JPH0762152B2 - アルカリプロテア−ゼ含有洗浄剤組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

技術分野 本発明は、優れた洗浄力を有し、かつ、保存時の酵素安
定性の良好な、新規アルカリプロテアーゼを含有する洗
浄剤組成物に関する。 従来技術 従来、衣類の汚れに対する洗浄力をより向上させた洗浄
剤組成物を得るために、アミラーゼ、プロテアーゼ、セ
ルラーゼなどの酵素を配合することがよく知られている
（特公昭47−45802号公報、同48−30646号、特開昭47−
3733号公報、同52−128904号公報、同53−56204号公
報、同56−129298号公報）。その中でも特にバチルス属
（Becillus）から生産されるアルカリプロテアーゼが一
般に使用されており、ノボ・インダストリー社の「アル
カラーゼ」（Alcalase）、「エスペラーゼ」（Esperas
e）、「サビナーゼ」（Savinase），ギスト・ブロカー
ズ社の「マキサターゼ」（Maxatase）、ナガセ生化学工
業（株）の「ビオプラーゼ」等の商品名で市販されてい
る。 しかしながら、これら市販のアルカリプロテアーゼは、
洗浄力向上側であるアルカリビルダーと併用すると、そ
の洗浄力向上効果が不十分であったり、保存時の酵素安
定性に劣るという問題点を有している。 発明の目的 本発明の目的は、アルカリビルダーと併用されて優れた
洗浄力を発揮し、しかも保存時の酵素安定性の良好なア
ルカリプロテアーゼ含有洗浄剤組成物を提供するもので
ある。 発明の構成 本発明のアルカリプロテアーゼ含有洗浄剤組成物は、以
下の（Ａ）および（Ｂ）成分を含有することを特徴とす
る。 （Ａ）バチルス・エスピー（Becillus sp.）Ｙ株（微工
研条寄第1029号）から生産されるアルカリプロテアー
ゼ。 （Ｂ）酸解離指数（pKa）が９以上のアルカリビルダ
ー。 以下、本発明についてさらに詳細に説明する。本発明で
用いられるアルカリプロテアーゼは新規な酵素であり、
広く自然界よりアルカリプロテアーゼ産生菌を検索した
結果見い出された、バチルス属（Becillus）に属する１
菌種、バチルス・エスピー（Becillus sp.）Ｙ株から産
生されたものである。 バチルス・エスピーＹ株は、微工研条寄第1029号（FERM
BP−1029）として工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている。また、バチルス・エスピーＹ株につい
ては、特願昭60−123021号として既に出願された出願明
細書に記載されている。 以下にその菌学的詳細を説明する。 なお、菌学的性質および分類方法は、 Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology第８
版（1974）、R.E.Gordenの検索表（1972）に準じて行な
った。pH10の培地は、炭酸ナトリウム１％を加えて調製
した。温度およびpHに関する成育最適範囲の測定は、温
度勾配バイオフォトレコーダーで行なった。 A.形態的性質 肉汁寒天培地上で35℃にて２日間培養したとき、以下の
形態的特徴が観察される。 １）細胞の形および大きさ： 桿菌、0.4−0.5μｍ×1.7−1.9μｍ。 ２）多形性：なし。 ３）運動性：周鞭毛を有し運動性あり。 ４）胞子：胞子を形成し、形成途上で細胞は先端近くか
ら膨張する。成熟した胞子はレモン型であり、大きさ
は、0.7−0.9μｍ×1.0−1.2μｍ。 ５）グラム染色性：陽性。 ６）抗酸性：陰性。 B.培養的性質 １）肉汁寒天平板培養： pH7.0にて生育して、円形、偏平状、全縁のコロニーを
形成する。該コロニーの表面は滑らかで光沢有り、該周
辺部は淡褐色、該中心部は半透明の淡褐色。 pH10.0にて生育して、円形、偏平状、全縁のコロニーを
形成する。該コロニーの表面は滑らかで光沢有り、クリ
ーム色。 ２）肉汁寒天斜面培養： pH7.0およびpH10.0にて拡帯状に生育し、光沢のあるク
リーム色ないし淡褐色のコロニーを形成する。赤褐色の
色素を僅かに生成する。 ３）肉汁液体培養： pH7.0にて生育するが、菌膜は形成しない。 pH10.0にて生育が良好で、菌膜は形成しない。 ４）肉汁ゼラチン穿刺培養： pH7.0にて僅かに液化する。 pH10.0にて液化する。 ５）リトマス・ミルク pH7.0にて生育が非常に悪い。 pH10.0にて生育する。 ミルクの凝固は見られない。培地がアルカリ性のため、
