JPH0736016B2 - 免疫グロブリンの定量方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト免疫グロブリンに対する単クローン性抗
体を単独又は２種類以上用いてヒト免疫グロブリンを光
学的に測定する方法に関する。

免疫グロブリンは、形質細胞、あるいはリンパ節で産生
される抗体蛋白で、細菌、ウィルス、毒素等から生体を
防禦する重要な働きを持つ蛋白質であり、体液中の免疫
グロブリン量を測定する事は各種疾患の診断、予防、予
後の経過を調べる上で重要な手段である。

体液中の免疫グロブリンを測定する方法に関しては、近
年その進歩にめざましいものがあり、測定方法もSRID
法、レーザー比朧法、比濁法、RIA法、EIA法、ラテック
ス凝集法等数多くの方法が開発されてきている。特に最
近では、免疫グロブリンの測定を、レーザーネフェロメ
ーターや、多項目の生化学的測定を対象に開発された自
動分析装置で短時間に行なう方法が、開発され普及しつ
つある。

しかしながらこれらの測定に使用する抗体は通常動物に
免疫をして得たポリクローナル抗体である為、抗原抗体
反応による凝集度が高く、濁りの度合が強すぎるので、
測定時に検体血清を希釈して用いなければならず、操作
が煩雑となり又、希釈による誤差なども生じ易いという
欠点があった。

更に、自動分析装置に於ては、通常、試料の希釈は行な
わずに測定する事が前提となっているので、同一試料に
ついて、糖、脂質、酵素等の生化学的検査と一緒に免疫
グロブリンの測定を行うことは実際上不可能であった。

又、免疫グロブリンの中でもIgGは殊にその含有量が高
く、通常血清中に500〜3,000mg/dl存在し、動物に免疫
をして得たポリクローナル抗体を用いた比濁法あるいは
比朧法の如き光学的測定法においては、血清を希釈せず
に測定する場合は多量の抗体が必要となり、又、その結
果極めて強い濁りが生じてしまう為、血清を希釈しない
で測定することは到底不可能と考えられていた。従って
測定に際しては血清をあらかじめ10〜30倍、又場合によ
っては100〜300倍（比朧法）に希釈したものを抗原抗体
反応に使用して、光学的に測定することが必要であっ
た。

本発明者らは、かかる問題点を解決すべく鋭意研究を重
ねた結果、免疫グロブリンとの反応に於いて単独でも測
定に利用可能な濁りを生ずる単クローン性抗ヒト免疫グ
ロブリン抗体を単独、あるいは２種以上組み合せて用い
ることにより、血清等生体試料の希釈を行なわずに、適
度な且つ充分測定可能な濁度が得られ、容易に且つ効率
的に免疫グロブリンの比朧法或いは比濁法による測定を
行うことができる本発明を完成するに到った。

即ち、生体試料を希釈せずにそのまま使用し、免疫グロ
ブリンとの反応に於いて単独でも測定に使用可能な濁り
を生ずる単クローン性抗ヒト免疫グロブリン抗体を不溶
性担体上に固定化することなく用いてこれと抗原抗体反
応を行わせ、生成する抗原抗体複合物に光を照射し光学
的変化量を測定する、自動分析装置に適した免疫グロブ
リンの定量方法である。

抗原抗体反応を利用した臨床化学分析に於てモノクロー
ナル抗体を用いる方法としては、放射免疫測定法（RI
A），酵素免疫測定法（EIA），蛍光免疫測定法（FIA）
等、抗体抗原反応後の抗原又は抗体に標識した同位元
素、酵素、蛍光物質等を測定することにより、間接的に
試料中の測定対象抗原又は抗体の量を求める方法に於
て、より精度の高い測定を行う目的で行われている例は
これまでに数例あるが、本発明の如く抗原抗体反応によ
る凝集の程度を直接光学的に測定する方法に於て、これ
を効果的に利用している例はこれまでに皆無である。

