JPH07504891A - ヒトクニッツ型プロテアーゼインヒビターの変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトクニッツ型プロテアーゼインヒビターの変異体見凱東孜歪分互 本発明は、ヒトークニッッ（Ｋｕｎｉｔｚ）型プロテアーゼインヒビタードメイ ンの変異体、その変異体をコードするＤＮＡ　、該変異体の製造方法、および該 変異体を含有する医薬組成物に関する。

生凱Ω■景 多形槙白血球（好中球またはＰＭＮ）および単核食細胞（単球）は、組織の損傷 、感染、急性および慢性の炎症および創傷の治癒に重要な役割を演する。これら の細胞は血液から炎症部位に移動し、次いで固有の刺激を受けて、オキシダント 化合物（Ｏ８・、０．−。

Ｈ＊０、および）ＩＯＣＩ）ならびに各種のタンパク質分解酵素を含有する顆粒 を放出する。これらの分泌顆粒は、例えばアルカリホスファターゼ、メタロブロ ティナーゼ例えばゼラチナーゼおよびコラゲナーゼ、ならびにセリンプロテアー ゼ、例えば好中球エラスターゼ、カテプシン、Ｇおよびブロティナーゼ３を含有 している。

潜伏メタロブロティナーゼ類はメタロブロティナーゼの組織インヒビター（ＴＩ ＭＰ）とともに放出される。その活性化の機構は充分解明されていないが、チオ ール基の酸化反応および／またはタンパク質分解反応がそのプロセスで役割を演 じているようである。また遊離のメタロブロティナーゼの活性はＴＩＭＰの不活 性化に依存している。

白血球のアズール親和性（ａｚｕｒｏｐｈ　ｉ　Ｉ）顆粒には、セリンプロテア ーゼ類の好中球エステラーゼ、カテプシンＧおよびプロテアーゼー３が、ゲルコ サミノグルカン類と複合した活性酵素として詰められている。これらの複合体は 不活性であるが、分泌する際に解離して活性酵素を放出する。そのプロテアーゼ 活性を中和するため、インヒビターであるα１−プロティナーゼインヒビター（ α＋　ＰＩ）とα１−キモトリプシンインヒビター（α＋　Ｃｈｉ）が大量に血 漿中に見られる。しかしＰＭＮはこれらインヒビターを局所で不活性することが できる。したがって、好中球エステラーゼの最も重要なインヒビターであるαＩ −１’ｌは、トリガーされたＰＭＮによって産生される酸素代謝生成物による反 応中心（Ｎｅｔ　３５Ｂ）における酸化反応に対して感受性である。このことか ら、α、　−ＰＩの好中球エラスターゼに対するアフィニティーは約１　／２０ ００まで低下する。

αＩ　−ＰＩの局所中和の後、好中球エラスターゼは他のタンパク質分解酵素の 多数のインヒビターを分解することができる。エラスターゼは、α、−Ｃｈｉを 切断するのでカテプシンＧの活性を助長する。

エラスターゼはＴＩＭＰをも切断するのでメタロプロティナーゼによる組織の分 解が起こる。さらに、エラスターゼは、抗トロンビンＩＩＩとヘパリン補因子Ｉ Ｉおよび恐らくは血餅の生成を促進する組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ） を切断する。一方好中球エラスターゼがし凝固因子を分解する性能は逆の作用を もっているようであり、そのためエラスターゼの作用全体は明らかになっていな い、好中球エラスターゼの線維素溶解現象に対する作用はそれほど不明確ではな い、エラスターゼがプラスミノーゲン活性化因子インヒビターとα２プラスミン インヒビタ−を分解すると線維素溶解活性が増大する。他方、これら両インヒビ ターはＯ８代謝物によって酸化されて不活性化する。

ＰＭＮは多量のセリンプロテアーゼを含存し、各白血球プロテアーゼ約２００　 ｍｇが毎日放出され体内の侵襲性因子を処理する。急性炎症が起こると放出され る酵素の量が何倍も増大する０通常の条件下では、タンパク質分解反応は、大量 のインヒビターαｌ　−ＰＩ、α、−Ｃｈ■およびα２マクログロブリンによっ て、受入れられる程度に低いレベルに保持されている。しかし、多数の慢性疾患 が、ＰＭＨの過刺激による病理学的タンパク質分解反応、例えば自己免疫応答、 慢性感染、タバコの煙または他の刺激源などによって起こるという証拠がある。

アプロチニン（ウシ膵臓トリプシンインヒビクー）は、トリプシン、キモトリプ シン、プラスミンおよびカリクレインを含む各種のセリンプロテアーゼを阻害す ることが知られており、急性肝臓炎、各種の状態のションク症候群、高線維素溶 解性出血および心筋梗塞を治療する際に治療用に用いられている（例えばＪ、Ｅ 、Ｔｒａｐｎｅｌ　Ｉら。

Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｓｕｒｇ、＋　６１巻、１７７頁、　１９７４年ｉ　Ｊ、ＭｃＭ ｉｃｈａｎら＋　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｏｒｙｓｈｏｃｋ、　９巻、１０７頁、　１ ９８２年ｉ　１．、Ｍ、Ａｕｅｒら、＾ｃＬａ　Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ、＋　４９ 巻、２０７頁、　１９７９年；　Ｇ、５ｈｅｒ＋八−、Ｊ、０ｂｓＬｅＬ、Ｇｙ ｎｅｃｏｌ、、　１２９　Ｓ＋１６４頁、　１９７７年；およびＢ、５ｃｈｎｅ ｉｄｅｒ、＾ｒｔｚｎｅｉｍ、−Ｐｏｒｓｃｈ、、　２６巻。

１６０６頁、　１９７６年参照）、アプロチニンを多量に投与すると、心肺バイ パス手術を含む心臓外科手術による血液の損失が著しく低下する（例えばＢ、Ｐ 、Ｂｉｄｓｔｒｕｐら、　Ｊ、Ｔｈｏｒａｃ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ、Ｓｕｒｇ 、＋　９７巻−３６４〜３７２頁、　１９８９年；　Ｗ、Ｖａｎ　０ｅｖｅｒｅ ｎ　ら、　Ａｎｎ、Ｔｈｏｒａｃ、Ｓｕｒｇ、＋　４４Ｓ、　６４０〜６４５真 、　１９８７年参照）、ある種のアプロチニン類似体、例えばアプロチニン（１ −５８，Ｖａ１１５）は顆粒球エラスターゼに対する比較的高い選択性とコラゲ ナーゼに対する阻害作用を示し、アプロチニン（１−５８，ＡＩａ１５）はエラ スターゼに対する作用は弱く、一方アブロチニン（３５８，Ａｒｇ１５．八Ｉａ １７．５ｅｒ４２）は優れた血漿カリクレイン阻害作用を示す（国際特許願公開 第ｗｏ８９／　１０３７４号参照）６しかし、アプロチニンはラット、ウサギお よびイヌに生体内投与した場合、比較的多量を繰返し注射した後、腎毒性作用を 示すことが見出されている（Ｂａｙｅｒ、　Ｔｒａｓｙｌｏｌ、　Ｉｎｈｉｂｉ ｔｏｒ　ｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　；”Ｖｅｒｈａｎｄｌｕｎｇｅｎ　ｄｅ ｒ　Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ　Ｇｅ５ｅｌｌｓｃｈａｆｔ　ｆｔ１ｒ　Ｉｎｎｅｒｅ 　Ｍｅｄｉｚｉｉ＋７８、Ｋｏｎｇｒｅｓｓ”　Ｂｅｒｇｍａｎｎ、　ＭＵｎｃ ｈｅｎ＋　１６１２〜１６１４頁、　１９７２年のＧｌａｓｅｒらの報告）、ア プロチニンについて観察された腎毒性（例えば損傷の形態において現われる）は 、アプロチニンが高いプラスの正味電荷をもっているので近位尿細管のマイナス に帯電している表面に捕捉されることから、腎臓の近位尿細管の細胞中にアプロ チニンが蓄積することが原因かもしれない、この腎毒性があるため、アプロチニ ンは臨床用には余り適切でない、特に多量のインヒビターを投与する必要がある 臨床目的（例えば心肺バイパス手術）には余り適切アプロチニンをヒトに投与す ると望ましくない免疫応答を起こす一つ又は複数のエピトープをもっている。

