験にはそれ
に適した施設が必要である。

【０００７】また、感度、定量性については以下の欠点
を有する： １．細胞で発現される微量の蛋白の検出をするため、放
射性同位体か同等の高い感度を有する検出方法を用いな
ければならない。 ２．結果が細胞の状態に大きく依存し、アッセイ間で値
がばらつく。 ３．酵素反応の量的および時間的コントロールが困難で
ある。即ち酵素および基質の細胞で生合成され、酵素反
応が引き続いて起こり、生合成と酵素反応がほぼ平行し
て起こっている為、酵素及び基質の量、酵素反応の開始
の時点を決めにくい。 ４．細胞に含まれる未知の因子の関与を否定するため
の、数多くのコントロール実験が必要である。

【０００８】したがって、より簡単な操作で、定量性に
優れたＨＣＶプロテアーゼ活性の測定法が求められてい
る。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】感染性のあるＨＣＶの
産生にはウイルス蛋白のプロッセシングが必須であると
考えられる。したがって、ＨＣＶ非構造蛋白のプロセッ
シングに必須のウイルスプロテアーゼの阻害は、ＨＣＶ
感染を阻止すると考えられ、したがって副作用の少ない
有効な抗ＨＣＶ剤となる可能性を有している。このよう
な阻害剤開発には、効率のよいＨＣＶプロテアーゼ活性
の測定法の確立が不可欠である。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記従来
技術のもつ欠点を克服して効率のよいＨＣＶプロテアー
ゼ活性測定法を完成させるべく鋭意研究した結果、ＨＣ
Ｖプロテアーゼとして従来必要十分と考えられていたＮ
Ｓ３領域のみでなく、ＮＳ３より下流域を同時に大腸菌
で発現し、簡便な精製法で単離することにより、安定で
切断活性の高い単離酵素を大量に得ることができた。ま
た、ＨＣＶプロテアーゼの切断部位近傍の合成ペプチド
を基質として用い、上記酵素と組み合わせることによ
り、操作性および定量性に優れた測定法を完成すること
に成功した。また、本発明のＨＣＶプロテアーゼ活性の
測定法はプロテアーゼ阻害剤のスクリーニングにも有用
である。

【００１１】すなわち、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）前駆体ポリプロテインの非構造タンパク質中
のＮＳ３領域およびＮＳ４Ａ領域、ならびに場合により
それより下流領域をコードする遺伝子を大腸菌で発現さ
せ、単離精製して得られるＨＣＶプロテアーゼと、合成
基質ペプチドとを反応させることからなる、ＨＣＶプロ
テアーゼ活性の測定法を提供する。

【００１２】さらに、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＣＶ）前駆体ポリプロテインの非構造タンパク質中のＮ
Ｓ３領域およびＮＳ４Ａ領域、ならびに場合によりそれ
より下流領域をコードする遺伝子を大腸菌で発現させ、
単離精製して得られるＨＣＶプロテアーゼと、合成基質
ペプチドとを反応させる系において、反応系に試験化合
物を添加し、該合成基質ペプチドの切断反応の進行を、
試験化合物添加のものと添加しないものとで比較するこ
とからなる、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤のスクリーニン
グ法を提供する。

【００１３】本発明の測定法およびスクリーニング法で
は細胞培養系を使用せず、試験管内で、単離精製したＨ
ＣＶプロテアーゼと合成基質ペプチドを使用する。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明において、発現させるＨＣ
Ｖプロテアーゼ領域としてはＮＳ３およびＮＳ４Ａを含
む領域であれば、いかなる箇所でもよい。したがって、
発現させるＨＣＶプロテアーゼ領域としては、 i）ＮＳ３領域およびＮＳ４Ａ領域を含む領域、 ii）ＮＳ３領域、ＮＳ４Ａ領域およびＮＳ４Ｂ領域を含
む領域、 iii）ＮＳ３領域、ＮＳ４Ａ領域、ＮＳ４Ｂ領域および
ＮＳ５Ａ領域を含む領域、あるいは iv）ＮＳ３領域、ＮＳ４Ａ領域、ＮＳ４Ｂ領域、ＮＳ５
Ａ領域およびＮＳ５Ｂ領域を含む領域、 が含まれる。又、ＨＣＶにはいくつかのサブタイプが知
られているが、いずれのサブタイプのアミノ酸配列を用
いてもよい。

【００１５】上記のＨＣＶ非構造領域遺伝子に相当する
cDNA断片の構成および構築は先の特許出願の明細書（特
願平５−１８８５４号）、及びJ.Virol., 67, 4665 (19
93)、あるいはProc.Natl. Acad.Sci. USA, 90, 10773(1
993)に述べる方法によって実施できる。

【００１６】ＨＣＶプロテアーゼは上記遺伝子を用い、
大腸菌、動物細胞、昆虫細胞、ウサギ網状赤血球溶血液
などで発現させることができる。

【００１７】これらのＨＣＶプロテアーゼを発現させる
発現ベクターは、効率よく融合蛋白の発現できるものな
らばいかなるものでもよい。例えば、ｐＴＺ１８、ｐＴ
Ｚ１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＫＳ、ＳＫ、ｐＨＳＧ３９８、ｐＲＳＥＴ、ｐＧＥ
Ｘ−２Ｔ、ｐＲＩＴ２Ｔなどが挙げられる。発現したプ
ロテアーゼの安定性を増し、精製が容易に行えるよう
に、プロテアーゼのアミノ酸末端側にマルトースバイン
ディングプロテイン（ＭＢＰ）との融合した状態で発現
するｐＭＡＬ−ｃなどが好ましい。発現に用いる大腸菌
株としてはＨＢ１０１、ＴＢ１、ＪＭ１０５などを用い
ることができるが、組換えプラスミドの変異が起こりに
くいｒｅｃＡ^-の菌株ＪＭ１０９が好ましい。

【００１８】基質として用いる合成ペプチドは、ＨＣＶ
プロテアーゼの切断部位として特定されているNS3/NS4
A、NS4A/NA4B、NS4B/NS5A、NS5A/NS5Bの各切断部位近傍
のアミノ酸配列を有しているものであればよく、これら
のコンセンサスなアミノ酸以外の１または２以上のアミ
ノ酸を置換、欠失または付加してもよい。コンセンサス
なアミノ酸とはNS3/NS4A、NS4A/NA4B、NS4B/NS5A、NS5A
/NS5Bの各切断点近傍のアミノ酸配列に保存されたアミ
ノ酸のことである。即ち、以下の表I中の下線で示した
アミノ酸のことである。