リトマスの変色は不明。 C.生理的性質 １）硝酸塩の還元：陽性。 ２）脱窒反応：陰性。 ３）MRテスト：陰性。 ４）VRテスト：陰性。 ５）インドールの生成：陰性。 ６）硫化水素の生成：陰性。 ７）デンプンの加水分解：陽性。 ８）クエン酸の利用:Koserの培地では利用しない。Chri
stensenの培地では僅かに利用する。 ９）無機窒素源の利用：硝酸塩は利用しない。アンモニ
ウム塩は利用しない。 10）色素の生成：水溶性の赤褐色の色素を菌体組成物と
に生産する。 11）ウレアーゼ：陽性。 12）オキシダーゼ：陽性。 13）カタラアーゼ：陽性。 14）生育の温度範囲:33ないし35℃付近（20ないし47
℃）が良好。 15）生育のpH範囲:10.0付近（6.0ないし12.0）が良好。 16）酸素に対する態度：好気性下でも嫌気性下でも生育
する。 17）Ｏ−Ｆテスト：陰性。 18）糖類から酸およびガスの生成:D−グルコース、Ｄ−
マンノース、Ｄ−フラクトース、胚芽糖、ショ糖、トレ
ハロース、Ｄ−マンニット、デンプンから酸を生成する
が、ガスは生成しない。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロ
ース、Ｄ−ガラクトース、乳糖、イノシット、グリセリ
ンからは酸もガスも生成しない。 D.その他の性質 １）塩化ナトリウムに対する耐性:10％NaCl下で生育す
る。 以上の性質を総括すると、まず、本菌株は、カラターゼ
陽性、通性好気性で耐熱胞子を有するグラム陽性の桿菌
であることにより、バチルス属の細菌である。 本菌株が、バチルス・アルカロフィルスに属すると思わ
れるため、理研、堀越らのバチルス・アルカロフィルス
No.221（ATCC 21522）、No.58（特公昭48−2792号、50
−16435号参照）、およびNo.D−６（特公昭56−4236参
照）と菌学的性質を比較した。本菌株とバチルス・アル
カロフィルスNo.221、No.58、No.D−６とは、アルカリ
性の培地（pH10）で良く生育する点で一致するが、無機
窒素源の利用に関して、本菌株が、硝酸塩およびアンモ
ニウム塩を利用できないのに対して、上記公知の菌株ら
は、利用できる。また、生育pHの範囲において、本菌株
がpH6からpH12であるのに対して、No.221は、pH7からpH
11であり、No.58、No.D−６は、pH7.5からpH11であり、
上記公知の菌株は、pH7.0以下では生育できない点で異
なる。生育温度の範囲においても、本菌株が20℃から47
℃であり、最適温度範囲が33℃から35℃であるのに対し
て、No.221は55℃、No.58は45℃まで生育でき、最適温
度が37℃から40℃であり、No.D−６も最適温度が35℃か
ら40℃と高く、本菌株と異なる。また、本菌株と、糖類
からの酸の生成をNo.D−６と比較すると、本菌株がＬ−
アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、グ
リセリンから酸を生成しないのに対して、No.D−６は生
成する。更に、本菌株は、10％食塩下でも成育し、上記
公知の菌株とは区別される。 このように本菌株は公知のバチルス・アルカロフィルス
の菌株とは異なるが、上述の菌学的性質からバチルス・
アルカロフィルス類縁菌と判断することが妥当である。 バチルス・エスピー（Becillus sp.）Ｙ株を培養して得
られるアルカリプロテアーゼは、Ya酵素とYb酵素との２
種類であり、それぞれ特願昭60−123022号および特願昭
60−286944号に記載されている。 バチルス・エスピーＹ株の培養は、例えば次のようにし
て行なうことができる。まず、可溶性デンプン２％、硫
酸マグネシウム0.02％を含む液体培地と、乾燥酵母１
％、リン酸水素カリウム0.1％を含む液体培地とを、そ
れぞれ121℃にて20分間別々に滅菌した後、各20mlを500
mlの坂口フラスコに文注し、更に滅菌済みの炭酸ナトリ
ウムを終濃度１％となるように該フラスコに加え、50ml
の培養液を調製する。該培養液にバチルス・エスピー
（Bacillus sp.）Ｙ株を接種し、該培養液を30℃で15時
間培養し、種培養液を調製する。該種培養液100mlを同
じ組成の培地3.5lの入った醗酵タンクに加え、該タンク
に30℃で毎分3.5lの空気を送りながら70時間通気攪拌培
養して微生物液を得る。 Ya酵素とYb酵素との分離・製造法は第１図に示した通り
である。まず、微生物培養液を、10000rpmで５分間遠心
分離し上清を得た。次に上清液を70％飽和の硫安塩析に
