CN115747298A - 昆虫烟酰胺酶抑制剂及鉴定方法及用于杀虫剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了昆虫烟酰胺酶抑制剂及鉴定方法及用于杀虫剂的用途，包括提供体外表达纯化的昆虫烟酰胺酶蛋白，测定上述昆虫烟酰胺酶蛋白的活性，通过检测是否可以反应得到烟酸或氨筛选出有活性的昆虫烟酰胺酶蛋白，在筛选出的有活性的昆虫烟酰胺酶蛋白中添加候选化合物，并测定化合物存在状态下昆虫烟酰胺酶蛋白的活性等步骤，本发明提供了一个可被用于开发新农药的分子靶点：昆虫烟酰胺酶。本发明作为杀虫剂的全新靶标和作为杀虫剂的用途，是国内在世界范围内首次发现的创新性杀虫剂靶点，本发明的方法简单，易于操作，成本低，适用于高通量筛选化合物，可利用本发明开发稳定、高效、无毒的绿色农药，具有广阔的应用前景。

Description

昆虫烟酰胺酶抑制剂及鉴定方法及用于杀虫剂的用途

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域及农业领域，特别是涉及昆虫烟酰胺酶作为分子靶标在筛选杀虫剂中的应用，具体是昆虫烟酰胺酶抑制剂及鉴定方法及用于杀虫剂的用途。

背景技术

杀虫剂被广泛的用于控制各种害虫及其他有害节肢动物。尽管目前市场上有几百种商业化使用的杀虫剂，但是根据国际杀虫剂抗性行动委员会(Insecticide ResistanceAction Committee,一个由全球农化公司专家组成的技术工作组)发布的用于害虫抗性治理的指南，所有的杀虫剂都可以根据其作用机制归类到32个不同的类别中，剩下的一小部分则还不清楚其作用机制。长期使用单一作用机制的杀虫剂会导致害虫迅速发展出抗性，所以有必要选择不同作用机制的杀虫剂进行轮换使用，并同时开发具有全新作用机制的新一代杀虫剂。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是细胞内的重要还原剂，其生化合成途径可以通过氨基酸底物的从头合成和预先形成的底物的“补救”途径，比如烟酰胺、烟酸和烟酰胺核苷。脊椎动物基因组中编码的烟酰胺磷酸核糖基转移酶，将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸以启动较短的补救通路。而在无脊椎动物，如昆虫中，则是通过烟酰胺酶(nicotinamidase)先将烟酰胺转化为烟酸，然后再进一步合成为NAD。目前对昆虫烟酰胺酶研究的报道仅限于Balan等人发现通过转基因技术过表达黑腹果蝇的烟酰胺酶基因Naam可以延长果蝇的寿命，参见“Life Span Extension and Neuronal Cell Protection by DrosophilaNicotinamidase”J Biol Chem.2008 Oct 10；283(41):27810-27819。对昆虫烟酰胺酶活性的研究，以及昆虫烟酰胺酶抑制剂的开发都处于空白阶段。

脊椎动物体内不存任何形式的与昆虫烟酰胺酶相近的基因，因此，昆虫烟酰胺酶是一个优良的用于防治害虫的分子靶点，可以通过抑制烟酰胺酶的活性而杀死害虫。因此，开发出鉴定昆虫烟酰胺酶抑制剂的方法，对开发新型农药、新型杀寄生虫剂非常重要。

发明内容

本发明弥补了昆虫烟酰胺酶活性研究的空白，提供了一个全新的杀虫剂分子靶标：烟酰胺酶，抑制该酶活性的化合物可以作为杀虫剂来防治害虫。

本发明提供了一种鉴定化合物是否为昆虫烟酰胺酶抑制剂的方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明公开了一种鉴定化合物是否为昆虫烟酰胺酶抑制剂的方法，包括：

1)提供体外表达纯化的昆虫烟酰胺酶蛋白；

2)测定上述昆虫烟酰胺酶蛋白的活性，通过检测是否可以反应得到烟酸或氨筛选出有活性的昆虫烟酰胺酶蛋白；

3)在筛选出的有活性的昆虫烟酰胺酶蛋白中添加候选化合物，并测定化合物存在状态下昆虫烟酰胺酶蛋白的活性；

4)比较步骤2)与步骤3)中的反应产物烟酸和氨含量的变化，鉴定所添加的候选化合物是否为昆虫烟酰胺酶的抑制剂，若烟酸或氨的含量降低，则鉴定所添加的候选化合物为昆虫烟酰胺酶的抑制剂。