【００１９】表I ＨＣＶサブタイプ 配列 ＨＣＶ中の部位 H-FDA CMSADLEVVT STWVLVGGVL NS3 / NS4A H-AP CMSADLEVVT STWVLVGGVL HCV-1 CMSADLEVVT STWVLVGGVL HCV-J CMSADLEVVT STWVLVGGVL HCV-BK CMSADLEVVT STWVLVGGVL HC-J6 CMQADLEVMT STWVLAGGVL HCV-T CMSADLEVVT STWVLVGGVL HC-J8 CMQADLEIMT SSWVLAGGVL HCV-JT, JT' CMSADLEVVT STWVLVGGVL H-FDA YQEFDEMEEC SQHLPYIEQG NS4A / NS4B H-AP YQEFDEMEEC SQHLPYIEQG HCV-1 YREFDEMEEC SQHLPYIEQG HCV-J YQEFDEMEEC ASHLPYIEQG HCV-BK YQEFDEMEEC ASHLPYIEQG HC-J1, J4 YEAFDEMEEC ASRAALIEEG HCV-T YQEFDEMEEC ASHLPYIEQG HC-J8 YQAFDEMEEC ASKAALIEEG HCV-JT, JT' YREFDEMEEC ASHLPYIEQG H-FDA WISSECTTPC SGSWLRDIWD NS4B / NS5A H-AP WISSECTTPC SGSWLRDIWD HCV-1 WISSECTTPC SGSWLRDIWD HCV-J WINEDCSTPC SGSWLKDVWD HCV-BK WINEDCSTPC SGSWLRDVWD HC-J1, J4 WITEDCPIPC SGSWLRDVWD HCV-T WINEDCSTPC SGSWLRDVWD HC-J8 WITEDCPVPC SGSWLQDIWD HCV-JT WINEDCSTPC SGSWLKDVWD HCV- JT' WINEDCSTPC SGSWLRDVWD H-FDA GADTEDVVCC SMSYTWTGAL NA5A / NS5B H-AP GADTEDVVCC SMSYSWTGAL HCV-1 EANAEDVVCC SMSYSWTGAL HCV-J GEAGEDVVCC SMSYTWTGAL HCV-BK EEASEDVVCC SMSYTWTGAL HC-J6 SEEDDSVVCC SMSYSWTGAL HCV-T EEDGEGVICC SMSYTWTGAL HC-J8 SDQEDSVICC SMSYSWTGAL HCV-JT, JT' GEASDDIVCC SMSYTWTGAL コンセンサス D C S E T A (Grakoui, et al., J. Virol., 67, 2832(1993))

【００２０】上記コンセンサスなアミノ酸ＤまたはＥ、
ＣまたはＴ、ならびにＳまたはＡは各位置で自由に組み
合わせることができる。すなわち、上記のＤ，Ｃ，Ｓや
Ｅ，Ｔ，Ａの組み合わせのみでなく、Ｄ，Ｔ，ＳやＥ，
Ｃ，Ｓの組み合わせであってもよい。

【００２１】合成ペプチドの長さは５〜２５アミノ酸が
よいが、好ましくは、１０〜２０アミノ酸である。例え
ば、YQEFDEMEEC ASHLPYIEQG、WINEDCSTPC SGSWLKDVWD、
GEAGDDIVCC SMSYTWTGAL等があげられる。最も好ましい
ものは、GEAGDDIVPC SMSYTWTGAL、GEAGDDIVPC SMSYTW
T、DDIVPC SMSYTWT、DDIVPC SMSYTであり、これらは大
腸菌内で切断反応が最も速く進行するNS5A / NS5Bの切
断点を含むアミノ酸配列をほぼ有している。しかも本来
のアミノ酸配列GEAGDDIVCC SMSYTWTGALでは、隣り合っ
た２つのシステインが速やかにジスルフィド結合を形成
して酵素反応を受けない化合物になる欠点を、P2をプロ
リンに変換することによって改良したものである。P2位
のプロリンは天然型 NS4B / NS5A切断点に存在してお
り、ＨＣＶプロテアーゼの天然型切断点の認識になんら
支障を与えるものではないのみならず、ペプチドの溶解
性を高める。

【００２２】また、これらのペプチドのＮ末端あるいは
Ｃ末端を蛍光、発光、発色基、アフィニティーリガン
ド、抗原などでラベルすることができる。例えば、Ｎ末
端を蛍光試薬のダンシル基(Dns-)、FITC基でラベルした
ものはHPLC検出で感度よく夾雑物の干渉なくペプチドの
シグナルを検出することができる。又、アフィニティー
リガンドであるビオチンをＮ末端あるいはＣ末端ラベル
し、アビジンコートしたミクロタイタープレートに固定
化し、ELISA法で検出が行なえる。または、ABC法で検出
することもできる。さらに、抗原であるジゴキシゲニン
(Dig)でＮ末端あるいはＣ末端をラベルすれば、抗Dig抗
体で検出できる。

【００２３】酵素反応の条件として、pHは５〜１０で行
なうことができるが、好ましくはpH７〜８である。二価
のイオンとして、カルシウム、マグネシウム、マンガン
を加えることができる。反応温度は０〜９０℃で行なう
ことができるが、好ましくは２５〜６０℃である。

【００２４】反応の検出はHPLC、TLC、ELISA法を用いる
ことができる。

【００２５】反応は経時的に進行し、 i）ＮＳ３領域およびＮＳ４Ａ領域を含む領域、 ii）ＮＳ３領域、ＮＳ４Ａ領域およびＮＳ４Ｂ領域を含
む領域、 iii）ＮＳ３領域、ＮＳ４Ａ領域、ＮＳ４Ｂ領域および
ＮＳ５Ａ領域を含む領域、および iv）ＮＳ３領域、ＮＳ４Ａ領域、ＮＳ４Ｂ領域、ＮＳ５
Ａ領域およびＮＳ５Ｂ領域を含む領域、 を発現させたＨＣＶプロテアーゼのいずれを用いても２
時間後には基質の９０％以上が切断された。これに対し
てＮＳ３領域のみを発現させたＨＣＶプロテアーゼを用
いた場合には反応の進行が他のプロテアーゼに比べて著
しく遅かった（図３および表２参照）。

