JPH07501709A - パピローマウイルスのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

パピローマウィルスのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害発明の分野 発明の背景 パピローマウィルス（ｐｖ）は、自然界に広く行きわたっており、一般に、共通 していぼと呼ばれ、良性の上皮および繊維上皮の病巣に関連している。ウィル４ 、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。 ヒトにおいて、ヒトバビーロマウィルスは、手および足の尋常性いぼ、喉頭のお よび尖圭コンジローマとも呼ばれる性器いぼは、最も深刻かつ顕著なＰ■感染の ひとつである。疾病コントロールセンター（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａ ｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）から報告されたように、性器いぼの性的方法による伝播 はよく立証されており、性器いぼの発生率は増加している。そのいぼの深刻さは 、ＨＰＶ　ＤＮＡが、子宮頚部上皮肉新生物症（ＣＩＮ　ｌ−１１１）の総ての 段階に見いだされ、ＨＰＶ型の特定のサブセットが子宮頚部上皮肉感において見 いだされたという最近の発見により強調されている。その結果、現在のところ、 特定のＨＰＶ型を含む性器いぼを持つ女性は、子宮頚癌に進行する高い危険性が あると考えられている。現在の性器いぼの治療は不充分である。 パピローマウィルスを妨害する組成物を提供することが強く要求されているが、 未だに実現されていない。同様に、動物におけるパピローマウィルス感染の治療 および診断の方法の発達が望まれている。さらに、パピローマウィルスの研究に おいて使用するための改良したキットおよび研究試薬が必要とされている。 発明の目的 本発明の目的は、パピローマウィルスのｍＲＮＡとハイブリダイズしてそのｍＲ ＮＡの機能を阻害しうるオリゴヌクレオチドを提供することである。 さらに本発明の目的は、ウィルスのｍＲＮＡとのアンチセンス相互作用を通じて 、パピローマウィルスＤＮＡの機能的発現を調節しうるオリゴヌクレオチドを提 供することである。 °　さらに、本発明の別の目的は、動物においてパピローマウィルスの治療およ び診断の方法を提供することである。 パピローマウィルスを含むと疑われる試料中のウィルスの存在または不在を検出 するための方法、物質およびキットもまた本発明の目的である。 新規なオリゴヌクレオチドも、本発明の他の目的である。 これらのおよび他の目的は、本明細書および特許請求の範囲の全体から当業者に 明らかとなるであろう。 図の簡単な説明 図１ａ、ｂ、ｃおよびｄは、幾つかのＰ■ゲノムの遺伝的構成の概要地図である 。 図２は、　オーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）およびゲノムがら転写され るｍＲＮＡを示す、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ−１）ゲノムの部分的遺伝 地図である。 図３は、ヌクレオチド２４４３−４２０３を示すＢＰＶ−Ｉ　Ｅ２トランスアク チベーター遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列である。 図４は、ヌクレオチド２４４３−３０８０を有するドメインを示すＢＰＶ−ＩＥ ２トランスアクチベーター遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列である。 図５は、ヌクレオチド８９−３０４を有するドメインを示す初期ｍＲＮＡをコー ドするＢＰＶ−１５’共通非翻訳領域のヌクレオチド配列である。 図６は、本発明の教示に従って作成されたアンチセンス　オリゴヌクレオチドの ヌクレオチド配列、およびこのオリゴヌクレオチドのＥ２　ｍＲＮＡにおける相 対位置である。オリゴヌクレオチドの同定、配列および機能的な役割が示される 。 図７は、本発明の教示に従って作成されたアンチセンス　オリゴヌクレオチドの 、Ｅ２発現に対する効果のグラフ描写である。ｍＲＮＡ　ＣＡＰ領域（■１７５ １）およびＥ２トランスアクチベーターの翻訳コドン（１１７５３）を標的とす るオリゴヌクレオチドは、マイクロモルの濃度でＥ２　トランスアクチベーショ ンを減少させることを示す。 図８は、本発明の教示に従って作成されたオリゴヌクレオチドの用量−反応曲線 のグラフ描写である。この用量−反応曲線のカーブは、翻訳開始コドンを含む領 域中のＥ２　トランスアクチベーターｍＲＮＡに相補的なアンチセンス　オリゴ ヌクレオチド１１７５３が、５５０−１Ｏ０ｎの範囲の５０％の阻害濃度（ＩＣ ５ｏ）を有するのに対し、同じｍＲＮＡのＣＡＰ領域を標的とするオリゴヌクレ オチド（１１７５１）が、５Ｏ０ｎＭの範囲のＩＣ５ｏを有することを示す。 図９ａおよびｂは、本発明の教示に従って作成され、Ｅ２ｍＲＮＡのトランスア クチベーターおよびトランスリプレッサーを標的とするアンチセンス　オリゴヌ クレオチドのヌクレオチド配列である。 図１０は、Ｅ２　ｍＲＮＡのトランスアクチベーター領域を標的とする、選択さ れたオリゴヌクレオチドの効果のグラフ描写である。本発明の教示に従って作成 された１５ｍｅｒから２０ｍａｒのアンチセンス　オリゴヌクレオチドは、Ｅ２ トランスアクチベーンヨンを阻害することが示される。 図１１は、Ｅ２　ｍＲＮＡのトランスリプレッサー領域を標的とする、選択され たオリゴヌクレオチドの効果のグラフ描写である。本発明の教示に従って作成さ れた１５ｍｅｒから２０ｍｅｒのアンチセンス　オリゴヌクレオチドは、Ｅ２ト ランスリブレッジコンを阻害することが示される。 図１２は、ＢＰＶ−１の生活史のｉｎ　５ｉｔｕにおけるＥ２トランスアクチベ ーターの減少の結果の写真描写である。本発明の教示に従って作成されたアンチ センス　オリゴヌクレオチドを、Ｃ１２７細胞のＢＰＶ−１による形質転換を阻 害もしくは減衰する能力について試験した。写真は、試験細胞を播種したベトリ ディッシュを描写する。 図１３は、Ｅ２　ｍＲＮＡのトランスアクチベーター領域を標的とする、選択さ れたオリゴヌクレオチドの効果のグラフ描写である。本発明の教示に従って作成 されたアンチセンス　オリゴヌクレオチドによるＢＰＶ−１フオーカス形成の阻 害が描写される。これらの１１７５１と１１７５３についての用量−反応曲線は 、１１７５３が１０ｎＭの範囲のＩＣ５ｏを有するのに対し、１１７５１が１１ ００ｎの範囲のＩＣ６゜を有することを示す。 図１４は、本発明の教示に従って作成されたアンチセンス　オリゴヌクレオチド の、ＢＰＶ−１のゲノムを複製する能力に対する効果のグラフ描写である。ウィ ルスによって形質転換された細胞を１１７５３および１１７５１により処理し、 ウィルスＤＮＡを定量した。 図１５は、代謝的に標識したオリゴヌクレオチドて処理した細胞または未処理の 対照を、モノクローナル抗体を用いて免疫沈澱させた、免疫沈澱アッセイの結果 を示す。 図１６は、ＨＰＶ−１１のＥ２の転写開始コドンの領域のヌクレオチド配列であ る。 図１７は、Ｃ１２７細胞において、ｌ５ＩＳ　１７５１およびｌ５ＩＳ　１７５ ３がＢＰＶ−１のフォーカス形成を阻害したことを示すグラフである。 図１８は、５μＭの範囲のＩＣ５゜を有するｌ５ＩＳ　２１０５を用いた濃度依 存的、配列特異的ＨＰＶ−１１Ｅ２ｍ存トランスアクチベーションの阻害を示す グラフである。 発明の概要 本発明の好ましい態様においては、パピローマウィルス由来のｍＲＮＡとハイブ リダイズしつるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体が提供され る。この関係は、一般に「アンチセンス」と称される。オリゴヌクレオチドおよ びオリゴヌクレオチド類似体は、タンパク質への翻訳、細胞質への輸送、あるい は全体的な生物学的機能に必要な他の活性等のＲＮＡの機能を阻害することがで きる。ｍＲＮＡがその機能のすべであるいは一部を成し遂げられない場合には、 パピローマウィルスゲノムは正確に発現されない。すなわち、増殖が不能となり 、正確な子孫が有効的な数だけ作られなくなり、そしてパピローマウィルスに感 染した動物の子孫への有害な効果が調節される。 ある一定のウィルスｍＲＮＡとして表現されるパピローマウィルスゲノムの部分 を、アンチセンス攻撃のための標的とすることが好ましいことが見いだされた。 この目的のためには、パピローマウィルスのＥ２．Ｅｌ、Ｅ７およびＥ６−７ｍ ＲＮＡが特に適していることが発見された。したがって、オリゴヌクレオチドに よるハイブリダイゼーションがめられるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ　Ｅ２．Ｅｌ。 Ｅ７．あるいはＥ６−７であることが好ましい。さらに好ましい態様によれば、 パピローマウィルスのＥ２トランスアクチベーター領域または共通の５′非翻訳 領域（例えばウンバピローマウィルス−１におけるヌクレオチ）’２４４３−３ ０８０あるいは８９−３０４）から転写されるＲＮＡ部分に相補的なように設計 されたヌクレオチド塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが提供される。 好ましい態様においては、Ｅ２トランスアクチベーターのｍＲＮＡ　ＣＡＰｆｌ 域および翻訳コドンを標的とするオリゴヌクレオチドが提供される。これらのオ リゴヌクレオチドは、ＢＰＶ−１のヌクレオチド２４４３−４１８０にコードさ れるＥ２　ｍＲＮＡとハイブリダイズするように設計される。 ＨＰＶ−５およびＨＰＶ−１１の両方のＥ２　ｍＲＮＡの翻訳開始、すなわちヌ クレオチド２７１３−２７３２を標的とする、２０ｍａｒのホスホロチオエート オリコヌクレオチド、ｌ５ＩＳ２１０５（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、７）が提供され 、これは、１度依存的、配列特異的にＥ２依存トランスアクチベーションを阻害 する。 パピローマウィルスの発現を調節する方法が発見された。この方法は、前記パピ ローマウィルス由来のｍＲＮＡと、パピローマウィルス由来のｍＲＮＡとハイブ リダイズしつるオリゴヌクレオチドとを接触させ、該オリゴヌクレオチドが前記 ｍＲＮＡとハイブリダイズしたときにその機能を阻害することからなる。 パピローマウィルスのＥ２．　Ｅｌ、　Ｅ７．またはＥ６−７のｍＲＮＡとハイ ブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド 類似体を用いることが好ましい。 