JP5807300B2 - 試料中のｃ反応性蛋白質の測定方法及び測定試薬 - Google Patents

Description

本発明は、試料中のＣ反応性蛋白質の測定方法及び測定試薬に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。

抗原と抗体、糖とレクチン、ヌクレオチド鎖とそれに相補的なヌクレオチド鎖、リガンドとレセプター等の特異的な親和性を有する物質間の反応を利用した試料中に含まれる微量の被検物質の測定方法又は測定試薬は種々のものが知られている。
中でも、抗原と抗体の間の抗原抗体反応（免疫反応）を利用した免疫学的測定方法は広く実施されている。
例えば、Ｃ反応性蛋白質；Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下ＣＲＰと略すこともある）は、肺炎球菌菌体のＣ多糖体と沈降反応を示す蛋白であり、血中ＣＲＰ濃度の上昇は、感染症に罹患していること、又は体内に炎症が生じていること等の証拠となる。
このためＣＲＰは各種炎症のマーカーとして、感染症又は炎症等の疾患の診断のためにその測定が行われてきた。
このＣＲＰの測定法としては、Ｃ多糖体との特異的反応をみる方法、及びＣＲＰに結合する抗体（抗ＣＲＰ抗体）を試薬に用い、試料中のＣＲＰと試薬中の抗ＣＲＰ抗体との抗原抗体反応により、抗原抗体複合体を生成させる方法等を挙げることができる。
現在では、抗ＣＲＰ抗体との抗原抗体複合体を生成させる方法である、免疫比ろう法、免疫比濁法、ラテックス免疫比濁法等が日常検査に広く利用されている。
また、このＣＲＰは、カルシウム結合蛋白質と呼ばれ、その立体構造中にカルシウムイオンとの結合部位を有しており、カルシウムイオンと結合したＣＲＰ（カルシウム結合型ＣＲＰ）はその立体構造（抗原性）の一部を変化させることが分かっている。〔なお、ＣＲＰにＥＤＴＡ等のキレート剤を共存させると、ＣＲＰに結合していたカルシウムイオンはこのキレート剤と結合する等して、「カルシウム非結合型ＣＲＰ」となる。〕
例えば、ＣＲＰに対する抗血清を得るために、動物にＣＲＰを接種すると、ＣＲＰは動物の血液中のカルシウムイオンと結合しカルシウム結合型ＣＲＰとなり、ＣＲＰを接種された動物は、カルシウム結合型ＣＲＰの持つ様々な抗原決定基に対する抗体を産生する。
また、この産生された抗体には、「カルシウム結合型ＣＲＰとは結合するが、カルシウム非結合型ＣＲＰとはその結合活性が著しく低下する抗体」、及び「カルシウム結合型ＣＲＰともカルシウム非結合型ＣＲＰとも同等に結合する抗体」の２種類の抗体があることが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
「臨床病理」，第３２巻，第２号，第２２３頁〜第２２４頁，１９８４年発行

健常人の血清中（又は血漿中）のＣＲＰ濃度は一般に０．３ｍｇ／ｄＬ以下であるが、炎症や細菌感染に対して短時間に鋭敏に反応して上昇し２，０００〜４，０００倍にも達する。
ＣＲＰ濃度は、炎症の大きさや程度、又はその改善と相関するため、その測定の臨床的意義は大きい。
また、ＣＲＰ濃度が正常域（０．３ｍｇ／ｄＬ以下）であっても、比較的高濃度の場合、冠動脈疾患を発症する可能性が高いことが報告され注目されている。
このため、試料中のＣＲＰ測定においては、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することが要求されてきている。
なお、この試料中のＣＲＰ測定において、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定する方法としては、例えば、平均粒径の異なる２種以上のラテックス粒子を混合し用いる方法（例えば、特許文献１参照）、測定試薬に界面活性剤を添加する方法（例えば、特許文献２参照）、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を組み合わせて使用する方法（例えば、特許文献３参照）等が提案されている。
特開昭６３−６５３６９号公報 特開２００１−３１８０９９号公報 特開２００６−１７７４５号公報

従って、本発明の課題は、ＣＲＰと、担体に固定化したＣＲＰに結合する特異的結合物質との、特異的結合反応により生じた複合体凝集物を測定することにより、試料中のＣＲＰを測定する方法及び測定試薬において、低濃度から高濃度までその測定範囲を拡げ、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる、新たな測定方法及び測定試薬を提供することである。

