JPH0750032B2 - 溶液中での電気発生のルミネセンスに基づく分析方法 - Google Patents
溶液中での電気発生のルミネセンスに基づく分析方法Info
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- JPH0750032B2 JPH0750032B2 JP6915089A JP6915089A JPH0750032B2 JP H0750032 B2 JPH0750032 B2 JP H0750032B2 JP 6915089 A JP6915089 A JP 6915089A JP 6915089 A JP6915089 A JP 6915089A JP H0750032 B2 JPH0750032 B2 JP H0750032B2
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、水溶液または非水溶液中の発光性化合物が、
直接的には電極からの電子移動によって、あるいは間接
的には電気化学的に誘起される仲介的な反応による電気
パルスによって励起される方法に関する。なお前記化合
物からの発光は励起パルス終了後に検出される。
直接的には電極からの電子移動によって、あるいは間接
的には電気化学的に誘起される仲介的な反応による電気
パルスによって励起される方法に関する。なお前記化合
物からの発光は励起パルス終了後に検出される。
この新規な方法は検出限界が非常に低い分野に用途があ
る。たとえば、イムノアッセイとハイブリッドアッセイ
のようなアッセイを結付けるような分析方法である。
る。たとえば、イムノアッセイとハイブリッドアッセイ
のようなアッセイを結付けるような分析方法である。
［発明が解決しようとする課題］ ルミネセンスに基づくいろいろな分析方法はその感度の
点で知られているが、発光種の濃度が非常に低い点が欠
点である。蛍光の感度は、非特定なバックグラウンド発
光を増加させる蛍光不純物は勿論のことレイリーおよび
ラーマン散乱によって限界がある。燐光は主として固体
状態に限られており溶液状態にあって室温燐光を有する
ごくわずかなこれら化合物の発光は普通極端に酸素に敏
感であるため実用化が阻まれている。ある種のランタニ
ドキレートの遅延蛍光はイムノアッセイの基準として用
いられているが、非常に検出が難しい。従来の蛍光や燐
光に基づく方法は光による励起を用い、適当な光源とオ
プチックスが必要である。化学発光（CL）をに基づくこ
れらの方法は励起用のオプチックスが必要でなく、その
計装は普通大変簡単である。しかし、CL法はしばしば難
しい化学的障害をうけるものである。
点で知られているが、発光種の濃度が非常に低い点が欠
点である。蛍光の感度は、非特定なバックグラウンド発
光を増加させる蛍光不純物は勿論のことレイリーおよび
ラーマン散乱によって限界がある。燐光は主として固体
状態に限られており溶液状態にあって室温燐光を有する
ごくわずかなこれら化合物の発光は普通極端に酸素に敏
感であるため実用化が阻まれている。ある種のランタニ
ドキレートの遅延蛍光はイムノアッセイの基準として用
いられているが、非常に検出が難しい。従来の蛍光や燐
光に基づく方法は光による励起を用い、適当な光源とオ
プチックスが必要である。化学発光（CL）をに基づくこ
れらの方法は励起用のオプチックスが必要でなく、その
計装は普通大変簡単である。しかし、CL法はしばしば難
しい化学的障害をうけるものである。
本発明が示す方法は他の発光法の持つ欠点に打勝つもの
である。励起オプチクスを必要とせず、しかも、電流に
よるパルス励起に必要な電子計装は非常に簡単に製作で
きる。本発明の核心は、寿命のながいルミネセンッスを
有する適当な発光化合物を用い、そして励起パルスから
しばらく遅延して発する光を測定することによって非特
定性のバックグラウンド発光を全面的に消去する事であ
る。
である。励起オプチクスを必要とせず、しかも、電流に
よるパルス励起に必要な電子計装は非常に簡単に製作で
きる。本発明の核心は、寿命のながいルミネセンッスを
有する適当な発光化合物を用い、そして励起パルスから
しばらく遅延して発する光を測定することによって非特
定性のバックグラウンド発光を全面的に消去する事であ
る。
［従来の技術］ 電気による化学発光（ECL）は、古くから知られてい
る。この方法のイムノアッセイに対する応用はバードな
どによって既に提案されている（D.Ege,W.Becker and
A.Bard,Anal.Chem.56（1984）2413,PCT Int.Appl.wo 86
/02734）．彼等はアッセイを結合するさいに標識として
ルテニウムまたはオスミウムを含有する化合物を使用す
ることを提案している。白金とガラス状炭素を実施例で
の電極の材料に使用し、この電極からの発光をポテンシ
ャルパルスの段階において測定する。
る。この方法のイムノアッセイに対する応用はバードな
どによって既に提案されている（D.Ege,W.Becker and
A.Bard,Anal.Chem.56（1984）2413,PCT Int.Appl.wo 86
/02734）．彼等はアッセイを結合するさいに標識として
ルテニウムまたはオスミウムを含有する化合物を使用す
ることを提案している。白金とガラス状炭素を実施例で
の電極の材料に使用し、この電極からの発光をポテンシ
ャルパルスの段階において測定する。
われわれがすでに発表したように電気で発生するルミネ
センスは、酸化物で覆われたアルミニウムまたはタンタ
ル電極から適当な酸化剤の存在下で多数の無機イオンに
よって発生する。［ケー、ハパッカなど（K.Haapakket
al.）によるAnal.Chim.Acta.171（1985）259］。これら
の研究においても、電極からの発光は電極にポテンシャ
ルパルスを与えているときに測定している。
センスは、酸化物で覆われたアルミニウムまたはタンタ
ル電極から適当な酸化剤の存在下で多数の無機イオンに
よって発生する。［ケー、ハパッカなど（K.Haapakket
