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JPH0788399B2 - 新規プロコアギュラント蛋白質 - Google Patents

新規プロコアギュラント蛋白質

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Publication number
JPH0788399B2
JPH0788399B2 JP61502448A JP50244886A JPH0788399B2 JP H0788399 B2 JPH0788399 B2 JP H0788399B2 JP 61502448 A JP61502448 A JP 61502448A JP 50244886 A JP50244886 A JP 50244886A JP H0788399 B2 JPH0788399 B2 JP H0788399B2
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JP
Japan
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factor viii
region
protein
dna
amino acid
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
JP61502448A
Other languages
English (en)
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JPS62502941A (ja
Inventor
トゥール，ジョン・ジェイ，ジュニアー
Original Assignee
ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24914180&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH0788399(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド filed Critical ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド
Publication of JPS62502941A publication Critical patent/JPS62502941A/ja
Publication of JPH0788399B2 publication Critical patent/JPH0788399B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプロコアギユラント活性を示す一連の新規蛋白
質に関する。本蛋白質はヒト第VIII:C因子とは構造的に
は著しく異なるが、類似のプロ血液凝固（プロコアギユ
ラント:procoa−gulant）活性を持っている。
第VIII:C因子は血友病Ａ型に欠損または欠除している血
漿蛋白質である。本疾患は男子２万人に約１人がかかる
遺伝性の出血性疾病である。第VIII:C因子の構造は1983
年10月28日付で出願された米国特許出願第546,650号お
よび1984年８月24日付の第644,036号（これらは本明細
書に参考文献として添付されている）およびネイチヤー
（Naturre）,312:306.307,326および342に記載されてい
る。
ヒト第VIII:C因子を血友病の治療に使用するのに現在直
面している問題の一つは、その抗原性からのものであ
る。かなりの割合の血友病患者において、治療に使用さ
れる第VIII:C因子への免疫反応の亢進が起こる。非血友
病患者も、その免疫系が第VIII:C因子に過敏になつて、
第VIII:C因子に対する循環性の抗体または「阻害剤が生
産される場合には、血友病になり得る。何れの場合に
も、その結果は患者に存在する第VIII:C因子全てを中和
し、治療を極めて困難にする。現在まで、本問題を持つ
血友病患者の治療に選択される方法は、重度の出血性の
事例においては処理済みブタ第VIII:C因子のような非ヒ
ト第VIII:C因子の投与である。カーノフ（Kernoff）ら
によるブラツド（Blood）63:31）1984）を参照せよ。し
かしヒト第VIII:C因子の凝血能力を無効にする抗体は別
の種の第VIII:C因子と種々の範囲で反応し、ブタ第VII
I:C因子はそれ自身抗原性があるので、このような治療
の短期的および長期的有効性は変わることであろう 更に、患者はしばしばブタのVIII:C因子の投与により、
好ましくない反応を起こす。そのような危険にも拘わら