【００２６】さらに、このような本発明のＨＣＶプロテ
アーゼ活性測定法を用いてプロテアーゼ阻害剤をスクリ
ーニングすることができる。上記したＨＣＶプロテアー
ゼと、合成基質ペプチドとを反応させる系において、反
応系に阻害剤の候補となる試験化合物を添加し、該合成
基質ペプチドの切断反応の進行を、試験化合物添加のも
のと添加しないものとで比較するによってスクリーニン
グを行うことができる。本発明のスクリーニング法にお
いては、実施例４に示すように、酵素反応液に試験化合
物を加えて、３７℃１５分プレインキュベーションし、
次いでＮ末端を蛍光標識したペプチド基質を添加して３
７℃で１０分反応させる。その後、９０℃５分加熱して
反応を止め、氷上保存して測定できる。したがって、１
時間以内で測定を完了することができ、上記した細胞培
養系に比べて極めて短時間で測定を行うことができる。
また、無菌操作などの煩雑な操作を伴わず、使用する施
設も簡単なものでよい。さらに、細胞を用いないので、
細胞培養系に比べて測定間のバラツキがなく、信頼のお
ける結果が得られる。放射性同位体などの検出方法を用
いる必要がない点も本発明の利点である。

【００２７】本発明の別の態様では、本発明は、以下の
工程からなるＨＣＶプロテアーゼ活性の測定法を提供す
る： （１）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）前駆体ポリプロテイ
ンの非構造タンパク質中のＮＳ３領域およびＮＳ４Ａ領
域、ならびに場合によりそれより下流領域をコードする
遺伝子を大腸菌で発現させ、単離精製して得られるＨＣ
Ｖプロテアーゼと、ビオチンまたは抗原物質または抗体
物質で標識（標識ａ）した合成基質ペプチドとを反応さ
せる； （２）工程（１）の切断産物である標識ペプチドを、さ
らに抗原物質で標識（標識ｂ）する； （３）ペプチドに標識した前記抗原物質に、前記抗原に
対する酵素標識抗体を結合する；そして （４）工程（３）の酵素の活性を測定する；ただし、工
程（２）、工程（３）または工程（４）の前に、標識ａ
に対する親和性を利用して標識ペプチドの固定化を行
う。

【００２８】この方法は、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤の
スクリーニングなどのように、多数の試料についてその
活性を測定しなければならない場合において、処理能力
の高いＥＬＩＳＡ法の汎用性を高め、基質の変化に容易
に対応できる点で有用である。この方法は、従来のＥＬ
ＩＳＡ法に先立って、酵素反応後、生成物に抗原物質を
結合させるポストラベル法である。

【００２９】上記方法で使用する合成基質ペプチドは、
プロテアーゼ切断で生じたアミノ基に対して特異的に標
識反応を行うため、このアミノ基以外に反応しうるアミ
ノ基が存在していてはならない。また、標識反応で得ら
れた反応生成物を固定化するために、合成基質ペプチド
の切断部位のＣ末側またはＮ末側をビオチンまたは抗原
物質または抗体物質であらかじめ標識しておく必要があ
る（この標識を標識ａという）。このような条件を満た
す限り、基質ペプチドのアミノ酸配列は、酵素の基質特
異性の範囲内で自由に設計することができる。

【００３０】しかし、以下の実施例に示すように基質ペ
プチド中にシステインが含まれている場合には、切断反
応で生じたアミノ基以外に、システインのチオール（Ｓ
Ｈ）基も抗原物質で標識されることがある。このような
基質ペプチドを用いる場合には、アミノ基に対する標識
反応に先立って、システインのチオール基を修飾してチ
オール基が抗原物質で標識されないようにしなければな
らない。チオール基の修飾剤としては、その後のアミノ
基に対する標識反応を阻害せず、さらにその後の処理に
も影響しないものであれば、特に限定されない。好まし
いチオール基の修飾剤は、Ｎ−メチルスクシミド、Ｎ−
エチルスクシミドなどのＮ−アルキルスクシミド、およ
びヨード酢酸、ヨード酢酸ナトリウムを含む。ヨード酢
酸、ヨード酢酸ナトリウムは水に対する溶解度が高いた
め特に好ましい。これらの修飾剤は、水または緩衝液、
アルコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムア
ミドなどの溶液として用いる。反応条件は特に限定され
ないが、反応温度として室温〜５０℃、反応時間として
３０分〜６０分の範囲で十分である。チオール基修飾剤
の量は、試料中に含まれるチオール基に対して、上記の
反応条件下で完全に修飾反応が進行すればよく、特に制
限はない。

【００３１】次いで、上記反応での切断産物である標識
ペプチドをさらに抗原物質で標識する（この標識を標識
ｂという）。例えば、標識ａを基質ペプチドの切断部位
のＮ末側に付けた場合には、標識ｂをカルボキシル基に
対して行う。

【００３２】抗原物質としては、それに対する抗体を作
製できる物質であれば、その種類は限定されない。この
抗体は通常のＥＬＩＳＡでの二次抗体に相当するもので
あり、実際の使用に際しては検出反応に用いる酵素で標
識しなければならないため、入手の容易さから、既に酵
素標識された抗体が市販されているジゴキシゲニンが適
している。しかしながら、ジゴキシゲニン自体はアミノ
基と反応しないため、アミノ基をジゴキシゲニンで標識
するために、ジゴキシゲニンをアミノ基の修飾剤である
ヒドロキシスクシミド化しなければならない。すなわ
ち、アミノ基に対する標識反応は、ジゴキシゲニン−３
−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−
ヒドロキシスクシミドエステル（以下、ＤＩＧ−ＮＨＳ
という）などのジゴキシゲニン標識試薬を用いて行う。
ＤＩＧ−ＮＨＳの溶剤としては、水と完全に混和し、Ｄ
ＩＧ−ＮＨＳ自身と反応しないものであれば、特に限定
されない。ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミ
ドが好ましい。反応温度は特に限定されないが、室温〜
５０℃の範囲で十分である。また、反応時間も特に限定
されないが、３０分〜６０分で十分である。ＤＩＧ−Ｎ
ＨＳの濃度は特に限定されないが、反応温度、反応時
間、および使用量に応じて、０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの
範囲で使用可能である。