al.）によるAnal.Chim.Acta.171（1985）259］。これら
の研究においても、電極からの発光は電極にポテンシャ
ルパルスを与えているときに測定している。
経済的で優先的に廃棄可能な電極を用い、比較的妨害の
少ない寿命のながいルミネセンスを有する化合物を使用
する方法が非常に有利であると思われる。このような方
法によれば、たとえば可成り単純で経済的な計装置でホ
モジニアスなイムノアッセイとヘテロジニアスなイムノ
アッセイとを結合するという用途があるであろう。イム
ノアッセイの場合または、もっと一般的な組合わされた
アッセイの場合、二つの成分がたがいに特定的に反応
し、生成物を適切な高感度の方法で定量する。測定する
まえに生成物を分離することが必要ならば、その方法は
ヘテロジニアスと呼ばれ、分離ステップが不必要ならば
ホモジニアスな方法と呼ばれる。簡単だという理由でホ
モジニアスなアッセイが好ましい。そしてヘテロジニア
スなアッセイは検出限界が低い。典型的には、これらの
方法の場合、ある化合物の存在は、それに対して高感度
物質たとえば放射性同位元素、酵素、蛍光性化合物な
ど、定量できる化学的成分で標識することによって示さ
れる。励起状態の発光減衰が緩慢である蛍光性化合物で
標識するのが特に有利である。イムノアッセイする大半
のサンプルは天然の蛍光性の種を含有しており、そのた
めバックグラウンド発光が増加して従来の蛍光測定の検
出限界を阻害するのである。
少ない寿命のながいルミネセンスを有する化合物を使用
する方法が非常に有利であると思われる。このような方
法によれば、たとえば可成り単純で経済的な計装置でホ
モジニアスなイムノアッセイとヘテロジニアスなイムノ
アッセイとを結合するという用途があるであろう。イム
ノアッセイの場合または、もっと一般的な組合わされた
アッセイの場合、二つの成分がたがいに特定的に反応
し、生成物を適切な高感度の方法で定量する。測定する
まえに生成物を分離することが必要ならば、その方法は
ヘテロジニアスと呼ばれ、分離ステップが不必要ならば
ホモジニアスな方法と呼ばれる。簡単だという理由でホ
モジニアスなアッセイが好ましい。そしてヘテロジニア
スなアッセイは検出限界が低い。典型的には、これらの
方法の場合、ある化合物の存在は、それに対して高感度
物質たとえば放射性同位元素、酵素、蛍光性化合物な
ど、定量できる化学的成分で標識することによって示さ
れる。励起状態の発光減衰が緩慢である蛍光性化合物で
標識するのが特に有利である。イムノアッセイする大半
のサンプルは天然の蛍光性の種を含有しており、そのた
めバックグラウンド発光が増加して従来の蛍光測定の検
出限界を阻害するのである。
ユーロピウムおよびテルビウムのキレートはその蛍光発
光の寿命がミリセカンドの範囲にあり、生物起源の有機
化合物の「自然」蛍光にくらべて数オーダー長い。
光の寿命がミリセカンドの範囲にあり、生物起源の有機
化合物の「自然」蛍光にくらべて数オーダー長い。
ルミネセンスに基づくホモジニアスアッセイは、表面に
吸着した抗体−抗原コンプレックスが溶液中の標識した
化合物を励起することなく、そして選択的に励起がるこ
とができるならば可能である。このことはすでに（米国
特許第3,939,350号1976年にて）石英スライドに結合し
た抗体に結合した標識した抗原を用いることによって達
成されている。試料はスライド表面から全面的に光を反
射しながら別の側から励起される。測定の際には、固相
結合部分だけが励起されるので分離段階は不要となる。
この方法では試料のスライドに厳密な光学的要件が必要
なので通常のアッセイには使用上限界がある。さらに散
乱およびバックグラウンド蛍光が難しい問題を残してい
る。表面またはそのすぐ隣の発光性物質を優先的に励起
することは電気によるルミネセンスにより技術的にさら
に容易に達成できる。
吸着した抗体−抗原コンプレックスが溶液中の標識した
化合物を励起することなく、そして選択的に励起がるこ
とができるならば可能である。このことはすでに（米国
特許第3,939,350号1976年にて）石英スライドに結合し
た抗体に結合した標識した抗原を用いることによって達
成されている。試料はスライド表面から全面的に光を反
射しながら別の側から励起される。測定の際には、固相
結合部分だけが励起されるので分離段階は不要となる。
この方法では試料のスライドに厳密な光学的要件が必要
なので通常のアッセイには使用上限界がある。さらに散
乱およびバックグラウンド蛍光が難しい問題を残してい
る。表面またはそのすぐ隣の発光性物質を優先的に励起
することは電気によるルミネセンスにより技術的にさら
に容易に達成できる。
［課題を解決するための手段］ 本発明はテルビウムまたはユーロピウムを含有した化学
的部分を溶質とする溶液に浸漬した電極中にそして／又
は電極の表面に電気パルスを加えることにより、さらに
同パルスをくわえてから暫くした後の遅延発光を測定す
ることにより、テルビウムまたはユーロピウムを含有し
た化学的部分の存在および／又は量を測定する方法に関
するものである。測定した発光は電極の近傍に存在する
化学的部分の量を示すものと考えられる。この測定現象
をここでは遅延電気ルミネセンス、略してDELと名づけ
る。
的部分を溶質とする溶液に浸漬した電極中にそして／又
は電極の表面に電気パルスを加えることにより、さらに
同パルスをくわえてから暫くした後の遅延発光を測定す
ることにより、テルビウムまたはユーロピウムを含有し
た化学的部分の存在および／又は量を測定する方法に関
するものである。測定した発光は電極の近傍に存在する
化学的部分の量を示すものと考えられる。この測定現象
をここでは遅延電気ルミネセンス、略してDELと名づけ
る。
前記化学的部部分の一般式は （Ｍ−Ｚ）ｎ−Lm−Yp である。ただしＭはテルビウムまたはユーロピウムであ
り、ｎは１以上の整数であり、ｍとｐは０以上の整数で
あり、Ｚは多歯状の配位子であり、Ｌは結合基である。
Ｙについては後述する。Z,LおよびＹは、遅延電気ルミ
ネセンスが必要とする条件に合せた場合、化学的部分を
発光させることのできる組成物である。