Ｅ２依存のトランスアクチベーンヨンを阻害することが最も好ましい。 さらに、動物におけるパピローマウィルス感染の影響を調節する方法が発見され た。この方法は、パピローマウィルス由来のｍＲＮＡとハイブリダイズすること ができ、かつ前記ｍＲＮＡとハイブリダイズしたときにそのｍＲＮＡの機能を阻 害しうるオリゴヌクレオチドを動物と接触させることを含む。パピローマウィル スのＥ２．　Ｅｌ、Ｅ７．またはＥ６−７のｍＲＮＡとハイブリダイズしうるオ リゴヌクレオチドが好ましい。Ｅ２　ｍＲＮＡの翻訳開始を標的とするオリゴヌ クレオチドが最も好ましい。 このようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を使用するパピ ローマウィルスの存在または不在を検出するための診断、ならびにそのような診 断のためのキットおよびそのようなハイブリダイゼーションに依存する研究試薬 もまた、本発明に含まれる。 発明の詳細な説明 性器いぼは、最も頻繁に診断される、ウィルス性の、性的に伝染される病気であ る。臨床的には、これらは二つの主要なグループ、すなわち尖圭コンジローマお よび扁平子宮頚部いぼに分類される。コンジローマはウィルスの粒子を含むこと が示され、分子生物学的研究により、これらの病巣の９０％以上がＨＰＶ−６ま たはＨＰＶ−１１ＤＮＡを含むことが発見された（Ｇｉｓｓｍａｎｎ、Ｌ、。 Ｗｏｌｎｉｋ、Ｌ、、Ｉｋｅｎｂｅｒｇ、Ｈ，、Ｋｏｌｄｏｖｓｋｙ、Ｕ、。 ５ｃｈｎｕｒｃｈ、Ｈ，Ｇ、＆　ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ、Ｈ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０：５６０−５６３（１９８３））。尖圭 コンジローマは一般にペニス、陰門および肛門周囲領域に生ずる。それらは、自 発的に退行するかまたは何年も存続し、浸襲性癌腫への進行は低頻度でしかおき ない。他の性器いぼとは異なり、子宮頚部に生じるいぼは、形態学的には先のと がったというより、扁平状を示し、通常はパパニコラウスミア法（Ｐａｐ　ｓｍ ｅａｒ）によって臨床的に検出される。子宮頚部異形成に対するパピローマウィ ルスの病因は、１９７０年後半、細胞学者たちの研究により示唆された。彼らは 、ＨＰＶ感染による細胞学的変化のパパニコラウスミア法と異形酸のババニコラ ウスミア法との関係を示した。他の研究は、これらの病巣の異形酸細胞の幾つか にウィルス粒子およびウィルスカプシド抗原が存在することを示した。既知の臨 床的な研究が、子宮頚部異形成（ＣＩＮ、あるいは子宮頚部上皮肉新生物症とも 称される）が上皮内癌の前駆体であり、そしてこの上皮内癌が子宮頚部の浸襲性 扁平上皮内細胞腫瘍の前駆体であることが認められたため、これらの関係は重要 である。ＨＰＶ１６型および１８型が子宮頚癌から直接クローニングされた（Ｄ ｕｒｓｔ、　Ｍ、、　Ｇｉｓｓｍａｎ、　Ｌ、、　ｒｋｅｎｂｅｒｇ、　Ｈ，＆ 　ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ、　Ｈ，、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ　８０：３８１２−３８１５（１９８３）、Ｂｏｓｈａｒｔ、Ｍ、 、　Ｇｉｓｓｍａｎｎ、　Ｌ、、　Ｉｋｅｎｂｅｒｇ。 Ｈ，、Ｋｌｅｉｎｈｅｉｎｚ、　Ａ、、　５ｃｈｅｕｒｌｅｎ、Ｗ、　＆ｚｕｒ 　Ｈａｕｓｅｎ、　Ｈ，、ＥＭＢＯＪ、３：１１５１−１１５７（１９８４）） 。次に、これらはハイブリダイゼーションのプローブとして使用され、ヒト子宮 頚癌およびそれから誘導された細胞株の７０％以上が、これらのＨＰＶ型のいず れかの存在について陽性であることが示された。他の２０％のもツバ、ＨＰＶ− ３１，ＨＰＶ−３３，およびＨＰＶ−３５等の他のＨＰＶ型を含む。 全国治療目録（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｉｎｄｅｘ）から 集められた情報は、１９８４年に２２４．９００件の生殖器いぼに関する初診が 、１５６，７２０件の生殖器ヘルペスに関する初診があったことを示した。生殖 器いぼの発生は、１９７０年代から１９８０年代を通じて確実に増加しており、 最近では、上皮学的研究により、１９５０年から１９７８年までの平均発生率が 人口１００，０００人に対して１０６．５に達したことを示した。２５才から５ ５才までの女性の子宮頚部ＨＰＶ感染の罹患率は０．　８％であったが、２２才 の女性においては２．７％であった。細胞学的に正常な女性に関する最近の研究 は、潜在的な感染の発生は１１％であることを示した。すなわち、この病気の潜 在的な段階にあるようであり、一層大きな発生および罹患率が示唆される。 活性型生殖器いぼは、妊娠したアメリカ女性の約２．５％において同定され、し たがって、毎年６０，０００から９０．０００人の妊婦に同定されると推定され る。ＨＰＶ感染は、妊婦においては２倍以上の罹患率である。毎年、１５００人 の喉頭パピローマの新患が見積もられ、このことは、母から新生児への感染の危 険性が１．８０から１　：　２００であることを示している。 喉頭パピローマは、喉頭部の良性の上皮腫瘍である。２つのＥＶ型、ＨＰＶ−６ およびＨＰＶ−１１が、喉頭パピローマに関係する最も一般的なものである。 臨床学的には、喉頭パピローマは若年発症性および成年発症性の２つのグループ に分けられる。若年発症性では、新生児が生殖器ＰＶ感染した母親の産道を通過 するときに感染すると考えられている。病気は２才までに顕在化し、ゆっくりで はあるが確実に良性のパピロームが成長し、最終的には外科手術の介入がなけれ ば気道閉塞に至るという特徴を有する。これらの子供達は、典型的には、パピロ ーマが再発生するため、数多（の手術を受けることになるだろう。患者は、究極 的には数多くの手術の合併症で倒れてしまう。現在までに若年発症性の喉頭乳頭 腫症に対する治療法がなく、自発的な退化は稀である。成年発症性の喉頭乳頭腫 症はそれほど攻撃的ではなく、しばしば自発的に緩解する。 パピローマウィルスの感染に関係した最も一般的な病気は、良性の皮膚のいぼで ある。一般に尋常性いぼは、ＨＰＶ−１，２，３，４または１０型を含む。これ らのいぼは、典型的には足踵、足底いぼまたは手の平に生ずる。尋常性皮膚いぼ は、子供や若い成人によ（見られる。後期になって、おそら（は免疫学的および 生理学的な変化により、尋常性いぼの発生は減少する。足底いぼはしばしば画質 化し、外科的な除去が必要となるが、手術後もしばしば再発を繰り返す。現在ま でに、足底いぼに対する確実な治療法はない。手の尋常性いぼは見苦しいが、は とんど画質化せず、通常は外科的な治療はされない。 ゆうぜい状表皮発育異常症（ＥＶ）は、希に遺伝的に伝達される病気であり、小 さな赤みがかった斑として現れる播種性偏平いぼにより特徴づけられる。多様な ＨＰＶ型がＥＶに関係している。時間がたっと、約１／３のＥＶ患者の皮膚の多 数の部位に扁平上皮癌（Ｓ　ＣＣ）が発生する。一般にｓｃｃは、皮膚の日光に 当たる部分に生ずる。ＥＶに関連したＰＶのサブセット、ＨＰＶ−５およびＨＰ ｖ−８のみが、ＳＣＣに一致して見られる。遺伝的な素因、免疫的な異常および ＵＶ照射、ならびにＨＰＶはすべて、これらの患者のｓｃｃの進行に寄与する。 ＰＶのゲノムは、二重鎖の、共有結合により閉環した環状ＤＮＡ分子であり、約 ８０００塩基対からなる。ウシパピローマウィルス１型（ＢＰＶ−１）を含む数 多くの動物やヒトＰｖの完全なヌクレオチド配列および遺伝的な構造が決定され ている（Ｃｈｅｎ、Ｅ、　Ｙ、、Ｈｏｗｌｅｙ、　Ｐ、　Ｍ、、　Ｌｅｖｉｎｓ ｏｎ、　Ａ、　Ｄ、＆　Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、　Ｈ，、Ｎａｔｕｒｅ　２９９ ：５２９−５３４　（１９８２））、幾つかのＰｖゲノムの地図を図１に示す。 ウィルスの転写は、単一の方向であり、総てのウィルスｍＲＮＡはウィルスＤＮ Ａの同じ鎖から転写される（Ｅｎｇｅｌ、Ｌ、Ｗ、、Ｈｅｉｌｍａｎ、Ｃ。 Ａ、＆　Ｈｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４７：５１６−５２８（１ ９８３）、Ｈｅｉｌｍａｎ、Ｃ，Ａ、、Ｅｎｇｅｌ、Ｌ、。 Ｌｏｗｙ、Ｄ、Ｒ，＆Ｈｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１１９　： 　２２−３４　（１９８２））。コーディング鎖は１ｏの名づけられたオープン リーディングフレーム（ＯＲＦｓ）を含む。個々の０ＲＦｓは、ＰＶゲノム中に おける位置および感染細胞における非生産的対生産的な発現様式により、「初期 」または「後期ＪＯＲＦｓとして分類されている。図２はウシパピローマウィル ス−１について、幾つかの０ＲＦｓの関係を示す。 誓言動物細胞を形質転換し、そのゲノムを形質転換細胞内でエビソームとして維 持することが可能であるために、ＢＰＶ−１はｉｎ　ｖｉｔｒｏ　の研究におい てパピローマウィルスのモデルとして用いられてきた。その結果、ＢＰＶ−１が すべてのパピローマウィルスの中で最もよく特徴づけられている。Ｂ　ＰＶ−１ のゲノムは長さ７９４６塩基対であり、クローニングされ配列決定されている（ Ｃｈｅｎ、　ｅ　ｔ　ａ　］、、　１１９８２年前出）　。Ｂ　ＰＶ　−１７７ ）ＤＮＡ配列解析は、８ＷＡの初期（Ｅ）および２個の後期（Ｌ）の０ＲＦｓを 明らかにした。 ０ＲＦｓの初期あるいは後期との名称は、非生産的感染形質転換細胞対許容的感 染細胞における発現様式に基づいている（Ｈｅｉｌｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、。 １９８２年、前出、Ｂａｋｅｒ、　ｃ、ｃ、＆　Ｈｏｗｌｅｙ、　Ｐ、Ｍ、。 ＥＭＢＯＪ、　６：１０２７−１０３５（１９８７））。 すべての０ＲＦｓは、ＤＮＡの同一の錆止に含まれており、現在までに特徴づけ られたすべてのｍＲＮＡはコーディング鎖から転写されていることが示されてい る（Ａｍｔｍａｎｎ、Ｅ、　＆　５ａｕｅｒ、Ｇ、、　Ｊ、ｖｉｒｏｌ、４３： ５９−６６　（１９８２））。ＢＰＶ−１０ＲＦｓの機能は、組み換えＤＮＡ手 法およびｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞培養系により解析された。幾つかのＯＲＦ　ｓは 、多重の機能を有していることが示された。Ｅ５およびＥ５　０ＲＦｓは、形質 転換タンパク質をコードしていることが示された（Ｙａｎｇ、　Ｙ、Ｃ，、Ｏｋ ａｙａｍａ、Ｈ，＆　Ｈｏｗｌｅｙ、　Ｐ、Ｍ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：１０３０−１０３４（１９８５））、Ｅｌおよび Ｅ７　０ＲＦｓは、感染した細胞中におけるＢＰＶ−１の高コピー数の維持に関 係している（Ｌｕｓｋｙ、Ｍ、　＆　Ｂｏｔｃｈａｎ、Ｍ、Ｒ，、Ｊ。 