したがって本発明の目的は、頻（１４のインヒビターのプロフィルをもっている かまたは改質されて望ましいインヒビターのプロフィルを示すアプロチニンと同 じタイプのヒトプロテアーゼインヒビター（すなわち、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ ）型インヒビター）を同定することである。

３瀝Ｆと」ｈ 本発明は、組織因子経路インヒビター（ＴＰＰＩ）のヒトクニッツ型プロテアー ゼインヒビタードメイン■の変異体に関し、この変異体は下記のアミノ酸配列で 構成されている。

Ｘ’　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｘ”　Ｇｌｙ　Ｘ３ Ｃｙｓ　Ｘ’　Ｘ’　Ｘ’　Ｘ’　Ｘ＠Ｘ’Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　 Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　 Ｘ”　ＴｙｒＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｘ”　Ｘ”　Ｘ”　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ａ ｒｇ　Ｐｈｅ　Ｘ”　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＣｙｓ　Ｘ”　Ｘ”　Ｍ ｅＬ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｘ”（配列番号：ｌ）ここでＸ−はＨｌまたは Ｃｙｓを除く１〜７個の天然アミノ酸残基を表し、Ｘｔ−Ｘ”は各々独立してＣ ｙｓを除く１個の天然アミノ酸残基を表し、そして）（ｌはＯＲ１またはＣＹＳ を除く１〜５個の天然アミノ酸残基を表す。但しアミノ酸残基ＸＩ　ＸＩ？の少 なくとも一つは未変性の配列の対応するアミノ酸配列とは異なる。

本願においては、“天然アミノ酸残基”という用語は通常存在するアミノ酸すな わち、＾ｌａ、　Ｖａｌ＋　Ｌｅｕ＋　ＩＩｅ＋　Ｐｒｏ、　Ｐｈｅ＋　Ｔｒｐ ＋　Ｍｅｔ。

ＧＩｙ＋　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ、　Ｃｙｓ＋　Ｔｙｒ、　Ａｓｎ＋　ＧＩｎ＋＾ｓ ｐ、　Ｇｌｕ、　Ｌｙｓ＋＾「ｇおよび旧Ｓのいずれか一つを意味するものとす る。

ＴＦＰＩは、外因性経路インヒビター（ＵＰＩ）またはりボタンバク質関連凝固 インヒビター（ＬＡＣＩ）　としても知られており、Ｂｒｏｚｅらにより単離さ れ（Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４巻、　１８８６〜１ ８９０頁、　１９８７年およびヨーロッパ特許第３００９８８号）、かつこのタ ンパク質をコードする遺伝子はクローン化されている（ヨーロッパ特許第３１８ ．４５１号参照）、このタンパク質の二次構造を分析した結果、このタンパク質 は、アミノ酸２２〜アミノ酸７９（ｒ）、アミノ酸９３〜アミノ酸１５０（ＩＩ ）およびアミノ酸１８５〜アミノ酸２４２　（ＩＩＩ　）の３つのクニンツ型の インヒビタードメインをもっていることが分かっている。

ＴＦＰＩのクニッツ型ドメインＩはＴＦ／ＦＶＩＩａと結合し、他方クニソツ型 ドメインＩＩはＦＸａに結合することが報告されている　（Ｇｊｒａｒｄら。

Ｎａｔｕｒｅ＋　３３８巻、　５１８〜５２０頁、　１９８９年）。

上記の位置の１つ又は複数において１つ又は複数のアミノ酸を置換することによ って、ＴＦＰＩのクニノツ型ドメイン■のインヒビタープロフィルを変えて、好 中球エラスターゼ、カテプシンＧおよび／またはプロテアーゼー３を優先的に阻 害するようにすることができる。さらに、凝固もしくは線維素溶解に関与する酵 素（例えばプラスミンもしくは血漿カリクレイン）またはその補体カスケードを 特異的に阻害する変異体を構築することができる。

ＴＦＰＩのクニノッ型ドメイン１の利点は、先に述べたように、強いプラスの正 味電荷を有するアプロチニンとは逆にマイナスの正味電荷をもっていることであ る。それ故に、アプロチニンよりプラスの正味電荷が低い本発明の変異体を構築 して、多量の変異体を投与した場合に腎臓を損傷する危険を少なくすることがで きる。もう１つの利点は、このドメインがアプロチニンと異なり、ヒトタンパク 質（フラグメント）であり、そのためヒトに投与した際の望ましくない免疫反応 が著しく減少するということである。

衾班色圧報奏皿丞 ＴＦＰＩのクニソツ型ドメインの好ましい変異体の例は、ＸＩ　が５ｅｒ−Ｐｈ ｅもしくはＭｅｔ−旧ｓ　−３ｅｒ−Ｐｈｅであり；またはＸ２が＾Ｉａ。

Ａｒｇ、　Ｔｈｒ、八Ｓｐ＋　Ｐｒｏ、　Ｇｌｕ、　Ｌｙｓ＋　ＧＩｎ＋　Ｓｃ ｒ＋　ＩｌｅおよびＶａｌ　からなる群から選択されるアミノ酸残基で、特にＸ ！はＴｈｒもしくはＡｓｐであり；またはｘ３はＰｒｏ、　Ｔｈｒ、　Ｌｅｕ、 ＾ｒｇ、　ＶａｌおよびＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸残基で、特に ｘ３はＰｒｏもしくはｌｉｅであり；またはＸ４はＬｙｓ、　Ａｒｇ、νａｌ＋ 　Ｔｈｒ＋　Ｉ！ｅ＋　Ｌｅｕ＋　Ｐｈｅ、　ＧＩｙ＋Ｓｅｒ、　Ｍｅｔ、　Ｔ ｒｐ＋　Ｔｙｒ＋　Ｇ１ｎ＋＾ｓｎおよび＾ｌａからなる群から選択されるアミ ノ酸残基で、特にｘ４はＬｙｓ＋　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ＋　ｒｌｅ＋　Ｔｈｒ、　 Ｍｅｔ＋Ｇｉｎ　もしくはＡｒｇであり；またはＸＳは＾ｌａ、　Ｇｌｙ、Ｔｈ ｒ、　Ａｒｇ、　Ｐｈｅ。

ＧｌｎおよびＡｓｐからなる群から選択されるアミノ酸残基で、特にＸ５はＡｌ ａ、　Ｔｈｒ、　ＡｓｐもしくはＧｒｙであり；またはＸ＆は＾ｒｇ、　Ａｌａ 。

Ｌｙｓ、　Ｌｅｕ＋　ＧＩｙ＋旧Ｓ＋　Ｓｅｒ、＾Ｓｐ＋　ＧＩｎ＋　Ｇｌｕ、 　Ｖａｌ、　Ｔｈｒ＋　Ｔｙｒ、　Ｐｈｅ＋Ａｓｎ、　ｒｌｅおよびＭｅｔから なる群から選択されるアミノ酸残基で、特にＸ６はＡｒｇ、　Ｐｈｅ、八ｌａ＋ 　Ｉｌｅ、　ＬｅｕもしくはＴｙｒであり；またはＸ７はｌｉｅ、　Ｍｅｔ＋　 Ｇｌｎ＋　Ｇｌｕ＋　Ｔｈｒ＋　Ｌｅｕ、　ＶａｌおよびＰｈｅからなる群から ｌｉｅ　Ｔｈｒ、　Ｌｅｕ、＾ｓｎ、　ＬｙＳ＋　Ｓｅｒ＋　ＧＩｎ＋　Ｇｌｕ 、　Ａｒｇ、　ＰｒｏおよびＰｈｅからなる群から選択されるアミノ酸残基で、 特にＸｌｌはＨｅもしくはＬｙｓであり；またはＸ’ｌはＡｒｇ＋　Ｓｅｒ、　 Ａｌａ、　Ｇｌｎ、　ＬｙｓおよびＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸残 基で、特にＸ９はＡｒｇであり；またはＸ１ｌｌはＧｌｎ、　Ｐｒｏ、　Ｐｈｅ 、　Ｉｌｅ＋　Ｌｙｓ、　Ｔｒｐ＋　Ａｌａ、　Ｔｈｒ、　Ｌｅｕ、　Ｓｅｒ。