作为进一步地改进，本发明所述的步骤1)具体为通过体外原核或真核表达系统，表达带有标签的烟酰胺酶，在体外纯化出具有生物学活性的烟酰胺酶。

作为进一步地改进，本发明所述的测定昆虫烟酰胺酶蛋白的活性的方法为：将纯化出的昆虫烟酰胺酶蛋白与底物烟酰胺反应，生成产物烟酸和氨。

作为进一步地改进，本发明所述的步骤3)中，所述的有活性的昆虫烟酰胺酶蛋白与底物烟酰胺反应生成产物烟酸和氨，通过酶偶联法检测氨的量是否降低，快速鉴定出烟酰胺酶的抑制剂，所述的酶偶联法反应体系由：待检测化合物、烟酰胺酶、烟酰胺、α-酮戊二酸、NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)(或NADPH，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和谷氨酸脱氢酶组成。

作为进一步地改进，本发明所述候选化合物为有机小分子、无机小分子、多糖、肽、蛋白质、核酸、由生物材料制成的提取物或以上任意一种或多种的组合。

本发明还公开了一种通过鉴定化合物是否为昆虫烟酰胺酶抑制剂的方法鉴定出来的抑制剂，包括：

4-(三氟甲基)烟酰胺，

3-吡啶甲醛，

4-(三氟甲基)烟醛，

2-(三氟甲基)苯甲酰胺，

4-氯烟酰胺，

4-(trifluoromethyl)pyrimidine-5-carboxamide，

2-(2-(Trifluoromethyl)phenyl)acetamide，

本发明还公开了昆虫烟酰胺酶抑制剂用于制备杀虫剂的用途，所述的昆虫烟酰胺酶抑制剂包括：

4-(三氟甲基)烟酰胺，

3-吡啶甲醛，

4-(三氟甲基)烟醛，

2-(三氟甲基)苯甲酰胺，

4-氯烟酰胺，

4-(trifluoromethyl)pyrimidine-5-carboxamide，

2-(2-(Trifluoromethyl)phenyl)acetamide，

所述的以上昆虫烟酰胺酶抑制剂可用于干扰昆虫的行为，从而杀死昆虫。

作为进一步地改进，本发明所述的昆虫烟酰胺酶抑制剂优选为：

4-(三氟甲基)烟酰胺，

作为进一步地改进，本发明所述的昆虫是农业/园艺害虫、病媒昆虫或寄生虫。

作为进一步地改进，本发明所述的农业/园艺害虫为蚜虫，粉虱，飞虱，叶蝉，介壳虫，粉蚧，蓟马，粉甲虫、木虱中的任意一种；所述病媒昆虫或寄生虫来自线虫门或节肢动物门。

本发明的有益效果如下：

1、本发明提供了一个可被用于开发新农药的分子靶点：昆虫烟酰胺酶。德国、日本、美国等农化公司，如巴斯夫、拜耳等二十几年来都在一直尝试寻找此靶点，但一直未找到。昆虫烟酰胺酶作为杀虫剂的全新靶标，是国内在世界范围内首次发现的创新性杀虫剂靶点。

2、本发明提供了一种简便、快速鉴定烟酰胺酶抑制剂的方法，并提供了一种对化合物活体杀虫活性、杀寄生虫活性进行筛选的方法。

3、本发明方法简单，易于操作，成本低，适用于高通量筛选化合物。可利用本发明开发稳定、高效、无毒的绿色农药，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为表达纯化后得到的烟酰胺酶变性电泳图；