ずブタ第VIII:C因子の使用は確かに有効である代替物が
ないため正しいとされている（上記のカーノフを参照せ
よ（38））。本発明はブタ第VIII:C因子の投与に代わる
物質を提供する。
本発明は第VIII:C因子と類似の凝血活性を有し、実質的
により低分子量である蛋白質を提供する。本蛋白質は以
下のような式（１）に簡略的に記述される： （１）Ａ−Ｘ−Ｂ 〔式中、Ａは配列Ala−20からArg−759までの実質上同
一のポリペプチド配列を表し;Bは配列Ser−1709からＣ
−末端のTyr−2351までの配列と実質上同一のポリペプ
チド配列を表し、Ｘは配列Ser−760からArg−1708まで
の配列内のアミノ酸配列と実質上同一の949個以下のア
ミノ酸から成るポリペプチド配列を表す〕。Ｘ領域のア
ミノ末端はＡのカルボキシ末端とペプチド結合（式１で
は“一”で表示）を介して共有結合している。Ｘ領域の
カルボキシル末端はＢのアミノ末端と同様に共有結合し
ている。本開示中のアミノ酸の番号付けは表１（リーダ
ー配列の第１アミノ酸、Metを１番とする）におけるア
ミノ酸の番号付けを参照とする。蛋白領域ＸはSer−760
からArg−1708の範囲から選択される連続的だか短い配
列から成立し得る。もしくはＸは （アミノ酸の番号の増加順を保つ）ペプチド結合で共有
結合した領域から選択される２またはそれ以上のアミノ
酸から成立し得る。
例えば、本発明の１つの化合物はSer−760からPro−100
0のアミノ酸配列と次にAsp−1582からArg−1708のアミ
ノ酸配列とからなるＸ領域を含んでいる。従ってこの化
合物はAla−20からPro−1000ペプチドにアミノ酸配列As
p−1582からTyr2351がペプチド結合によって共有結合し
たポリペプチド配列からなる。もう一つの典型的な化合
物はSer−760からThr−778のアミノ酸配列とPro−1659
からArg−1708のアミノ酸配列とからなるＸ領域を含ん
でいる。従って、この化合物はPro−1659からTyr−2351
のポリペプチド配列にAla−20からThr−778のアミノ酸
配列がペプチド結合によって共有結合したポリペプチド
配列からなる。更にもう一つの典型的な化合物はSer−7
60からThr−778のアミノ酸配列とGlu−1694からArg−17
08のアミノ酸配列とからなるＸ領域を含んでいる。従っ
てこの化合物はGlu−1694からTyrt−2351のポリペプチ
ド配列にAla−20からThr−778のアミノ酸配列がペプチ
ド結合によって共有結合したポリペプチド配列からな
る。
これらの典型的化合物を表２に概略的に記述する。
Ｘで表わされるアミノ酸配列は分子のプロコアギュラン
ト活性（活性は従来の方法によつて都合よく分析でき
る）を実質的に減じないように選択されるべきである。
表２の化合物（２）は現時点で好適な実施態様である。
通常の組換えDNAの技法と類似の種々の位置特異的突然
変異形成法を使用して、特異的に変えられた第VIII:C因
子DNAによつて形質転換した適当な宿主細胞により、こ
のプロコアギユラント蛋白質を合成できる。
出発物質は表１に示したような完全なヒト第VIII:C因子
のような完全な第VIII:C因子分子、またはその配列の末
端が切断されたものをコードするDNA配列であるか、ま
たは出発物質が少なくとも目的のポリペプチドのアミノ
酸配列を暗号にするのに十分なDNAを含んでいる限り
は、そのDNA配列セグメントでも良い。
ヒト第VIII:C因子の重要なアミノ酸セグメントが欠除し
ているのに加えて、本発明のプロコアギユラント蛋白質
はヒト第VIII:C因子よりもＮ−グリコシル化可能部位が
少ない。好適なのは、少なくとも１個のＮ−グリコシル
化部位が欠失しているものである。より好適なのは、25
個のＮ−グリコシル化可能部位のうち18個が分子中に欠
けているものである。更により好適なのは、25個のＮ−
グリコシル欠可能部位のうち19個までが除去されている
ものである。理論に束縛されたくないが、本発明に従つ
て欠失される蛋白質セグメントすなわちアミノ酸セグメ
ントそれ自身またはグリコシル化蛋白質の炭水化物部位
に含まれる抗原性決定因子に対する第VIII:C因子への抗
体は本発明の凝血促進蛋白質を中和しないと現時点では
考えられている。更に本発明の凝血促進剤がその蛋白質
の生産に使用する非ヒト哺乳類または他の細胞による非
ヒトグリコシル欠部位の多くを欠損するという事実も本
蛋白質の抗原性を減じ、凝血促進剤への抗体を生じさせ
る見込みを少なくすると考えられる。このことが凝血促
進剤による治療を必要とする患者の治療を容易にする可
能性がある。
ヒト第VIII因子の生産を実行するよりも、かなり安い費
用で本化合物を組換えDNA技法によつて合成し得ると発