かけた。更に得られた沈殿物を20mMトリス−塩酸緩衝液
（Caイオン2mM添加、pH7.2）に溶解し、同緩衝液に対し
て透析し、Ｙ粗酵素（以下、単にＹ酵素と称す）を得
た。続いてＹ酵素溶液を、ジエチルアミノエチル（DEA
E）−53セルロースのアニオン交換クロマトグラフィー
にかけ10mMホウ酸緩衝液（pH9.3）で溶出させ、非吸着
画分を得た。さらに続いて該非吸着画分を、再び70％飽
和の硫安塩析にかけた。得られた沈殿物を再び20mMトリ
ス−塩酸緩衝液（Caイオン2mM添加、pH7.2）に溶解し、
同緩衝液に対して透析した。更にまた該溶液を、トヨパ
ールHW−55のゲル過クロマトグラフィーにかけ、20mM
トリスー塩酸緩衝液（Caイオン2mM添加、pH7.2）に溶出
させ、活性のある画分を集めた。さらに該画分を70％飽
和の硫安塩析にかけ、得られた沈殿物を20mMトリス−塩
酸緩衝液（Caイオン2mM添加、pH7.2）に対して透析し
た。最後に変性蛋白質を除去するために、透析後の活性
画分をミリポアフィルターで過し、精製Ya酵素（以
下、単にYa酵素と称す）を得た。 一方、得られたＹ酵素溶液をジエチルアミノエチル（DE
AE）−53セルロースのアニオン交換クロマトグラフィー
にかけ20mMトリス−塩酸緩衝液（Caイオン2mM添加、pH
7.2）で非吸着画分としてYa酵素を溶出させた後、０〜
0.5M塩化ナトリウムを含む同緩衝液を用い、直線濃度勾
配で溶出し、Yb酵素の粗画分を得た。該クロマトグラフ
ィーの溶出曲線を第２図に示す。さらに続いて該Yb粗画
分を、再び70％飽和の硫安塩析にかけた。得られた沈殿
物を50mMリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、同緩衝液に
対して透析した。さらに該溶液をヘモグロビン−アガロ
ース、アフィニティーカラムクロマトグラフィーにか
け、50mMリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出させ、活性のあ
る画分を集めた。さらに該画分を70％飽和の硫安塩析に
かけ、得られた沈殿物を20mMトリス−塩酸緩衝液（Caイ
オン2mM添加、pH7.2）に溶解し、同緩衝液に対して透析
した。さらに該溶液をトヨパールHW−55のゲル過クロ
マトグラフィーにかけ、20mMトリス−塩酸緩衝液（Caイ
オン2mM添加、pH7.2）で溶出させ、活性のある画分を集
めた。さらに該画分を70％飽和の硫安塩析にかけ、得ら
れた沈殿物を20mMトリス−塩酸緩衝液（Caイオン2mM添
加、pH7.2）に溶解し、同緩衝液に対して透析し、精製Y
b酵素（以下、単にYb酵素と称す）を得た。 精製済みのYa酵素およびYb酵素を試料としたゲル過ク
ロマトグラフィーの溶出曲線を、それぞれ第12図および
第13図に示す。樹脂としてトヨパールHW−55を用い、溶
出液として20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.2,Caイオン2mM
を含む）を用い、展開を上昇法により実施した。また、
精製済みのYa酵素を試料とした高速液体クロマトグラフ
ィーの溶出曲線を第14図に示す。機種はウオーターズWI
SP−710Bを用い、Ｉ−125をカラムを２本直列させ、50m
Mリン酸緩衝液で溶出させた。以上から明らかなよう
に、Ya酵素およびYb酵素は完全に精製された。 精製済みのYa酵素およびYb酵素を試料としたゲル過ク
ロマトグラフィーの溶出曲線を、それぞれ第12図および
第13図に示す。樹脂としてトヨパールHW−55を用い、溶
出液として20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.2,Caイオン2mM
を含む）を用い、展開を上昇法により実施した。また、
精製済みのYa酵素を試料とした高速液体クロマトグラフ
ィーの溶出曲線を第14図に示す。機種はウオーターズWI
SP−710Bを用い、Ｉ−125カラムを２本直列させ、50mM
リン酸緩衝液で溶出させた。以上から明らかなように、
Ya酵素およびYb酵素は完全に精製された。 すなわち、バチルス・エスピー（Becillus sp.）Ｙ株を
培養することによって得られるアルカリプロテアーゼで
あるＹ酵素は、はYa酵素とYb酵素との混合物であり、そ
の比率はYa酵素/Yb酵素＝90/10〜50/50である。 次に前述した方法に従って得られたYa酵素、Yb酵素およ