Ｔｙｒ、　Ｈｉｓ、　Ａｓｐ、　Ｍｅｔ、　ＡｒｇおよびＶａｔからなる群から 選択されるアミノ酸残基で、特にＸ１０はＶａｌ　もしくはｌｉｅであり；また はＸｌｌはＧｌｙ、　Ｍｅｔ、　ＧＩｎ＋　Ｇｌｕ、　Ｌｅｕ＋　＾ｒｇ＋　Ｌ ｙｓ＋　ＰｒｏおよびＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸残基で、特にｘ ｌは＾ｒｇもしくはＧｌｕであり；またはＸ１２はＡｌａ　もしくはｃｒｙであ り；またはＸ「ゴはＬｙｓ、　ＡｓｎおよびＡｓｐからなる群からＪ択されるア ミノ酸残基で特にＸＩはＬｙｓ　もしくはＡｓｎであり；またはχ目はＶａｌ、 　Ｔｙｒ、＾ｓｐ、　Ｇｌｕ、　Ｔｈｒ、　Ｇｌｙ。

Ｌｅｕ、　Ｓｅｒ、　ＩＩｅ＋　Ｇｌｎ、　Ｉ（ｔｓ、　Ａｓｎ＋　Ｐｒｏ＋　 Ｐｈｅ、　Ｍｅｔ、　ＡＩａ＋　Ａｒｇ＋　ＴｒｐおよびＬｙｓからなる群から 選択されるアミノ酸残基で、特にＸＩａはＬｙｓもしくはＧｌｕであり；または ＸＩＳはＬｙｓ＋　Ｍｅｔ、　ＧｌｕもしくはＬｅｕであり；またはＸ１６はｌ ｙｓ、　Ａｌａ、＾ｓｎもしくはＧｌｕであり；またはＸ１７はＡｓｐである変 異体である。好ましい態様では、ｘｌはＮｅｔ　−）１ｉｓ　−５ｅｒ−Ｐｈｅ でｘｌ７はＡｓｐであり、一方Ｘｔ　ＸＩ６は上記定義と同しである。

本発明のＴＦＰＩクニノツ型ドメインＩの変異体は好ましくはプロテアーゼ結合 領域（すなわちｘ３−ｘｌ４で表されるアミノ酸残基）中にＭｅｔ残基を含有し てはならない。上記のα１−ＰＩから類推して、これらの位置のいずれか一つに Ｍｅｔ残基があると、インヒビターが、Ｐ？ＩＮによって産生される酸素代謝物 による酸化的不活性化反応に対して感受性になり、逆にこれらの位置にＭｅｔ残 基がないと、インヒビターは、かような酸素代謝物の存在下で一層安定になる。

−ゼ結合部位に位置するアミノ酸残基の１つ又は複数（すなわちアプロチニンの １３．１５．１６．１７．１８．１９．２０．３４．３９．４０．４１および４ ６の位置に対応するＸＳ　Ｘ１４の１つ又は複数）が、生来のアプロチニンの同 じ位置に存在するアミノ酸に対して置換されている変異体である。この変異体の アミノ酸配列は下記のとおりである。

Ｍｅｔ旧ｓ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｓ ｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　ＬｙｓＡｌａ　Ａｒｇ　ｌｌｅ　Ｉｌｅ 　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ 　Ｇｉｎ　ＣｙｓＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ｃｙｓ　Ａｒｇ＾Ｉａ　！ｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　ＰｈｅＬｙｓ　Ｓｅ ｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｔｈ ｒ　Ａｒｇ＾ｓｐ　＜配列番号：２）。

他の態様では、本発明は、本発明のヒトクニッッ型インヒビタードメインの変異 体をコードするＤＮＡ構成物に関する０本発明のこのＤＮＡ構成物は、完成され た標準方法、例えばＳ、Ｌ、［ｌｅａｕｃａｇｅおよびＭ、）１．ｃａｒｕＬｈ ｅｒｓ＋↑ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ＋　２２巻、　１８５９〜１ ８６９頁、　１９８１年に記載されているホスホルアミダイト法またはｈａｔｔ ｈｅｓら、　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　３巻、８０１〜８０５頁、１９８４年 に記載されている方法によって合成して製造することができる。ホスホルアミダ イト法によれば、オリゴヌクレオチドが、例えば自動ＯＮ八へ成機で合成され、 精製され、アニールされ、連結され、次いで適切なベクター中にクローン化され る。

あるいは、ＴＦＰｒクニノツ型ドメイン■をコードするゲノムまたはｃＤＮＡ（ 例えばＴＦＰＩをコードするＤＮＡのゲノムもしくはｃＤＮＡのライブラリーを 合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングし、次いでドメインＩ をコードするＤＮＡ配列を単離することによって得られる）を用いることができ る。このＤＮＡ配列は、アミノ酸置換を行うことが望ましい部位に相当する１つ 又は複数の部位が修飾される。この修飾は例えば所望のアミノ酸配列をコードす る合成オリゴヌクレオチドを用いて部位特異的突然変異誘発を行って、公知の方 法で相同的組換えを実施する。

さらに別の態様では、本発明は本発明のＤＮＡ構成物を含有する組換え発現ベク ターに関する。この＆ＩＩ換え発現ベクターは、＆ＩＩｖＡえＤＮＮ演法便利に 行うことができるいずれのベクターでもよく、ベクターの選択は、ベクターが導 入される宿主細胞によってきまることが多い、したがってそのベクターは、自律 複製ベクターすなわち染色体外構成要素として存在するベクターであり、その複 製は染色体の複製とは無関係であり、例えばプラスミドである。あるいは、本発 明のベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノム中に組込まれ、組込 まれた染色体ともに復製される。

このベクターにおいて、本発明のＴＦＰＩクニソッ型ドメイン■変異体をコード する口Ｎ＾配列は、作用可能に適切なプ１゛１モーター配列に接続されなければ ならない。このプロモーターは、選択された宿主細胞中で転写活性を示し、かつ 宿主細胞に対して同種性もしくは異種性のタンパク質をコードする遺伝子から誘 導されるいずれのＤＮＡ配列でもよい、哺乳動物細胞中で本発明のＴＰＰｆクニ ッッ型ドメイドメインｌ変異体ドするＤＮＡの転写を指示する適切なプロモータ ーの例は、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　ら、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ ｌ　Ｂｉｏｌ、＋　１巻。

８５４〜８６４頁、　１９８１年）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）のプ ロモーター（Ｐａ　１ｍ　ｉ　Ｌｅｒら、　５ｃｔｅｎｃｅ＋　２２２巻、　８ ０９〜８１４頁、　１９８３年）、またはアデノウィルス２の主要後期プロモー ターである。酵母宿主細胞中で用いるのに適切なプロモーターとしては、酵母の 解糖系遺伝子由来のプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、＋　２５５巻。

１２０７３〜１２０８０頁、　１９８０年ｉ　ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋ ｉ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎ−＋　１巻、　４１９〜４３４頁、　１９８２年）、または７７Ｌ／　ニ ア　−ルデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら編集のＧｅｎｅｔｉ ｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　Ｃ ｈｅｓｉｃａｌｓ、米国１ニユーヨークのＰｌｅｎｕｓＰｒｅｓｓ社、　１９８ ２年中のＹｏｕｎｇらの報告）もしくはＴＰＩ　１　（米国特許第４．５９９． ３１１号）もしくはＡＤＨ２４ｃ　（Ｒｕｓｓｅｌｌら、　Ｎａｔｕｒｅ＋　３ ０４巻、６５２〜６５４頁、　１９８３年）のプロモーターがある。糸状菌の宿 主細胞中で使用するのに適切なプロモーターは、例えばＭＤｌｌ　３プロモータ ー（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、、　４巻、　２０９３〜２０ ９９頁、　１９８５年）またはｔｐｉＡブロモ−クーである。