明者は期待している。宿主生物は本質的により簡単な本
発明の化合物をより効果的にプロセツシングし、発現し
なければならない。
本発明の化合物は既知の方法に従つて非経口適した賦形
剤と一緒にして医薬として適当な製品に処方され得る。
非経口投与に適した本発明の医薬製品としては受血者の
血液と等張の溶液を製造するために減菌水を添加して再
構成できる蛋白質の減菌凍結乾燥製品が挙げられる。そ
の製品は封入アンプルまたはビンのようなユニツトまた
はマルチ投与容器中に入れることができる。その使用は
ヒト第VIII因子の使用と同様であり、効能を適当に調節
する。
これらの蛋白質を発現させる１つの方法は、適当な制限
酵素によつて完全長の第VIII:C因子DNAを切断してヒト
第VIII:C因子のアミノ酸760から1708をコードするDNA配
列を除去して作製されるDNAを使用するものである。次
にその切断DNAをオリゴヌクレオチドと連結し、切断DNA
を切除して正しい翻訳読み枠（reading frame）を保持
する。
cDNAの製造は上記の米国特許出願番号第546,650および6
44,086号に詳しく示されている。表１に記述されたヌク
レオチド配列を含むpSP64組換えクローン（pSP64−VIII
と表示）はアメリカンタイプカルチヤーコレクシヨン
（AmericanType Culture Collection）に寄託番号ATCC3
9812として寄託されている。
制限エンドヌクレアーゼを用いてヒト第VIII:C因子cDNA
（以下においてDNA供給源配列）のヌムレオチド配列の
適当な部位を切断する。他に述べていない限り、制限エ
ンドヌクレアーゼをその販売供給者によつて推奨される
条件および方法で使用する。本明細書で選択された制限
エンドヌクレアーゼは切り取るのが望ましい第VIII:C因
子分子の部分をコード化する特定の配列を切り取ること
が可能なものである。BamHIおよびSecIは特に有効なエ
ンドヌクレアーゼである。しかし、当業者は従来の選択
方法で選択した他の制限エンドヌクレアーゼを使用する
ことも可能である。欠失されるヌクレオチドの数は変動
し得るが、根本的なcDNA配列の読み枠が影響を受けない
ことを確実にするように注意すべきである。
次に生じたDNAフラグメントをマニアチス（Maniatis）
らによるモレキユラークローニング、アラボラトリーマ
ニユアル（Molecular Cloning,ALaboratory Manual）
〔コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spr
ing Harbor Laboratory）1982;この開示は本明細書に参
考文献として含まれている〕およびプロシーデイングス
オブザナシヨナルアカデミーオブサイエンシス（オブジ
ユナイテツドステイツオブアメリカ）〔Proc.Natl.Aca
d.Sci.（U.S.A）〕76:615−619（1979）に記載されたよ
うな慣用の手法を用いて精製する。次に精製したDNAを
連結して、好適な本発明のポリペプチドをコード化する
配列を形成する必要または望ましい時には、通常の連結
条件を用いて、切断DNAを再切除して、正しい翻訳読み
枠を保持するオリゴヌクレオチド内でライゲーションを
行なう。ライゲーション反応は上記でマニアチスらによ
つて2453−６に記載されたようにし、246ページに記載
された緩衝液を用い、１−100μg/mlのDNA濃度で、ブラ
ントエンドのDNAでは23℃、粘着末端のDNAでは16℃の温
度で実施する。下記のようにBamHI/SacI欠失がある時に
は、次の二本鎖オリゴヌクレオチドが有用である。
５′Ｐ−CATGGACCG−３′ ３−TCGAGTACCTGGCCTAG5′； しかし作製される欠失および反応条件によつて当業者で
あれば他のオリゴヌクレオチドを選択することも可能で
ある。
他の方法に加えて、新規なプロコアギユラントポリペプ
チドをコード化するDNA配列は例えばモリナガ（Morinag
a,Y.）らがバイオテクノロジー（Biotechnology）,2:63
6−639（1984）に記載したようなオリゴヌクレオチド媒
介欠失突然変異形成（しばしばループアウト突然変異形
成と呼ばれる）を適用してヒト第VIII:C因子DNAから誘
導され得る。
種々の欠失を含む新規DNA配列を哺乳類の細胞に発現す
るために適当なベクターに導入する。一時的にトランス
フエクシヨンまたは安定に形質転換した宿主細胞によつ
て生産されるプロコアギユラント活性は血漿試料用の標
準的分析を用いて測定され得る。
本明細書に記載される真核細胞発現ベクターは当業者に
よく知られた技法によつて合成され得る。細菌レプリコ