A从左至右依次为:烟粉虱、褐飞虱、果蝇和亚洲虎蚊烟酰胺酶蛋白的变性电泳图；

B从左至右依次为:秀丽隐杆线虫烟酰胺酶1和秀丽隐杆线虫烟酰胺酶2的变性电泳图；

图2为几种昆虫烟酰胺酶的酶活性图；

依次为A为黑腹果蝇，B为桃蚜，C为烟粉虱，D为褐飞虱，E为亚洲虎蚊；

图3为桃蚜烟酰胺酶与TFNA-AM反应的酶活图；

A为不同浓度的TFNA-AM与桃蚜烟酰胺酶反应后340nM荧光值的变化曲线图，

B为与A相对应的化合物TFNA-AM对桃蚜烟酰胺酶抑制的IC₅₀曲线图；

图4为化合物TFNA-AM对不同物种的烟酰胺酶抑制的IC₅₀抑制曲线图；

A为黑腹果蝇，B为桃蚜，C为烟粉虱，D为褐飞虱，E为亚洲虎蚊；

图5为果蝇喂食氟啶虫酰胺(FL)和TFNA-AM的爬行能力统计；

A为果蝇爬行实验示意图，B为喂食不同浓度的FL后行为异常统计，C为喂食TFNA-AM后行为异常统计；

图6为果蝇喂食氟啶虫酰胺(FL)和TFNA-AM后HPCL检测头部烟酰胺和TFNA-AM含量的图；

A为喂食FL后HPCL检测头部烟酰胺和TFNA-AM含量的图，B为喂食TFNA-AM后HPCL检测头部烟酰胺和TFNA-AM含量的图；

图7为果蝇烟酰胺酶与TFNA-AM分子对接后的结构分析图；

图8为TFNA-AM对果蝇烟酰胺酶A265E突变体的酶活抑制实验与其对基因编辑后的果蝇(A265E突变体)爬行实验；

A为TFNA-AM对果蝇烟酰胺酶A265E突变体的IC₅₀抑制曲线图，

B为TFNA-AM对基因编辑后的果蝇(A265E突变体)爬行的影响；

图9为通过本发明筛选出的化合物2-(三氟甲基)苯甲酰胺对果蝇烟酰胺酶的IC₅₀抑制曲线图与对果蝇爬行的影响；

A为化合物2-(三氟甲基)苯甲酰胺对果蝇烟酰胺酶的IC₅₀抑制曲线图；

B为化合物2-(三氟甲基)苯甲酰胺对果蝇爬行的影响统计图；

图10为3-吡啶甲醛(表二中化合物4)和4-(三氟甲基)烟醛(表二中化合物5)对秀丽隐杆线虫的烟酰胺酶(1型和2型)的IC₅₀抑制曲线图对线虫生殖行为失调的统计图；

A为3-吡啶甲醛对秀丽隐杆线虫的烟酰胺酶1型的IC₅₀抑制曲线图，B为

3-吡啶甲醛对秀丽隐杆线虫的烟酰胺酶2型的IC₅₀抑制曲线图，C为4-(三氟甲基)烟醛对秀丽隐杆线虫的烟酰胺酶1型的IC₅₀抑制曲线图，D为4-(三氟甲基)烟醛对秀丽隐杆线虫的烟酰胺酶2型的IC₅₀抑制曲线图，E为3-吡啶甲醛和4-(三氟甲基)烟醛对秀丽隐杆线虫生殖行为失调的统计图。

具体实施方式

本发明公开了一种鉴定化合物是否为昆虫烟酰胺酶抑制剂的方法，包括：

1)提供体外表达纯化的昆虫烟酰胺酶蛋白；通过体外原核或真核表达系统，表达带有标签的烟酰胺酶，在体外纯化出具有生物学活性的烟酰胺酶。

2)测定上述昆虫烟酰胺酶蛋白的活性，将纯化出的昆虫烟酰胺酶蛋白与底物烟酰胺反应，生成产物烟酸和氨，通过反应产物烟酸或氨筛选出有活性的昆虫烟酰胺酶蛋白，若检测到了烟酸或氨，则说明了昆虫烟酰胺酶蛋白有活性；

3)在筛选出的有活性的昆虫烟酰胺酶蛋白中添加候选化合物，并测定昆虫烟酰胺酶蛋白在化合物存在情况下的活性；

4)比较步骤2)与步骤3)中的反应产物烟酸和氨含量的变化，鉴定所添加的候选化合物是否为昆虫烟酰胺酶的抑制剂，通过酶偶联法检测氨气的量是否降低，快速鉴定出烟酰胺酶的抑制剂，所述的酶偶联法反应体系由：待检测化合物、烟酰胺酶、烟酰胺、α-酮戊二酸、NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)(或NADPH，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和谷氨酸脱氢酶组成。