また本発明のＴＰＰＩクニッッ型ドメイドメインｌ変異体ドするＤＮ＾配列は、 例えばヒト成長ホルモンターミネータ−（Ｐａｌｓｉｔｅｒらの前記文献）のよ うな適切なターミネータ−または（真菌宿主に用いる）ＴＰＩ　ｌ　（Ａｌｂｅ ｒおよびＫａｗａｓａｋｉの前記文献）またはＡＤＨ３（Ｍｃｋｎｉｇｈｔらの 前記文献）のプロモーターに作用可能に接続される０本発明のベクターはさらに 、ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ４０もしくはアデノウィルス５のＥＩｂ ｆ＋Ｉ域由来）、転写エンハンサ−配列（例えばＳＶ４０のエンハンサ−）およ び翻訳エンハンサ−配列（例えばアデノウィルスＶＡ　ＲＮ＾をコードする配列 ）のような要素を含有することができる。

本発明の組換え発現ベクターはさらに、注目の宿主細胞中でベクターを複製可能 にするＤＮＡ配列を含有することができる。かような配列の例は、（宿主細胞が 哺乳類の細胞の場合）ＳＶ４０の複製開始点であるか、または（宿主細胞が酵母 細胞の場合）酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰＩ−３と複製開始点である。

また本発明のベクターは選択マーカー例えばその産物が宿主細胞の欠陥を相補す る遺伝子を含有することができ、このような遺伝子としては、例えばジヒドロ葉 酸レダクターゼ（ＤＦＩＦＲ）をコードする遺伝子、または医薬の例えばネオマ イシン、ハイグロマイシンもしくはメトトレキセートに対する耐性を与える遺伝 子、またはシゾサツカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃ ｅｓ−胛ｂｅ　）ＴＰＩ遺伝子（Ｐ、Ｒ，Ｒｕ５ｓｅｌ＋　Ｇｅｎｅ＋４０＠、 　１２５〜１３０頁、　１９８５年に記載されている）がある。

本発明のＴＦＰＩクニノッ型ドメイドメインＸ変異体ドするＤＮＡ配列、プロモ ーターおよびクーミネーターをそれぞれ連結し次に、その配列を、復製するのに 必要な情報を有する適切なベクターに挿入するのに用いる方法は当該技術分野の 当業者にとって公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら＋　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ＋　米国、 ニューヨーク州、コールドスプリングハーバ−１１９８９年参照）。

本発明の発現ベクターを導入する宿主細胞は本発明のＴＦｒ’ｌクニッツ型ドメ イン■変異体を産生できるいずれの細胞でもよく、哺乳類、酵母もしくは真菌の 細胞のような真核細胞が好ましい。

本発明によって宿主細胞として使用される酵母生物は、培養中に、本発明のＴＦ ＰＩクニンツ型ドメイン１変異体を大量に産生ずるいずれの酵母生物でもよい。

適切な酵母生物の例は、酵母の種であるサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃ ｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　、サツカロミセス・クルイベリ 　（Ｓａｃｃｈａｒｏｓ　ｃｅｓ　社吐■社）　、シゾサツカロミセス・ホ７へ （ＳｃがＪ郊ｌ占静旦見匹邦−摂遍ｂｅ　）またはサツカロミセス・ウバルム（ Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｕｖａｒ叩）の菌株である。酵母細胞の形質転換 は例えば原形質体を形成し次いでそれ自体公知の方式で形質転換を行うことがで きる。

適切な哺乳類細胞系の例はＣ０３（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５０）、ＢＨＫ　（＾ ＴＣＣＣＲＬ１６３２、　ＡＴＣＣＣＣＬ　１０）またはＣＩＯ（ＡＴＣＣＣＣ Ｌ　６１）の細胞系である。哺乳類の細胞をトランスフェクトし、細胞に導入さ れたＤＮＡ配列を発現する方法は、例えばにａｕｆｓ＋ａｎおよび５ｈａｒｐ、 　Ｊ、Ｍｏ１．８ｉｏ１．１５９巻。

６０１〜６２１頁、　１９８２年；　５ｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、　Ｊ、 Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、ＧｅｎｅＬ、。

１巻、　３２７〜３４１　頁、１９８２年ＨＬｏｙｔｅｒら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ Ｌ］、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、υＳＡ。

７９巻、　４２２〜４２６頁、　１９８２年ｊ　Ｍｉｇｌｅｒら、　Ｃｅ１ｌ、 　１４巻、７２５頁。

１９７８年ｉ　ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、　ＳｏｍａＬｉｃ　Ｃｅ １ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　７巻。

６０３頁、　１９８１年；　Ｇｒａｈａ＋＊およびＶａｎｄｅｒ　Ｅｂ＋νｉｒ ｏｌｏｇｙ＋　５２巻、４５６頁、　１９７３年；ならびにＮｅｕ＋ｗａｎｎ　 ら、　ＥＭＢＯＪ、、　１巻、　８４１〜８４５頁。

１９８２年に記載されている。

あるいは、真菌の細胞を本発明の宿主細胞として使用することができる。適切な 真菌の細胞の例は糸状菌である例えばアスペルギルス１Ｋ（７）Ｉ　（ハＬゴ旦 旦Ｓ　ｓｐｐ、）もしくはノイロスポラ属の種（狂肛毀り胆ｓｐｐ、）、特にア スペルギルス・オリゼ（ハＬ」旦旦り肛■凹）またはアスペルギルス・ニガー（ ｄ　ｎｉ■Ｌ）の菌株の細胞である。タンパク質を発現するのにアスペルギルス 属の種を使用することは例えばヨーロッパ特許第２３８０２３号に記載されてい る。

本発明はさらに、本発明のＴＦＰＩクニッッ型ドメイン■の変異体を製造する方 法であって、該変異体の発現を促進する条件下で上記細胞を培養し、得られた該 変異体を培養物から回収することからなる方法に関する。

前記細胞を培養するのに用いる培地は、宿主細胞の選択によって、哺乳類の細胞 または真菌（酵母を含む）の細胞を増殖させるのに適した通常のいずれの培地で もよい０本発明の変異体は、宿主細胞によって増殖培地に分泌され、次いで宿主 細胞を遠心分離または濾過によって培地から分離し、上澄み液または濾液のタン パク質成分を、塩例えば硫酸アンモニウムによって沈澱させ、各種のクロマトグ ラフィーの方法例えばイオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロ マトグラフィーなどによって精製することを含んでなる通常の方法によって培地 から回収される。

また本発明は、本発明のＴＦＰＩクニソツ型ドメイン！変異体および医薬として 容認可能な担体または賦形剤とを含んでなる医薬組成物に関する０本発明の組成 物中に、本発明の変異体は、例えばＲｅｓｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｖａｃｅ ｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　１９８５年に記載されているような、医薬組 成物の確立された調合法のいずれかによって調合される０本発明の組成物は一般 に、全身注射または全身注入に適した形態であり、そのま−滅菌水または等偏食 塩液またはグルコース溶液によって調合される。

予想外のことであるが、ＴＦＰＩクニッッ型ドメインＩがそれ自体カテプシンＧ を阻害できることが見出されたのである。それ故に本発明は、ＴＦＰＩのヒトク ニンツ型プロテアーゼインヒビタードメインＩまたは上記のその変異体および医 薬として許容可能な担体または賦形剤を含んでなる、カテプシンＧを阻害する医 薬組成物に関する。

それ故に、本発明のＴＰＰＴクニッッ型ドメイドメインｌ変異体来のアプロチニ ンまたは他のインヒビタープロフィルを有するアプロチニンＩＩ（１４体につい て示唆される治療用途、特に大投与量のアプロチニンを使用する必要がある用途 に用いるのに有利であると考えられる０本発明の上記変異体がヒトセリンプロテ アーゼ類、例えばトリプシン、プラスミン、カリクレイン、エラスターゼ、カテ プシンＧおよびブロティナーゼー３を阻害する性能をもっていることから、本発 明の該変異体を使用することが必要である治療用途としては、（限定されないが ）栄、性膵臓炎、炎症、血小板減少症、血小板機能の保存、臓器保存、創傷治癒 、ショック（ションク肺を含む）および高線維素溶解性出血を伴う症状、気腫、 リューマチ様関節炎、成人型呼吸窮迫症候群、慢性炎症腸疾患ならびに乾廚があ り、換言すれば、トリガーされたＰＭＮから放出されるエラスターゼ、カテプシ ンＧおよびプロテアーゼー３による病的なタンパク質分解によって起こると推定 される疾患である。