Ｖｉｒｏｌ、　５３：９５５　９６５（１９８５））。 ３゛　Ｅｌ　０ＲＦは、ウィルスゲノムの複製およびウィルスゲノムの維持に必 要な因子をコードしている（Ｌｕｓｋｙ、Ｍ、＆　Ｂｏｔｃｈａｎ、Ｍ、Ｒ，。 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６０ニア２９−７４２（１９８６））。５’Ｅ１　０ＲＦは ウィルスＤＮＡ復製のモジュールをコードしている（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｊ。 Ｍ、　＆　Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、　Ｈ，、Ｃｅ１ｌ　４６：７４１−７５２（１ ９８６））。Ｅ２　０ＲＦの全長は、ウィルスの転写をトランスアクチベートす るタンパク質をコードしており（Ｓｐａｌｈｏｌｚ、　Ｂ、Ａ、、　Ｙａｎｇ、 　ｙ、ｃ、　＆　Ｈｏｗｌｅｙ、　Ｐ、Ｍ、、　Ｃｅ１ｌ　４２：１８３−１９ １　（１９８５））　、一方、３’　Ｅ２　０ＲＦはウィルスの転写のトランス リプレッサーをコードしている（Ｌａｍｂｅｒｔ、　Ｐ、Ｆ、、　５ｐａｌｈｏ ｌｚ、　Ｂ、Ａ、　＆　Ｈｏｗｌｅｙ、　Ｐｌｖｌ、、　Ｃｅ１ｌ　５０：６９ −７８　（１９８７））。ＢＰＶ−１のＥ３．Ｅ４およびＥ８の機能はまだ明ら かとなっていない。ＬＬ（Ｃｏｗｓｅｒｔ、　Ｌ、Ｍ、、　Ｐｉｌａｃｉｎｓｋ ｉ、Ｗ。 Ｐ、＆Ｊｅｎｓｏｎ、Ａ、Ｂ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６５：６１３−６１５ （１９８８））およびＬ２はカプシドタンパク質をコードしている。 本発明に従えば、当業者はそこから転写されたＤＮＡのオーブンリーディングフ レームにより同定されるｍＲＮＡは、ＤＮＡの０ＲＦｓからの情報のみならず、 ５’　ＣＡＰ領域、５゛非翻訳領域および３°非翻訳領域として当業者に知られ ている領域を形成する関連リボヌクレオチドも含むことを理解するであろう。し たがって、全体として又は部分的に、これらの関連リボヌクレオチドならびに情 報を有するリボヌクレオチドを標的とするオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌク レオチド類似体を、本発明にしたがって形成することができる。。 ＢＰＶ−ｌゲノム中において７１００から８１００の間に位置している約１００ ０塩基対の長さの領域は、広範囲でコードしている可能性がないことが同定され た。この領域はロング　コントロール　領域（ＬＣＲ）と称される。ＬＣＲはウ ィルス転写およびウィルス複製の制御に重要な多数のＣＩＳコントロール要素を 有している。ＯＲＦｓの機能的な割り当ての概要を表１に示す。　ＢＰＶ−１ゲ ノムの転写は、多数のプロモータの存在および複雑かつ変化するスプライシング のパターンのために複雑である。今までのところ、１８の異なったｍＲＮＡ種が 様々な方法で同定された（Ａｍｔｍａｎ、Ｅ、＆　５ａｕｅｒ、Ｇ、、　Ｊ。 Ｖｉｒｏｌ、　４３：５９−６６　（１９８２）、Ｂｕｒｎｅｔｔ、Ｓ、、Ｍｏ ｒｅｎｏ−Ｌｏｐｅｚ、Ｊ、＆　Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、Ｕ、、　Ｎｕｃｌｅｉ ｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１５：８６０７−８６２０（１９８７）、Ｅｎｇｅｌ 。 Ｌ、Ｗ、、Ｈｅｉｌｍａｎ、Ｃ，Ａ、、Ｅｎｇｅｌ、Ｌ、、Ｌｏｗｙ、Ｄ、Ｒ。 ＆　Ｈｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、、　ＶｉｒｏｌｏｇＹ１１９：２２−３４　（１９ ８２）、Ｂａｋｅｒ、Ｃ，Ｃ，＆　Ｈｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、、　ＥＭＢＯＪ、６ ：　１０２７−１０３５　（１９８７）　、５ｔｅｎｌｕｎｄ、Ａ、、Ｚａｂｉ ｅｌｓｋｉ、Ｊ、、Ａｈｏｌａ、Ｈ，、Ｍｏｒｅｎｏ−Ｌｏｐｅｚ、Ｊ、＆　Ｐ ｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、Ｕ、、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１８２：５４１−５５４ 　（１９８５）、Ｙａｎｇ、Ｙ、Ｃ，、Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，＆　Ｈｏｗｌｅｙ 、Ｐ、Ｍ。 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８２：１０３０−１０３４（ １９８５））。 総ての初期ｍＲＮＡは、初期０ＲＦｓの下流に位置するヌクレオチド（ｎｔ）４ １８０において共通のポリアデニル化シグナルを使用しており、一方、後期ｍＲ ＮＡはヌクレオチド７１５６の二番目のポリアデニル化シグナルを使用している 。ＢＰＶ−１ｃＤＮＡの配列解析により、多重５゛　スプライス部位（ｎｔ３０ ４．８６４．１２３４．２５０５．３７６４および７３８５）および３゛スプラ イス位（ｎｔ５２８．３２２５．３６０５．５６０９）の存在、およびその結果 としての選択的スプライシング事象が明らかとなった。大部分のＢＰＶ−１ｍＲ ＮＡｓの５°末端は、ｎｔ８９にマツプされ、ｎｔ８９と第一スプライシング供 与部位ｎｔ３０４との間の共通の領域を含む。他のｍＲＮＡ５の５′末端は、ｎ ｔ８９０．２４４３および３０８０にマツプされる。 異なる種および１つの種の中の異なるタイプからのパピローマウィルスＤＮＡが 異なることが予期される。しかし同様に種々のＰＶの同一のＯＲＦの間の類似は 相違よりも重大であり、本発明の態様に影響するものと信じられる。したがって 、例えば、種々のＰＶのＥ２領域は、本質的にそれぞれのＰｖの同一の機能を与 えていること、およびＥ２の遺伝的な情報の発現の妨害は多様な種において同様 の結果を与えだるうということが信じられる。このことは、たとえＰＶの種の間 のヌクレオチド配列の違いが疑い無く存在しても、そのように信じられる。 したがって、本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、記載される特定の種に ついての代表例であることが理解されるであろう。。パピローマウィルスの異な る種についての相同性または類似性を有する配列は、特に本発明の範囲に包含さ れると考えられる。 初期の遺伝学的な実験は、Ｅ２の欠失または変異がＣ１２７細胞におけるＢＰ■ ＰＶ−カス形成活性の消失をもたらすことを示し、このことはＥ２が形質転換機 能を有することを示唆している。後の研究では、Ｅ２がウィルスの転写のレギュ レータであり、Ｅ２の変異による形質転換能力の消失は、Ｅ２の条件付きエンハ ンスを介する他の形質転換遺伝子のダウンレギュレーションによるものであるこ とが示された。全長のＥ２　０ＲＦは、ウィルスの初期遺伝子の転写を刺激する Ｅ２トランスアクチベーターをコードしている。Ｅ２トランスアクチベーターは 、図２に種Ｎとして示されるように５゛末端がｎｔ２４４３にマツプされる、ス プライスされていないｍＲＮＡから翻訳される。Ｅ２トランスリプレッサーは、 Ｅ２トランスアクチベーターのＮ末端が不完全な形をしており、プロモーターに よりＥ２　ＯＲＦ中のヌクレオチド３０８９の転写開始から生じる（図２、種Ｏ ）。 Ｅ２の、トランスアクチベートドメイン（５°部位）およびＤＮＡ結合ドメイン （３′部位）、ならびにパリンドロームであるＤＮＡ認識配列（ＡＣＣＮ６ＧＧ Ｔ）が同定された。Ｅ２　ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方とも、約６０分より 短いオーダーの非常に短い半減期を有することが示された。Ｅ２のトランスレギ ュレートの回路（ｃｉｒｃｕｉｔ）は、パピローマウィルスの間に一般的な特徴 である。Ｅ２トランスレギュレーターは、これまでに調査されているどのパピロ ーマウィルスでも報告された。 ＰＶゲノムは、直径５５ｎｍのむきだしの正二十面体カプシドに詰め込まれてい る。ウィルスカプシドはエンベロープを持たず、グリコジル化されていない。 ウィルスによりコードされるＬｌおよびＬ２と名づけられた２つのタンパク質が カプシドを形成している。Ｌｌは主要カプシドタンパク質であり、ピリオンに存 在する８０％のタンパク質を構成し、５０から６０ｋＤの間の分子量を有する。 Ｌ２はマイナーカプシドタンパク質であり、理論的には５１ｋＤの分子量を有す るが７６ｋＤに移動することが示されている。Ｐｖはｉｎ　ｖｉｔｒｏで生産す ることができず、生産性病巣では成熟ピリオンがほとんど見いだされないために 、ＰＶの詳しい血清学研究を行うことはできなかった。 パピローマウィルスの生活サイクルは複雑であり、今の時点ではまだよく理解さ れていない。現在まで、成熟Ｐｖピリオンの生産が可能なｉｎ　ｖｉｔｒｏ系は 開発されておらず、そのため、パピローマウィルスの生活サイクルの特徴づけは 不可能である。ＰＶは、種の壁をほとんど越えない、制限された宿主域を有する 。さらに、Ｐｖは粘膜あるいは角質化している分化上皮細胞にのみ感染する。 ＰＶ遺伝子発現の制御は、宿主の上皮細胞の分化プログラムと深く連結している と考えられている。現在好ましく受け入れられているＰｖの生活環は、以下のと おりである。感染したＰＶの粒子が、外傷を介して上皮細胞の外膜に浸透し、宿 主組織の基底細胞に感染する。ここで、ウィルスは比較的低コピーの染色体外因 子として維持される。上皮細胞の分化が進み始めると、ＰＶゲノムは高コピー数 に複製され、その細胞が分化の終盤にかかると、後期遺伝子が発現されウィルス ゲノムがカプシドに取り込まれる。 パピローマウィルスはアンチセンス療法の理想的な標的であることが発見された 。第１に、パピローマウィルスの病巣は外用的であるため、アンチセンスオリゴ ヌクレオチドを局所的に適用することができ、かつ迅速なりリアランス等の多く の問題を排除し、合成オリゴヌクレオチドの全身投与に関連するオリゴヌクレオ チドの臨床的に活性のある組織１度が得られる。第２に、ウィルスゲノムは感染 細胞内において分離した遺伝子的因子として維持される。このことは、症状の治 療とは異なり、ウィルスの複製機能を攻撃することによる治療的方法の可能性の 門戸を開いている。 パピローマウィルスゲノム上のＥ２　０ＲＦが特にアンチセンスオリゴヌクレオ チドの設計によく適合していることが発見された。Ｅ２は、ＢＰＶ−１およびＨ ＰＶ系の両方においてウィルス転写の主要なトランスアクチベーターであること が示されている。