ン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーターなどのベ
クターの成分は天然材料から入手したり既知の方法によ
つて合成する。カーフマン（Kaufman）らのジヤーナル
オブモレキユラーバイオロジー（J.Mol.Biol.）,159:51
−521（1982）：カーフマン、Proc.Natl.Acad.Sci.,82:
689−693（1985）を参照せよ。
形質転換した細胞系を含めた樹立細胞系が宿主として適
している。正常二倍性細胞、インビトロの一次組織培養
及び一次織片培養から導かれた細胞株（造血系幹細胞の
ような比較的未分化の細胞を含む）も適している。選択
遺伝子が優先的に作動する限り、候補細胞は選択遺伝子
がジエノタイプ的に欠失している必要はない。
宿主細胞は樹立された哺乳類の細胞系であることが好ま
しい。染色体DNAにベクターDNAを安定に融合させたり、
融合したベクターDNAを増幅するためにはCHO（チャイニ
ーズハムスター卵巣）細胞が現在は好適である。米国特
許第4,399,216号を参照せよ。別の態様では、ベクターD
NAはウシパピローマ（乳頭類）ウイルスゲノム〔ラスキ
ー（Lusky）ら、セル（Cell）,36:391−401（1984）〕
の全体または一部であっても良く、そしてベクターDNA
は、安定なエピソーム成分としてC127マウス細胞系のよ
うな細胞系に保持される。他の使用可能な哺乳類細胞系
としてはHeLa,COS−１サル細胞、Bowes細胞のようなメ
ラノーマ（黒色腫）細胞、マウスＬ−929細胞、スイ
ス、Balb−ｃまたはNIHからの3T3系、およびBHKやHaKハ
ムスター細胞系などが挙げられる。
次に安定なトランスフオーマントを通常の免疫または酵
素分析によりプロコアギユラント生成物の発現を調べ
る。凝血促進淡白質を暗号に書き直すDNAの存在はサザ
ーンブロツトのような標準的技法によつて検出できる。
COS−１サル細胞のような適性な宿主細胞に発現ベクタ
ーDNAを導入した後数日間一時的に発現するプロコアギ
ユラント遺伝子は選別することなく、培養地中の蛋白質
を酵素的または免疫的に分析して測定する。
本発明は以下に例証する実施態様（純粋に典型的なもの
である）を参考にすれば更に理解されるであろうし、請
求の範囲に記述したように本発明の本当の範囲を限定す
ると解釈すべきではない。
実施例 1. ヒト第VIII:C因子（ヌクレオチド１はATGイニシエータ
ーメチオニンコドンのＡである）のヌクレオチド562−7
269を含むプラスミドpAGE｛pSP64〔プロメガバイオテツ
ク（Promega Biotec），マジソン（Madison）,Wis.〕誘
導体｝（10μｇ）を50mM Tris.HCl（pH8.0）50mM MgC
l2,および2,4ユニツトのBamHI〔ニユーイングランドバ
イオラボ（New England Biolabs）〕を含んだ溶液（100
μ）中で37℃で30分間保持してBamHIを部分的に分解
した。EDTAを20mMになるように添加して反応を止め、フ
エノールで１回、クロロホルムで１回抽出し、エタノー
ルで沈殿させて遠心分離によりペレツトにした。DNAを
再溶解し、40ユニツトのSacI（50μ）中で37℃、1.5
時間かけて完全に分解した。次にDNAを緩衝化した0.6％
アガロースゲルで電気泳動を行つた。第VIII:C因子配列
のヌクレオチド2992−4774に相当する配列だけが欠除し
たpACEの部分的BamHI−SacIフラグメントに相当する8.1
kbフラグメントをProc.Natl.Acad.Sci.,76:615−619（1
979）に記載されたガラス粉末技法を用いてゲルから精
製した。精製したDNAを通常の連結条件を用いて下記の
二本鎖オリゴヌクレオチド ５′Ｐ−CATGGACCG−３′ ３′−TCGAGTACCTGGCCTAG5′ （100pmoles）と連結した。除去されるDNA配列はアミノ
酸998から1581までの584個のアミノ酸の欠失を表わす。
しかし挿入されるオリゴヌクレオチドは998−1000に相
当するアミノ酸をコードしている。従つてコードされた
ポリペプチドは581個のアミノ酸の欠失を含む。
次にコンピテント大腸菌（E.coli）を形質転換するのに
DNAを使用し、目的のSacI−BamHI欠失ミユータントを含
有するプラスミドを固定するため、いくつかのアンピシ
リン耐性トランスフオーマントからのDNAを制限酵素地
図法で分析した。このプラスミドからのDNAはKpnIで完
全に分解した。この酵素は第VIII:C因子をコートする配
列のヌクレオチド1816において特異的にそのプラスミド
を分解するものである。このDNAを第VIII:C因子DNAのヌ