【００３３】ジゴキシゲニンの標識反応には過剰量のＤ
ＩＧ−ＮＨＳを用いるため、次の工程（固定化、酵素反
応）以降の支障とならないように、未反応のＤＩＧ−Ｎ
ＨＳの不活化処理を行う。不活化処理は、過剰量のアミ
ノ基を有する物質を加えてＤＩＧ−ＮＨＳと反応させる
ことによって実施できる。このような物質としては、一
級アミノ基を有し、水溶性の物質であれば特に限定され
ない。好ましい例として、アミノ酸およびその誘導体を
挙げることができる。水溶液のｐＨは、微アルカリ性、
好ましくはｐＨ７．５〜１０の範囲である。濃度および
使用量は、ＤＩＧ−ＮＨＳの濃度および使用量に応じて
変更でき、未反応のＤＩＧ−ＮＨＳと完全に反応すれば
よく、特に限定されない。また、反応条件も特に限定さ
れないが、室温〜５０℃の範囲の温度で、３０分〜６０
分の時間で十分である。

【００３４】以上の処理によりプロテアーゼ切断で生じ
た断片の末端アミノ基に対するジゴキシゲニンの選択的
な標識が可能となる。

【００３５】次いで得られたジゴキシゲニンで標識され
た切断断片を固定化する。ただし、請求の範囲に記載す
るように、固定化の時期はこの段階であっても、あるい
は上述した標識ｂを行う前であっても、あるいは酵素活
性の測定直前であってもよい。

【００３６】固定化を行うには、標識ａに対する親和性
を利用する。例えば、標識ａがビオチンである場合には
アビジンまたはストレプトアビジンを、標識ａが抗原で
ある場合には該抗原に対する抗体を、標識ａが抗体であ
る場合には該抗体に対する抗原を用いて担体に固定化を
行う。担体としては固体担体が好ましく、例えば任意の
大きさ、形状に成型されたスチレンやポリスチレンなど
の高分子担体の他、これらの材料で成型した反応容器の
内壁、具体的には標識ａに対して親和性を示す物質（ス
トレプトアビジン、抗体、抗原）をコーティングしたチ
ューブ、マイクロタイタープレート、ビーズ、カラム担
体などを用いて行う。固定化は検出感度、基質量および
反応液量に応じて、ジゴキシゲニン標識反応液の全量も
しくはその一部を用いて行うことができる。その際、界
面活性剤を含む緩衝液で希釈することも可能である。界
面活性剤としては、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−
４０、ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、トリトン（Ｔｒｉ
ｔｏｎ）Ｘ−１００などの非イオン性の界面活性剤が好
ましく、その濃度は０．００１〜１％で十分である。固
定化の温度および時間は特に限定されないが、温度は４
℃（冷蔵庫内）〜３７℃の範囲で、時間は１〜２４時間
の範囲で行うことができる。

【００３７】未反応の基質ペプチドおよび標識された切
断生成断片の固定化を行った後、反応液中の酵素などの
夾雑物を除くために洗浄を行う。洗浄液には、固定化の
ときに用いた希釈液の他に、生化学実験で汎用されてい
るＴＢＳ（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎ
ｅ）やＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ
Ｓａｌｉｎｅ）などの緩衝液を用いることができる。

【００３８】これ以降の操作は通常のＥＬＩＳＡと同様
に行うことができる。すなわち、洗浄後、ペプチドに標
識した前記抗原物質に、前記抗原に対する酵素標識され
た抗ジゴキシゲニン抗体（以下、酵素標識抗体という）
を結合させる。結合工程の前に、固定化に用いた器具表
面での非特異的吸着を防ぐために、ブロッキング試薬に
よる処理を行うことが好ましい。ブロッキング試薬とし
て、ウェスタンブロット法などで用いるスキムミルク、
カゼインなどを用いることができる。ブロッキング処理
は、４℃〜３７℃の温度で、１〜２４時間の範囲で行う
ことができる。

【００３９】基質ペプチドの切断断片に選択的に標識さ
れたジゴキシゲニンに対する酵素標識抗体の結合は、標
識されている酵素（標識酵素）の安定性にもよるが、４
℃〜３７℃の温度で、１〜数時間の範囲で行うことがで
きる。通常、室温中、１時間で十分である。標識酵素に
は、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼが多く
用いられるが、特に限定されない。

【００４０】結合しなかった余分の酵素標識抗体を除く
ために、ＴＢＳなどの緩衝液で洗浄する。その後、標識
酵素に対する基質溶液を加えて、酵素反応を行う。酵素
反応を酸またはアルカリによって停止させた後、酵素反
応によって生じた生成物の吸光度または蛍光強度を測定
する。

【００４１】本発明によるこの方法を用いると、反応生
成物をジゴキシゲニンなどの抗原物質で標識することに
よって従来のＥＬＩＳＡ法と同様の操作で測定できる。
さらに、従来のＥＬＩＳＡ法では測定対象物質に対する
抗体（一次抗体）が必要であったが、本発明の方法では
測定対象物質に特異的な抗体を必要としないため、広範
囲で使用可能である。

【００４２】以下の実施例７〜１２では、ＨＣＶプロテ
アーゼとしてＨＣＶのＮＳ３領域、ＮＳ４Ａ領域および
ＮＳ４Ｂ領域を含む領域由来のプロテアーゼ（３４５Ｐ
ｓ）、基質ペプチドとしてビオチン化（Ｃ末端リジンの
ε−アミノ基）およびアセチル化（Ｎ末端アミノ基）し
たＡｃ・ＧＥＡＧＤＤＩＶＰＣＳＭＳＹＴＷＴＫ［Ｂｉ
ｏ］を用いた例を示すが、本発明の方法はこの実施例に
限定することなく、広く使用できる。

【００４３】本発明のＨＣＶプロテアーゼ活性測定法お
よびプロテアーゼ阻害剤のスクリーニングを以下の実施
例により詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定
されない。

【００４４】

【実施例】

実施例１：酵素発現ベクターの構築 ＨＣＶ非構造領域遺伝子に相当するcDNA断片の構成およ
び構築は先の特許出願の明細書（特願平５−１８８５４
号）、及びJ.Virol., 67, 4665 (1993)、あるいはProc.
Natl. Acad.Sci. USA, 90, 10773(1993)に述べるとうり
である。

【００４５】pMANS2d3X：特願平５−１８８５４号に述
べるとうり、ベクターpMal-cにＨＣＶのORF（オープン
リーディングフレーム）上985 - 1325番のアミノ酸に相
当するcDNA断片を挿入したものである。