その理由は、一般に、単クローン性抗体を用いた場合に
は、例えば抗原が本発明に於ける免疫グロブリンの一つ
であるIgGの場合について云えば、IgG1分子当り抗体と
反応する抗原決定基は２個しか存在せず、従って単クロ
ーン性抗体とは２個所でしか結合できないので、動物由
来のポリクローナル抗体の場合のようにIgG1分子に対し
不特定多数の抗体が結合してポリマー化が進行し抗原抗
体複合物の粒子が粗大化して濁度が高くなるのに比べ、
単クローン性抗体では抗原抗体複合体の粒子の成長が少
なく、結果として一定抗原量に対する濁りの度合が小さ
くなるので、光学的にこれを測定するのは不可能である
と考えられていたからである。

公知文献であるクリニカル ケミストリー 27巻 2044
−2047頁（1981年）には、単クローン性抗体を使用した
免疫グロブリンの定量法に関する記載があるが、ここで
述べられていることは要約すれば、単クローン性抗体は
単独で用いた場合には抗原抗体反応による濁りが認めら
れず、複数の単クローン性抗体を組み合せて用いること
により始めて測定に適用できるというものであり、単に
ポリクローナル抗体と置き換え得るものとして単クロー
ン性抗体の使用を検討しているに過ぎず、これを積極的
に用いることにより新たな効果を引き出そうとしている
ものではない。従って、当然のことながら、この場合の
検体は従来通り希釈したものが用いられている。

本発明者らは、単クローン性抗体と濁度との関係につい
て研究を進めるうちに、単クローン性抗体を単独で抗原
と反応せしめた場合に前記文献中に記載の如く濁りが認
められないのは、単に濁りの度合が少なく感度が低いに
過ぎないこと、又、その感度即ち濁りの度合は単クロー
ン性抗体を適宜組み合せて用いることにより調節可能で
あること、更には血清等の生体試料を希釈せずにそのま
ま用いた場合には単クローン性抗体を単独又は２種類以
上組み合せて用いることにより、極めて適切な感度が得
られることを見出し本発明に到達したのである。即ち、
単クローン性抗体を用いた場合にはポリクローナル抗体
を用いた場合と測定濃度域が異なり、ポリクローナル抗
体の場合と比べるとかなり低濃度域での測定となるが、
血清等の生体試料を希釈せずにそのまま用いた場合には
免疫グロブリンにとってそれが極めて適切な濃度域にな
っており、従って充分測定可能な濁度（感度）が得られ
るということを本発明者らは見出したのである。

本発明の方法によれば、血清等の生体試料を希釈するこ
となくそのまま測定することが可能であり、その結果、
希釈操作に伴う煩雑さ及び誤差を排除でき、正確性が向
上すると共に、同一試料について糖，脂質，酵素等多項
目の生化学的検査を一緒に行う自動分析装置への適用が
極めて容易となり、応用範囲が飛躍的に拡大される。

本発明の目的を達成するために第１段階は、抗体を産生
する単クローンハイブリドーマを作製することである
が、このハイブリドーマの作製方法は簡単には次の３工
程から成る。

1.免疫 2.細胞融合 3.ハイブリドーマの選択と単クローン化以下、これにつ
いて順を追って説明する。

免疫抗原はヒト血清より精製分離した各種免疫グロブリ
ンを使用する。

各免疫グロブリンは生理食塩水、或いは緩衝液などに溶
解し、マウス又はラット１匹あたり１回に１μｇから30
0μｇを投与するのが好ましい。免疫は数回に分けてお
こなうが、初回免疫はアジュバントと共におこなうこと
が一般的である。アジュバントとしてはフロイントアジ
ュバント、ミヨウバンなどが使用される。免疫は２〜４
週間の間隔でおこない、最終免疫はアジュバントを使用
せず、生理食塩水などに溶解し、腹腔内或いは静脈内に
投与する。免疫動物としては、一般にはラット、マウス
が汎用される。これは細胞融合に使用する腫瘍細胞株に
よって決められる為で、マウスの中でも免疫グロブリン
を産生しない腫瘍細胞株の確立されているBALB/cがよく
用いられる。最終免疫後２〜４日後に、リンパ節、或い
は脾臓を摘出し、得られるリンパ球を細胞融合に供す
る。