さらに本発明は、過刺激されたＰＭＮから放出されるプロテアーゼによる病的な タンパク質分解には付随する疾患または症状の予防用もしくは治療用医薬の製造 に用いる、上記のＴＦＰＩクニッッ型インヒビタードメイン■もしくはその変異 体の用途に関する。上記のように、ＴＦＰＩクニッッ型インヒビタードメイン！ または変異体と同時にヘパリンを投与することが有利である。

上記の医薬用途とは別に、前記のＴＦＰＩクニッツ型ドメインＩＩもしくはその 変異体は、有用な天然物質、例えばＴＦＰＩクニッッ型ドメインＩＩに直接もし くは間接的に結合する、ヒト物質由来のプロテアーゼ類もしくは受容体類を、例 えばスクリーニング検定法またはアフィニティークロマトグラフィーによって単 離するのに用いることができる。

本発明は下記の実施例によってさらに詳しく説明するが、これら実施例は本発明 の適用範囲を限定するものではない。

実施例 二般釣方広 報告されている標準のＤＮＡ法を実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、　Ｆｒ １ｔｃｈ。

Ｅ、Ｆ、およびＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｔ ｎｇ　：＾ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　１９８９年、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ社、米国、ニュ ーヨーク化、コールドスプリングハーバ−）０合成オリゴヌクレオチドを、制御 された多孔質ガラスの支持体上でホスホルアミダイト化学反応を利用し自動ＤＮ Ａ合成ｔ］１（３８０Ｂ＋　Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓＬｅｍｓ）で製造し た（Ｂｅａｕｃａｇｅ、　Ｓ、Ｌ、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ＋　Ｍ、Ｈ，＋　 ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ＋　２２巻、１８５９〜１８６９頁、１ ９８１年）　、　ＤＮＡ配列の決定は、ジデオキシ　チェインターミネーション 法で行った（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｐ、＋Ｍｉｃｋｌｅｎ、　Ｓ、およびＣｏｕｌｓ ｏｎ＋　Ａ、　Ｒ，、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７４巻、５４６３〜５４６７頁、１９７７年）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）をＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅ ｔｕｓ）で実施した。

アミノ酸分析を、減圧密封管中１１０°Ｃにて２４時間６Ｍ　ＩＣ＋で加水分解 を行ってから実施した。分析は、ミクロボアーオペレージぢン（−ｉｃｒｏｂｏ ｒｅ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）について改変したＢｅｃｌｖａｎ　１２１ＭＢ自動 アミノ酸分析器で実施した。

Ｎ末端のアミノ酸配列の分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋＊ｓ　４ ７０１１気相配列分析器を用いて自動エドマン分解法で行った。オンライン逆相 ＨＰＬＣによる分析は、各配列分析器のサイクルから放出されたρＴ１１アミノ 酸の検出と定量を行うために実施した。

分子量の測定は、約１５ｃｍのフライト管（Ｎｉｇｈｔ　ｔｕｂｅ）を備え、ポ ジティブモード（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　＋ｍｏｄｅ）で作動するＢＩＯ−ＴＯＮ　 ２０プラズマデソーブシヨン（ＰＩａｓ＋ｅａ　ｄｅｓｏｒｐＬｉｏｎ）質量分 析計（ＰＤＭＳ）で行った。

５μＩづつを１５ＫＶに設定した加速電圧で分析し、イオンは５００万の核分裂 イベントについて集めた。帰属された分子イオンの正確さは、明確なピークにつ いては約Ｏ９１％であり、さもなければ正確さはいくぶん小さい。

実施例１ 組　経路インヒビターのＴＦＰＩ−１の第一クニッツドメインの、ＫＦＮ　−１ ６５１カ”　（Ｄ’に４４ＴＰＰＴの全長をコードするｃＤＮＡを、ヒト腎臓由 来の細胞系ＨｅｐＧ　２（ＡＴＣＣＩｔ８８０６５）から単離し、下記の文献に 記載されているようにして、哺乳類の発現ヘクターｐＫＦＮ−１１６８に０．９ 　ｋｂ　Ｂａ５ａｌ−Ｘｂａｌフラグメントとして挿入した（その文献は、Ｐｅ ｄｅｒｓｅｎ、八、Ｈ，Ｎｏｒｄｆａｎｇ。

ｏ、ｌ　Ｎｏｒｒｉｓ、　ｐ、＋　Ｗｉｂｅｒｇ、　Ｆ、Ｃ，、Ｃｈｒｉｓｔｅ ｎｓｅｎ、　Ｐ、Ｍ、Ｍｏｅｌｌｅｒ、に、Ｂ、。

Ｍｅｉｄａｈｌ　−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ＋　Ｊ、＋　Ｂｅｃｋ＋　Ｔ、　Ｃ，、Ｎ ｏｒｒｉｓ＋　Ｋ、＋）Ｉｅｄｎｅｒ、　１１．およびＫ１５ｉｅｌ、　Ｗ、＋ 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｃｖ、　２６５巻、１６７８６−１６７９３頁、１９ ９０年である）。挿入断片のＤＮＡ配列を配列番号＝３に示す。ＴＦＰＩ−１は 提示されたヌクレオチド１５２−３２５でコードされている。

ＴＰＰＴ−１：　ブラ　イ　マーＮＯＲ−２５２４（ＧＣＴＧＡＧＡＧＡＴＴＧ ［；ＡＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＣＡＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴＧＣ）　とＮ０ＩＩ　− ２５２５（Ｔ＾＾ＴＣＣＴＴＣＴＡＧＡＴＴ八＾ＴＣＴＣＴＴＧＴＡＣＡＣへＴ ）を各々１００ｐ１００ｐづつ含有するＰＣ１１反応で、ｐＫＦＮ−１１６８由 来の０．９ｋｂＢａ−旧〜Ｘｂａ　Ｉフラグメント０．ｌ　ｕｇを鋳型として使 用した。　ＮＯＲ−２５２４の１７個の３′末端の塩基は、配列番号＝３のＴＦ ＰＩ−１遺伝子の塩基１５２−１６８と同一であり、そして２１個の５′未満の 塩基は、上記ｐＫＦＮ　−１０００由来の合成リーダー遺伝子（配列番号：５参 照）の塩基２１５−２３５に同一である。プライマーＮＯＲ−２５２５は配列番 号：３の塩基３１１−３２５に相補的であり、翻訳終止コドンとこれに続くＸｂ ａ１部位を含有する５′延長部（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）をもっている。

ＰＣＲ反応は市販のキット（ＧｅｎｅＡｍｐ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃ ｅｔｕｓ）を用いて１００　Ｉｔ　Ｉの容積で実施した。そのサイクルは９４° Ｃで２０秒、５０°Ｃで２０秒および７２°Ｃで３０秒であった。１９サイクル を終ってから、最終サイクルを上記サイクルの７２°Ｃのステップを１０分間維 持して行った。

ＰＣＲ法による生成物は２１１ｂｐのフラグメントであり、これを２％アガロー スゲル上の電気泳動法で単離した。

シグナル−リーダー：プライマーＮ０Ｒ−１４７８（ＧＴＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣ ＣＡＧＴ）およびＮＯＲ−２５２３（ＴＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＡ ＧＣ）を各々１００ｐｓｏｌｅづつ含有するＰＣＲ反応の鋳型として、下記ｐＫ ＦＮ−１０００由来の０．７ｋｂ　Ｐｖｕｌｌフラグメント０．１　μｇを使用 した。Ｎ０Ｒ−１４７８は、配列番号：５のＥｃｏＲ１部位のすぐ上流の配列に マノヂしている。プライマーＮＯＲ−２５２３はｐＫＦＮ−１０００の合成リー ダー遺伝子の１７個の３′未満塩基に対して相補的である（配列番号：５参照） 　、　ＰＣＲ反応を上記のようにして実施し２５７ｂｐのフラグメントを得た。