Ｅ２　０ＲＦの変異体は、形質転換および染色体外ＤＮＡの複 製に対して多面的効果を有する（ＤｉＭａｉｏ、　Ｄ、　、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。 ５７：４７５−４８０　（１９８６）、ＤｉＭａｉｏ、Ｄ、＆　Ｓｅｔｔｌｅｍ ａｎ、　Ｊ、、　ＥＭＢＯＪ、７　：１１９７−１２０４　（１９８８）　、Ｇ ｒ。 ｆｆ、Ｄ、ｅ、＆　Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、Ｗ、Ｄ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５０： ２２１−２３０（１９８６）、Ｒａｂｓｏｎ、Ｍ、Ｓ、、Ｙｅｅ。 Ｃ，、Ｙａｎｇ、　Ｙ、Ｃ，＆　Ｈｏｗｌｅｙ、　Ｐ、Ｍ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ 、６０：６２６−６３４　（１９８６）、５ａｒｖｅｒ、Ｎ、、　Ｒａｂｓｏｎ 、Ｍ、Ｓ、、　Ｙａｎｇ、Ｙ、Ｃ，、Ｂｙｒｎｅ、Ｊ、Ｃ，＆　Ｈ。 ｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５２＋３７７−３８８（１９８４）） 　。 次に、Ｅ２　０ＲＦは転写のトランスアクチベーターをコードしていることが示 された（Ｓｐａｌｈａｌｚ、Ｂ、Ａ、、　Ｙａｎｇ、　Ｙ、Ｃ，＆　Ｈｏｗｌｅ Ｌ　Ｐ、Ｍ、、　Ｃｅ１ｌ　４２：１８３−１９１　（１９８５））。内部ＡＵ Ｇにおける翻訳開始によって作られるＥ２の不完全な形が、転写のトランスリプ レッサーであることが示された（Ｌａｍｂｅｒｔ、Ｐ、Ｆ、、　５ｐａｌｈｏｌ ｚ、　Ｂ、Ａ、＆　Ｈｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、、　Ｃｅ１１５０：６９−７８　（ １９８７））　。ＤＮＡ結合領域、すなわちＣ末端の１００アミノ酸（ＭｃＢｒ ｉｄｅ、Ａ、Ａ、、　Ｓｃｈｅｌｅｇｅｌ、Ｒ，＆　Ｈｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、　 ＥＭＢＯＪ、７：５３３−５３９　（１９８８））およびＤＮＡ認識配列（Ａｎ ｄｒｏｐｈｙ、Ｅ、Ｊ、、　Ｌｏｗｙ、Ｄ、Ｒ，＆　５ｃｈｉｌｌｅｒ、Ｊ、Ｔ 、。 Ｎａ　ｔｕｒｅ３２５．７０−７３　（１９８７）　、Ｍｏ５ｋａ、ｌ　ｕｋ、 Ｃ，＆Ｂａ５ｙｉａ、Ｄ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 　８４　：１２１５−１２１８　（１９８７））の両方が同定された。Ｅ２の転 写制御回路は、パピローマウィルスの間で一般的な特徴である。Ｅ２トランスレ ギュレーシコンはこれまでに調査された池のパピローマウィルスのそれぞれにお いて報告された（Ｇｉｕｓ、Ｄ、、Ｇｒｏｓｓｍａｎ、Ｓ、、　Ｂｅｄｅｌｌ、 Ｍ、Ａ。 ＆　Ｌａ１ｍ１ｎｓ、Ｌ、Ａ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６２：６６５−６７２（ １９８８Ｌ　Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ、Ｈ，、Ｂｒｏｋｅｒ、Ｔ、Ｒ，＆　Ｃｈｏｗ 、　Ｌ、Ｔ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６２：２９９４−３００２　（１９８８） 、Ｐｈｅｌｐｓ、Ｗ、Ｃ，＆　Ｈｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。 ６１　：１６３０−１６３８　（１９８７）　、Ｔｈ１ｅｒｒｙ、Ｆ、＆　Ｙａ ｎｉｖ。 Ｍ、、　ＥＭＢＯＪ、　６　：　３３９１　３３９７　（１９８７））。 本発明者らは、動物およびヒトのパピローマウィルスの間で共有される、必須の ウィルス転写因子の同定により、パピローマウィルスの研究、診断および治療に 対して、Ｅ２がアンチセンス方法の第１のターゲットであることを決定した。 特に、ヌクレオチド’２７１３−２７３２をカバーするＨＰｖ−１１Ｅ２トラン スアクチベータ−ｍＲＮＡのＡＵＧ領域にハイブリダイズするように設計された ２０ｍａｒのホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド　ｌ５ＩＳ２１０５　（ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア）が、濃度依存的、配列特異的に、Ｅ２依存性トランス アクチベーンヨンを阻害することが見いだされた。 本発明者らは、Ｅ１遺伝子座もまた同様にパピローマウィルスの攻撃の位置とし て見込まれることを発見した。警歯動物繊維芽細胞のＢＰＶ−１形質転換の初期 の変異解析により、ＥｌがウィルスＤＮＡ複製のレギュレ−ト候補として同定さ れた。３’　ＥＩ　ＯＲＦはウィルス　ゲノムの複製および維持に必要な因子を コードしている（Ｓａｒｖｅｒ、Ｎ、、　Ｒａｂｓｏｎ、Ｍ、Ｓ、、　Ｙａｎｇ 、Ｙ、Ｃ，Ｂｙｒｎｅ、Ｊ、Ｃ，＆　Ｈｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏ ｌ、　５２：３７７−３８８（１９８４）、Ｌｕ５ｋｙ、Ｍ、＆　Ｂｏｔｃｈａ ｎ、Ｍ、Ｒ，、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５３：９５５−９６５　（１９８５）、Ｌｕ５ ｋｙ、Ｍ、＆　Ｂｏｔｃｈａｎ、Ｍ、Ｒ，、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６０ニア２９−７ ４２　（１９８６））。Ｅｌの転写の発現の阻害は、感染細胞中においてＢＰＶ −１の（そして潜在的にはＨＰＶの）ＤＮＡを複製する能力を阻害するらしいと 考えられている。 本発明者らは、Ｅ７部位もまたパピローマウィルスに対する治療、診断および研 究への将来的な見込みがあることを見いだした。ＢＰＶ−１においては、Ｅｌは ウィルスの複製の制御に関与していることが示された（Ｂｅｒｇ、Ｌ、Ｊ、。 Ｓｉｎｇｈ、に、　＆　Ｂｏｔｃｈａｎ、Ｍ、、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉ。 １、６：８５９−８６９（１９８６））。ＨＰＶ−１６においては、Ｅｌは形質 転換および不死化に関係していることが実証された。今の時点では、ＨＰＶのＥ ｌがウィルスＤＮＡの複製に関与しているか否かは明らかではないが、Ｅ７特異 的アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび類似体がＢＰＶ−１ウイルスＤＮＡの 複製を阻害すると信じられる。 ＨＰＶのＥ６−Ｅ７領域は、形質転換領域であることが見いだされている。ウィ ルスの生活環におけるこの領域の正確な役割は今の時点で明らかではない。しか し、この領域がウィルスにより誘導された病巣の生活史において中心的な役割を 果たすため、この領域を標的とするオリゴヌクレオチドもまた本発明の目的に有 用であるらしいことがわかった。 最近の研究は、ｍＲＮＡの５′領域および、好ましくはＣＡＰ領域および開始コ ドンに向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、遺伝子の発現の阻害に最 も効果的であることを示唆している。パピローマウィルスの転写の一つの特徴は 、多くのｍＲＮＡが共通の５゛非翻訳領域およびＣＡＰ領域を有することである 。したがって、この領域に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、２つ 以上のｍＲＮＡを無能にする可能性を有することが確認された。多数のウィルス 遺伝子の停止は、最小限でも付加的な様式で作用し、おそら（は、共働的に感染 細胞からのウィルスのゲノムの根絶に作用するであろう。 本発明のある好ましい態様の実施により、アンチセンスの攻撃の好ましい標的で あるｍＲＮＡを生じさせるパピローマウィルスゲノムの０ＲＦｓが他のｍＲＮＡ の部分をもコードしていることが理解されるだろう。 前記の０ＲＦｓを表１にまとめる。 表１ パピローマウィルスのオーブン・リーディング・フレームおよびその割り当てら れた機能 ＯＲＦ　割り当てられた機能 Ｅ　（ＢＰＶ−１）　（３’　）　複製（ＢＰＶ−１）Ｅ２（全長’）　転写ト ランス７クチベーシａン（ＢＰＶ−１，ＨＰＶ−６゜ＨＰＶ−１６） （３゛部分）　転写抑制（ＢＰＶ−１）Ｅ４　いぼの細胞質リンタンパク質（Ｈ ＰＶ−１）Ｅ５　形質転換、ＤＮＡ合成の刺激　（ＢＰＶ−１）Ｅ６　形質転換 （ＢＰＶ−１） Ｅｌ　プラスミドのコピー数コントロール（ＢＰＶ−１）Ｌｌ　主要カプシドタ ンパク質 Ｌ２　マイナーカプシドタンパク質 本発明は、パピローマウィルスのｍＲＮＡの機能のアンチセンス阻害に使用する ためのオリゴヌクレオチドを用いる。本発明においては、”オリゴヌクレオチド ”との用語は天然に生じる塩基および天然のホスホジエステル結合により連結さ れたシクロフラノシル基からなるポリヌクレオチドを意味する。この用語は天然 に生じる種または天然に生じるサブユニットから形成された合成種またはこれら の類似体を意味する。”オリゴヌクレオチド”との用語は、オリゴヌクレオチド と同様に機能するが天然に生じない部分を有する一部分を意味する。したがって 、オリゴヌクレオチドは変化した糖部分あるいは糖量結合を有していてもよい。 これらの例は、当該技術分野において使用が知られているホスホロチオエートお よび他のイオウ含有種である。幾つかの好ましい態様に従えば、オリゴヌクレオ チドの少なくとも１つのホスホンエステル結合が、その活性が調節されるべきＲ ＮＡが位置する細胞の領域に浸透する組成物の能力を高める機能を有する構造に より置換される。このような置換は、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネ ート結合または短鎖アルキルもしくはノクロアルキル構造を含むことが好ましい 。 他の好ましい態様によれば、ホスホジエステル結合は、同時に実質上非イオン性 かつ非対本性である構造、または対掌性であり鏡像異性体的に特異性のある構造 で置換される。当業者は本発明の実施において使用するための他の結合を選ぶこ とができるであろう。 オリゴヌクレオチドはまた、少なくとも幾つかの修飾された塩基型を含む種を含 んでいてもよい。したがって、天然に通常見いだされるもの以外のプリンおよび ピリミジンを使用してもよい。同様に、本発明の本質的な意図が実行される限り 、ヌクレオチドサブユニットのフラノシル部分を修飾することもできる。このよ うな修飾の例は、２′−〇−アルキルーおよび２゛　−ハロゲン置換ヌクレオチ ドである。