びＹ酵素について説明する。 〔１〕基質特異性 Ya酵素およびYb酵素の作用は、蛋白質の加水分解であ
る。その酵素の基質特異性を第１表に示す。また、バチ
ルス・エスピー（Bacillus sp.）Ｙ株より同時に生産さ
れるYa酵素およびYb酵素との混合物の基質特異性も同様
に評価し、比較した。 Ａ酵素［バチルス・リケニフォルミス（Bacillus Liche
niformis）より単利されたアルカリプロテアーゼ（商品
名アルカラーゼ、ノボ社）の活性を100としたときの相
対分解率を次の条件で測定した。 条件：温度 35℃ pH 10.5（50mMホウ酸緩衝液） 反応時間 60分 基質温度 １％ただしヘモクロビンは0.4％ 酵素使用量 100APU/mlただし卵白は500APU/ml 蛋白質分解率すなわち活性の測定は、アンソン−萩原の
変法に従った。反応後過した反応溶液の吸光度275nm
にて測定した。１分間にチロシン１μｇを遊離させる酵
素活性を１アルカリプロテアーゼ単位（APU）とした。 この表から、Ya酵素はケラチンに対して特異性が強く、
Yb酵素は卵白に対する特異性が強く、不溶性蛋白質であ
るケラチンに対しては弱いことが分かる。また、Ya酵素
とYb酵素の混合物であるＹ酵素は、公知のＡ酵素より広
範な基質に対して強く作用する特徴を有する。 〔２〕至適pHおよび安定pH領域 Ya酵素およびYb酵素の至適pHおよび安定pH領域のグラフ
図を第３図および４図に示す。用いた緩衝液は以下のと
おりである。 pH領域 緩衝液 3.5−5.5 酢酸 4.5−7.0 クエン酸 6.0−8.0 リン酸 7.5−9.0 トリス−HCl 8.0−9.0 ホウ酸−HCl 9.0−10.5 グリシン−NaOH 9.5−11.0 ホウ酸−NaOH 11.0−12.0 リン酸−NaOH 12.0−13.0 KCl−NaOH 至適pHを調べるに当っては、カゼイン0.6％を含む20mM
の各緩衝液に各酵素を約400APU/mlとなるように加え、3
5℃で10分間反応させ活性を測定した。至適pHでの活性
を100とするときの各pHでの相対活性を求めた。安定pH
領域を調べるに当っては、20mMの各緩衝液に各酵素を約
400APU/mlとなるように加え、25℃で24時間インキュー
ベートした後、活性を測定した。インキューベート前の
活性を100として各pHでの相対活性を求めた。第３図か
ら分かるように、Ya酵素の至適pHは10.0ないし12.5であ
り、安定pH領域は6.5ないし13.0である。第４図から分
かるように、Yb酵素の至適pHは9.0ないし10.0であり、
安定pH領域は6.5ないし12.0である。 〔３〕至適温度及び耐熱性 Ya酵素およびYb酵素の至適温度と耐熱性を第５図および
６図に示す。至適温度を調べるに当っては、基質として
0.6％のカゼインを含むpH10.5の緩衝液に各酵素を加
え、10分間各温度で反応させた。35℃での活性を100と
して各温度での相対活性を求めた。耐熱性は次のように
して調べた。50mMホウ酸−NaOH緩衝液（35℃でpH10.5）
に約400APU/mlの酵素を加え、各温度で10分間熱処理
し、氷冷した後、活性を測定した。第５図から分かるよ
うに、Ya酵素の至適温度は70℃であり、55℃の温度まで
活性が維持される。 第６図から分かるように、Yb酵素の至適温度は65ないし
70℃の範囲であり、50℃の温度まで100％活性が維持さ
れる。 〔４〕紫外線吸収スペクトル Ya酵素およびYb酵素の紫外線吸収スペクトルを第７図お
よび第８図に示す。試料を50mMのトリス−塩酸緩衝液
（pH8.0）に溶かし、紫外線吸収スペクトルを測定した
ところ、Ya酵素は277nmの波長で極大吸収を示し、その
波長での吸光係数▲E^1% _1cm▼は7.5と計算された。一
方、Yb酵素は278nmの波長で極大吸収を示し、その波長
での吸光係数▲E^1% _1cm▼は9.5と計算された。 〔５〕金属イオンの影響 金属イオンのYa酵素およびYb酵素の活性に与える影響を
調べた。その結果を第２表および第３表に示す。20mMホ
ウ酸−NaOH緩衝液（pH10.5）にYa酵素またはYb酵素を約
400APU/mlを加え、更に各種金属塩を1mMの濃度で添加
し、各所定の条件で処理後残存活性を測定した。数値は
０分の活性を100としてその相対活性で表す。 この第２表から、Ya酵素は硫酸銅、硝酸銀、塩化第２水
銀、塩化カドミウムの添加により活性は阻害されるが、
塩化カルシウムの添加では活性の熱に対する安定性が増
すことがわかる。 また、第３表から、Yb酵素は硫酸銅、硝酸銀、塩化第２