【００４６】pMANS34NsH：pTZ18にＨＣＶのORF上722 -
1647番のアミノ酸に相当するcDNA 断片を挿入したpN722
- 1647をSac II - Hind IIIで切断し、pMANS2d3Xの同
じ制限酵素で切断したものに挿入し、pMANS34Nsを得
た。これをEcoT22 - Hind IIIで切断し、合成DNA断片を
挿入し、pMANS34NsHを得た。

【００４７】pMANS34Sm：pTZ18にＨＣＶのORF上722 - 1
908番のアミノ酸に相当するcDNA 断片を挿入したpN722
- 1908をSac II - Hind IIIで切断してえたフラグメン
トを、pMANS2d3Xの同じ制限酵素で切断したフラグメン
トと置換し、pMANS34Smを得た。p MANS345C：pTZ18にＨ
ＣＶのORF上729 - 3010番のアミノ酸に相当するcDNA 断
片を挿入したpN729 - 3010をSac II -Sal Iで切断し、p
MANS2d3Xの同じ制限酵素で切断したものに挿入し、pMAN
S345Cを得た。

【００４８】pMANS345Bs：pTZ18にＨＣＶのORF上722 -
2472番のアミノ酸に相当するcDNA 断片を挿入したpN722
- 2472をPst I - Hind IIIで切断してえたフラグメン
トを、pMANS345Cの同じ制限酵素で切断したフラグメン
トと置換し、PMANS345Bsを得た。

【００４９】pMANS345Ps：pMANS345C をPst Iで切断
し、再び酵素的に結合し、小さなフラグメントを欠失さ
せpMANS345Psを得た。

【００５０】実施例２：酵素の発現と精製 上記の発現ベクターで大腸菌株JM109コンピテント細胞
を形質転換する。形質転換した大腸菌は50μg / μl ア
ンピシリンを含むLBrothで一夜37℃前培養し、50μg /
μl アンピシリンを含むLBrothで希釈し(20 - 30 倍)、
37℃約2時間培養した。濁度がOD₆₀₀ = 0.5〜 0.7になっ
た時点で最終濃度0.5 mMのイソプロピルベータチオガラ
クトシドを加え、さらに20℃で3時間培養した後、培養
液を遠心し菌体を集めた。菌体は−８０℃の冷凍庫で保
存した。

【００５１】保存した菌体を培養液の１／１０容のバッ
ファーA(10 mM Na-燐酸バッファーpH7.2、30 mM NaCl、
10 mM ベータメルカプトエタノール)に懸濁し、超音波
破砕機で氷冷下10分細胞を破砕した。遠心分離して上清
を得、上清に70 % 飽和になるように硫酸アンモニウム
を加え、蛋白を沈殿させた。沈殿を遠心分離で集め、上
清の１／２容のバッファーＡに溶解し、アミロース樹脂
カラムにアプライした。カラムはバッファーＡで洗浄
後、バッファーＢ(10 mM Na-燐酸バッファー pH7.2、30
mM NaCl、10 mM ベータメルカプトエタノール、0.2 %
Tween 20)、バッファーＣ(10 mM Na-燐酸バッファー pH
7.2、500 mM NaCl、10 mM ベータメルカプトエタノー
ル)で洗浄した。カラムに結合した蛋白を10 mM マルト
ースを添加したバッファーＡで溶出した。溶出した蛋白
は限外濾過で濃縮し、最終濃度が５０％になるようにグ
リセロール添加し、−２０℃の冷凍庫で保存した。得ら
れた酵素を分析した。即ち、得られた酵素標品をサンプ
ルバッファーに溶解し、１００℃５分加熱した後、SDS-
ポリアクリルアミドゲルにアプライし電気泳動後、ク−
マシーブリリアントブルーで染色した。あるいは電気泳
動後、展開した蛋白をPVDF膜にトランスファーし、抗NS
3抗体および抗MBP抗体でウヱスタンブロットした。

【００５２】実施例３：基質ペプチドの合成 ペプチドDns-GEAGDDIVPC SMSYTWTGAL、Dns-GEAGDDIVAC
SMSYTWTGAL、Dns-GEAGDDIVPN SMSYTWTGAL、Dns-GEAGDDI
VP(D)C SMSYTWTGAL、Dns-GEAGDDIVPC SMSYTWT、Dns-GEA
GDDIVPC SMS、Dns-GEAGDDIVAC SMS、Dns-GEAGDDIVCC SM
S、Dns-DDIVPC SMSYT、Dns-DDIVPC SMS、Dns-DDIVPC SM
SYTWT、Dns-GEAGDDIVPC SMSYTWTK、Dns-GEAGDDIVSC SMS
YTWTGAL、Dns-WINEDCSTPC SGSWLKDVWP、Dns-YQEFDEMEEC
ASHLPYIEQGはペプチド合成機を用いて固相法で行なっ
た。すなわち、αアミノ基をt-ブチルオキシカルボニル
基で保護し、側鎖のカルボキシル基をシクロヘキシル
基、水酸基をベンジル基、チオール基をメチルベンジル
基、そしてεーアミノ基をベンジルオキシカルボニル基
で保護した第２アミノ酸を、カルボキシル基が樹脂に結
合したαアミノ基が無保護の第１アミノ酸にジシクロヘ
キシルカーボジイミドを用いて縮合した後、αーアミノ
基の保護をトリフロロ酢酸で除去した。第３以下のアミ
ノ酸についても同様にして順次Ｃ端からＮ端へ合成し
た。全鎖合成後αーアミノ基の保護をトリフロロ酢酸で
除去し、ダンシルクロリドで修飾し、樹脂からの切り出
しと脱保護をフッ化水素で行ない上記各ペプチドを得
た。

【００５３】Ac-GEAGDDIVPC SMSYTWTK-Bioは、αーアミ
ノ基を保護し、樹脂に固相化したリジンのεーアミノ酸
をビオチン化し、保護したアミノ酸を用いて固相合成
後、Ｎ末端をアセチル化した後に脱保護した。

【００５４】Dig-GEAGDDIVPC SMSYTWTK-Bioは同様な固
相合成、脱保護の後ジスルフィド結合を形成させ、Ｎ末
端アミノ基の標識をジゴキシゲニン−３−O−サクシニ
ル[２−（Ｎ−マレイミド）]エチラミド（Digoxigenin-
3 - O - succinyl -[2-(N -maleimido)] - ethylamid
o）で行ないDTTでジスルフィド結合を切断し得た。