一方細胞融合に使用される腫瘍細胞株としては、免疫グ
ロブリンを産生しないP3−X63−8AZ−U1やP3−NS1−１
などが使用される。細胞融合時にはリンパ球を腫瘍細胞
の５〜20倍量多く用いる。MEM培地、McCoy培地、RPMI16
40培地或いは等張緩衝液等で洗浄後、リンパ球と腫瘍細
胞を遠心操作でペレット状態にする。ペレットをほぐし
た後、HVJ（センダイビールス）或いはPEG（ポリエチレ
ングリコール）を加え細胞融合をおこなうが、通常は、
取扱いの容易なPEGの平均分子量1,000〜8,000の40〜60
％溶液を0.5〜2ml使用する。融合促進剤として、PEG添
加時にジメチルスルホキシドなどを少量加えることもあ
るが必須ではない。PEG溶液を細胞に添加し、融合反応
を１〜10分間程度おこなった後、MEM培地或いはRPMI164
0培地などを10〜50ml徐々に加え反応を停止する。融合
反応停止後、直ちに遠心し上清を除去する。牛胎児血清
（FCS）を５〜20％含むMEM培地或いはRPMI1640培地に細
胞を懸濁し、24穴培養プレートにリンパ球が１穴あたり
１×10⁵〜５×10⁶個となるよう1mlずつ分注する。何れ
に於いても、フイーダー細胞は添加する方が好ましい。
フイーダー細胞としては、同系のラット或いはマウスの
胸腺細胞、脾細胞等が用いられ、濃度としては0.5〜２
×10⁶/mlとなるように添加する。次にヒポキサンチン１
×10^-4Ｍ、アミノプテリン４×10^-7Ｍ、チミジン1.6×1
0^-5Ｍを含むRPMI1640培地（或いはMEM培地）即ちHAT培
地に換えていく。HAT培地交換の方法は一般には翌日培
養プレートに融合後分注した容量と等容量加え、更に翌
日その半量をHAT培地と交換する。その後２〜３日毎HAT
培地で半量づつ交換する。融合後10〜14日目にアミノプ
テリンを除いたHT培地で半量交換し、更にその１〜３日
毎に培地の半量をHATを含まない通常の培地に交換す
る。融合細胞（ハイブリドーマ）の増殖の盛んな穴の培
養上清を種々の分析法、例えばRIA、ELISA等で目的の抗
体産生ハイブリドーマを選択する。ハイブリドーマを得
たならクローニングを行うが、その方法としてはFACS
（Fluorescent Activated Cell Sorter）を用いる方
法、Soft Agarよりコロニーを拾いあげる方法、一般に
よく用いられる限界希釈法などがある。どの方法を用い
てもクローニングは２回以上繰返し、完全に単一クロー
ンとする。

クローンを確立したならば、その細胞をin vitro法また
はin vivo法で培養することによって各種単クローン性
抗ヒト免疫グロブリン抗体が得られる。in vitro法、in
vivo法のいずれでもよいが、in vivo法の方が抗体価が
はるかに高いので望ましい。

単クローン性抗体を用いた免疫グロブリンの測定法とし
ては比濁法、比朧法等がある。比濁法で測定する場合
は、既存の自動分析装置や分光光度計が使用でき、波長
としては好ましくは340〜800nmの範囲であるが特に限定
されるものではない。又、比朧法で測定する場合は、現
在普及しているレーザー光源を使用したもの等が利用で
きるが、光源及び検出方法は特に本発明を限定するもの
ではない。

測定に使用する緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸
緩衝液、ベロナール緩衝液等通常用いられている緩衝液
は全て使用でき、pHは好ましくは、6.0〜9.0の範囲であ
るが特に限定されるものではない。

また、測定に使用する単クローン性抗体としては、免疫
グロブリンとの反応に於いて単独でも測定に利用可能な
濁りを生ずるものであればその種類及び数は限定される
ものではなく、必要な感度に合せて１種類でも、又２種
類以上を組み合せて使用してもよい。単クローン性抗体
の使用量については特に限定されるものではないが、通
常抗体溶液1ml中当り単クローン性抗体0.02mg〜2mgの濃
度範囲で用いられる。