水銀の添加により、活性が阻害されることが分かる。 バチルス属に属する菌の生産するアルカリプロテアーゼ
は、一般にCa²⁺によって熱安定性を増すことから、Ca²⁺
の効果をみるため、5mMのCa²⁺を含む50mMホウ酸−NaOH
緩衝液（35℃でpH10.5）に約400APU/mlの酵素を加え、
各温度で10分間熱処理し、氷冷した後活性を測定して残
存活性を求めた。比較のため、Ca²⁺を加えない条件でも
同時に評価した。その結果を第４表に示す。数値は０分
の活性を100としてその相対活性で表す。 Caイオンの添加により、熱に対する安定性がYa酵素では
約５℃、Yb酵素では約10℃向上することが分かった。 〔６〕阻害剤の影響 Ya酵素およびYb酵素に対する各種の阻害剤の影響を調べ
た。条件および方法は以下の通りである。50mMトリス−
塩酸緩衝液（pH7.2）でYa酵素またはYb酵素を800APU/ml
になるよう調製した。各阻害剤を添加して、35℃で30分
間インキューベート後、残存活性を測定した。値は、阻
害剤無添加のものを100とした相対活性で示した。その
結果を第５表に示す。 この表から分かるように、Ya酵素およびYb酵素は、カゼ
インを基質とした場合、EDTA（エチレンジアミン四酢
酸）およびPCMB（ｐ−クロロマーキュリー安息香酸）、
アンチパイン（Antipain）、キモスタチン（Chymostati
n）では活性が阻害されないが、DFP（ジイソプロピルフ
ルオロリン酸）およびPMSF（フェニルメタンスルフォニ
ルフルオリド）では活性が阻害されることより、活性中
心にセリンを有するプロテアーゼである。 〔７〕分子量 Ya酵素およびYb酵素の分子量をゲル過クロマトグラフ
ィーにより調べた。充填剤には、トヨパールHW−55を用
い、20mMトリス−塩酸緩衝液（Caイオン2mM添加、pH7.
2）を溶出液とした。標準蛋白に以下の蛋白（カッコ内
は分子量）を用いて検量線を作成した。蛋白アルブミン
（43,000）、サーモライシン（37,500）、ズブチリシン
（27,600）、キモトリプシノーゲン（25,700）、ミオグ
ロビン（17,200）、チトクロームＣ（11,700）を用い
た。検量線を第９図に示す。この方法により、Ya酵素の
分子量は21,000,Yb酵素の分子量は40,000と決定した。 〔８〕等電点 Ya酵素およびYb酵素の等電点を等電点電気泳動法により
調べた。カラム用担体には、ファルマライト３−10を用
いた。Ya酵素およびYb酵素の等電点電気泳動模様を第10
図および11図に示す。この方法によりYa酵素の等電点は
10.1、Yb酵素の等電点は5.1と決定した。

〔９〕アミノ酸組成 Ya酵素およびYb酵素のアミノ酸組成〔アミノ酸分析器JL
C−200A（日本電子）使用〕を調べた。なお、トリプト
ファンはアルカリ分解法、システインは過蟻酸酸化法に
より測定した。その組成を公知のプロテアーゼのものと
比較して第６表に示す。 その結果、他の酵素と比べてYa酵素はトリプトファン、
セリン、バリンなどYb酵素はトリプトファン、ヒスチジ
ン、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、アラニン
などのアミノ酸組成において顕著な相違が見られる。 〔10〕元素分析値 Ya酵素およびYb酵素の元素分析値を第７表に示す。 最後にまとめて、Ya酵素大きいYb酵素の各種性状をＡ酵
素、バチルス属の好アルカリ性細菌の生産する公知のア
ルカリプロテアーゼのもと比較して後記の第８表に示
す。 他の類似した公知のアルカリプロテアーゼ（Ｅ−1,E−
2,API−21,No.221については第８表の注を参照）と比較
すると、至適pHはＡ酵素、Ｅ−１、Ｅ−２およびAPI−2
1が10〜11、No.221が11〜12であり、Ya酵素は10〜12.5
と領域が高pH側に広く、Yb酵素の至適pHは９〜10であ
り、Ya酵素と他の公知のアルカリプロテアーゼに比べて
低い。 次に、至適温度がYa酵素およびYb酵素が70℃付近にある
のに対して、Ａ酵素、No.221は60℃、API−21は45〜50
℃と低く、Ｅ−１、Ｅ−２においては、75℃とYa酵素お
よびYb酵素より高く、この点においても異なる。 また、Ya酵素およびYb酵素は5mMCa²⁺イオン存在下で、
Ａ酵素、No.221、API−21の酵素と同様に耐熱性が約５
〜10℃向上するが、バチルスNo.D−６株（第８表の注を
参照）の生産するＥ−１、Ｅ−２はCa²⁺イオンによる熱