步骤3)中的候选化合物为有机小分子、无机小分子、多糖、肽、蛋白质、核酸、由生物材料制成的提取物或以上任意一种或多种的组合。

通过以上的鉴定化合物是否为昆虫烟酰胺酶抑制剂的方法鉴定出来的抑制剂，包括：

4-(三氟甲基)烟酰胺，

3-吡啶甲醛，

4-(三氟甲基)烟醛，

2-(三氟甲基)苯甲酰胺，

4-氯烟酰胺，

4-(trifluoromethyl)pyrimidine-5-carboxamide，

2-(2-(Trifluoromethyl)phenyl)acetamide，

以上筛选出来的抑制剂昆虫烟酰胺酶抑制剂通过用于昆虫体内，是否能干扰昆虫的行为，从而杀死昆虫，可以筛选出用于杀死昆虫的抑制剂，用于制备杀虫剂的用途，当然，用于制备杀死昆虫的昆虫烟酰胺酶抑制剂优选为：

4-(三氟甲基)烟酰胺，

其中昆虫是农业/园艺害虫、病媒昆虫或寄生虫，农业/园艺害虫为蚜虫，粉虱，飞虱，叶蝉，介壳虫，粉蚧，蓟马，粉甲虫、木虱中的任意一种；所述病媒昆虫或寄生虫来自线虫门或节肢动物门。

下面通过具体实施案例、结合说明书附图，对本发明的技术方案作进一步地说明：

实施例1:

昆虫烟酰胺酶的表达与纯化。

(1)构建含有烟酰胺酶的表达质粒。通过基因合成的方式，合成昆虫烟酰胺酶蛋白质序列对应的DNA序列，构建到适合的质粒中，并同时在适当的位置带上纯化标签。蛋白质序列信息见表一：

表一

(2)表达与纯化烟酰胺酶的蛋白质。将构建好的质粒转化到大肠杆菌中，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达出含有标签的蛋白质。离心收集细菌，破碎细菌，离心获得可溶性蛋白，离心后上清与纯化填料抚育，经过洗涤、洗脱、浓缩获得纯化后的蛋白。经过SDS-page变性电泳检测，获得高纯度蛋白。见图1。

昆虫烟酰胺酶活性的检测

(1)配置反应溶液。每200μL溶液A(20mM Tris,pH 7.5,150mM NaCl,1mM MgCl₂)中依次加入α-酮戊二酸、还原型辅酶I二钠盐、谷氨酸脱氢酶和烟酰胺，使终浓度为：1mMα-酮戊二酸，500μM还原型辅酶I二钠盐(NADH),3单位谷氨酸脱氢酶(Cas:9001-46-1)，0.01-1mM的不同浓度烟酰胺。反应溶液中的NADH可以用还原辅酶Ⅱ四钠盐(NADPH)替代，谷氨酸脱氢酶可以用其他类型的谷氨酸脱氢酶替代，反应体系中各成分的浓度可以根据实验需求进行调整,反应的缓冲溶液A也可根据需求换成其他缓冲体系的溶液，镁离子可以由其他二价离子取代。

(2)烟酰胺酶溶液的配置。将纯化的烟酰胺酶用溶液A稀释到合适的浓度，例如0.1mg/ml。

(3)在每个反应孔中加入10μL(2)中的烟酰胺酶(使得酶的总含量为1μg)起始反应,并在340nM下监测OD₃₄₀荧光值的变化。根据米氏方程换算出酶的K_m值，如图2所示。

抑制剂4-(三氟甲基)烟酰胺(TFNA-AM)对昆虫烟酰胺酶活性的抑制实验

(1)配置反应溶液。每200μL溶液A(20mM Tris,pH 7.5,150mM NaCl,1mM MgCl₂)中依次加入烟酰胺、α-酮戊二酸、还原型辅酶I二钠盐和谷氨酸脱氢酶，使终浓度为：500μM烟酰胺，1mMα-酮戊二酸，500μM还原型辅酶I二钠盐(NADH),3单位谷氨酸脱氢酶(Cas:9001-46-1)。反应溶液中的NADH可以用还原辅酶Ⅱ四钠盐(NADPH)替代，谷氨酸脱氢酶可以用其他类型的谷氨酸脱氢酶替代，反应体系中各成分的浓度可以根据实验需求进行调整,反应的缓冲溶液A也可根据需求换成其他缓冲体系的溶液，镁离子可以由其他二价离子取代。

(2)烟酰胺酶溶液的配置。将纯化的烟酰胺酶用溶液A稀释到合适的浓度，例如0.1mg/ml。

(3)配置含有化合物的反应溶液。在96孔板中，将待测化合物稀释到反应溶液(1)中，形成化合物浓度梯度，如(0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、0.6μM、1μM、3μM、6μM、10μM、30μM、60μM、100μM、300μM、600μM、1000μM)。