クレオチド１−1815を含むKpnI DNAフラグメントおよび
合成SalI部位と−11から−５のヌクレオチドで連結しコ
ンピテント大腸菌を形質転換するのに使用した。
プラスミドDNAを単離し、制限酵素地図法により向きを
測定してKpnI挿入の５′から３′への正確な向きで含む
プラスミドpBSdKを固定した。そのプラスミドからの全
ポリペプチドコード領域を切除するSalI消化を行ない、
緩衝化した0.6％アガロースゲルでDNAを電気泳動を行な
つた。5.3kbSalIフラグメントを上述のようにしてゲル
から精製した。このDNAフラグメントをXhoI切断pXMT2DN
Aと連結してプラスミドpDGR−２を得た。PXMT2はCOS−
１アフリカグリーンモンキー腎臓細胞系のような哺乳類
の細胞に導入する場合に異種遺伝子を発現できるプラス
ミドであり、上記のカーフマンの689−93ページに記述
された発現ベクターの誘導体である。発現成分はアデノ
ウイルス・メジヤーレイト・プロモーターの転写開始位
置について−45から＋156にわたるアデノウイルス・メ
ジヤー・レイトプロモーターの欠失があること以外はプ
ラスミドpQ2に記述されたものと同様である。pXMTにお
けるmRNA発現はSV40レイトプロモーターによつて誘導さ
れる。しかし細菌レプリコンはテトラサイクリンよりも
むしろアンピシリンに耐性であるベクターを含む細菌を
複製するように代えられる。pXMT2はSV40レイトプロモ
ーターから挿入されたcDNAを発現させる位置に独特のXh
oI部位を含む。SalI部位が側面にあるのでこのXhoI部位
は第VIII:C因子cDNA構造を挿入するのに都合がよい。
トランスフオーマントの制限酵素地図化により、SV40レ
イトプロモーターからの転写の方向に関して、ポリペプ
チドコード配列を、５′から３′への正確な定位を含む
プラスミド、pDGR−２、が同定された。pDGR−２はアメ
リカンタイプカルチヤーコレクシヨンに寄託番号ATCC53
100として寄託されている。
実施例 2. 他の新規凝血促進蛋白質は例えば上記のモリナガらによ
つて記述されたループアウト突然変異形成法を用いたオ
リゴヌクレオチド媒介欠失突然変異形成によつて産生さ
れる構造物から得られる。欠失突然変異形成は発現プラ
スミドpDGR−２または他の適当なプラスミドやバクテリ
オフアージベクターを用いて実行される。M13ベクター
などによつて生産される一本鎖DNAを用いるオリゴヌク
レオチド媒介突然変異形成の他の方法も好適である。ゾ
ラー（Zollar）らによるヌクレイツクアシツズリサーチ
（Nucl.Acids Res.）,10:6487−6500（1982）を参照せ
よ。例えばこれらの欠失はオルゴヌクレオチド （Ａ）５′AAAAGCAATTTAATGCCACCCCACCAGTCTTGAAACGCCA （Ｂ）５′AAAAGCAATTTAATGCCACCGAAGATTTTGACATTTATGA を用いてヌクレオチド（Ａ）2334〜4974または（Ｂ）23
34〜5079から第VIII:C因子cDNA中で欠失を起こして導入
できる。これらの造成物によってコードされる蛋白質は
第VIII:C因子に関しては（Ａ）で880個、（Ｂ）で915個
のアミノ酸の欠失をともなう。
新規蛋白質がプロコアギヤラント活性が有るか否かを決
定するため欠失された蛋白質を直接または適当な発現ベ
クターにサブローニングした後試験した。血液凝固活性
は実施例３および４に記述したようにして分析した。
実施例 3. COSサル細胞におけるプロコアギラント分子の発現実施
例１または２で生産される修飾cDNAおよび全体長のcDNA
を含めた発現プラスミドをDEAE−デキストラントランス
フエクシヨン手順に従つてCOS−１細胞に導入した。ソ
ンペイラツク（Sompayrac）およびデイナ（Dana）によ
るProc.Natl.Acad.Sci.,78:7575−7578（1981）を参照
せよ。トランスフエクション後48時間でならし倍地を回
収し、ツール（Tool）らによりネイチヤー（Nature）,3
12:342−347（1984）に記載されたようにして第VIII因
子型活性を分析する。実験結果を表３に要約した。修飾
cDNAを含む両方のプラスミドはプロコアギラント活性を
生じ、この活性は野生型のcDNAを用いて得たものよりも
強かつた。これらのデータより、ヒト第VIII因子の限定
された範囲内の880個以下のアミノ酸（95,000ダルト
ン）の除去は補因子活性を消去しないと結論された。更
にこれらの短縮されたプロコアギユラント蛋白質はトロ
ンビンによる活性化を受けてもその活性を維持する。
表に示したプラスミドをCOS細胞にトランスフエクシヨ
ンし、48時間後ならし倍地をカビコアテスト（Kabi Coa