安定性の増大が認められない点で異なる。 更に、Yb酵素の分子量が４万と公知のアルカリプロテア
ーゼに比べて大きく、等電点も5.1と低いことからも、
明らかに別種のものと言える。 以上のことから本酵素は従来知られているアルカリプロ
テアーゼのいずれとも異なる。よって本酵素を新規酵素
と判断することが妥当であり、アルカリプロテアーゼYa
およびYbと命名した。 本発明のアルカリプロテアーゼ（Ｙ酵素）の配合量は特
に限定されないが、好ましくは、洗浄剤組成物1kg当り5
0〜10000APU、さらに好ましくは1000〜5000APUである。 （Ｂ）成分のアルカリビルダーは、酸解離指数（pKa）
が９以上であることが必要である。ここでいう酸解離指
数（pKa）は、酸解離定数（Ka）の逆数の対数値で示さ
れる。酸解離指数が９未満では、洗浄力向上効果が不十
分である。酸解離指数が９以上のアルカリビルダーとし
ては、ジエタノールアミン（pKa＝8.90）、モノエタノ
ールアミン（pKa＝9.52）、炭酸ナトリウム（pKa＝10.3
3）ケイ酸ナトリウム（pKa＝13.1）等が挙げられ、これ
らは単独で用いてもよく、２種以上組合せてもよい。 （Ｂ）成分のアルカリビルダーの洗浄剤組成物に対する
配合量は特に限定されないが、好ましくは３〜20wt％、
さらに好ましくは５〜15wt％である。 本発明の洗浄剤組成物は、pHを９以上とすることが望ま
しい。 本発明の洗浄剤組成物の中には、さらに必要に応じて任
意成分を配合することができる。任意成分としては、一
般に洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤、キレートビ
ルダー、再汚染防止剤、漂白剤、酵素、蛍光増白剤、ハ
イドロトロープ、無機塩、香料などがあげられる。 界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤、イニオン
性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤
または双性イオン界面活性剤などが用いられる。アニオ
ン性界面活性剤としては、通常のスルホネート系、サル
フェート系、ホスフェート系のアニオン性界面活性剤お
よび石鹸が使用される。スルホネート系アニオン性界面
活性剤としては、Ｃ_８〜22の直鎖または分枝鎖のアルキ
ルベンゼンスルホン酸塩、Ｃ_８〜22の長鎖アルキルスル
ホン酸塩、Ｃ_８〜22の長鎖オレフィンスルホン酸塩、な
どが挙げられる。また、サルフェート系アニオン性界面
活性剤としては、Ｃ_８〜22の直鎖または分枝鎖のアルキ
ルないしアルケニル硫酸エステル塩、Ｃ_８〜22のポリオ
キシエチレン（EO＝１〜７モル）直鎖または分枝鎖の
アルキルないしアルケニルエーテル硫酸エステル塩、Ｃ
_８〜18のポリオキシエチレン（EO＝１〜７モル）直鎖
または分枝鎖のアルキルフェニルエーテル硫酸エステル
塩などが挙げられる。ここでEOは、エチレンオキシド
の平均付加モル数を示す。また、ホスフェート系アニオ
ン性界面活性剤としては、Ｃ_８〜22のモノアルキル（ま
たはアルケニル）、ジアルキル（またはアルケニル）あ
るいはセスキリン酸塩、Ｃ_８〜22のポリオキシエチレン
（EO＝１〜７モル）モノアルキル（またはアルケニ
ル）、ジアルキル（またはアルケニル）あるいはセスキ
リン酸塩などが挙げられる。石鹸としては、Ｃ_８〜24の
飽和または不飽和脂肪酸塩が挙げられる。これらのアニ
オン性界面活性剤の対イオンとして陽イオンは、例えば
ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどのアルカリ金
属またはアルカリ土類金属イオン、モノエタノールアミ
ン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどの
アルカノールアミン、アンモニウムなどである。 ノニオン性界面活性剤としては、Ｃ_８〜22のポリオキシ
エチレン（EO＝１〜25モル）直鎖または分枝鎖のアル
キルまたはアルケニルエーテル、Ｃ_８〜18のポリオキシ
エチレン（EO＝１〜25モル）アルキルまたはアルケニ
ルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプ
ロピレンブロックコポリマーなどのオキシアルキレン付
加化合物、Ｃ_８〜24の飽和または不飽和脂肪酸アルカノ
ールアミドまたはそのアルキレンオキサイド付加物、Ｃ
_12〜14の第三級アミンオキシドなどが挙げられる。 両性界面活性剤としては、ジメチルジアルキル（Ｃ