り、ｎは１以上の整数であり、ｍとｐは０以上の整数で
あり、Ｚは多歯状の配位子であり、Ｌは結合基である。
Ｙについては後述する。Z,LおよびＹは、遅延電気ルミ
ネセンスが必要とする条件に合せた場合、化学的部分を
発光させることのできる組成物である。
最も簡単な例では、ｍとｐは共に０で、ｎは１である。
この場合、Ｍ−Ｚはテルビウムまたはユーロピウムのキ
レートである。Ｚの好ましい一つの構造は次の通りであ
る。
この場合、Ｍ−Ｚはテルビウムまたはユーロピウムのキ
レートである。Ｚの好ましい一つの構造は次の通りであ
る。
本方法はたとえば実施例１に述べるようにテルビウムの
高感度定量に利用できる。
高感度定量に利用できる。
もっと複雑な場合には、n,m≧１でありｐ≧１である。
物質ＹはDEL標識で標識できると言われる。適切な物質
Ｙのなかには沢山の生物的物質、たとえば全細胞、亜細
胞粒子、ウイルス、核酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレ
オチド、ポリヌクレオチド、多糖、蛋白、ポリペプチ
ド、酵素、細胞代謝産物、ホルモン、薬理学的物質、ア
ルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、炭水化
物、血清誘導抗体またはモノクロナール抗体がある。合
成物質、たとえば薬剤、合成核酸、合成ポリペプチドも
また本発明の範囲に含まれる。物質Ｙは結合基Ｌによっ
てキレートＭ−Ｚに結合する。結合基は２価のラヂカル
でよく普通、当業者には周知のようにプローブ分子によ
って分析する分子に標識するのに使用されるものであ
る。これら２価の結合基のなかには、−CONH−，−CONM
e−のようなウレイド、チオウレイド、アミド；−Ｓ
−，−Ｓ−Ｓ−のようなチオエーテル；−SO2NH−，−S
O2NMe−のようなスルホアミドが含まれている。結合基
Ｌもまた長さと組成が変化するスペーサーと呼ばれる分
子鎖を含んでいる。このスペーサーはキレート部と物質
Ｙとをたがいに適当な距離に離しておくのに使用され、
しかもそれは前述の２価の結合基を側基として有してい
る。これら側基の一部分は多歯状の配位子Ｚに結合し、
他部分は物質Ｙに結合する。多歯状の配位子Ｚは−CH2N
（CH2COOH）２のようなキレート化用側基を有する芳香
属化合物であってもよい。好ましい一つのキレートの構
造は次の通りである； 本発明は問題とする標識した部分を測定するのに使用で
き、問題とする分析物を測定するために標識した部分を
利用するのに使用でき、あるいは競合結合アッセイおよ
び非競合結合アッセイのいずれの場合においても問題と
する分析物を測定するために問題の分析物の標識した類
似物を利用するのに使用できる。またこれら結合アッセ
イはヘテロジニアスかあるいはホモジニアスである。ま
た類似の結合アッセイは核酸ハイブリッド形成技術に利
用でき、この場合たとえば採取およびPCR（重合酵素連
鎖反応:polymerase chain reaction）技術に基づく親和
性を用いたハイブリッド形成アッセイとともにドット・
ブロット（dot−blot）およびサンドイッチハイブリッ
ド形成アッセイのような用途がある。
物質ＹはDEL標識で標識できると言われる。適切な物質
Ｙのなかには沢山の生物的物質、たとえば全細胞、亜細
胞粒子、ウイルス、核酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレ
オチド、ポリヌクレオチド、多糖、蛋白、ポリペプチ
ド、酵素、細胞代謝産物、ホルモン、薬理学的物質、ア
ルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、炭水化
物、血清誘導抗体またはモノクロナール抗体がある。合
成物質、たとえば薬剤、合成核酸、合成ポリペプチドも
また本発明の範囲に含まれる。物質Ｙは結合基Ｌによっ
てキレートＭ−Ｚに結合する。結合基は２価のラヂカル
でよく普通、当業者には周知のようにプローブ分子によ
って分析する分子に標識するのに使用されるものであ
る。これら２価の結合基のなかには、−CONH−，−CONM
e−のようなウレイド、チオウレイド、アミド；−Ｓ
−，−Ｓ−Ｓ−のようなチオエーテル；−SO2NH−，−S
O2NMe−のようなスルホアミドが含まれている。結合基
Ｌもまた長さと組成が変化するスペーサーと呼ばれる分
子鎖を含んでいる。このスペーサーはキレート部と物質
Ｙとをたがいに適当な距離に離しておくのに使用され、
しかもそれは前述の２価の結合基を側基として有してい
る。これら側基の一部分は多歯状の配位子Ｚに結合し、
他部分は物質Ｙに結合する。多歯状の配位子Ｚは−CH2N
（CH2COOH）２のようなキレート化用側基を有する芳香
属化合物であってもよい。好ましい一つのキレートの構
造は次の通りである； 本発明は問題とする標識した部分を測定するのに使用で
き、問題とする分析物を測定するために標識した部分を
利用するのに使用でき、あるいは競合結合アッセイおよ
び非競合結合アッセイのいずれの場合においても問題と
する分析物を測定するために問題の分析物の標識した類
似物を利用するのに使用できる。またこれら結合アッセ
イはヘテロジニアスかあるいはホモジニアスである。ま
た類似の結合アッセイは核酸ハイブリッド形成技術に利
用でき、この場合たとえば採取およびPCR（重合酵素連
鎖反応:polymerase chain reaction）技術に基づく親和
性を用いたハイブリッド形成アッセイとともにドット・
ブロット（dot−blot）およびサンドイッチハイブリッ
ド形成アッセイのような用途がある。
たとえば、競合イムノアッセイにおいて抗体を電極の表
面に被覆すると抗原とDEL標識を有する抗原とが抗体の
活性部位に対して競争する。さて抗原は物質Ｙに対応し
そして前述したタイプのうちの一つに属することができ
る。電極表面上の抗体・抗原コンプレックスの量はDEL
によって、免疫反応後に直接定量するか、あるいは洗浄
を行いそして例えば過酸化二硫酸塩を含有した適当な電