(4)在每个反应孔中加入10μL(2)中的烟酰胺酶(使得酶的总含量为1μg)起始反应,并在340nM下监测OD₃₄₀荧光值的变化。例如，图3为桃蚜烟酰胺酶与TFNA-AM单次反应的结果，其中A为荧光值的曲线，B为根据A图换算出的IC₅₀值。

(5)拟合出化合物对酶的抑制半抑制浓度IC₅₀，并根据公式K_i＝IC₅₀/(1+[s]/K_m)计算出化合物的抑制常数(inhibition constant)K_i值。

各物种的IC₅₀与K_i值如图4所示。

通过本发明方法鉴定出的几种对烟酰胺酶具有抑制活性的化合物

表二

昆虫烟酰胺酶抑制剂用于制备杀虫剂的用途，昆虫烟酰胺酶抑制剂包括：

4-(三氟甲基)烟酰胺，

3-吡啶甲醛，

4-(三氟甲基)烟醛，

2-(三氟甲基)苯甲酰胺，

4-氯烟酰胺，

4-(trifluoromethyl)pyrimidine-5-carboxamide，

2-(2-(Trifluoromethyl)phenyl)acetamide，

以上昆虫烟酰胺酶抑制剂可用于干扰昆虫的行为，从而杀死昆虫。

杀虫剂氟啶虫酰胺(FL)及其代谢物4-(三氟甲基)烟酰胺(TFNA-AM)引起果蝇行为失调

喂药后果蝇的爬行行为，可以直接反映出果蝇中毒的程度。将果蝇喂药后向上攀爬的能力(超过攀爬管中线位置的百分数，图5)作为衡量果蝇中毒行为的一个标准。

(1)准备待测果蝇。挑选2-4天的雄性果蝇，每组10只，过夜饥饿约10小时。对照组喂食10％糖水，实验组喂食含有相应化合物的10％糖水，共喂食3个小时。

(2)进行爬行实验。爬行馆总长180毫米，直径为20毫米。敲击爬行管，由于振动，所有果蝇在敲击后都处于爬行馆底部。此时，开始记录30秒内果蝇向上的爬行的数据。超过中线的果蝇记录为有活力的果蝇。

结果参见图5，表明喂食FL和TFNA-AM后果蝇爬行能力显著降低，并且，爬行能力随着化合物浓度的增高而降低。

喂食氟啶虫酰胺(FL)或4-(三氟甲基)烟酰胺(TFNA-AM)导致果蝇头部氟啶虫酰胺积累

氟啶虫酰胺(FL)，以及其代谢产物4-(三氟甲基)烟酰胺(TFNA-AM)杀死昆虫的原理，是通过抑制烟酰胺酶的活性，造成昆虫神经系统中烟酰胺酶的底物烟酰胺不能够被及时转化掉，产生烟酰胺的累积，超出正常水平的烟酰胺进一步激活下游的TRPV家族离子通道，从而起到杀死昆虫的作用。化合物在活体水平是否具有烟酰胺酶的抑制活性，可以通过检测喂药后昆虫神经系统中的烟酰胺量来检测。

(1)准备待测果蝇。挑选2-4天的果蝇，每组30只，过夜饥饿约10小时。对照组喂食10％糖水，实验组喂食含有相应化合物的10％糖水。在喂食前(0小时)，喂食1小时、喂食3小时这三个时间点，将每个实验组(30只)果蝇的头部用200微升超纯水研磨，用0.22微米的滤膜过滤样品，上清保存在-20度待测。

(2)将准备好的样品，每组20微升用Waters UPLC-MS/MS system(Waters Corp.,Milford,MA,USA)进行检测。

结果参见图6，表明抑制烟酰胺酶的活性会在昆虫神经系统中积累大量的烟酰胺，引起昆虫行为失调。

烟酰胺酶A265E点突变果蝇对氟啶虫酰胺(FL)和4-(三氟甲基)烟酰胺(TFNA-AM)产生抗性

根据化合物TFNA-AM与果蝇烟酰胺酶结构的分析,参见图7，发现果蝇烟酰胺酶第265个氨基酸可能是关键的药物结合位点。将果蝇烟酰胺酶的第265个氨基酸从丙氨酸突变谷氨酸后，DmNaam_A265E的IC₅₀升高为1836μM，K_i值升高为296.3μM，参见图8A。通过基因编辑获得了果蝇烟酰胺酶A265E的单点突变果蝇，此果蝇对氟啶虫酰胺和烟酰胺都具有强抗性,参见图8B。