プラスミドｐＫＦＮ−１０００は、合成酵母シグナルリーダーペプチドをコード するＤＮＡを含有するプラスミドｐＴＺ１９Ｒ（Ｍｅａｄ、　ｏＪ、ｌ　５ｚｃ ｚｅ−ｓｎａ　５ｋｏｒｕｐａ、　Ｅ、およびにｅｌｌｌｐｅｒｌ　８．＋　ｒ ’ｒｏｔ、　Ｅｎｇｉｎ、、１巻、６７−７４頁、１９８６年）の誘導体である 。

プラスミドｐＫＰＮ−１０００は国際特許出願第５ｙｏ９０／１００７５号に記 載されている。　ｐＫＦＮ−１０００のＥｃｏＲ１部位から下流の２３５ｂｐの ＤＮ＾配列と、合成酵母シグナル−リーダーでコードされるアミノ酸配列を配列 番号＝５に示す。

シグナル−リーダー−ＴＦＰＩ−１：上記の二つのＰＣＲフラグメント各０．１ 　μｇづつを混合した。　ＰＣＲ反応を、プライマーＮＯＲ−１４７８とＮ０Ｒ −２５２５を各々１００ｐｓ＋ｏｌｅづつ用い、次のサイクル＝９４°Ｃで１分 間、５０°Ｃで２分間および７２°Ｃで３分間で実施した。１６サイクルを終っ て最後のサイクルはそのサイクルの７２℃のステップを１ｏ分間保持して行った 。

得られた４４３ｂｐのフラグメントを１％アガロースゲル上の電気泳動法によっ て精製し、次いでＥｃｏＲＩ　とＸｂａ　Ｉで消化した。得られた４１２ｂｐの フラグメントを、ｐＭ７６３６由来の９．５Ｋｂ　Ｎｃｏｒ−Ｘｂａ＋フラグメ ントおよびＰＭＴ６３６由来の１．４ｋｂ　Ｎｃｏｌ−ＥｃｏＲＩ　フラグメン トに連結した。プラスミドｐＭ７６３６は国際特許出願第ｗｏ８９１０１９６８ 号に記載されている。

ｐＭＴ６３６は、大腸Ｗ（Ｅ、Ｃｏ１１）　−５・セレビシェ　シェトルベクタ ーであり、シゾサツカロミセス・ポンベのＴＰＩ遺伝子（ＰＯＴ）　（Ｒｕｓｓ ｅｌｌ。

Ｐ、Ｒ，、Ｇｅｎｅ、　４０Ｓ、１２５〜１３０頁、１９８５年）ならびにＳ、 セレビシェのトリオースリン酸イソメラーゼのプロモーターとターミネータ−で あるＴＰＩｐとＴＰＴＴ　（Ａｌｂｅｒ、　Ｔ、およびＫａｗａｓａｋｉ、　Ｇ 、＋　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、、１巻、４１９〜４３４頁、１９８２年）を含有している 。

上記連結混合物を用いて、コンピテント大腸菌株Ｃｒ−、ｍ’　）を形質転換し てアンピシリン耐性を選択した。　ＤＮＡの配列決定を行った結果、得られたコ ロニー由来のプラスミドは、合成酵母シグナル−リーダー遺伝子に正しく融合さ れた、ＴＦＰＩ−１の正しいＤＮ＾配列を含有していることが分かった。

その後使用するのに１つのプラスミドｐＫＦＮ−１６０３を選択した。プラスミ ドｐＫＦＮ−１６０３の構築を図１に示す。

プラスミドｐＫＦＮ−１６０３の発現カセットは下記の配列をもっている。

ＴＰＩｐ−ＫＦＮｌｏｏＯシグナル−リーダー　ＴＦＰＩ　Ｉ　ＴＰＩｖ　ｐＫ ＦＮ　１６０３由来の４１２ｂｐのＥｃｏＲＩ　Ｘｂａｌフラグメントの［ｌＮ Ａ配列は配列番号＝７に示す。

酵母の形質転換：Ｓ・セレビシェの菌株？ＩＴ６６３　（Ｅ　２−７８ＸＥＩＩ −３６ａ　／　ａ　、Δｊｐ＋／Δ’１ｌｌｉ＋　ｐｅｐ　４−３／ｐｅｐ　４ 　３）をＹＰＧａＬ　（１％Ｂａｃｔｏ酵母エキス、２％Ｂａｃｔｏペプトン、 ２％ガラクトース、１％ラクトース）上で、６００ｎａ＋にて０．６のり、Ｄ、 になるまで増殖させた。

培養物１００ｍ１を遠心分離によって収穫し、水１００１で洗浄し、再度遠心分 離し次いで、１．２　Ｍソルビトール、２５ｗＭ　ＮａＪＤＴＡ　ｐＨ＝８．０ および６．７ｓｇ　／ｍｌのジチオトレイトールを含有する溶液１（１ｗｌ中に 再懸濁させた。その懸濁液を３０℃で１５分間インキュベートし、遠心分離し、 得られた細胞を、１．２Ｍソルビトール、１０＋ｗＭ　ＮａＪＤＴＡ　。

０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ５，８およびＮｏｖｏｚｙｍ　（登録商４１） ２３４２１１ｇを含有する溶液１０１中に再懸濁させた。その懸濁液を３０″Ｃ で３０分間インキュベートし、細胞を遠心分離で集め、１．２Ｍソルビトール１ ０ｍ１およびＣＡＳ　（１，２Ｍソルビトール、１０＋＊Ｍ　ＣａＣＩｔ、１０ ＩＩＭトリスＨＣＩ　（トリス−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）　 ｐＨ＝７．５　）１０ｍｌで洗浄し、次いでＣＡ３２ｍｌ中に再懸濁させた。形 質転換を行うため０．１　μｇのプラスミドｐＫＦＮ−１６０３を添加し次いで 混合物を室温で１５分間放置した。（２０％ポリエチレングリコール４０００． ２０ｍＭＣａＣ１ｚ　、１０＊Ｍ　ＣａＣＩｚ　、１０＋ｎＭ　トリスｔｌｃＩ 　ｐＨ＝７．５　）　１ｌＩｌを添加し、生成した混合物をさらに３０分間室温 で放置した。その混合物を遠心分離し、得られたペレットをＳＯ３（１，２Ｍソ ルビトール、３３％Ｖ／Ｖ　ＹＰＤ　、６．７　＊Ｍ　ＣａＣＩｚ　、１４μｇ ／ｍ１ｔｌイシ７）　０．１　ｍｌ中に再懸濁させて３０°Ｃで２時間インキュ ベートした。次にその懸濁液を遠心分離し生成したペレットを１．２Ｍソルビト ール０．５　ｍｌ中に再懸濁した０次に、５２°Ｃのトンブ寒天６ｍｌ　（１， ２Ｍソルビトール＋２．５％寒天を含有する（Ｓｈｅｒｍａｎ　ら、Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　ＧｅｎｅＬｔｃｓ　、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９Ｂ２年）のｓｃ培地）を添加し、その懸 濁液を、同じ寒天で固化したソルビトール含有培地が入っているプレートの上面 に注入した。

形質転換体のコロニーを３０°Ｃで３日間経過後に採取し、再度単離し単離物を 用いて液体培養を開始した。このような形質転換体の一つであるＫＦＮ　−１６ ５１を選択してさらに特性決定を行った。

発酵：酵母菌株ＫＦＮ−１６５１をＹＰＤ培地〔１％酵母エキス、２％ペプトン （Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より入手）および３％グルコース〕 上で増殖させた。該菌株の培養物ＩＬを、６５０　ｒ＋ｎでの光学濃度が２４に なるまで３０°Ｃで振盪した。遠心分離に付した後上澄液を単離した。

上記酵母上澄液を５％の酢酸とリン酸でｐＨ３，０に調節し、Ｓ−５ｅｐｈａｒ ｏｓｅ　Ｐａ５Ｌ　Ｆｌｏｗ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のカラムに加え、次い で５゜−ｉギ酸ｐＨ３，７で平衡化した。平衡化緩衝液で洗浄した後、ＩＩＫ＋ 　ドメインを１Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。平衡化したセファデックスＧ−２ ５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用い、０．１％炭酸水素アンモニウムｐＨ ７，９で溶離して脱塩を行った。減圧遠心分離で濃縮しｐＨを３．０に調節した 後、５０ｍＭギ酸ｐＨ３，７で平衡化したＭｏｎｏ　Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃ ｔａ社）でさらに精製を行った。平衡化緩衝液で洗浄した後、０〜ＩＭ塩化ナト リウム含有平衡化緩衝液を用いて勾配溶出を実施した。最終の精製は、Ｖｙｄａ ｃＣ４カラム（米国、カリフォルニア州、Ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｇｒ ｏｕｐ）を用いて５〜５５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡで勾配溶出する逆 相ＨＰＬＣで実施した。精製された生成物を減圧遠心分離によって凍結乾燥し次 いで水に再溶解した。