【００５５】実施例４：酵素反応 標準的な酵素反応は以下のような条件で行った。50 mM
Tris HCl pH 7.6、 30mM NaCl、 10 mM DTT、酵素蛋白4
μg - 8μgを含む酵素反応液100 μlに、DMSOあるいは
水溶液で溶解した試験化合物を最終濃度が1 - 10μg/ml
になるように加え、 37℃15分プレインキュベーション
し、HPLC法ではＮ末端を蛍光標識したペプチド基質（DM
SO溶液）最終濃度86μM（最終DMSO濃度：２％）を添加
して反応を開始した。37℃で反応した後、90 ℃ 5分加
熱して反応を止め、氷上保存した。ELISA法では、Ｎあ
るいはＣ末端を蛍光標識、あるいはアフィニティー標識
した基質を同様に反応させた。

【００５６】実施例５：検出 （１）HPLC法 反応液5μlをとり、逆相HPLC（φ4.6 mm x 15 cm）にア
プライした。カラムは50 mM 酢酸アンモニウム(pH 6.5)
中 22.5 % →60%のアセトニトリルの直線濃度勾配（10
分）で溶出し、未反応のペプチド基質 と切断産物のＮ
末端側断片の蛍光シグナルをexcitation : 340 nm 、em
ission : 510 nmで検出した。切断率は両者の面積の比
から求めた。

【００５７】（２）ELISA法 N末端にジゴキシゲニン（Dig）で標識し、C末リジンの
側鎖のアミノ基をビオチン（Bio）標識した基質Dig-GEA
GDDIVPC SMSYTWTK-Bioを酵素反応した後、反応液1μlを
とり、2% ２ーメルカプトエタノールと0.01% NP-40を加
えた燐酸緩衝液(pH8.5)で2000倍に希釈し、10 μlをス
トレプトアビジンでコートしたミクロタイタープレート
に加えた。室温１時間放置後、プレートを洗浄し、アル
カリフォスファターゼ標識抗Dig抗体と室温１時間反応
した。プレートを洗浄後、アルカリフォスファターゼ基
質２，２’−アジド−ジ−（３−エチルベンズチアゾリ
ンサルフェート）（2,2' - Azido - di-(3-ethylbenzth
iazoline sulfate)）溶液200μlを加え室温１０分反応
し、1 N NaOH 50μlを加え反応を停止した。405 nmの吸
光度を測定し、残存Dig量を検出した。

【００５８】実施例６：結果 （１）酵素の名称 上記のように発現プラスミド pMANS34NsH、 pMANS34Sm、
pMANS345C、 pMANS345Bs、 pMANS345Ps を大腸菌に感染さ
せ、マルトース結合蛋白と融合蛋白として発現し、アミ
ロース樹脂で精製した酵素をそれぞれ34NsH、34Sm、345
C、345Bs、345Psと称する。図１に各々発現プラスミド
の名称と挿入したＨＣＶ遺伝子の領域をしめす。

【００５９】（２）酵素反応の検出 酵素345Ps 0.04 μgと合成基質Dns-GEAGDDIVPC SMSYTWT
を上記の条件で反応したときのHPLCのクロマトグラムを
図２に示す。未反応の基質は保持時間７〜８分に、切断
を受けた産物は保持時間３〜４分にそれぞれに溶出され
た。この時切断率は２４％であった。

【００６０】（３）時間反応曲線 34NsH、34Sm、345C、345Bs、345Ps各0.08μg / μlを上
記の反応条件で合成基質Dns-GEAGDDIVPC SMSYTWTと反応
させた時間反応曲線を図３に示す。反応は経時的に進行
し、２時間後には34Sm、345C、345Bs、345Psでは基質の
90 %以上が切断された。しかし、34NsHでは反応の進行
は他の酵素の比べ著しく遅かった。

【００６１】次いで切断された反応液中のペプチドのＮ
末端をアミノ酸シークエンサーで分析した。未切断の基
質および切断産物のＮ端側の断片はダンシル基でアミノ
末端が保護され、分析されず、切断産物のＣ端の断片の
Ｎ末端からのアミノ酸配列が分析できるが、結果は期待
されたとおりのSMSYTWTのアミノ酸配列であり、切断が
正しい切断部位で起こっていることを確認した。

【００６２】（４）反応速度 34NsH、34Sm、345C、345Bs、345Psの反応速度を比較し
た。反応条件は酵素 0.08 μg/μl、標準溶液（50 mM T
ris HCl (pH7.6), 30 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 10mM DT
T） 中、37℃でプレインキュベーション 30分後、 0.05
μg/μl、0.1μg/μl、0.2μg/μl、0.5μg/μl、1μg
/μl、2μg/μlの基質をいれ、37 ℃10分反応した。反
応は70 ℃5分加熱して止めた。得られた結果を以下の表
IIに示す。表IIから明らかなように、切断活性は345P
s、345Bsが最高であり、345C、34Smの順であった。34Ns
Hはこれらに比し著しく低かった。

【００６３】

【表１】

【００６４】（５）阻害剤の効果 実施例４に記載の方法を用いて、セリンプロテアーゼ阻
害剤の一つであるPMSF（フェニルメタンスルフォニルフ
ロリド）のプロテアーゼ活性に及ぼす効果を調べた。酵
素には345Psを、基質には Dns-GEAGDDIVPC SMSYTWT を
用い、1mM および 10mM 濃度のPMSF の効果を検討し
た。対照としてプロテアーゼ活性をもつトリプシンを用
いた。

【００６５】得られた結果を図４に示す。プロテアーゼ
活性は、トリプシンと同様に10mM PMSFで阻害を受けた
が、その程度はトリプシンより小さかった。

【００６６】実施例７：チオール基修飾 実施例４に記載の方法によって得られた反応液（反応時
間：３時間）を試料として用いた（この反応液には、Ｈ
ＰＬＣ分析により未反応基質の存在は認められなかっ
た）。

【００６７】（１）チオール基の修飾 ５μｌのＮ−エチルマレイミド（１００ｍＭ、エタノー
ル溶液）に１μｌの反応液を加え、撹拌後、室温（２３
℃）で３０分、チオール基の修飾反応を行った。これに
５μｌのＤＩＧ−ＮＨＳ（ベーリンガー・マンハイム社
製：０．４ｍｇ／ｍｌ、ジメチルスルホキシド溶液）を
加え、撹拌した後、さらに室温で３０分反応を行った。
次いで１０μｌのグリシン水溶液（５００ｍＭ、水酸化
ナトリウムでｐＨを８．５に調節）を加えて、さらに室
温で９０分反応を行った。このようにして得られた反応
液に、１００μｌの固定用希釈液（５０ｍＭ、リン酸緩
衝液（ｐＨ８．５）、０．０１％ノニデットＰ−４０）
を加えて撹拌した。