本発明において有用な幾つかの特定の糖部分の２゛位の修飾の例は、 ＯＨ，ＳＨ，ＳＣＨ３，Ｆ、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ２）。ＮＨ２または０ 　（ＣＨ２）−ＣＨ３（ここでｎは１から約１０である）、および同様の特性を 有する他の置換基である。 このようなオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチドまたは天然の線に したがって合成されたオリゴヌクレオチドと機能的に交換可能であるが、天然の 構造とひとつ以上の相違を有するものとして良く記述される。総てのこのような 類似体は、パピローマウィルスのｍＲＮＡとハイブリダイズしてそのＲＮＡの機 能を阻害するために効果的な機能を果たす限り、本発明に包含される。 本発明に従うオリゴヌクレオチドは、好ましくは約３から約５０のサブユニット を含む。このようなオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、約 ８から約２５のサブユニットを含むことがより好ましく、約１２から約２０のサ ブユニットを含むことがさらに好ましい。理解されるように、サブユニットはホ スホジエステルまたは他の結合により隣接したサブユニットと適当に結合する塩 基と糖の組み合わせである。本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、 周知の方法である固相合成法により便利に日常的に作成することができる。この ような合成のための装置はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含む幾つか の業者により販売されている。このような合成のための他の方法を用いることも できるが、オリゴヌクレオチドの実際の合成は、日常的な仕事をする人の能力の 範囲内である。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体等の他のオリゴヌク レオチドの製造もまた知られているだろう。 本発明のオリゴヌクレオチドは、パピローマウィルスのｍＲＮＡとハイブリダイ ズしつるように設計される。このようなハイブリダイゼーションは、達成したと きにｍＲＮＡの正常な機能を妨害し、ウィルスの有用性の喪失を引き起こす。 妨害されるべきｍＲＮＡの機能としては、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの移 動、ＲＮＡからのタンパク質の実際の翻訳、およびおそらくはＲＮＡが関与する 独立した触媒活性等の総てのウィルスの機能を含む。このようなＲＮＡの機能の 妨害の全体的な効果は、パピローマウィルスにＲＮＡの恩恵を喪失させ、総合的 にウィルスゲノムの発現の妨害を引き起こす。このような妨害は、一般的には致 死的である。 本発明にしたがえば、ウィルスにおいて高い代謝的重要性を有することが決定さ れたｍＲＮＡを妨害するように設計されたオリゴヌクレオチドを提供することが 好ましい。上記の説明のとおり、Ｅｌ、Ｅ２．　Ｅｌ、　またはＥ６−７バピロ 一マウイルスｍＲＮＡが好ましい標的である。Ｅ２が最も好ましい標的である。 ウシパピローマウィルス−１ゲノムのヌクレオチド２４４３−３０８０またはヌ クレオチド８９−３０４に実質的に等しいヌクレオチドによってコードされてい るＲＮＡを妨害することもまた好ましい。これは、これらが必須のタンパク質を 導く複数のＲＮＡをコードすると信じられているため、特に攻撃を受けやすい位 置を表していると信じられているからである。異なるパピローマウィルスは、ウ シパピローマウィルス−１と多少異なる構造を有することが理解されるであろう が、必須の類似する領域を日常的に決定することができる。図３．４および５は 、ウシパピローマウィルス−１ゲノム上のそれらの領域を表す。そして特定のパ ピローマウィルスにおいてその対応する領域にコードされたＲＮＡを妨害するよ うに設計されたどのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体も、パ ピローマウィルスの作用を妨害するような特別の効用を有しているようである。 ウシパピローマウィルス−１のＥ２　ｍＲＮＡを標的としたオリゴヌクレオチド の適例を表２に示す。 、′Ｘ ＨＰＶ−１１の転写開始コドンを標的としたオリゴヌクレオチドの適例を表３に 示す。 表３ ＨＰＶ−１１の翻訳開始コドンを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド化 合物　５−−−−−−−−−−−−−−−−−−−３゛　配列番号Ｉ２］００　 ＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣ１１２１０１ＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣ Ｇ　２Ｉ２１０２　ＴＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＧ　３Ｉ２１０３　ＴＧ ＣＴ丁ＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＧＴ　４Ｉ２１０４　ＴＴＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴ ＴＣＣＴＣＧＴ　５Ｉ２１０５　ＴＴＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＧＴＣ６ したがって、上記に示した２０のオリゴヌクレオチド、または当業者が上記で論 じたようにパピローマウィルスゲノムのＥ２　０ＲＦのそれぞれの好ましい領域 の知識から製造しつる同様のオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。それ ぞれの領域の配列の知識から、パピローマウィルスＥ１．　Ｅ７．およびＥ６− ７の好ましいＯＲＦの標的についても同様の表を作成することがでキル。 オリゴヌクレオチドが、前記の表に記載されたものと正確に一致し、あるいはパ ピローマウィルスゲノムのマツピンクの完全に模倣した解釈により要求されると おりに正確であることは必要ではない。むしろ、本発明の趣旨は、ゲノムの構造 およびオリゴヌクレオチドへの文字どおりの“翻訳”に対する厳格な忠実性から はいくぶんそれることを許容する。オリゴヌクレオチドの必須のハイブリダイ同 様に、種々のパピローマウィルスの間の種子様性が生じることが理解されるだろ う。種々の領域、すなわちＥ２．Ｅｌ等が種の間で非常に類似しているが、幾つ かの相違もある。本発明は、これらの多様性に適応するためのオリゴヌクレオチ ドの変更を、特に意図するものである。 Ｅ２の発現を阻害するＥ２特異的アンチセンス　オリゴヌクレオチドの能力を試 験する好ましいアッセイは、よく報告されているＥ２のトランスアクチベーショ ンの特性に基づくものであった（Ｓｐａｌｈｏｌｔｚ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５１ ：２１２８−２１３７　（１９８７）　）。Ｅ２依存性のエンハンサ−として機 能するＥ２応答要素を含むように、レポーター　プラスミド（Ｅ２ＲＥＣＡＴ） を構築した。Ｅ２ＲＥＣＡＴは、さらにＳＶ４０初期プロモーター、初期ポリア デニル化シグナルおよびクロラムフェニコール　アセチルトランスフェラーゼ遺 伝子（ＣＡＴ）を含む。このプラスミドの状況においては、ＣＡＴ発現はＥ２の 発現に依存する。Ｅ２の存在に対するＣＡＴ発現の依存性は、ＢＰＶ−１により 形質転換されたＣ１２７細胞、未感染Ｃ１２７細胞、およびＥ２ＲＥＣＡＴおよ びＥ２発現ベクターでコトランスフエクトされたＣ１２７細胞に、このプラスミ ドをトランスフェクションすることにより試験した。 アンチセンス　オリゴヌクレオチドは、主要Ｅ２トランスアクチベータ−ｍＲＮ Ａを標的とするように設計した（図６）。ターゲットはｍＲＮＡ　ＣＡＰ領域、 転写開始コドン、転写終止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含むが、これ らに限定されるものではない。種々の標的に相補的な１５または３０残基のオリ ゴヌクレオチドを、野生型ホスホジエステル　ヌクレオシド間連結または修飾さ れたホスホロチオエート　ヌクレオシド間連結により合成した。ｍＲＮＡ　ＣＡ Ｐ領域（１１７５１）およびＥ２トランスアクチベーターの転写コドン（■１７ ５３）を標的としたオリゴヌクレオチドは、予備的なスクリーニングにおいて、 １マイクロモルの濃度でＥ２トランスアクチベーションを減少させることを示し た（図７）。Ｅ２）ランスリプレッサーの転写開始コドンを標的とするオリゴヌ クレオチド１１７５６　（図６）は、ＣＡＴ活性の増加により示されたようにト ランスリプレッノヨンの部分的軽減を与えることができた（図７）。同様の長さ および塩基組成を有するがＥ２　ｍＲＮＡの他の領域を標的とするオリゴヌクレ オチドおよび他のノンセンス対照はアンチセンス効果を与えなかった。一般に、 ホスホロチオエート　ヌクレオノド間連結修飾を有するオリゴヌクレオチドは、 天然のホスホジエステル　ヌクレオシド間連結を含む同一の配列のオリゴヌクレ オチドより効果的であった。これは、おそらく血清中および細胞内に含まれるヌ クレアーゼに対するホスホロチオエートの耐性が増加しているためであろう。用 量−反応曲線は、１１７５３が５０から１１００ｎの範囲の５０％阻害濃度（Ｉ Ｃｓｏ）を有するノニ対し、Ｉ　１７５１が５００ｎＭの範囲ノ、１０倍も高イ Ｉｃ、。を有することを示す（図８）。Ｅ２１−ランスアクチベーターおよびト ランスリプレッサーの転写開始コドンを上首尾のアンチセンス標的として同定し た後、この領域の、より慎重なプローブとして追加の１組のホスホロチオエート を設計した（図９）。これらのデータは、適当なＡＵＧをカバーする１５から２ ０ｍａｒのオリゴヌクレオチドが、Ｅ２トランスアクチベーノヨンまたはトラン スリプレッションを阻害しうることを示した（図１０および１１）。 ＢＰＶ−１の生活史上のｉｎ　５ｉｔｕにおけるＥ２のトランスアクチベーター の減少の結論を決定するために、アンチセンス　オリゴヌクレオチドを、Ｃ１２ ７細胞のＢＰＶ−１による形質転換を阻害または減衰する能力について試験した （図１２）。１１７５１およびＩ　１７５３の用量−反応曲線は、１１７５３が １０％Ｍの範囲のＩＣ５゜を有するのに対し、１１７５１が１１００ｎの範囲の ＩＣ５Ｏを有することを示した（図１３）。このアッセイにおけるこれら２つの 化合物のＩＣ，。についての１０倍の相違は、トランスアクチベーションの阻害 のアッセイにおいて観察された相違と同様であり、このことは、転写開始コドン がより優れた標的であることを示唆する。 