本発明の方法により測定可能な免疫グロブリンとして
は、免疫グロブリンの中でも含有量の高いヒトIgG、ヒ
トIgA、及びヒトIgMが挙げられる。

本発明は、抗原抗体反応による凝集の程度を光学的に測
定することにより体液中の免疫グロブリンを測定する方
法に於て、免疫グロブリンとの反応に於いて単独でも測
定に利用可能な濁りを生ずる単クローン性抗ヒト免疫グ
ロブリン抗体を用いることを特徴とする発明である。こ
のような特徴を有するが故に、本発明に於ては、免疫グ
ロブリンの定量に用いる試薬の調製に際して従来法の如
く２種類以上の単クローン性抗体を混合して使用するこ
とが必ずしも必要ではないため免疫グロブリンの定量に
用いる試薬の調製が容易となると共に、試薬を調製する
ために必要な原料（単クローン性抗ヒト免疫グロブリン
抗体）を多種類確保する必要がなく、試薬調製に要する
煩雑さを低減することができるという効果を奏するので
斯業に貢献するところ大なる発明である。また、本発明
は、血清等の生体試料を希釈せずにそのまま測定に供す
ることができるので、希釈操作に伴う煩雑さ及び誤差を
排除でき、正確性が向上すると共に、同一試料について
多項目の測定を自動分析装置への適用を極めて容易成ら
しめるという効果も奏する発明である。

以下に参考例及び実施例をあげて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

参考例１単クローン性抗IgG抗体及びこれを産生するハ
イブリドーマの作製 （１）免疫 ヒトIgG100μｇを溶解した0.15M塩化ナトリウム0.1mlと
フロイントコンプリートアジュバント0.1mlを混合し、
エマルジョン抗原液とし、その0.2mlを、BALB/cマウス
（雌、６週齢）の腹腔内に投与した。４週後、ヒトIgG1
00μｇを0.15M塩化ナトリウム0.2mlに溶解し、尾静脈に
注射した。

（２）細胞融合 最終免疫より３日後、免疫マウスの脾臓を摘出し、10ml
のRPMI1640培地を入れたプラスチックシヤーレ中で、脾
リンパ球をほぐす。脾リンパ球を遠心操作（1000回転、
10分）を繰返しRPMI1640培地で３回洗浄した。脾リンパ
球１×10⁸個とマウス骨髄腫細胞P3−NA1−1 1×10⁷個を
試験管中で混合し、遠心操作で沈殿とした。上清を吸引
除去した後沈殿をかるくほぐす。50％ポリエチレングリ
コール（平均分子量6,000）1mlをほぐした沈殿に加え、
試験管をまわしながら室温で１分間融合反応をおこなっ
た。その後30秒後、RPMI1640培地1mlを５分間加え反応
を停止した。直ちに遠心分離し、（1000回転、５分）上
清を除き、フィーダー細胞を１×10⁶/ml、FCS（牛胎児
血清）を20％含むRPMI1640培地50ml中に細胞を懸濁し
た。24穴プレート２枚に細胞懸濁液を１穴あたり1ml分
注しCO₂インキュベーター内で培養する。

24時間後、HAT培地（ヒポキサンチン１×10^-4Ｍ、アミ
ノプテリン４×10^-7Ｍ、チミジン1.6×10^-5Ｍを含む20
％FCS添加RPMI1640培地）を１穴あたり、1mlずつ加え
る。２日目、３日目さらに２日毎に培地の半量をHAT培
地に交換した。10日目に培地の半量を上記のHAT培地よ
りアミノプテリンを除いたHT培地で交換した。翌日から
２日毎に通常の培地即ち、10％FCS添加RPMI1640培地に
半量ずつ交換し、18日目の培養上清を抗IgG抗体産生の
検定に供した。

（３）ハイブリドーマの選択 抗IgG抗体産生ハイブリドーマ選択のために48穴の各細
胞培養上清をELISAにて分析した。まずELISA用96穴プレ
ートにヒトIgGを10μg/mlの濃度で0.1mlずつ分注し、４
℃16時間静置してヒトIgGをプレートに固定化した。Twe
en20（ノニオン系界面活性剤、アトラス社商品名）を0.
05％含む10mMリン酸緩衝液pH7.4（洗浄液）で３回洗浄
した後、培養上清中の蛋白質の非特異的吸着を避けるた
めに、１％牛血清アルブミン溶液を0.2mlずつ分注し、3
7℃２時間静置した。次に洗浄液で３回洗浄後細胞培養
上清を0.1ml分注し、37℃２時間静置した。陰性対照と
して20％FCS添加RPMI1640培地を0.1ml分注した。更に洗
浄液で３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫
グロブリン抗体溶液0.1mlを分注し37℃２時間静置し
た。洗浄液で３回洗浄後0.4％オルトフエニレンジアミ
ン溶液0.1ml分注し、室温で２分反応後6N硫酸0.05mlを
加え反応を停止させ、O.D.490nmを測定した。陰性対照
の２倍以上のO.D.を示す培養上清中で増殖しているハイ
ブリドーマを抗IgG抗体産生ハイブリドーマとして選択
した。48穴中３穴に抗IgG抗体産生を認めた。