解質溶液を添加してから定量する。さもなければ、ホモ
ジニアス非競合イムノアッセイを、電極表面の『捕獲用
（catching）』抗体を固定化することによって行うこと
ができる。こうした抗体で捕獲した試料抗原は、抗原の
別の場所に結合したDEL標識した抗体を用いて定量す
る。この場合の抗原は、Ｙの定義に関連して前記に掲げ
た物質である。
面に被覆すると抗原とDEL標識を有する抗原とが抗体の
活性部位に対して競争する。さて抗原は物質Ｙに対応し
そして前述したタイプのうちの一つに属することができ
る。電極表面上の抗体・抗原コンプレックスの量はDEL
によって、免疫反応後に直接定量するか、あるいは洗浄
を行いそして例えば過酸化二硫酸塩を含有した適当な電
解質溶液を添加してから定量する。さもなければ、ホモ
ジニアス非競合イムノアッセイを、電極表面の『捕獲用
（catching）』抗体を固定化することによって行うこと
ができる。こうした抗体で捕獲した試料抗原は、抗原の
別の場所に結合したDEL標識した抗体を用いて定量す
る。この場合の抗原は、Ｙの定義に関連して前記に掲げ
た物質である。
A.装置 装置について特許請求はしていないが、本測定方法につ
いて明確なイメージを与えるためその詳細な説明を行
う。
いて明確なイメージを与えるためその詳細な説明を行
う。
本測定装置はパルス発生器、定電位装置、二または三ケ
の電極を有する試料セル、オプションの光のフィルター
またはモノクロメーター、光検出器およびゲーティドイ
ンテグレター又は光子カウンターから構成されている。
パルス発生器は、振幅が調節でき自由にプログラムでき
るパルス鎖を発生するものなら何でもよい。
の電極を有する試料セル、オプションの光のフィルター
またはモノクロメーター、光検出器およびゲーティドイ
ンテグレター又は光子カウンターから構成されている。
パルス発生器は、振幅が調節でき自由にプログラムでき
るパルス鎖を発生するものなら何でもよい。
定電位装置は普通の三電極定電位装置がよいが、もし二
電極のものしか使えない場合には数十ミリアンペアの電
流を流すことのできるブースタ増幅器を用いる。
電極のものしか使えない場合には数十ミリアンペアの電
流を流すことのできるブースタ増幅器を用いる。
試料セルと光検出器は同一の光遮断箱に収納されてい
る。セルには電解溶液に浸漬した二または三ケの電極が
ある。三電極の場合は一つの電極は参照電極で、一つの
電極は補助電極で、いま一つの電極は作動電極である。
これらの電極は普通の方法で定電位装置に接続してあ
る。発光は導電性材料で出来ている作動電極で測定す
る。好ましい材料としては酸化物で覆われた金属たとえ
ばアルミニウム、タンタル、ジルコニウムまたはハフニ
ウムである。参照電極は普通の電極たとえばカロメル電
極またはAg−AgCl電極でよい。補助電極は導電性材料な
ら何んでもよいが普通は白金を使用する。もし二電極だ
けを使用する場合には電極は同一材料たとえばアルミニ
ウムで作ってもよく、この場合には光は両電極から発す
ることができる。あるいは一方の電極を別の材料でつく
る。さもなければ、試料用コップ自体をアルミニウムで
つくってよく、その場合にはそれは作動電極として機能
し光はそこから発光する。
る。セルには電解溶液に浸漬した二または三ケの電極が
ある。三電極の場合は一つの電極は参照電極で、一つの
電極は補助電極で、いま一つの電極は作動電極である。
これらの電極は普通の方法で定電位装置に接続してあ
る。発光は導電性材料で出来ている作動電極で測定す
る。好ましい材料としては酸化物で覆われた金属たとえ
ばアルミニウム、タンタル、ジルコニウムまたはハフニ
ウムである。参照電極は普通の電極たとえばカロメル電
極またはAg−AgCl電極でよい。補助電極は導電性材料な
ら何んでもよいが普通は白金を使用する。もし二電極だ
けを使用する場合には電極は同一材料たとえばアルミニ
ウムで作ってもよく、この場合には光は両電極から発す
ることができる。あるいは一方の電極を別の材料でつく
る。さもなければ、試料用コップ自体をアルミニウムで
つくってよく、その場合にはそれは作動電極として機能
し光はそこから発光する。
作動電極からの光の強さを、光電子増倍管または中間に
オプチオンのフィルターまたはモノクロメーターを持っ
たフォトダイオードを用いて測定し、光検出器からの電
気信号をゲーティド・インテグレターまたはゲーティド
光子カウンターへ伝える。ゲーティングは適当な遅れを
もってパルス・ゼネレーターからのパルスに同期化す
る。
オプチオンのフィルターまたはモノクロメーターを持っ
たフォトダイオードを用いて測定し、光検出器からの電
気信号をゲーティド・インテグレターまたはゲーティド
光子カウンターへ伝える。ゲーティングは適当な遅れを
もってパルス・ゼネレーターからのパルスに同期化す
る。
B.方法 DELを測定する試料は溶液に溶解した化合物かあるいは
作動電極の表面に吸着した化合物である。その化合物の
エレクトロルミネセンスの減衰は緩慢でなければならな
い。優先的化合物は発光ランタニドコンプレックスであ
り、好ましくはたとえばTb3+またはEu3+のキレートであ
ってその減衰はミリセカンドの時間スケールである。こ
の化合物はそれ自体でも測定できるが、標識としてアッ
セイすべき材料に結合することもできる。測定すべき化
合物の外に、試料セル中の電解溶液には或る電解質が含
まれているが、好ましくは導電度を増加する硫酸塩かあ
るいは酢酸塩を用いる。過酸化二硫酸塩、過酸化水素ま
たは溶存酸素のような酸化剤が溶液中に存在してもよ
い。酸化剤の機能は直接または媒介された電解還元反
応、たとえば、 S2O8 2-＋ｅ−SO4 2-＋SO4 - によって反応性に富んだイオン基を生成することであ
る。
作動電極の表面に吸着した化合物である。その化合物の
エレクトロルミネセンスの減衰は緩慢でなければならな
い。優先的化合物は発光ランタニドコンプレックスであ
り、好ましくはたとえばTb3+またはEu3+のキレートであ
ってその減衰はミリセカンドの時間スケールである。こ
の化合物はそれ自体でも測定できるが、標識としてアッ