Ｅ２を標的としたアンチセンス　オリゴヌクレオチドの、ゲノムを複製するＢＰ Ｖ−］の能力に対する効果を試験するために、ＢＰＶ−１により安定に形質転換 したｌ−３８細胞をＩ　１７５３および１１７５１で処理し、ウィルスＤＮＡを 定量した（図１４）。１マイクロモルの濃度で４８時間処理した後、細胞当たり のウィルスＤＮＡのコピー数は約３倍減少した。このアッセイの間に、この細胞 は２回から３回分裂した。このデータは、ウィルスＤＮＡが細胞性ＤＮＡと同調 して複製できなかったことを示唆している。 Ｅ２２タンパク質成に対する１１７５３の効果を試験するために、■−３８細胞 を代謝的に標識し、Ｅ２特異的モノクロナール抗体で免疫沈降した。オリゴヌク レオチドと接触させない細胞またはセンスもしくは無関係なオリゴヌクレオチド で処理した細胞においては、４６ＫｄのＥ２タンパク質が存在している（図１５ ）。Ｅ２を標的とするオリゴヌクレオチドで処理した細胞においては、４６Ｋｄ のバンドが消失しており、このことは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼー ションにより翻訳の停止に作用していることを示している。 本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、診断、治療お よび研究用試薬およびキットとして使用することができる。治療的利用としては 、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を、手のいぼ、足のいぼ 、喉頭のいぼ、尖圭コンジローマ、ゆうぜい状表皮発育異常症、扁平子宮頚部い ぼ、子宮頚部上皮肉新生物等のパピローマウィルス感染、あるいはパピローマウ ィルスに関係した他の感染を患う動物に投与する。一般に、本発明に従う治療試 薬を局所的にまたは病巣内部に適用することが好ましい。皮下や筋肉内等の他の 投与方法もまた有効である。座薬も現在ではかなり有効であると考えられている 。本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を予防において 使用することも同様に有効であると考えられる。例えば、コンドーム等のコーテ ィングとして医薬を適用することにより予防が達成される。幾つかの態様におい ては、薬学的に許容しうる担体を使用することも好ましい。 本発明はまた、診断および研究にも有用である。本発明のオリゴヌクレオチドお よびオリゴヌクレオチド類似体はパピローマウィルスにハイブリダイズするため 、この事実を利用するサンドインチ法およびその他のアッセイ法を簡単に構築す ることができる。パピローマウィルス含むと疑われる試料中に存在するパピロー マウィルスと、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とのハイブ リダイゼーションを検出する手段の準備は日常的に行うことができる。このよう な準備には、酵素のコンジュゲート、放射性標識、あるいは他の適当な検出系を 含むだろう。パピローマウィルスの存在または不在を検出するキットもまた提供 されるだろう。 実施例 実験例１　アンチセンス　オリゴヌクレオチドによるＥＰＶ−Ｉ　Ｅ２の発現の 阻害 ＢＰＶ−１で形質転換したＣ１２７細胞を１２ウエルのプレートに播種した。 Ｅ２ＲＥ１によるトランスフェクションの２４時間前に、増殖培地にアンチセン ス　オリゴヌクレオチドを最終濃度５．１５および３０ｍＭで加えて細胞を前処 理した。翌日、リン酸カルシウム沈澱により１０μｇのＥ２ＲＥＩＣＡＴで細胞 をトランスフェクトした。１０μｇのＥ２ＲＥＩＣＡＴおよび１０μｇのキャリ ヤーＤＮＡ　（ＰＵＣ１９）を、最終容量２５０μｌのＨ２Ｏ中で６２μｌの２ ＭＣａＣｌ２と混合し、次に２５０μｌの２ｘＨＢＳＰ　（１，５ｍＭ　Ｎａｚ ＰＯｚ。 １０ｍＭ　ＫＣＩ、２８０ｍＭ　ＮａＣ１，１２ｍＭグルコースおよび５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，０）を加え、室温で３０分間インキュベートした。この溶 液１００μｍをそれぞれのテストウェルに加え、３７℃で４時間インキュベート した。インキュベート後、細胞を、領　７５ｍＭ　ＮａｚＰＯｚ、５ｍＭ　ＫＣ ｌ、１４０ｍＭ　ＮａＣ１，６ｍＭ　グルコースおよび２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ。 ｐＨ７中の１５％のグリセロールを用いて、室温において１分間グリセロールン ヨノクを行った。グリセロールンヨノク後、細胞を血清フリーＤＭＥＭで２回洗 浄し、１０％牛脂児血清および最初の濃度のアンチセンス　オリゴヌクレオチド を含むＤＭＥＭで再び培養した。トランスフェクションから４８時間後に細胞を 回収し、ＣＡＴ活性を分析した。 ＣＡＴ活性の測定のためには、細胞をリン酸緩衝液生理食塩水で２回洗浄し、か き取って集める。細胞を１００．ｃｚｌの、２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ Ｈ８，０に墾濁し、３回の凍結融解により破壊する。各測定には２４μｍの細胞 抽出物を使用する。各測定について、２５μｌの細胞抽出物、５μＩの４ｍＭア セチル　コエンチームＡ、１８μｌの水および１μｌの１４ｃｍクロラムフェニ コール（４０６０ｍＣ１／ｍＭ）をｌ、５ｍｌ工、ｙペンドルフ　チューブ中で 混合し、これを３７℃で１時間インキュベートする。インキュベート後、クロラ ムフェニコール（アセチル化型および非アセチル化型）を酢酸エチルで抽出し、 蒸発乾固させる。サンプルを２５μＩの酢酸エチルに再懸濁し、ＴＬＣプレート にスポットして、クロロフォルム：メタノール（１９：　１）でクロマトグラフ ィーを行う。 ＴＬＣはオートラジオグラフィーにより解析する。アセチル化および非アセチル 化１４Ｃ−クロラムフエニコールに対応するスポットをＴＬＣプレートから切除 し、液体シンチレーションにより計数してＣＡＴ活性を定量する。用量に依存し た様式でＣＡＴ活性を低下させるアンチセンス　オリゴヌクレオチドは陽性であ ると考えられる。 実験例２　アンチセンス　オリゴヌクレオチドによるＨＰＶ　Ｅ２発現の阻害ア ンチセンス　オリゴヌクレオチドによるＨＰＶ　Ｅ２の阻害のアッセイは、本質 的にはＢＰＶ−Ｉ　Ｅ２のアッセイと同一である。ＨＰＶのアッセイにおいては 、上記のリン酸カルシウム法を使用して、適当なＨＰＶｓをＰＳＶ２ＮＥＯと共 に、ＣＶ−１またはＡ４３１細胞にコトランスフエクトする。ＤＮＡを取り込ん だ細胞は、抗生物質Ｇ４１８を含む培地で培養して選択する。次に６４１８耐性 細胞をＨＰＶ　ＤＮＡおよびＲＮＡについて解析する。Ｅ２を発現している細胞 をアンチセンス研究のための標的細胞として使用する。各アンチセンス　オリゴ ヌクレオチドについて、細胞を上記のように前処理し、続いてＥ２ＲＥＩＣＡＴ によりトランスフェクトし、上記のようにＣＡＴ活性を測定する。アンチセンス 　オリゴヌクレオチドは、用量に依存した様式でＣＡＴ活性を低下させた場合に は陽性の効果を有すると考えられる。 実験例３　アンチセンス　オリゴヌクレオチドによるＨＰＶ　Ｅ７発現の阻害Ｈ ＰＶ−１６のＥｌは、ＡｄＥ２ブロモターをトランスフクトベートしうることか 示されている（Ｐｈｅ　Ｉｐｓ、Ｗ、Ｃ，Ｙｅｅ、Ｃ，Ｌ、、Ｍｕｎｇｅｒ。 Ｋ、、　＆　Ｈｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、、”ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ７遺 伝子はアデノウィルスＥＩＡの遺伝子に類似したトランスアクチベーションおよ び形質転換の機能をコードする”、Ｃｅ１ｌ　５３：５３９−５４７）。　この 活性を監視するため、ＡｄＥ２プロモーター（ＡｄＥ２ＣＡ、Ｔ）の制御下のク ロラムフェニコール　トランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドを構築した 。 このアッセイ条件下においては、ＣＡＴ発現はＨＰＶ　Ｅｌの発現に依存してい る。このアッセイのために、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下のＨＰＶ　Ｅｌ を有する細胞株を開発した。各アンチセンス　オリゴヌクレオチドについて、細 胞を上記のように前処理し、続いてＡｄＥ２ＣＡＴでトランスフェクトし、上記 のようにＣＡＴ活性を解析する。 実験例４　アンチセンス　オリゴヌクレオチドによるＢＰＶ−Ｉ　Ｅｌの発現Ｂ ＰＶ−１のＥｌは、ウィルスゲノム複製のレギュレーターであることが示されて いる。ウィルスの複製に対するアンチセンス　オリゴヌクレオチドの効果を調べ るために、成長培地に最終濃度５．１５および３０μＭでオリゴヌクレオチドを 加えることにより、ＢＰＶ−１で感染したＣ１２７細胞をＥ１特異的アンチセン ス　オリゴヌクレオチドで処理する。オリゴヌクレオチドの効果は、Ｅ１特異的 ＲＮＡおよび全ウィルスＲＮＡの定量のための日常的ノザン　プロット解析によ り評価する。さらに、全ゲノムＤＮＡについてのサザンプロットにより、ウィル スゲノムのコピー数に対するアンチセンス　オリゴヌクレオチドの効果を決定す る。 実験例５　実験的に誘導されたウシ繊維腫に対するＢＰＶ−１アンチセンスオリ ゴヌクレオチドの有効性の決定 精製したＢＰＶ−１を上皮に直接感染させることにより、子牛に多数のラン繊維 腫が誘導される。繊維腫が成長した後、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの系で陽性であったオ リゴヌクレオチドおよび対照で繊維腫を処理する。繊維腫の退化を誘導するアン チセンス　オリゴヌクレオチドは陽性であると考えられる。 実験例６　Ｅ２　ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドの設計および合成公開 されたＢＰＶ−１のヌクレオチド配列（Ｃｈｅｎ、Ｅ、Ｙ、、Ｈｏｗｌｅ　ｙ、 Ｐ、　Ｍ、、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、Ａ、Ｄ、、＆　Ｓｅｅｂｕｒｇ、Ｐ。 Ｈｌ、”ランパピローマウィルスタイプ１ゲノムの一次構造および遺伝的構成” 。 Ｎａｔｕｒｅ　２９９：５２９−５３４　（１９８２））、および主要Ｅ２１− ランスアクチベータ−ｍＲＮＡのｃＤＮＡ構造（Ｙａｎｇ、Ｙ、Ｃ９，Ｏｋａｙ ａｍａ、　Ｈ，、Ｈｏｗｌｅｙ、Ｐ、　Ｍ、　、”ウシパピローマウィルスは複 数の形質転換遺伝子を含む”、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 　８２：１０３０−１０３４　（１９８５））に記載されたＥ２　ｍＲＮＡの種 々の領域に相補的なようにアンチセンス　オリゴヌクレオチドを設計した。