_８〜18）アルキルカルボキシベタイン、ジアルキル（Ｃ
_８〜18）アミノアルキレンカルボン酸塩、２−アルキル
−１−カルボキシ−１−ヒドロキシエチルイミダゾリウ
ムベタインなどが挙げられる。 カチオン性界面活性剤としては、下記の一般式（Ｉ）、
（II）、（III）で表されるものが挙げられる。 （式中のR₁、R₂、R₃、R₄の少なくとも１つはＣ_12〜24の
アルキルまたはアルケニル基であり、その他はＣ_１〜４
のアルキル基またはビトロキシアルキル基あるいはベン
ジル基を表わし、Ｘはハロゲンを表わす。） （式中のR₅とR₆はＣ_12〜24のアルキル基またはアルケニ
ル基、R₇はＣ_１〜４のアルキル基またはビトロキシアル
キル基あるいはベンジル基、R₈はＨまたはCH₃、ｎは１
〜５の整数、Ｘはハロゲンを表わす。） （式中のR₉とR₁₀はＣ_12〜24のアルキル基またはアルケ
ニル基、ｌおよびｍは１〜20の整数、Ｘはハロゲンを表
わす。） これらの界面活性剤はそれぞれ単独で用いてもよいし、
２種以上組合せてもよく、その配合量は10〜50wt％が適
当であり、好ましくは15〜40wt％である。 キレートビルダーとしては、オルソリン酸塩、ピロリン
酸塩、トリポリリン酸塩、メタリン酸塩、ヘキサメタリ
ン酸塩等のリン酸塩；ニトリロ三酢酸、エチレンジアミ
ン四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、
ジエチレントリアミン五酢酸等のアミノカルボン酸また
はこれらの塩；クエン酸、ジグリコール酸、リンゴ酸、
シュウ酸、酒石酸、コハク酸などの多価カルボン酸塩ま
たはこれらの塩；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、
アクリル酸共重合体、ポリマイレン酸、ポリフマル酸、
無水マレイン酸共重合体などの高分子電解質またはこれ
らの塩；ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコー
ル、カルボキシメチルセルロースなどの非電解離高分
子；一般式 （IV）で表わされる結晶性または無定形アルミノケイ酸
塩が挙げられる。 ｘ（M₂O又はＭ′Ｏ）・Al₂O₃・y(Sio₂)・w(H₂O）… （I
V） （式中のＭはアルカリ金属、Ｍ′はカルシウムと交換可
能なアルカリ土類金属、ｘ、ｙ、ｗは各成分のそれぞれ
モル数を表わし、一般的には、ｘは0.7〜1.5yは１〜
３、ｗは任意の数である。） これらビルダーは１種または２種以上組合せて用いら
れ、洗浄剤組成物中に好ましくは１〜50wt％、さらに好
ましくは５〜30wt％配合させる。 再汚染防止剤としては、カルボキシメチルセルロース、
ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ
ビニルピロリドンなどが；漂白剤としては過炭酸ソー
ダ、過ホウ酸ソーダなどが；酵素としては本発明以外の
プロテアーゼおよびリパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ
などが；蛍光増白剤としては、4,4′−ビス（２−スル
ホスチル）−ビフェニル塩、4,4′−ビス（４−クロロ
−３−スルホスチリル）−ビフェニル塩、２−（スチル
フェニル）ナフトチアゾール誘導体、4,4′−ビス（ト
リアゾール−２−イル）スチルベン誘導体、ビス（トリ
アジニルアミノ）スチルベンジスルホン酸などが、ハイ
ドロトロープとしては低級アルコール、多価アルコー
ル、低級アリールスルホン酸またはその塩などが挙げら
れ、これらの各成分はいずれもそれぞれ単独で用いても
よいし、２種以上組合せてもよい。 発明の効果 本発明によれば、バチルス・エスピーＹ株から生産され
る新規なアルカリプロテアーゼを、酸解離指数が９以上
のアルカリビルダーと併用して用いることにより、十分
な洗浄力向上効果が発揮され、しかも長期保存において
も酵素の活性低下が極めて小さく、従来から知られてい
た酸素含有洗浄剤組成物に比べて、顕著に改善された酵
素安定性と洗浄力を併有する極めて実用性に高い洗浄剤
組成物が実現される。 次に、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
各実施例における評価は、以下の試験方法に従って行な
った。 ・洗浄力 US.Testing社のTerg−Ｏ−Tometerを洗浄装置として使
用し、これにタンパク質配合湿式人工汚垢布10枚とセバ
ム布、清浄メリヤス布を入れ浴比30倍に合わせ、120r.