一部分を質量ＰＤ−質量分析法で分析しく１実測値：　６８５３．５　、　Ｍ− 計算値：　６８５３．８）　そしてエドマン分解法を４５サイクル行ってＮ末端 アミノ酸の配列を決定して、ＴＦＰＩ−１ドメインの一次構造を確認した（表１ ）。

表１ ＴＦＰＩ−１のＮ末端配列の分析結果 的３５０ｐｍｏｌのＫＦＮ１６５１　（ＨＰＬＣ画分１８＃９２０３２７）を分 析した。平均反応収率はＸＸ、Ｘ％であった。配列決定装置の作動＃１５７５゜ ＣｙｓのＰＴ）Ｉ誘導体は例えばサイクル５．１４．３０および３８では同定さ れていない。

配列決定装置は６０サイクルを終って停止させたが、その配列はその最初の４５ 個のアミノ酸について推定することができた。

実施例２ ］メイン■ＫＦＮ１６５１によるセ１ンプローイー−ゼ　の　ＩＫＦＮ１６５１ を酵母培養培地から精製した。　ＫＦＮ１６５１の濃度を、基準としてＢＰＴＩ を用い２１４ｎ鴎の吸光度から測定した。ブタのトリプシンとヒトの組換え因子 Ｖ１１．はＮｏｖａ　Ｎｏｒｄｉｓｋ＾／Ｓ社（デンマーク、Ｂａｇｓｖａｅｒ ｄ）から入手し、うシのキモトリプシン（ＴＬＣに処理済）はＳｉｇｍａ　Ｃｈ ｅ＋＊１ｃａｌ　Ｃｏ、社（ＵＳ＾、ミズーリ州、セントルイス）から人手した 。端を切取ったヒトの組換え組織因子はＣｏｒｖａｓ社（米国、カリフォルニア 州、サンディエゴ）から入手した。

ヒト好中球カテプシンＧは、ＢａｕｇｈおよびＴｒａｖｉｓが報告した方法（Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１５　：０１８３６〜８４３頁、１９７６年）にし たがって、ＰＭＮの抽出物から精製した。ペプチジルニトロアニリドの基ｉ＊、 ５２２５１　、５２５８６．５２２８ＢはＫａｂｉ社（スエーデン、ストックホ ルム）から入手した。　５７３８８はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、社 （米国、ミズーリ州、セントルイス）から入手し、ＦＸａ−１はＮｙｃｏＭｅｄ 社（ノルニー、オスロー）から入手した。

セリンプロテイナーゼ類は、各種の濃度のにＦＮ１６５１　とともに３０分間イ ンキュベートした６次に基質を添加し、次いで残留プロテイナーゼの活性を４０ ５ｎｓで測定した。結果を表２に示す。

未修飾のＴＦＰＩクニッツドメインＩ　（ＫＦＮ１６５１）は、トリプシン、キ モトリプシン、好中球カテプシンＧおよび因子ｖｕａ／＆ｌｌ織因子のインヒビ ターであることが見出された。

表２ 配列一覧表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：　Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ　／　５（Ｂ）ストリー）　：　 Ｎｏｖｏ　Ａ１１ｅ（Ｃ）市：　Ｂａｇｓｖａｅｒｄ （Ｄ）国：デンマーク （Ｅ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　Ｄｌ！−２８８０（Ｆ）電話：　４−４５　４ ４４４８８８８（Ｇ）テレファックス：　＋４５　４４４９　３２５６（Ｈ）テ レックス：　３７３０４ （ｉｉ）発明の名称：ヒトクニツツ型プロテアーゼインヒビターの変異体 （ｉｉｉ）配列の数二８ （ｉν）コンピュータが読取り可能な形態：（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーデ ィスク（Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティン グシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−００５（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎ ｔ　Ｉｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．Ｏ、Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５　（ＥＰＯ） （２）配列番号：ｌに関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：５５個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：合成 （ｘｉ）配列の表示：配列番号：ｌ： Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｆｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　 Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａｌ　５　１０　１５ Ｘａａ　Ｉ’ｈｅ　Ｉ’ｈａ　Ｉ’ｈｅ　Ａｓｎ工ｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｒ ｇ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｘａａ　Ｔ凾■ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　 Ｉ’ｈｅ　Ｘａａ　Ｓａｒ　’Ｌａ５ｘ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　bｙｓ （２）配列番号：２に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ２５８個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 （ｉｆ）分子の型：タンパク質 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物二合成 （ｘｉ）配列の表示：配列番号：２： Ｍａｔ　Ｈｉｓ　Ｓａｒ　Ｆｈａ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｆｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　 Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　聯ＡｌａＰｈｅ　Ｖａｌ　’］π（ ｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　’Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｒｑ　 Ｆｈｅ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｉｔｍ（２）配列番号；３に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：９４５個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ＩＮの数ニー末鎖 ＣＤ）トポロジー二直鎖状 （ｊｉ）分子の型：　ｃＤＮ八 （ｖｉ）起ｒＡ＝ （Ａ）生物；ホモ・サピエンス （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：１５２・・３２５ （ｘｉ）配列の表示：配列番号：３　：届口騨児πｎ）詰０ロルに品Ｌπに品Ｘ 冗■バズＩこ田Ｗ工　５４５σロハエλズ；Ｔ　ｍＧＣＡＡＣＣＣＡＧＣＴＯに ｔＧｃ％Ｔ　ｆｆｌ　ロηＮ：０ズに６０５（２）配列番号：４に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ２５８個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 Ｎｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の表示：配列番号：４： （２）配列番号：５に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２３５個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮ八 （ｖｉ）起ｔＡ： （Ａ）生物：合成 （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ｃＤｓ （Ｂ）位置＝７７、・２３５ （ｘｉ）配列の表示：配列番号＝５： ＧＭｄＴＯコｄＴａＧＧ鳩工￥πｉコいＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＣＭＡ　Ｃひ ごフ入ロズａ■スＣへＣＡＡＴ　６０Ａ１１７１ＭＣｒＪＡＣＣＭＡＡＧＡ　Ａ ＴＧ　ＡＡＧ　ＧＣｒ　Ｇｒｒ　ｆｆ　ＴＴＧ　Ｇｎ”　ＴＴＧＴＣＣ’ＩＴＧ 　ＡＴＣ１０９ＧＧＡ　ＴＴＩＩ：’　ＴＧＣＴＧＧ　ＧＣＣＣＡＡ　（ＩＡ　 ＧｒＣＡＣｒ　ＧＧＣＧＡＴ　ＧＡＡ　ｆｉ　’ｒ　Ｇｒｒ　ＧＡＧ　１５V （２）配列番号；６に関する情報： （ｉ）配列の特性； （Ａ）長さ２５３個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：直鎮状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の表示：配列番号＝６　：−エｌａ　ｎａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓ ｎ　’Ｉｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ａｌａ　ＡＳｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｍｅｔ：　 Ａｌａ　Ｇｌｕ（２）配列番号ニアに関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝４１８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｕｉの数；−・末鎖 （Ｄ）トポロジー二面鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮ＾ （ｖｉ）起源：　。