其他烟酰胺酶抑制剂导致果蝇行为学失调

2-(三氟甲基)苯甲酰胺(表二中化合物6)，在化学结构上与4-(三氟甲基)烟酰胺相似，其对果蝇烟酰胺酶也具有抑制效果，K_i＝38.5μM，2-(三氟甲基)苯甲酰胺导致的果蝇行为失调具有浓度梯度依赖性,参见图9。

烟酰胺酶抑制剂引起线虫生殖行为的失调

3-吡啶甲醛(表二中化合物4)和4-(三氟甲基)烟醛(表二中化合物5)对线虫的烟酰胺酶具有抑制效果，参见图10A-D，并且引起线虫生殖行为的失调，高浓度抑制线虫的产卵率，参见图10E。

上述对实施例的描述是为便于本技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对上述实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鉴定化合物是否为昆虫烟酰胺酶抑制剂的方法，包括：

1)提供体外表达纯化的昆虫烟酰胺酶蛋白；

2)测定上述昆虫烟酰胺酶蛋白的活性，通过检测是否可以反应得到产物烟酸或氨筛选出有活性的昆虫烟酰胺酶蛋白；

3)在筛选出的有活性的昆虫烟酰胺酶蛋白中添加候选化合物，并测定化合物存在状态下昆虫烟酰胺酶蛋白的活性；

4)比较步骤2)与步骤3)中的反应产物烟酸和氨含量的变化，鉴定所添加的候选化合物是否为昆虫烟酰胺酶的抑制剂，若烟酸或氨的含量降低，则鉴定所添加的候选化合物为昆虫烟酰胺酶的抑制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)具体为通过体外原核或真核表达系统，表达带有标签的烟酰胺酶，在体外纯化出具有生物学活性的烟酰胺酶。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的测定昆虫烟酰胺酶蛋白的活性的方法为：将纯化出的昆虫烟酰胺酶蛋白与底物烟酰胺反应，生成产物烟酸和氨。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中，所述的有活性的昆虫烟酰胺酶蛋白与底物烟酰胺反应生成产物烟酸和氨，通过酶偶联法检测氨的量是否降低，快速鉴定出烟酰胺酶的抑制剂，所述的酶偶联法反应体系由：待检测化合物、烟酰胺酶、烟酰胺、α-酮戊二酸、NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)(或NADPH，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和谷氨酸脱氢酶组成。

5.根据权利要求1或2或4所述的方法，其特征在于，所述候选化合物为有机小分子、无机小分子、多糖、肽、蛋白质、核酸、由生物材料制成的提取物或以上任意一种或多种的组合。

6.一种通过鉴定化合物是否为昆虫烟酰胺酶抑制剂的方法鉴定出来的抑制剂，其特征在于，包括：

4-(三氟甲基)烟酰胺，

3-吡啶甲醛，

4-(三氟甲基)烟醛，

2-(三氟甲基)苯甲酰胺，

4-氯烟酰胺，

4-(trifluoromethyl)pyrimidine-5-carboxamide，

2-(2-(Trifluoromethyl)phenyl)acetamide，

7.昆虫烟酰胺酶抑制剂用于制备杀虫剂的用途，其特征在于，所述的昆虫烟酰胺酶抑制剂包括：

4-(三氟甲基)烟酰胺，

3-吡啶甲醛，

4-(三氟甲基)烟醛，

2-(三氟甲基)苯甲酰胺，

4-氯烟酰胺，

4-(trifluoromethyl)pyrimidine-5-carboxamide，

2-(2-(Trifluoromethyl)phenyl)acetamide，

所述的以上昆虫烟酰胺酶抑制剂可用于干扰昆虫的行为，从而杀死昆虫。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的昆虫烟酰胺酶抑制剂优选为：

4-(三氟甲基)烟酰胺，

9.根据权利要求7或8所述的用途，其特征在于，所述的昆虫是农业/园艺害虫、病媒昆虫或寄生虫。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的农业/园艺害虫为蚜虫，粉虱，飞虱，叶蝉，介壳虫，粉蚧，蓟马，粉甲虫、木虱中的任意一种；所述病媒昆虫或寄生虫来自线虫门或节肢动物门。

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