ＨＰ Ｖ−１１Ｅ２の翻訳開始コドンを標的とするアンチセンス　オリゴヌクレオチド は、公開されたＨＰＶ−１１の配列に基づいて設計した（Ｄａｒｔｍａｎｎ、に 、、Ｓｃｈｗａｒｚ、Ｅ、、Ｇｉｓｓａｍｎｎ、Ｌ、、＆　ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅ ｎ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５１：１２４−１３０（１９８６））。固相法オリゴ チオキシリポヌクレオチド合成は、アブライドバイオシステムダ３８０Ｂ自動Ｄ ＮＡ合成機を用いて行った。ホスホロチオエートオリゴヌクレチドについては、 １ｙｅｒらの記載にしたがって、それぞれのカップリング後にアセトニトリル中 に溶解した０、２Ｍ　３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジ オキシドを用いてサルファ化を行った（Ｉｙｅｒ、Ｒ，Ｐ、、Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ 、Ｌ、Ｒ９゜Ｅｇａｎ、Ｗ、、Ｒｅｇａｎ、Ｊ、＆　Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ、Ｌ 、、”イオウ転移試薬として３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン　１， １−ジオキシドを用いる、イオウ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドの自動合 成”、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、　５５：４６９３−４６９９（１９９０））。完 全なチオ化を確実にするために、成長しつつあるオリゴヌクレオチドをそれぞれ ののサルファ化後キャンプした。合成マトリックスから切断した後、脱保護およ び脱トリチル化したオリゴヌクレオチドを、ＮａＣ１で２回エタノール沈澱し、 水に懸濁した。 オリゴヌクレオチドの濃度は２６０μｍの吸光度により決定した。細胞培養アッ セイにおいて使用するため、オリゴヌクレオチドを慣習的に１００マイクロモル ストックに希釈して、使用するまで一８０’Ｃで凍結保存した。オリゴヌクレオ チド調整物の純度、無傷さ、および量は、Ｍａｎｉａｔｉｓらの記述にしたがっ て調製した２０％アクリルアミド７Ｍ尿素ゲル（４０ｃｍＸ２０ｃｍＸＯ，７５ ｍｍ）における電気泳動により決定した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓ ｃｈ、Ｅ、Ｆ、＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ＋Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８２）ｏ電気泳動し たオリゴヌクレオチドは、ゲル中で”ステインズオール（Ｓｔａｉｎｓ−ａｌｌ 、Ｓｉｇｍａ社、Ｅ−９３７９から購入、１−エチル−２［３−（１−エチルナ フトール［１，２ｄ］−チアゾリン−２−イリデン）−２−メチル−プロペニル しナフトール［１，２ｄ］−チアゾリウム　ブロマイド）”で染色して可視化し た（Ｄａｈｌｂｅｒｇ、Ａ、Ｅ、、Ｄｉｇｍａｎ、Ｃ，Ｗ、＆　Ｐｅａｃｏｃｋ 、Ａ、Ｃ，、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、４１：３９　（１９６９））。 実験例７　分子構築 本研究に使用したＥ２クロラムフェニコール　アセチル　トランスフェラーゼ（ ＣＡＴ）レポータープラスミドは、既に記述されている（Ｓｐａｌｈｏｌｚ。 Ｂ、Ａ、、Ｂｙｒｎｅ、Ｊ、Ｃ，＆Ｈｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、、”ウシパピローマ ウィルス１型のＥ２トランスレギュレーションにおけるＥ２結合部位間の共同作 用の証拠”、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２：３１４３−３１５０　（１９８８））。簡 単には、ＢＰＶ−１のＥ２応答因子であるＥ２ＲＥ１　（ｎｔ、７６１１−７８ ０６）をオリゴヌクレオチドを使用して再構築し、ＳＶ４０エンハンサ−である ５ｐｈ１断片が削除されたｐｓＶ２ｃＡＴにクローニングした。このプラスミド からのＣＡＴの発現は全長のＥ２に依存していることが示されている。プラスミ ドＣ５９はＳ　Ｖ　４０のプロモーターおよびエンハンサ−から発現されるＥ２ 　ｃＤＮＡを含み、他の文献に詳しく叙述されている（Ｙａｎｇ、Ｙ、−Ｃ，、 Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，＆　Ｈｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、、”ウシパピローマウィルス は多数のＢｐｖ−１形質転換遺伝子を含む”　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａ ｄ、Ｓｃ　１ＵＳＡ　８２・１０３０−１０３４　（１９８５）　）。２つのＨ ＰＶ−１１全長Ｅ２発現構築体を作成した。ＴＰＶｌ１５は、ファルマシアから 購入したｐＭＳＧ（カタログ番号２７ｉ５０６）のＳｍａ　１部位にクローニン グされたＨＰＶ−１１のＸｍｎ１断片（ｎｔ２６６５−４９８８）を含む。Ｉ　 ＰＶＩ　１８は、ｐｓＶＬ（ファルマシア、カタログ番号２７−４５０９）のＳ ｍａ　ｒ部位にクローニングされた、同じＨＰＶ−１１のＸｍｎ１断片を含む。 実験例８　細胞株 マウスＣ１２７細胞（Ｄｖｏｒｅｔｚｋｙ、１．５ｃｈｏｂｅｒ、Ｒ，、＆Ｌｏ ｗｙ、Ｄ、、”ウシパピローマウィルス１型についてのマウス細胞のフォーカス アッセイ”、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１０３：３６９−３７５（１９８０））を、１ ０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０ ０μｇ／ｍｌ）およびＬ−グルタミン（４ｍ〜１）を補充したダルベツコ変法イ ーグル培地で増殖させた。■−３８−３８細胞精製したＢＰＶ−１により形質転 換したＣ１２７細胞の単一のフォーカスから誘導した（Ｃｏｗｓｅｒｔ、Ｌ、Ｍ 、Ｌａｋｅ、Ｐ、、＆　Ｊｅｎｓｏｎ、Ａ、Ｂ、、”モノクローナル抗体により 決定されたウシパピローマウィルス１型の局在的形態学的エピトープ、ＪＮＣ１ ７９：１０５３−１０５７　（１９８７））。 実験例９　Ｅ２依存性トランスアクチベーションアッセイのオリゴヌクレオチド 阻害 Ｅ２トランスアクチベーションまたはトランスリプレッションを阻害するオリゴ ヌクレオチドの能力を試験するため、■−３８細胞をトランスフェクションの２ ４時間前に、６０ｍｍペトリディッシュに１ｃｍ２当たりｌＸｌ０’細胞で播種 した。トランスフェクションの１６時間前に培地を吸引し、適当な濃度のオリゴ ヌクレオチドを含む培地で置き換えた。トランスフェクションの１時間前に培地 を吸引し、オリゴヌクレオチドを含まない新鮮な培地で置き換えた。細胞はＧｒ ａｈａｍらの記載にしたがって（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ、Ｌ、＆　ｖａｎｄｅｒＥｂ 。 Ａ、Ｊ、　、”ヒトアデノウィルス５ＤＮＡの感染の分析の新しい方法”、Ｖｉ 。 ］Ｏｇｙ５２・４５６−４６１　（１９７３））、リン酸カルシウム沈澱法によ り、沈殿物１ｍｌ中全量２０μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。それぞれの ６０ｍｍディッノユには、４μｇのＤＮＡを含む２００μｍの沈澱を加えた。沈 澱したＤＮＡを加えてから４時間後、上清を吸引し、細胞を１５％グリセロール で処理した（Ｆｒｏｓｔ、Ｅ、＆　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｊ、、”マーカーレスキ ューによるアデノウィルス　タイプ５の温度感受性の宿主域変異およびマツッピ ング”　、Ｖｉ　ｒｏ　ｌｏｇｙ９１　：　３９−５０　（１９８７）Ｉ：記載 ）。洗浄後、細胞を最初の濃度のオリゴヌクレオチドを含む培地に再び蒔き、４ ８時間インキュベートした。 実験例１０　アンチセンスオリゴヌクレオチドによるフォーカス形成の阻害Ｅ２ トランスアクチベーンヨンを阻害してウィルスのフォーカス形成（形質転換の尺 度）を阻害するアンチセンス　オリゴヌクレオチドの能力を試験した。マウスＣ １２７細胞を６０ｍｍペトリディソンユに準コンフルエント（５Ｘ１０’細胞／ 　ｃ　ｍって播種した。細胞はプレートあたり５０フオ一カス形成単位（ＦＦＵ ）の精製ＢＰＶ−１に感染させるかまたはクローンされたＢＰＶ−Ｉ　ＤＮＡで トランスフェクトした。感染又はトランスフェクションの２４時間後、オリゴヌ クレオチドを培地に加えた。培地は７２時間毎に交換し、交換の度に新鮮なオリ ゴヌクレオチドを培地に加えた。感染から２５日後、細胞をＰＢＳ中の１０％ホ ルマリンで５分間固定し、０．１４％メチレンブルー水溶液で１０分間染色した 。プレートを水で洗浄し、フォーカスを計数した。 Ｅ２トランスアクチベーンヨンを阻害した２つの組成物、ｌ５ＩＳ　１７５１お よびｌ５ＩＳ　１７５３は、Ｃ１２７細胞でのＢＰｖ−１フオーカス形成をも阻 害した（図１７）。 この効果は濃度に依存しており、Ｉｔｓ　１７５３について１０％ＭのＩＣ５ｏ であった。ｌ５ＩＳ　１７５１についての明らかなＩＣｓ。は得られなかったが 、５００−１０００ｎＭの範囲にあるようである。Ｅ２依存トランスアクチベー ションを増加させた［ＳＩＳ　１７５５は、ＢＰＶ−１フオーカス形成に対して は影響がなかった。 実験例１１　ヒトパピローマウィルスＨＰＶ−１１Ｅ２）ランスアクチベーショ ンのアンチセンス　オリゴヌクレオチド阻害得られたＢＰＶの結果に基づき、Ｈ ＰＶ−１１Ｅ２１−ランスアクチベーターｍＲＮＡのＡＵＧ　（翻訳開始）領域 にハイブリダイズする１２ヌクレオチドのホスホロチオエートオリゴヌクレオチ ドｌ５ＩＳ　２１０５を設計した。ＨＰＶ−１１Ｅ２）ランスアクチベーション の阻害のため、Ｃ１２７細胞を培地にオリゴヌクレオチドを添加することにより 前処理した。翌日培地を吸引し、オリゴヌクレオチドを含まない新鮮な培地で置 き換えた。２μｇのＩＰＶ１１８　ＨＰＶ−１１Ｅ２発現プラスミド、２μｇ（ ’）ＩＰＶ１２０−１５　Ｄ２−ＣＡＴレポータープラスミドおよび２μｇのＰ ＣＨＩＩＯを用いて細胞をコトランスフェクトした。