（４）単クローン化 BALB/cマウス（雌、６週齢）の胸腺を摘出し、10mlのRP
MI1640培地をいれたプラスチックシヤーレ中で胸腺リン
パ球をほぐす。胸腺リンパ球を遠心操作（1000回転、10
分）を繰返しRPMI1640培地で３回洗浄した。胸腺リンパ
球を20％FCS添加、RPMI1640培地50mlに浮遊させた。こ
の浮遊液に抗IgG抗体産生ハイブリドーマ500個/mlの溶
液0.1mlを加え、よく混合後、96穴培養プレートに１穴
あたり0.2mlずつ分注し10日間、CO₂インキュベーター内
で培養した。細胞増殖の認められる培養上清をELISAに
て分析の結果、抗IgG抗体産生ハイブリドーマ７クロー
ンを得た。このうちの１クローンを更に同上操作をおこ
ない抗IgG抗体産生ハイブリドーマ６クローンを得、単
クローン化を完全なものとした。

（５）単クローン性抗体の作製 （４）までの操作で得られたクローンＧ−２−３ ２×10⁶個をRPMI1640培地0.2mlに浮遊させ、BALB/cマウ
ス（雄、６週齢）の腹腔内に投与し、約２週間後に腹水
を回収した。回収した腹水を遠心操作（3000回転10分）
して上清を得、その上清4mlに飽和硫安溶液を徐々に加
え、最終硫安飽和濃度を50％とし、室温で２時間攪拌し
た後、遠心操作（3000回転10分）で沈殿を回収し、生理
食塩水5mlを加え溶解した。これを生理食塩水で10倍ず
つ段階希釈してゆきELISAにて分析し、抗体活性の認め
られる希釈倍数を求めたところ、10⁶であった。なおマ
ウスIgG含量（抗体の力価の目安）を抗マウスIgGのウサ
ギ血清を含有するアガロースプレートにより測定（SRID
法）したところ23mg/mlであった。

（６）（４）までの操作で得られたクローンＧ−３につ
いて（５）と同様の操作を行ない単クローン性抗体5ml
を得た。又、（５）と同様の方法で抗体活性及びマウス
IgG含量を求めたところ、抗体活性は10⁶、マウスIgG含
量は20mg/mlであった。

（７）（４）までの操作で得られたクローンＧ−５につ
いて（５）と同様の操作を行ない単クローン性抗体5ml
を得た。又、（５）と同様の方法で抗体活性及びマウス
IgG含量を求めたところ、抗体活性は10⁵、マウスIgG含
量は20mg/mlであった。

参考例２単クローン性抗IgA抗体及びこれを産生するハ
イブリドーマの作製 ヒトIgA200μｇを溶解した0.15M塩化ナトリウム0.1mlと
フロイントコンプリートアジュバント0.1mlを混合し、
エマルジョン抗原液とし、その0.2mlを、BALB/cマウス
（雌、５週齢）の腹腔内に投与した。４週後、ヒトIgA1
00μｇを0.15M塩化ナトリウム0.2mlに溶解し、尾静脈に
注射した。以後参考例１の（２）〜（４）の操作を行な
い抗IgA抗体産生ハイブリドーマ５クローンを得た。さ
らに参考例１の（５）の操作を行ない抗IgA単クローン
性抗体５種類（Ａ−2,A−3,A−5,A−8,A−９）を得た。
各クローンの抗体活性及びマウスIgG量（抗体の力価の
目安）は表１の通りであった。