セイすべき材料に結合することもできる。測定すべき化
合物の外に、試料セル中の電解溶液には或る電解質が含
まれているが、好ましくは導電度を増加する硫酸塩かあ
るいは酢酸塩を用いる。過酸化二硫酸塩、過酸化水素ま
たは溶存酸素のような酸化剤が溶液中に存在してもよ
い。酸化剤の機能は直接または媒介された電解還元反
応、たとえば、 S2O8 2-＋ｅ−SO4 2-＋SO4 - によって反応性に富んだイオン基を生成することであ
る。
これらのイオン基は発光化合物と反応して発光する。そ
の結果、作動電極にたいし陰極パルスが与えられた後、
エレクトロルミネセンスが観察される。陽極パルスはあ
る種のランタニド化合物に対して使用できる可能性があ
る。
の結果、作動電極にたいし陰極パルスが与えられた後、
エレクトロルミネセンスが観察される。陽極パルスはあ
る種のランタニド化合物に対して使用できる可能性があ
る。
発光化合物によって適当な持続性と衝撃係数を有する一
連の陰極パルスを作動電極に与える。その結果生じた発
光は適当なゲートの幅と遅れを用いて陰極パルス終了後
に測定する。好ましいテルビウム・コンプレクッスの場
合、陰極パルスの長さは0.2msないし5msの範囲を変動
し、パルス後の遅延は0.1msないし0.5msであり、そして
ゲート幅は2msないし10msである。ユーロピウム・コン
プレックスの場合は、約４倍短い。オープン・ゲート時
間中に集積した信号は、所要な信号対ノイズ比を達成す
るに必要な期間を対象に平均する。
連の陰極パルスを作動電極に与える。その結果生じた発
光は適当なゲートの幅と遅れを用いて陰極パルス終了後
に測定する。好ましいテルビウム・コンプレクッスの場
合、陰極パルスの長さは0.2msないし5msの範囲を変動
し、パルス後の遅延は0.1msないし0.5msであり、そして
ゲート幅は2msないし10msである。ユーロピウム・コン
プレックスの場合は、約４倍短い。オープン・ゲート時
間中に集積した信号は、所要な信号対ノイズ比を達成す
るに必要な期間を対象に平均する。
［実施例］ 実施例 Ｉ エレクトロルミネセンスによるテルビウムに対する標準
曲線 本例における試料溶液は、硫酸ナトリウムの0.3M溶液、
過酸化二硫酸カリウムの0.001M溶液および3,6−ビス−
［N,N−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］−４
−ベンゾイルフェノールの10-5M溶液であ、そしてそのp
Hを５×10-4のトリス（Tris）とNaOHによって11.2に調
整する。DELの測定は厚さ0.3mmで純度99.9％のアルミニ
ウム製の使い捨てコップ中で行った。塩化テルビウムの
添加量を増加させながら加え、そして遅延エレクトロル
ミネセンスを、連続時間1ms,振幅8.5V,衝撃係数４％の
陰極パルスを使って測定した。アルミニウムコップから
発した光を光電子増倍管と２チャンネル光子カウンター
［スタンダードリサーチ（Standard Research）製モデ
ルSR400］で測定した。一つのチャンネルのゲートは陰
極パルス終了後0.2msないし10ms開いており、そして他
のチャンネルは10.2msないし20msのあいだ『暗流』光子
をカウントした。100sカウントした後に２台のカウンタ
ーレジスターの値を相互に差引いた。表１と第１図はそ
の結果である。
曲線 本例における試料溶液は、硫酸ナトリウムの0.3M溶液、
過酸化二硫酸カリウムの0.001M溶液および3,6−ビス−
［N,N−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］−４
−ベンゾイルフェノールの10-5M溶液であ、そしてそのp
Hを５×10-4のトリス（Tris）とNaOHによって11.2に調
整する。DELの測定は厚さ0.3mmで純度99.9％のアルミニ
ウム製の使い捨てコップ中で行った。塩化テルビウムの
添加量を増加させながら加え、そして遅延エレクトロル
ミネセンスを、連続時間1ms,振幅8.5V,衝撃係数４％の
陰極パルスを使って測定した。アルミニウムコップから
発した光を光電子増倍管と２チャンネル光子カウンター
［スタンダードリサーチ（Standard Research）製モデ
ルSR400］で測定した。一つのチャンネルのゲートは陰
極パルス終了後0.2msないし10ms開いており、そして他
のチャンネルは10.2msないし20msのあいだ『暗流』光子
をカウントした。100sカウントした後に２台のカウンタ
ーレジスターの値を相互に差引いた。表１と第１図はそ
の結果である。
実施例 II 指標化用化合物の製造 ４−（３−ニトロベンゾイル）−2,6−ビス［N,N−ビス
（メトキシカルボニルメチル）アミノメチル］フェノー
ル（１）の合成 メタノール（20mL）中に37％のホルムアルデヒド水溶液
（0.81g,10mmol）を溶かした溶液に、ジメチルイミノジ
アセテート（1.61g,10mmol）を加えた。得られた溶液を
真空中で濃縮した。別に用意したメタノール（25ml）を
残渣に加え、得られた溶液を真空中で濃縮した。残部に
対し４−ヒドロキシ−３′−ニトロベンゾフェノン（1.
22g,5mmol）を加え、得られた混合物を攪拌しながら110
℃で20時間加熱した。生成物は溶離液にクロロホルムを
使用しシリカゲルでクロマトグラフィーにより精製し
た。帯黄色のオイルの収量は1.76g（60％）であった。1
H NMR（CDC13）：δ3.48（1H,S）,3.58（8H,S）,3.71
（12H,S）4.08（4H,S）,7.73（2H,S）,7.56−8.58（4H,
m）。
（メトキシカルボニルメチル）アミノメチル］フェノー
ル（１）の合成 メタノール（20mL）中に37％のホルムアルデヒド水溶液
（0.81g,10mmol）を溶かした溶液に、ジメチルイミノジ
アセテート（1.61g,10mmol）を加えた。得られた溶液を
真空中で濃縮した。別に用意したメタノール（25ml）を
残渣に加え、得られた溶液を真空中で濃縮した。残部に
対し４−ヒドロキシ−３′−ニトロベンゾフェノン（1.