【００６８】（２）プレートへの固定 （１）の全量をストレプトアビジン・コーティド・マイ
クロタイタープレート（ベーリンガー・マンハイム社
製）に入れ、撹拌し、室温で放置した。１時間後、内容
物を捨て、３５０μｌの固定用希釈液、ＴＢＳで順次洗
浄した。３００μｌの５０％ブロックエース（大日本製
薬（株）社製：ＴＢＳで希釈）を加え、１時間放置し
た。内容物を捨て、３００μｌのＴＢＳで２回洗浄し
た。

【００６９】（３）抗ジゴキシゲニン抗体およびアルカ
リホスファターゼによる標識 （２）で得られたプレートに２００μｌのアルカリホス
ファターゼ標識の抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガー
・マンハイム社製：ＴＢＳで１０００倍に希釈：０．７
５Ｕ／ｍｌ）を加え、１時間放置した。３００μｌのＴ
ＢＳで２回洗浄した後、アルカリホスファターゼの基質
として２００μｌのｐ−ニトロフェノールリン酸２ナト
リウム溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ：１００ｍＭ炭酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ９．８）、２ｍＭ塩化マグネシウム）
を加え、室温（２３℃）で１５分反応を行った。５０μ
ｌの水酸化ナトリウム（１Ｎ）を加えて反応を停止さ
せ、吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。同様の処理を未
反応液（基質溶液）およびＴＢＳを用いて行った。さら
に、チオール基の修飾としてのＮ−エチルマレイミド処
理を行わない場合についても、同様の操作を行った。得
られた結果を表IIIに示す。

【００７０】 表III チオール基修飾の効果（吸光度） 修飾 反応液 未反応液 ＴＢＳ 有 １．５８３ ０．２４３ ０．２３４ 無 １．７５２ １．０７１ ０．２３０

【００７１】実施例８：反応生成物量と吸光度との関係
（１） 実施例７で用いた反応液および未反応液のそれぞれを等
量のジメチルスルホキシドで希釈した後、ビオチン量が
一定になるように両者を種々の割合で混合した。得られ
た混合試料の１μｌを用いて、実施例７と同様の操作を
行った（室温：２３℃）。ただし、Ｎ−エチルマレイミ
ド処理およびジゴキシゲニン標識反応は３７℃で行っ
た。得られた結果を図５に示す。

【００７２】実施例９：反応生成物量と吸光度との関係
（２） 実施例７で用いた反応液および未反応液のそれぞれを２
倍量のジメチルスルホキシドで希釈した後、ビオチン量
が一定になるように両者を種々の割合で混合した。マイ
クロタイタープレートに２μｌの混合試料を入れ、実施
例７と同様の操作を行った（室温：２３℃）。ただし、
Ｎ−エチルマレイミドの代わりにヨード酢酸ナトリウム
（１００ｍＭ、ＴＢＳに溶解）を用い、ＤＩＧ−ＮＨＳ
の濃度は０．２ｍｇ／ｍｌとした。チオール基の修飾反
応およびジゴキシゲニン標識反応は３７℃で３０分、グ
リシン処理は３７℃で４５分行った。また、アルカリホ
スファターゼの発色時間は１０分とした。得られた結果
を図６に示す。

【００７３】実施例１０：測定値のバラツキ 反応液および未反応液のそれぞれを４倍量のジメチルス
ルホキシドで希釈した後、ビオチン量が一定になるよう
に両者を種々の割合で混合した。得られた混合試料の２
μｌを用いて、実施例９と同様の操作を行った（室温：
２３℃）。ただし、ヨード酢酸ナトリウム処理およびジ
ゴキシゲニン標識反応は３７℃で３５分、グリシン処理
は１５μｌのグリシン溶液を加え、３７℃で４０分行っ
た。ストレプトアビジン・コーティド・マイクロタイタ
ープレートへの固定化は、１００μｌの固定用希釈液を
入れ、この中に１０μｌのグリシン処理反応液を加え
た。また、アルカリホスファターゼの発色時間は１５分
とした。得られた結果を表IVに示す。

【００７４】 ＊：標準偏差／平均値

【００７５】実施例１１：プロテアーゼ阻害剤を含む場
合 プロテアーゼ阻害剤としてＰＭＳＦ（フェニルメタンス
ルホニルフルオリド）処理を行った酵素反応液を用い
た。反応停止は４倍量のジメチルスルホキシドを加え
た。１μｌの停止反応液を用いて、実施例１０と同様な
操作を行った。得られた結果を表Vに示す。

【００７６】表V ＰＭＳＦによる阻害 ＰＭＳＦ濃度 活性（切断％） １０ｍＭ ７１ １ｍＭ ８７０ｍＭ １００

【００７７】実施例１２：測定の適応範囲 試料として、基質ペプチドの切断断片のＳＭＳＹＴＷＴ
Ｋ［Ｂｉｏ］を用いた。２μｌの試料溶液（ジメチルス
ルホキシドに溶解したもの）に対して、実施例１０と同
様に、ヨード酢酸ナトリウム処理（３７℃、３０分）、
ジゴキシゲニン標識（３７℃、３０分）、およびグリシ
ン処理（３７℃、４０分）を行い、その１０μｌを固定
化した。発色反応は室温（２４．５℃）で１０分行っ
た。これらの操作を種々の濃度で行い、その結果を図７
に示す。

【００７８】

【発明の効果】本発明のＨＣＶプロテアーゼ活性測定法
は、試験管内で実施することができるので、細胞培養系
に比べて極めて短時間で測定を行うことができる。ま
た、無菌操作などの煩雑な操作を伴わず、使用する施設
も簡単なものでよい。さらに、細胞を用いないので、細
胞培養系に比べて測定間のバラツキがなく、信頼のおけ
る結果が得られる。放射性同位体などの検出方法を用い
る必要がない点も本発明の利点である。また、本発明の
ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング法を用いる
と、極めて簡単かつ確実に阻害剤のスクリーニングを行
うことができ、抗ＨＣＶ剤の開発におおいに利用でき
る。