トランスフェクンヨン後、 細胞を再びオリゴヌクレオチドで処理し、４８時間培養した。細胞を回収し、Ｃ ＡＴアッセイおよびβ−ガラクトノダーゼアッセイのために処理した。クロラム フェニコール　アセチルトランスフェラーゼ活性は標準的な方法で測定した（Ｇ ｒｏｍａｎ、ｃ、ｍ、、Ｍｏｆｆａｔ、Ｌ、Ｆ。 、＆　Ｈｏｗａｒｄ、Ｂ、Ｈ，、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、２：１０４４− １０５１　（１９８２））。アセチル化および非アセチル化反応生成物を薄層ク ロマトグラフフィーにより分離し、ホスファ−イメージヤ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ、５ｕｎｎｙｖａｌｅ　ＣＡ）を用いて定量した。β−ガ ラクトンダーゼ活性は標準的な方法を用いて測定した（Ｈｅｒｂｏｍｅｌ、　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　３９：６５３　（１９８４））。 実験例１２　ＨＰＶ−１８アンチセンス　オリゴヌクレオチドによるヒト癌細胞 の阻害 化合物　配列　遺伝子　標的領域　配列番号ｌ５ＩＳ　２４９０　ＡＧＣＧＣＧ ＣＣＡＴＡＧＴＡＴＴＧＴＧＧ　Ｅ６　Ｈ１Ｒ開始　８ＩＳＩＳ　２４９１　Ｇ ＴＣＣＡＴＧＣＡＴＡＣＴＴＡＡＴＡＴＴ　Ｅ７　翻訳開始　９ＩＳＩＳ　２４ ９４　ＴＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＡＧＡＴＴＣＴＡＣｆ　ンセ：／　ス対照　１０ 日目に回収し、細胞数を計数した。データはプレート当たりの全細胞数としてプ ロットし、３回の平均をとった。 培養の１０日目までに、２μＭのＴＳＩＳ　２４９１は、ランダム配列の対照オ リゴヌクレオチドで処理した細胞の４５％まで１４８３細胞の成長を減少させた のに対し、５μＭの１５１５　２４９１は１８％まで減少させた。２μＭのｌ５ ＩＳ　２４９０と２μＭのｌ５ｆＳ　２４９１との組み合わせは、１４８３細胞 の成長を対照の３％まで減少させた。オリゴヌクレオチドの組み合わせは、培養 ６日目までに、０４−１細胞を８９％まで減少させた。形態学的な実験は、ＴＳ ＩＳ　２４９０および２４９１のいずれも、成長の減少を除き、単独では１４８ ３細胞の顕著な変化をもたらさなかったのに対し、オリゴヌクレオチドの組み合 わせは、細胞の球状化および接着の喪失をもたらした。これらの結果は、ヒトパ ピローマウィルスを運ぶ癌細胞の成長の制御に対するアンチセンス分子の役割を 支持している。 数多くの特定の態様を記載したが、本発明は以下の請求の範囲にのみ従って限定 される。

【配列表】

配列情報ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　ｌ： （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ：１５ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ （Ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　ｌ：ＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴ　ＴＣＣＴ Ｃ１５配列情報ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２： （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ：１６ （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー・直線状 （ｉｖ）アンチセンス＋　ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２：ＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴ　ＴＣＣＴ ＣＧ　１６配列情報ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３二 （１）配列の特性： （＾）配列の長さ：１７ （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３：ＴＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ ＣＧ　１７配列情報ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４： （ｉ）配列の特性。 （Ａ）配列の長さ＝１８ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４＋ＴＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ ＣＧＴ　１８配列情報ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　５： （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ、１９ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：ＴＴＧＣＴＴＣＣＡＴ　ＣＴＴＣＣ ＴＣＧＴ　１９配列情報ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　６： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：２０ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鏑の数；−重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　６：ＴＴＧＣＴＴＣＣＡＴ　ＣＴＴＣ ＣＴＣＧＴＣ２０配列情報ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　７＋ （ｉ）配列の特性。 （＾）配列の長さ：２０ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｖ）アンチセンス＋　ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　７：ＴＴＧＣＴＴＣＣＡＴ　ＣＴＴＣ ＣＴＣＧＴＣ２０配列情報ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　８： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ　２０ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　８：ＡＧＣＧＣＧＣＣＡＴ’　ＡＧＴ ＡＴＴＧＴＧＧ　２０配列情報ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　９： （ｉ）配列の特性； （Ａ）配列の長さ：２０ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ （ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　９：ＧＴＣＣＡＴＧＣＡＴ　ＡＣＴＴ ＡＡＴＡＴＴ　２０配列情報ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１０：（ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ、２０ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー・直線状 （ｉｖ）アンチセンス：ｎ。 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１０：ＴＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＡＧＡ ＴＴＣＴＡＣ２０特表千７−５０１７０９　（１２） アセチル化（％） ＣＡＴ　（％未処理対照） ＣΔＴ（％未処理対照） ＦＩＧ、１２ 四ＵＴＣこ１７５１　圧田１７５３ −ｒヶ、１４ ＦＩＧ、１５ −ｏ−１７５１−−−１７５３−ｉ−−１７６３オリゴヌクレオチド（ｎＭ） 一轟−１２１０５−Δ−１２３２４ オリゴ濃度（μＭ） 手続補正書 平成　６年　９月３０日−

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．８から５０ヌクレオチドを含み、ヒトパピローマウイルスＥ２トランスアク チベーターｍＲＮＡの翻訳開始領域とハイブリダイズすることができ、かつハイ ブリダイズしたときに前記ｍＲＮＡの機能を阻害するアンチセンスオリゴヌクレ オチド。
2. ２．少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する請求項１ 記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
3. ３．配列番号７を有する請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
4. ４．８から５０ヌクレオチドを含み、ヒトパピローマウイルスＥ６またはＥ７ｍ ＲＮＡの翻訳開始領域とハイブリダイズすることができ、かつハイブリダイズし たときに前記ｍＲＮＡの機能を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
5. ５．少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する請求項４ 記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
6. ６．配列番号８または９を有する請求項４記載のアンチセンスオリゴヌクレオチ ド。
7. ７．ヒトパピローマウイルスを運ぶ癌細胞の成長を制御する方法であって、ヒト パピローマウイルスを運ぶ癌細胞を、請求項４記載のアンチセンスオリゴヌクレ オチドと接触させることを含む方法。
8. ８．ヒトパピローマウイルスを運ぶ癌細胞の成長を制御する方法であって、ヒト パピローマウイルスを運ぶ癌細胞を、請求項５記載のアンチセンスオリゴヌクレ オチドと接触させることを含む方法。
9. ９．ヒトパピローマウイルスを運ぶ癌細胞の成長を制御する方法であって、ヒト パピローマウイルスを運ぶ癌細胞を、請求項６記載のアンチセンスオリゴヌクレ オチドと接触させることを含む方法。