22g,5mmol）を加え、得られた混合物を攪拌しながら110
℃で20時間加熱した。生成物は溶離液にクロロホルムを
使用しシリカゲルでクロマトグラフィーにより精製し
た。帯黄色のオイルの収量は1.76g（60％）であった。1
H NMR（CDC13）：δ3.48（1H,S）,3.58（8H,S）,3.71
（12H,S）4.08（4H,S）,7.73（2H,S）,7.56−8.58（4H,
m）。
４−（３−アルミノベンゾイル）−2,6−ビス［N,N−ビ
ス（メトキシカルボニルメチル）アミノメチル］フエノ
ール（２）の合成 化合物１（0.89g,1.5mmol）を圧力50psi（3.52kg/cm）
の水素雰囲気下で10％のPd/c（90mg）を加えたメタノー
ル（50mL）中で１時間攪拌した。得られた混合物を過
し真空中で蒸発した。生成物を、溶離液として軽油（b.
p.50−70℃）／酢酸エチル（2:5）を使用しシリカゲル
でクロマトグラフィーにより精製した。帯黄色のオイル
の収量は0.40g（48％）であった。1H NMR（CDC13）:K3.
56,（1H,S）3.59（8H,S）,3.71（12H,S）,4.01（6H,ブ
ロードＳ）,7.05−7.14（4H,m）,7.70（2H,S）。
ス（メトキシカルボニルメチル）アミノメチル］フエノ
ール（２）の合成 化合物１（0.89g,1.5mmol）を圧力50psi（3.52kg/cm）
の水素雰囲気下で10％のPd/c（90mg）を加えたメタノー
ル（50mL）中で１時間攪拌した。得られた混合物を過
し真空中で蒸発した。生成物を、溶離液として軽油（b.
p.50−70℃）／酢酸エチル（2:5）を使用しシリカゲル
でクロマトグラフィーにより精製した。帯黄色のオイル
の収量は0.40g（48％）であった。1H NMR（CDC13）:K3.
56,（1H,S）3.59（8H,S）,3.71（12H,S）,4.01（6H,ブ
ロードＳ）,7.05−7.14（4H,m）,7.70（2H,S）。
４−（３−イソチオシアネートベンゾイル）−2,6−ビ
ス［N,N−ビス（カルボキシルメチル）アミノメチル］
フェノールのテルビウムコンプレックス（３）の合成 化合物（２）（0.40g,0.71mmol）を0.5MのKOH−エタノ
ール（20mL）と水（5mL）の溶液中で３時間攪拌した。
得られた混合物を1MのHClで中和し真空中で蒸発した。
水（15mL）と塩化テルビウム（0.27g,0.72mmol）を加
え、pHを8.0に調節してから混合物を過した。液に
数ミリリットルのアセトンを添加、テルビウムコンプレ
ックスを別した。水（3mL）中にある本コンプレック
スの小部分（68mg）を、CHC13中にあるチオホスゲン（3
1μL,0.4mmol）とNaHCO3（42mg,0.5mmol）の混合物に対
して滴下した。１時間攪拌後、水層を分離しCHC13で洗
浄した。数ミリリットルのアセトンを加えた後、析出物
を別し、溶離液としてCH3CN/H2O（4:1）を用い、シリ
カゲルでクロマトグラフィーによって精製した。収量は
15mg［38％；（２）を基準として］であった。
ス［N,N−ビス（カルボキシルメチル）アミノメチル］
フェノールのテルビウムコンプレックス（３）の合成 化合物（２）（0.40g,0.71mmol）を0.5MのKOH−エタノ
ール（20mL）と水（5mL）の溶液中で３時間攪拌した。
得られた混合物を1MのHClで中和し真空中で蒸発した。
水（15mL）と塩化テルビウム（0.27g,0.72mmol）を加
え、pHを8.0に調節してから混合物を過した。液に
数ミリリットルのアセトンを添加、テルビウムコンプレ
ックスを別した。水（3mL）中にある本コンプレック
スの小部分（68mg）を、CHC13中にあるチオホスゲン（3
1μL,0.4mmol）とNaHCO3（42mg,0.5mmol）の混合物に対
して滴下した。１時間攪拌後、水層を分離しCHC13で洗
浄した。数ミリリットルのアセトンを加えた後、析出物
を別し、溶離液としてCH3CN/H2O（4:1）を用い、シリ
カゲルでクロマトグラフィーによって精製した。収量は
15mg［38％；（２）を基準として］であった。
実施例 III ヒトのパンクレアチンホスホリバーゼA2のヘテロジニア
スサンドイッチイムノアッセイ ヒツジ−抗−ヒトPLA2抗血清の標識化:4−（３−イソチ
オシアネートベンゾイル）−2,6−ビス［N,N−ビス（カ
ルボキシメチル）−アミノメチル］フェノールのテルビ
ウムコンプレックス［実施例IIの（３）］を60倍モル過
剰にして抗体とpH9.5で一晩反応させた。標識した抗体
を、セファデックス（Sephadex）Ｇ−50（１×5.5cm）
とセファローズ（Sepharose）6B（１×5.2cm）を充填し
たカラムにて溶離液として9g/LのNaClと0.05％のNaN3を
含有するpH9.3の0.1Mの炭酸ナトリウム緩衝液を使用し
て過剰な遊離テルビウムコンプレックスから分離した。
スサンドイッチイムノアッセイ ヒツジ−抗−ヒトPLA2抗血清の標識化:4−（３−イソチ
オシアネートベンゾイル）−2,6−ビス［N,N−ビス（カ
ルボキシメチル）−アミノメチル］フェノールのテルビ
ウムコンプレックス［実施例IIの（３）］を60倍モル過
剰にして抗体とpH9.5で一晩反応させた。標識した抗体
を、セファデックス（Sephadex）Ｇ−50（１×5.5cm）
とセファローズ（Sepharose）6B（１×5.2cm）を充填し
たカラムにて溶離液として9g/LのNaClと0.05％のNaN3を
含有するpH9.3の0.1Mの炭酸ナトリウム緩衝液を使用し
て過剰な遊離テルビウムコンプレックスから分離した。
アルミニウムコップの被覆： アルミニウムコップ（厚さ0.3mm純度99.9％のアルミニ
ウム箔製）を、9g/LのNaClと0.05％のNaN3（TSA−緩衝
液）を含有したpH7.5の0.5MのTris−HCl緩衝液中で室温
で一晩物理的に吸着させることによって抗−ヒトPLA2抗
血清で被覆した。被覆後アルミニウムコップを洗浄液
（9g/LのNaCl,0.01％のNaN3及び0.2g/LのTween20）で洗
い、そして0,1％のウシ血清アルブミン（BSA）で一晩飽
和し、そして＋４℃で湿潤状態に保存した。
ウム箔製）を、9g/LのNaClと0.05％のNaN3（TSA−緩衝
液）を含有したpH7.5の0.5MのTris−HCl緩衝液中で室温