（Ａ）生物：合成／ヒト （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　Ｃ０５ （Ｂ）位置ニア７・・４０９ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー＋ｓｉｇ−ペプチド （Ｂ）位置＝７７・・２３５ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ｍａｔ−ペプチド （Ｂ）位置：２３６・・４０９ （Ｘｌ）配列の表示：配列番号：７： （２）配列番号二８に関する情報： （ｉ）配列の特性； （Ａ）長さ：　１１１個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （にｉ）配列の表示：配列番号：８： Ｍｅｔ　−Ａｌａ　Ｖａｌ　！’ｈｅ　Ｉａｕ　Ｖａｌ　Ｌｅａｓ　Ｓｅｒ　Ｌ ｅｕ　Ｉユａ　Ｇｕｙ　Ｔｈｅ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　ＡｌａＡｒｇ　ＬＭｕＧｌｕ 　Ｌｙｓ　Ａｒｑ　Ｍｅｔ　Ｈ４ｓ　Ｓｅｒ　’Ｅｍ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｆｈｅ 　烏石ＡＬａ　Ａｓｐ　ＡｓｐＧｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｄｐ　Ａｌａ　ｎｅ　 Ｍａｔ　Ｄｐ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｐｈａ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ工ｌａ　Ｐｎａ　Ｔｈ ｒＬｌ　２０　２５ Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ｉ’ｈｅ工１ｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ｋｍＧｉｎ　Ａｓｎ３０　コ５　４０ Ｆｉｇ、　１ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年７月７日

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）のヒトクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型 プロテアーゼインヒビタードメインＩの変異体であって；下記アミノ酸配列： 【配列があります】 （配列番号： １） （上記配列中、Ｘ１はＨ、またはＣｙｓを除く１〜７個の天然アミノ酸残基を表 し、Ｘ２−Ｘ１６は各々独立して１個の天然アミノ酸残基を表し、そしてＸ１７ はＯＨ、またはＣｙｓを除く１〜５個の天然アミノ酸残基を表す。但しアミノ酸 残基Ｘ１−Ｘ１７の少なくとも１つは生来の配列の対応するアミノ酸残基とは異 なる）を有する変異体。
2. ２．Ｘ１がＳｅｒ−Ｐｈｅまたは【配列があります】である請求項１に記載の変 異体。
3. ３．Ｘ２がＡｌａ，Ａｒｇ，Ｔｈｒ，Ａｓｐ，Ｐｒｏ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ ，Ｓｅｒ，ＩｌｅおよびＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸残基である請 求項１に記載の変異体。
4. ４．Ｘ２がＴｈｒまたはＡｓｐである請求項３に記載の変異体。
5. ５．Ｘ３がＰｒｏ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，ＶａｌおよびＩｌｅからなる群か ら選択されるアミノ酸残基である請求項１に記載の変異体。
6. ６．Ｘ３がＰｒｏまたはＩｌｅである請求項５に記載の変異体。
7. ７．Ｘ４がＬｙｓ，Ａｒｇ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ ，Ｓｅｒ，Ｍｅｔ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｇｌｎ，ＡｓｎおよびＡｌａからなる群か ら選択されるアミノ酸残基である請求項１に記載の変異体。
8. ８．Ｘ４がＬｙｓ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｔｈｒ，Ｍｅｔ，ＧｌｎまたはＡ ｒｇである請求項７に記載の変異体。
9. ９．Ｘ５がＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ａｒｇ，Ｐｈｅ，ＧｌｎおよびＡｓｐから なる群から選択されるアミノ酸残基である請求項１に記載の変異体。
10. １０．Ｘ５がＡｌａ，Ｔｈｒ，ＡｓｐまたはＧｌｙである請求項９に記載の変異 体。
11. １１．Ｘ６がＡｒｇ，Ａｌａ，Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｓｅｒ，Ａｓ ｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ａｓｎ，Ｉｌｅおよび Ｍｅｔからなる群から選択されるアミノ酸残基である請求項１に記載の変異体。
12. １２．Ｘ６がＡｒｇ，Ｐｈｅ，Ａｌａ，Ｉｌｅ，ＬｅｕまたはＴｙｒである請求 項１１に記載の変異体。
13. １３．Ｘ７がＩｌｅ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，ＶａｌおよびＰｈｅか らなる群から選択されるアミノ酸残基である請求項１に記載の変異体。
14. １４．Ｘ７がＩｌｅである請求項１３に記載の変異体。
15. １５．Ｘ８がＩｌｅ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ａｓｎ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｎ，Ｇｌ ｕ，Ａｒｇ，ＰｒｏおよびＰｈｅからなる群から選択されるアミノ酸残基である 請求項１に記載の変異体。
16. １６．Ｘ８がＩｌｅまたはＬｙｓである請求項１５に記載の変異体。
17. １７．Ｘ９がＡｒｇ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｂ，ＬｙｓおよびＬｅｕからなる群 から選択されるアミノ酸残基である請求項１に記載の変異体。
18. １８．Ｘ９がＡｒｇである請求項１７に記載の変異体。
19. １９．Ｘ１０がＧｌｎ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｔｒｐ，Ａｌａ，Ｔ ｈｒ，Ｌｅｕ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｍｅｔ，ＡｒｇおよびＶａｌ からなる群から選択されるアミノ酸残基である請求項１に記載の変異体。
20. ２０．Ｘ１０がＶａｌまたはＩｌｅである請求項１９に記載の変異体。
21. ２１．Ｘ１１がＧｌｙ，Ｍｅｔ，Ｇｌｎ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏおよ びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸残基である請求項１に記載の変異体 。
22. ２２．Ｘ１１がＡｒｇまたはＧｌｕである請求項２１に記載の変異体。
23. ２３．Ｘ１２がＡｌａまたはＧｌｙである請求項１に記載の変異体。
24. ２４．Ｘ１３がＬｙｓ，ＡｓｎおよびＡｓｐからなる群から選択されるアミノ酸 残基である請求項１に記載の変異体。
25. ２５．Ｘ１１がＬｙｓまたはＡｓｎである請求項２４に記載の変異体。
26. ２６．Ｘ１４がＶａｌ，Ｔｙｒ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｔｈｒ，Ｇｌｙ，Ｌｅｕ，Ｓ ｅｒ，Ｉｌｅ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ａｓｎ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ａ ｒｇ，ＴｒｐおよびＬｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残基である請求項 １に記載の変異体。
27. ２７．Ｘ１４がＬｙｓまたはＧｌｕである請求項２６に記載の変異体。
28. ２８．Ｘ１５がＬｙｓ，Ｍｅｔ，ＧｌｕまたはＬｅｕである請求項１に記載の変 異体。
29. ２９．Ｘ１６がＬｙｓ，Ａｌａ，ＡｓｎまたはＧｌｕである請求項１に記載の変 異体。
30. ３０．Ｘ１７がＡｓｐである請求項１に記載の変異体。
31. ３１．Ｘ１がＭｅｔ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅであり、Ｘ１７がＡｓｐである請 求項１に記載の変異体。
32. ３２．下記のアミノ酸配列： 【配列があります】 （配列番号： ２） を有する請求項１に記載の変異体。
33. ３３．請求項１〜３２のいずれか１項に記載のヒトクニッツ型プロテアーゼイン ヒビター変異体をコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構成物。
34. ３４．請求項３３に記載のＤＮＡ構成物を含有する組換え発現ベクター。
35. ３５．請求項３３記載のＤＮＡ構成物または請求項３４に記載の発現ベクターを 含有する細胞。
36. ３６．請求項１〜３２のいずれか１項に記載のヒトクニッツ型プロテアーゼイン ヒビター変異体の製造方法であって；請求項３５に記載の細胞を、上記タンパク 質の発現を促進する条件下で培養し、次いで：生成した該タンパク質を培養物か ら回収することを含んで成る製造方法。
37. ３７．請求項１〜３２のいずれか１項に記載のヒトクニッツ型プロテアーゼイン ヒビター変異体および医薬として容認可能な担体もしくは賦形剤を含んで成る医 薬組成物。
38. ３８．請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＴＦＰＩのヒトクニッッ型プロテ アーゼインヒビタードメインＩもしくはその変異体、および医薬として容認でき る担体または賦形剤を含んで成る、カテプシンＧを阻害用医薬組成物。
39. ３９．さらにヘパリンを含有する請求項３７または３８に記載の組成物。
40. ４０．病的なタンパク質分解に付随する疾患または症状の予防用もしくは治療用 の医薬を製造するのに用いる、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＴＦＰＩ のヒトクニッツ型プロテアーゼインヒビタードメインＩもしくはその変異体の用 途。