参考例３単クローン性抗IgM抗体及びこれを産生するハ
イブリドーマの作製 ヒトIgM100μｇを溶解した0.15M塩化ナトリウム0.1mlと
フロイントコンプリートアジュバント0.1mlを混合し、
エマルジョン抗原液とし、その0.2mlを、BALB/cマウス
（雌、６週齢）の腹腔内に投与した。３週後ヒトIgM100
μｇを0.15M塩化ナトリウムに溶解し、尾静脈に注射し
た。

以後参考例１の（２）〜（４）の操作を行ない、抗IgM
抗体産生ハイブリドーマ４クローンを得た。さらに参考
例１の（５）の操作を行ない抗IgM単クローン性抗体４
種類（Ｍ−1,M−2,M−3,M−５）を得た。各クローンの
抗体活性及びマウスIgG量（抗体の力価の目安）は表２
の通りであった。

実施例１ 単クローン性抗体を用いたヒト血清IgGの測定試薬：次
の各試薬を調製した。

1.緩衝液 ポリエチレングリコール6000 5g 0.1Mトリス塩酸緩衝液,pH7.4 100ml 2.抗体溶液 参考例１で得た単クローン性抗体Ｇ−３ 1ml 緩衝液 50ml 試料：次の各ヒト血清を使用した。

IgG含量 500,1000,1500,2000,3000mg/dlのヒト血清 操作法：試験管に５つの試料血清10μｌをとり、これに
抗体溶液2mlを添加して37℃10分間反応させた後、分光
光度計（日立624形）で、層長10mm、波長505nmに於ける
吸光度を測定した。測定結果を第１図に示す。

実施例２ 単クローン性抗体を用いたヒト血清IgAの測定 試薬：次の各試薬を調製した。

1.緩衝液 ポリエチレングリコール6000 4.5g 塩化ナトリウム 0.9g 0.01Mリン酸緩衝液,pH7.4 100ml 2.抗体溶液 参考例２で得た単クローン性抗体Ａ−２ 0.2ml 参考例２で得た単クローン性抗体Ａ−３ 0.2ml 緩衝液 100ml 3.標準血清 IgA含量 560mg/dlの標準血清 試料：ヒト血清 操作法：試験管に標準血清及びヒト血清をそのまま10μ
ｌとり、これに抗体溶液3mlを添加して37℃、10分間反
応させた後、分光光度計で375nmの吸光度を測定する。
別に、標準血清及びヒト血清10μｌに抗体を含まない緩
衝液3mlを添加して37℃10分間加温後、分光光度計（日
立624形）で層長10mm、波長375nmの吸光度を同様に測定
する。

計算法： Es ；ヒト血清と抗体溶液を反応させたときの吸光度 Es・Ｂ；ヒト血清＋緩衝液の吸光度 Estd ；標準血清と抗体溶液を反応させたときの吸光度 Estd・Ｂ；標準血清＋緩衝液の吸光度 EB ；抗体溶液の吸光度 上記計算式により求めたヒト血清IgA量、及び本実施例
で用いたヒト血清試料をSRID法により求めたIgA量を表
３に示す。

表３より、本測定方法はSRID法によるそれとよい相関を
示していることが判る。

実施例３ 単クローン性抗体を用いた表示ヒト血清IgMの測定 試薬：次の各試薬を調製した。

1.緩衝液 ポリエチレングリコール6000 4g 塩化ナトリウム 0.9g 0.01Mベロナール緩衝液,pH7.5 100ml 2.抗体溶液 参考例３で得た単クローン性抗体Ｍ−１ 0.1ml 参考例３で得た単クローン性抗体Ｍ−３ 0.1ml 参考例３で得た単クローン性抗体Ｍ−５ 0.1ml 緩衝液 100ml 試料：次の各ヒト血清を使用した。

IgM含量75,150,300,500,700mg/dlのヒト血清 操作法：試験管にヒト血清10μｌをとり、抗体溶液2ml
を添加して37℃で10分間反応させた後、分光光度計（島
津UV−200）で、層長10mm、波長505nmに於ける吸光度を
測定する。別にヒト血清10μｌを試験管にとり、緩衝液
2mlを加えて37℃10分間加温後、分光光度計で505nmの吸
光度を同様に測定する。