test）第VIII:C因子法（色原体活性）およびツールらに
よりネイチヤー（1984）に記載された第VIII:C因子欠損
血漿を用いる一段階の部分的トロンボプラスチン活性化
時間（APTT）凝血分析（クロテツク活性）を行なつた。
トロンビン（IIa）活性化には、試料を0.2ユニット1ml
トロンビン（IIa）で室温で１−10分間予備処理した。
活性化率を括弧内に示す。野生型（pMXT−VIII）トラン
スフエクシヨンの倍地からの活性は低く過ぎてトロンビ
ン活性化前にクロテツク活性を直接測定することはでき
なかつた。野生型第VIII因子活性を濃縮した他の実験か
ら約30倍活性化できることが示された。
実施例 4. CHO細胞におけるプロコアギユラント分子の発現 Ａ）pDGR−２の発現 （第VIII:C因子cDNAに関して）581個のアミノ酸（pDGR
−２）の欠失を含む、プロコアギラントの発現ベクター
をCaPO4共沈法によりプラスミドpAdD26SV（Ａ）＃３（1
0μg pDGR−2:1μg pAdD26SV（Ａ＃３）と一緒にOHO CH
FR欠乏細胞（DUKX−B11）にトランスフエクシヨンし、
トランスフオーマントを単離して、カーフマンら（198
5）によつて記述されたようにMTX濃度を高して増殖させ
た。J1と表示されたトランスフオーマントはMTXの濃度
上昇への耐性機能として以下の活性を示した。
Ｂ）pLA−２の発現 880個のアミノ酸（pLA−２）の欠失があるプロコアギユ
ラント発現ベクターをサンドリーゴルジン（Sandri−Go
ldin）らによりモレキユラーアンドセルラ−バイオロジ
ー（Mol.Cell.Biol.）,1:743−752（1981）に記載され
たプロトプラスト融合法によつてCHO DHFR欠損細胞〔DU
KX−B11,チヤシン（Chasin）およびウルローブ（Urlau
b）,PNAS,77:4216−4220,（1980）〕に導入した。融合
後、各プレートにカナマイシン（100μg/ml）およびチ
ミジン、アデノシン、デオキシアデノシン、ペニシリ
ン、ストレプトマイシン（各10μg/ml）および10％透析
ウシ胎児血清を含む新鮮な倍地を加えた。カナマイシン
はプロトプラストへの変化を逃避させる細胞が生育する
のを防止するために添加した。４日後、細胞を10％透析
ウシ胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシン
（ヌクレオチドは除外）を含んだアルフア倍地に1:15で
継代培養した。選択性倍地に細胞を継代して10−12日後
にコロニーが出現した。Ｂトランスフオーマントのグル
ープを集め、MTXの開始濃度を0.02μＭから0.1、0.2お
よび1.0μＭと段階的に上げて増殖させた。MTX濃度の上
昇への細胞耐性における第VIII因子型活性の結果を下記
に示した。
μ M MTX mUnits/ml/日/106細胞＊ ０ 16 0.02 530 0.2 1170 1.0 1890 ＊ 第VIII因子活性はカビコアテスト第VIII:C因子法
（色原体活性）によつて決定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒト第VIII:C因子のアミノ酸配列を持つ活
    性プロ血液凝固蛋白において、アミノ酸の番号をヒト第
    VIII:C因子のリーダー配列のMet−１から数えて、Thr−
    778とGlu−1694とに挟まれた領域内で、少なくともPro
    −1000とAsp−1582とに挟まれた領域のアミノ酸が欠失
    していることを特徴とする蛋白。
  2. 【請求項２】（ａ）Thr−778とPro−1659とに挟まれた
    領域、または （ｂ）Thr−778とGlu−1694とに挟まれた領域 を欠失しているヒト第VIII:C因子のアミノ酸配列を持ち
    活性プロ血液凝固作用を持つ特許請求の範囲第１項記載
    の蛋白。
  3. 【請求項３】ヒト第VIII:C因子のアミノ酸配列を持つ活
    性プロ血液凝固蛋白において、アミノ酸の番号をヒト第
    VIII:C因子のリーダー配列のMet−１から数えて、Thr−
    778とGlu−1694とに挟まれた領域内で、少なくともPro
    −1000とAsp−1582とに挟まれた領域のアミノ酸が欠失
    していることを特徴とする蛋白の製造方法において、 該蛋白をコードするDNAを発現可能に含有している哺乳
    動物宿主細胞を遺伝子工学的に造成し、次いで、この宿
    主細胞を該蛋白が発現される条件で培養することから成
    る方法。
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