で一晩物理的に吸着させることによって抗−ヒトPLA2抗
血清で被覆した。被覆後アルミニウムコップを洗浄液
（9g/LのNaCl,0.01％のNaN3及び0.2g/LのTween20）で洗
い、そして0,1％のウシ血清アルブミン（BSA）で一晩飽
和し、そして＋４℃で湿潤状態に保存した。
イムノアッセイ： アルミニウムコップを一回500μＬの洗浄液で洗浄し
た。TSA−緩衝液（0.1％のBSA）中の0,9,54および324ng
/mLのホスホリパーゼA2を含有した25μＬの標準を前記
コップに加え、次いで5g/LのBSA,0.5g/LのNaN3を含有し
たpH7.8で0.05MのTris−H2SO4緩衝液中の175μＬのTbで
標識した抗−PLA2抗体（570ng/mL）を加えた。連続的に
振とうしながら３時間温置した後、コップを６回洗浄液
で洗った。カウンティング時間が僅か３秒であった点は
別として、実施例Ｉのように0.3mol/LのNa2SO4と0.001m
ol/LのK2S2O8を含有したpH8.7である450μＬの0.001Mの
Tris−H2SO4緩衝液を加えた後にコップの中でエレクト
ロルミネセンスを測定した。アッセイの結果は表２と第
２図に示してある。
た。TSA−緩衝液（0.1％のBSA）中の0,9,54および324ng
/mLのホスホリパーゼA2を含有した25μＬの標準を前記
コップに加え、次いで5g/LのBSA,0.5g/LのNaN3を含有し
たpH7.8で0.05MのTris−H2SO4緩衝液中の175μＬのTbで
標識した抗−PLA2抗体（570ng/mL）を加えた。連続的に
振とうしながら３時間温置した後、コップを６回洗浄液
で洗った。カウンティング時間が僅か３秒であった点は
別として、実施例Ｉのように0.3mol/LのNa2SO4と0.001m
ol/LのK2S2O8を含有したpH8.7である450μＬの0.001Mの
Tris−H2SO4緩衝液を加えた後にコップの中でエレクト
ロルミネセンスを測定した。アッセイの結果は表２と第
２図に示してある。
実施例 IV 血清中のヒト膵臓PLA2のホモジニアス・サンドイッチ・
イムノアッセイ コップの被覆とヒツジ−抗−ヒトPLA2抗血清の標識化は
実施例IIIのように行った。
イムノアッセイ コップの被覆とヒツジ−抗−ヒトPLA2抗血清の標識化は
実施例IIIのように行った。
イムノアッセイ： アルミニウムコップを１回500μＬの洗浄液で洗浄し
た。ヒト血清中の0,9,54および324ng/mLのホスホリパー
ゼA2を含有した25μＬの標準を前記コップに加え、次い
で5g/LのBSA,0.5g/LのNaN3,0.3ml/LのNa2SO4,0.001mol/
LのK2S2O8を含有したpH8.7で0.05MのTris−H2SO4緩衝液
中の425μＬのTbで標識した抗−PLA2抗体（235ng/mL）
を加えた。連続的に振とうしながら３時間温置した後。
カウンティング時間が僅か３秒であった点は別として、
実施例Ｉのようにコップの中でエレクトロルミネセンス
を直接測定した。アッセイの結果は表３と第３図に示し
てある。
た。ヒト血清中の0,9,54および324ng/mLのホスホリパー
ゼA2を含有した25μＬの標準を前記コップに加え、次い
で5g/LのBSA,0.5g/LのNaN3,0.3ml/LのNa2SO4,0.001mol/
LのK2S2O8を含有したpH8.7で0.05MのTris−H2SO4緩衝液
中の425μＬのTbで標識した抗−PLA2抗体（235ng/mL）
を加えた。連続的に振とうしながら３時間温置した後。
カウンティング時間が僅か３秒であった点は別として、
実施例Ｉのようにコップの中でエレクトロルミネセンス
を直接測定した。アッセイの結果は表３と第３図に示し
てある。
第１図は実施例Ｉの測定結果を示すグラフ、第２図は実
施例IIIの測定結果を示すグラフ、第３図は実施例IVの
測定結果を示すグラフである。
施例IIIの測定結果を示すグラフ、第３図は実施例IVの
測定結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−153940（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−186170（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−155834（ＪＰ，Ａ) 米国特許4280815 （ＵＳ，Ａ) 米国特許4374120 （ＵＳ，Ａ) Ｅｈｌｅｋｔｒｏｋｈｉｍｉｙａ，Ｖｏ ｌ．14，Ｎｏ．２（露）Ｐ．246−250 （1978)
Claims (18)
- 【請求項１】テレビウムまたはユーロピウムを含有する
化学的部分の存在及び／又は量を、電気的パルスを溶液
に浸漬した電極に与えることによりそしてパルス終了後
しばらくしてからの遅延した発光を測定することにより
把握する方法おいて、前記化学的部分が前記電極に結合
しているか、そして／又は前記溶液中に存在し、かつ前
記発光が前記電極の近傍に存在する化学的部分の量を示
すものであると見做されることを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記化学的部分が一般式： （Ｍ−Ｚ）ｎ−Lm−Yp を有することを特徴とする請求項１記載の方法。ただし
式中： Ｍはテレビウムまたはユーロピウムであり;ZはＭの多歯
状の配位子であり;Lは−CONH−，−CONMeのようなウレ
イド、チウレイド、アミド；−Ｓ−，−Ｓ−Ｓ−のよう
なチオエーテル;SO2NH−，−SO2NMe−のようなスルホン
ナミドのごとき結合基あり、かつＬは種々の組成と長さ
の分子鎖を含むことができ、しかもこの分子鎖は前記の
２価の基の一部分によって多歯状の配位子Ｚに結合し、
また他部分によって物質Ｙに結合する。 そして、Ｙは一個以上の結合基Ｌを経てＺに結合する物
質であるが;nは１以上の整数であり;pは０以上の整数で
あり;mは０以上の整数である。 - 【請求項３】前記化学的部分が化学的物質に結合できる
ことを特徴とする請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】問題の分析物の存在を測定するための競合
結合法において、分析物と化学的部分は競合的に化学的
材料に結合するが、化学的部分は一般式： （Ｍ−Ｚ）ｎ−Lm−Yp を有し、式中 Ｍはテレビウムまたはユーロピウムであり;ZはＭの多歯