計算法： 血清IgMと抗体との反応による吸光度（Es）は Es＝Es・Ａ−Es・Ｂ Es・A;ヒト血清と抗体溶液を反応させたときの吸光度 Es・B;ヒト血清＋緩衝液の吸光度 測定結果を第２図に示す。

実施例４ 単クローン性抗体を用いたヒト血清IgGの測定 試薬：次の各試薬を調製した。

1.緩衝液 ポリエチレングリコール6000 5g 塩化ナトリウム 0.9g 0.1Mトリス塩酸緩衝液,pH7.5 100ml 2.抗体溶液 参考例１で得た単クローン性抗体Ｇ−２−３ 0.5ml 参考例１で得た単クローン性抗体Ｇ−５ 0.5ml 緩衝液 50ml 3.標準血清 IgG含量500,1000,2000,4000mg/dlの標準血清 試料：ヒト血清 操作法：キュベットに標準血清及びヒト血清をそのまま
10μｌをとり、抗体溶液500μｌを添加して室温で25分
間反応させた後、レーザーネフェロメーター（ZD−80
1）で波長633nmに於ける散乱光量を測定する。別に抗体
溶液の代りに緩衝液を用いて同様の測定をする。

ヒトIgGと抗体の反応による散乱光量（Ds）は次の式で
計算される。

Ds＝Ds.A−Ds・Ｂ 標準血清による検量線を第３図に示す。又第３図より求
めた本実施例に於けるヒト血清試料のIgG量、及びSRID
法により求めた本実施例に於けるヒト血清試料のIgG量
を表４に示す。

表４より、本測定方法はSRID法によるそれとよい相関を
示していることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１に於て得られた試料血清中のIgG量
の測定結果を表わし、横軸の各IgG量（mg/dl）について
得られた吸光度（OD）を縦軸に沿ってプロットした点を
結んだものである。 第２図は、実施例３に於て得られた試料血清中のIgM量
の測定結果を表わし、横軸の各IgM量（mg/dl）について
得られた吸光度（OD）を縦軸に沿ってプロットした点を
結んだものである。 第３図は、実施例４に於ける標準血清によるIgG量の検
量線を表わし、横軸の各IgG量（mg/dl）について得られ
た光散乱強度（mV）を縦軸に沿ってプロットした点を結
んだものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 牛尾 善博 兵庫県西宮市北名次町11―３―307 (72)発明者 鈴置 純 兵庫県神戸市東灘区岡本７丁目14番１号 (56)参考文献 臨床病理 臨時増刊 特集第53号 臨床 検査のためのイムノアッセイ−技術と応用 −昭58年２月 日本臨床病理学会Ｐ．15

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生体試料を希釈せずにそのまま使用し、免
   疫グロブリンとの反応に於いて単独でも測定に使用可能
   な濁りを生ずる単クローン性抗ヒト免疫グロブリン抗体
   を不溶性担体上に固定化することなく用いてこれと抗原
   抗体反応を行わせ、生成する抗原抗体複合物に光を照射
   し光学的変化量を測定する、自動分析装置に適した免疫
   グロブリンの定量方法。
2. 【請求項２】単クローン性抗ヒト免疫グロブリン抗体
   が、マウスの腫瘍ラインからの細胞とヒト免疫グロブリ
   ンで予め免疫されたマウスの脾細胞との融合により形成
   されたハイブリドーマより産生される単クローン性抗ヒ
   ト免疫グロブリン抗体である、特許請求の範囲第１項に
   記載の免疫グロブリンの定量方法。
3. 【請求項３】光学的変化量が光散乱強度の変化量であ
   る、特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の免疫グロ
   ブリンの定量方法。
4. 【請求項４】光学的変化量が透過光量の変化量である、
   特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の免疫グロブリ
   ンの定量方法。
5. 【請求項５】免疫グロブリンがヒトIgG、ヒトIgM又はヒ
   トIgAである、特許請求の範囲第１〜４項いずれかに記
   載の免疫グロブリンの定量方法。
6. 【請求項６】該単クローン性抗ヒト免疫グロブリン抗体
   を２種類以上組み合わせて用いる、特許請求の範囲第１
   〜５項いずれかに記載の免疫グロブリンの定量方法。