p.mで25℃10分間洗浄する。洗浄液は、所定の洗浄濃度
のもの900mlを用い、すすぎは900mlの水で３分間行な
う。使用水は3DHのものを用いた。洗浄力は次式で算出
する。 なお、本洗浄力試験法は、油化学30,432（1981）「新し
い人工汚垢に関する研究（第１報）」に準ずる。 ・酵素活性残存率 供試洗浄剤組成物100mlを広口ビンに入れ、所定温度に
所定時間保存したのち酵素活性を測定し、保存前の酵素
活性に対する度合いを100分率で表わした。なお、酵素
活性の測定は、朝倉書店発行「酵素研究法２」（赤堀四
郎編）第228ページ以下に記載のCasein−275mμ吸収Ａ
法に準じて行なった。 実施例１ 後記第９表に示す各組成の液体洗浄剤組成物を調製し
て、その性能を評価した。 実施例２ ポリエチレンアルカリ硫酸エステルナトリウム（炭素数
12〜13、直鎖率80％、平均EO付加モル数３）20wt％、ポ
リオキシエチレンアルキルエーテル（炭素数12〜13、直
鎖率80％、平均EO付加モル数７）15wt％、モノエタノー
ルアミン10wt％、パラトルエンスルホン酸5wt％、エタ
ノール4wt％、水バランスを基準配合組成とし、第10表
に示すように酵素を含有させて各種液体洗浄剤組成物を
調製し、それぞれ組成物の洗浄力、酵素安定性を評価
し、その結果を第10表に示した。なお、Ya、Yb、Ｙ酵
素、の配合量は洗浄剤１グラム当り5000APUとなるよう
に配合し、アルカラーゼ2.5Lは1wt％配合した。

【図面の簡単な説明】 第１図はYa酵素およびYb酵素の精製段階を示すフローシ
ートである。 第２図はＹ酵素のDEAE−53セルロースのアニオン交換ク
ロマトグラフィーにかけた際の溶出曲線を示すグラフで
ある。 第３図はYa酵素の至適pHおよび安定pH領域を、第４図は
Yb酵素の至適pHおよび安定pH領域を示すグラフである。 第５図はYa酵素の至適温度および耐熱性を、第６図はYb
酵素の至適温度および耐熱性を示すグラフである。 第７図はYa酵素の紫外線吸収スペクトル曲線を、第８図
はYb酵素の紫外線吸収スペクトル曲線を示すグラフであ
る。 第９図はYa酵素およびYb酵素の分子量決定の際の検量線
を示すグラフである。 第10図はYa酵素の、第11図はYb酵素のそれぞれ等電点電
気泳動模様を示すグラフである。 第12図はYa酵素の、第13図はYb酵素のそれぞれゲル過
クロマトグラフィー溶出曲線を示すグラフである。 第14図はYa酵素の高速液体クロマトグラフィー溶出曲線
を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（Ａ）バチルス・エスピー（Bacillys s
   p.）Ｙ株（微工研条寄第1029号）から生産されるアルカ
   リプロテアーゼおよび （Ｂ）酸解離指数（pKa）が９以上のアルカリビルダー を含有することを特徴とするアルカリプロテアーゼ含有
   洗浄剤組成物。