状の配位子であり;Lは−CONH−，−CONMeのようなウレ
イド、チオウレイド、アミド；−Ｓ−，−Ｓ−Ｓ−のよ
うなチオエーテル;SO2NH−，−SO2NMe−のようなスルホ
ンナミドのごとき結合基であり、かつＬは種々の組成と
長さの分子鎖を含むことができ、しかもこの分子鎖は前
記の２価の基の一部分によって多歯状の配位子Ｚに結合
し、また他部分によって物質Ｙに結合する。 そして、Ｙは一個以上の結合基Ｌを経てＺに結合する物
質であるが;nは１以上の整数であり;pは１以上の整数で
あり;mは１以上の整数である。 前記の方法は； ａ）前記の、化学的材料、化学的部分および分析物を、
試薬混合物が形成するように適当な条件の下で接触させ
る事； ｂ）溶液中に浸漬した電極に電気パルスを与えることに
よって化学的部分の発光を誘起する事； ｃ）電気パルスを与えてから少しおくれて発する光を検
出する事とそれによって問題の分析物を測定する事とか
ら成ることを特徴とする。 - 【請求項５】Ｙが全細胞、亜細胞粒子、ウイルス、核
酸、多糖、蛋白、ポリペプチド、酵素、細胞代謝産物、
ホルモン、薬理学的物質、薬剤、アルカロイド、ステロ
イド、ビタミン、アミノ酸または炭水化物であることを
特徴とする請求項２、３または４記載の方法。 - 【請求項６】Ｙがヌクレオチド、オリゴヌクレオチドま
たはポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項２
記載の方法。 - 【請求項７】Ｙが抗体であることを特徴とする請求項５
記載の方法。 - 【請求項８】前記化学的物質が全細胞、亜細胞粒子、ウ
イルス、核酸、多糖、蛋白、ポリペプチド、酵素、細胞
代謝産物、ホルモン、薬理学的物質、薬剤、アルカロイ
ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸または炭水化物で
あることを特徴とする請求項３記載の方法。 - 【請求項９】前記化学的物質が少なくとも一つの電極の
表面上に固定化されることを特徴とする請求項３記載の
方法。 - 【請求項１０】前記化学的物質の抗体であることを特徴
とする請求項３記載の方法。 - 【請求項１１】前記分析物が全細胞、亜細胞粒子、ウイ
ルス、核酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリ
ヌクレオチド、多糖、蛋白、ポリペプチド、酵素、細胞
代謝産物、ホルモン、薬理学的物質、薬剤、アルカロイ
ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸または炭水化物で
あることを特徴とする請求項４記載の方法。 - 【請求項１２】前記分析物が抗体であることを特徴とす
る請求項11記載の方法。 - 【請求項１３】前記化学的材料が抗体であることを特徴
とする請求項４記載の方法。 - 【請求項１４】前記化学的物質が電極の表面上に固定さ
れた分析物特有抗体であり、Ｙが分析物上の別のあるい
は同じ抗原決定基に対する抗体であり、そして分析物が
抗体の間に結合していることを特徴とする請求項３記載
の方法。但しこの方法は非競合アッセイである。 - 【請求項１５】前記分析物がが全細胞、亜細胞粒子、ウ
イルス、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチ
ド、多糖、蛋白、ポリペプチド、酵素、細胞代謝産物、
ホルモン、薬理学的物質、アルカロイドまたは炭水化物
であることを特徴とする請求項14記載の方法。 - 【請求項１６】方法がホモジニアスな方法であり、して
適切な条件が、結合化学的部分と非結合化学的部分とが
電気パルスによる発光が検出される前には分離されない
ような条件であることを特徴とする請求項3,4,14または
15記載の方法。 - 【請求項１７】方法がヘテロジニアスな方法であり、そ
して適切な条件が、電極に対して電気パルスを加えそし
て発光を測定する前に結合化学的部分と非結合化学的部
分とを分離することから成ることを特徴とする請求項3,
4,14または15記載の方法。 - 【請求項１８】電極の少なくとも一つがアルミニウム製
であることを特徴とする請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8801011A SE461117B (sv) | 1988-03-21 | 1988-03-21 | Foerfarande foer bestaemning av koncentrationen av en luminiscerande lantanid foerening |
| SE8801011-1 | 1988-03-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01302144A JPH01302144A (ja) | 1989-12-06 |
| JPH0750032B2 true JPH0750032B2 (ja) | 1995-05-31 |
Family
ID=20371751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6915089A Expired - Lifetime JPH0750032B2 (ja) | 1988-03-21 | 1989-03-20 | 溶液中での電気発生のルミネセンスに基づく分析方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0750032B2 (ja) |
| DE (1) | DE3908918C2 (ja) |
| FR (1) | FR2628838B1 (ja) |
| GB (1) | GB2217007B (ja) |
| SE (1) | SE461117B (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE122032T1 (de) * | 1989-12-07 | 1995-05-15 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Phenolderivat und seine verwendung in der kolorimetrischen analyse von metallionen. |
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