【００７９】さらに、発色原子団を遊離させることによ
って活性測定が困難なプロテアーゼに対しては、酵素反
応後に生成物に抗原物質を結合させるポストラベル法に
よるＥＬＩＳＡ法を用いる本発明のＨＣＶプロテアーゼ
活性測定法が有利である。この測定法は基質の変化に容
易に対応でき、極めて応用範囲が広い。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＣＶ前駆体ポリプロテイン構造、および本発
明で使用した発現プラスミドの名称とそれぞれに挿入し
たＨＣＶ遺伝子の領域を示す。なお、図中、アミノ末端
側のＣはウイルスコアタンパク質、Ｅ１およびＥ２はエ
ンベロープタンパク質１および２を表し、これらはウイ
ルス構造タンパク質に相当する。それより下流領域から
の産物はウイルス複製に機能する非構造タンパク質（Ｎ
Ｓ）に相当する。

【図２】酵素３４５Ｐｓと合成基質Ｄｎｓ−ＧＥＡＧＤ
ＤＩＶＰＣ ＳＭＳＹＴＷＴを反応させたときのＨＰＬ
Ｃのクロマトグラムである。

【図３】酵素３４ＮｓＨ、３４Ｓｍ、３４５Ｃ、３４５
Ｂｓ、３４５Ｐｓを合成基質Ｄｎｓ−ＧＥＡＧＤＤＩＶ
ＰＣ ＳＭＳＹＴＷＴと反応させたときの時間反応曲線
を示す。

【図４】酵素３４５Ｐｓ、合成基質 Dns-GEAGDDIVPC SM
SYTWT を用い、阻害剤としてＰＭＳＦを添加したときの
効果、ならびに同濃度のＰＭＳＦ存在下におけるトリプ
シンの基質Ｎ−ベンゾイルＦＶＲ（Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａ
ｒｇ）−ｐ−ニトロアニリド切断反応の結果を示す。

【図５】Ｎ−エチルマレイミド処理を行った場合の反応
生成物量と吸光度（４０５ｎｍ）との関係を示す。

【図６】ヨード酢酸ナトリウム処理を行った場合の反応
生成物量と吸光度（４０５ｎｍ）との関係を示す。

【図７】ヨード酢酸ナトリウム処理を行った場合の測定
適応範囲を示す。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）前駆体ポリ
   プロテインの非構造タンパク質中のＮＳ３領域およびＮ
   Ｓ４Ａ領域、ならびに場合によりそれより下流領域をコ
   ードする遺伝子を大腸菌で発現させ、単離精製して得ら
   れるＨＣＶプロテアーゼと、合成基質ペプチドとを反応
   させることからなる、ＨＣＶプロテアーゼ活性の測定
   法。
2. 【請求項２】 ＨＣＶプロテアーゼが、ＮＳ３領域およ
   びＮＳ４Ａ領域を含む領域をコードする遺伝子を用いて
   発現させたものである、請求項１記載の測定法。
3. 【請求項３】 ＨＣＶプロテアーゼが、ＮＳ３領域、Ｎ
   Ｓ４Ａ領域およびＮＳ４Ｂ領域を含む領域をコードする
   遺伝子を用いて発現させたものである、請求項１記載の
   測定法。
4. 【請求項４】 ＨＣＶプロテアーゼが、ＮＳ３領域、Ｎ
   Ｓ４Ａ領域、ＮＳ４Ｂ領域およびＮＳ５Ａ領域を含む領
   域をコードする遺伝子を用いて発現させたものである、
   請求項１記載の測定法。
5. 【請求項５】 ＨＣＶプロテアーゼが、ＮＳ３領域、Ｎ
   Ｓ４Ａ領域、ＮＳ４Ｂ領域、ＮＳ５Ａ領域およびＮＳ５
   Ｂ領域を含む領域をコードする遺伝子を用いて発現させ
   たものである、請求項１記載の測定法。
6. 【請求項６】 合成基質ペプチドがＮＳ３／ＮＳ４Ａ、
   ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５ＡまたはＮＳ５
   Ａ／ＮＳ５Ｂの各切断部位近傍のペプチド、あるいはこ
   れらのペプチド中のコンセンサスアミノ酸以外の１また
   は２以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したペプチ
   ドである、請求項１記載の測定法。
7. 【請求項７】 合成基質ペプチドが１０〜２０アミノ酸
   である、請求項６記載の測定法。
8. 【請求項８】 合成基質ペプチドがＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ
   切断部位近傍のペプチドである、請求項６記載の測定
   法。
9. 【請求項９】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）前駆体ポリ
   プロテインの非構造タンパク質中のＮＳ３領域およびＮ
   Ｓ４Ａ領域、ならびに場合によりそれより下流領域をコ
   ードする遺伝子を大腸菌で発現させ、単離精製して得ら
   れるＨＣＶプロテアーゼと、合成基質ペプチドとを反応
   させる系において、反応系に試験化合物を添加し、該合
   成基質ペプチドの切断反応の進行を、試験化合物添加の
   ものと添加しないものとで比較することからなる、ＨＣ
   Ｖプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング法。
10. 【請求項１０】 以下の工程からなる、請求項１記載の
    ＨＣＶプロテアーゼ活性の測定法： （１）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）前駆体ポリプロテイ
    ンの非構造タンパク質中のＮＳ３領域およびＮＳ４Ａ領
    域、ならびに場合によりそれより下流領域をコードする
    遺伝子を大腸菌で発現させ、単離精製して得られるＨＣ
    Ｖプロテアーゼと、ビオチンまたは抗原物質または抗体
    物質で標識（標識ａ）した合成基質ペプチドとを反応さ
    せる； （２）工程（１）の切断産物である標識ペプチドを、さ
    らに抗原物質で標識（標識ｂ）する； （３）ペプチドに標識した前記抗原物質に、前記抗原に
    対する酵素標識抗体を結合する；そして （４）工程（３）の酵素の活性を測定する、ただし、工
    程（２）、工程（３）または工程（４）の前に、標識ａ
    に対する親和性を利用して標識ペプチドの固定化を行
    う。
11. 【請求項１１】 合成基質ペプチドがシステインを含む
    場合、抗原物質による標識（標識ｂ）に先立って、シス
    テインのチオール基が抗原で標識されないようにチオー
    ル基を修飾しておくことを特徴とする請求項１０記載の
    測定法。