本発明者らは、上記の課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、ＣＲＰと、担体に固定化したＣＲＰに結合する特異的結合物質との、特異的結合反応により生じた複合体凝集物を測定することにより、試料中のＣＲＰを測定する方法及び測定試薬において、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体を使用して、試料中のＣＲＰの測定を行った場合には、ＣＲＰが低濃度域にあるときはＣＲＰとの反応性は低く測定の感度は低いものの、中濃度域から高濃度域までＣＲＰとの反応性は高く、ＣＲＰ濃度の増加に応じて複合体凝集物も増加してゆくこと、すなわち中濃度域から高濃度域まで測定の定量性を有することに気付いた。
また、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体を使用して、試料中のＣＲＰの測定を行った場合には、ＣＲＰが低濃度域にあるときはＣＲＰとの反応性は高く測定の感度は高いものの、中濃度域から高濃度域に掛けては、ＣＲＰとの反応性は低下し、ＣＲＰ濃度が増加しても複合体凝集物は増加しないか又は低下し、中濃度域から高濃度域に掛けては測定の定量性を有しないことに気付いた。
そして、本発明者らは、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質の２種類の特異的結合物質を組み合わせて使用することにより、ＣＲＰの測定において低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げ、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１） カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質を各々担体に固定化し、当該担体固定化特異的結合物質と試料中に含まれていたＣ反応性蛋白質との当該特異的結合反応により生成した当該特異的結合物質とＣ反応性蛋白質との複合体凝集物を測定することにより、試料中のＣ反応性蛋白質を測定する方法。
（２） カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質が、カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体である、前記（１）記載の試料中のＣ反応性蛋白質を測定する方法。
（３） カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体がモノクローナル抗体である、前記（１）又は（２）記載の試料中のＣ反応性蛋白質を測定する方法。
（４） カルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質が、カルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体である、前記（１）〜（３）のいずれか１項記載の試料中のＣ反応性蛋白質を測定する方法。
（５） カルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体がモノクローナル抗体である、前記（１）〜（４）のいずれか１項記載の試料中のＣ反応性蛋白質を測定する方法。
（６） 担体がラテックス粒子である、前記（１）〜（５）のいずれか１項記載の試料中のＣ反応性蛋白質を測定する方法。
（７） カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質を固定化した担体を含有することを特徴とする、試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬。
（８） カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質が、カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体である、前記（７）記載の試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬。
（９） カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体がモノクローナル抗体である、前記（７）又は（８）記載の試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬。
（１０） カルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質が、カルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体である、前記（７）〜（９）のいずれか１項記載の試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬。
（１１） カルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体がモノクローナル抗体である、前記（７）〜（１０）のいずれか１項記載の試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬。
（１２） 担体がラテックス粒子である、前記（７）〜（１１）のいずれか１項記載の試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬。

本発明によれば、ＣＲＰと、担体に固定化したＣＲＰに結合する特異的結合物質との、特異的結合反応により生じた複合体凝集物を測定することにより、試料中のＣＲＰを測定する方法及び測定試薬において、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質の２種類の特異的結合物質を組み合わせて使用することにより、ＣＲＰの測定において低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができるものであり、そして、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができるものである。

図１は、抗ＣＲＰ抗体のカルシウム結合型ＣＲＰ、カルシウム非結合型ＣＲＰそれぞれとの結合性を見た図である。
図２は、抗ＣＲＰ抗体のカルシウム結合型ＣＲＰ、カルシウム非結合型ＣＲＰそれぞれとの結合性を見た図である。
図３は、抗ＣＲＰ抗体のカルシウム結合型ＣＲＰ、カルシウム非結合型ＣＲＰそれぞれとの結合性を見た図である。
図４は、抗ＣＲＰ抗体のカルシウム結合型ＣＲＰ、カルシウム非結合型ＣＲＰそれぞれとの結合性を見た図である。
図５は、各抗ＣＲＰ抗体を固定化したラテックス粒子を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。
図６は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−１）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−４）を固定化したラテックス粒子を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。
図７は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−２）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−４）を固定化したラテックス粒子を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。
図８は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−３）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−４）を固定化したラテックス粒子を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。
図９は、抗ＣＲＰ抗体のカルシウム結合型ＣＲＰ、カルシウム非結合型ＣＲＰそれぞれとの結合性を見た図である。
図１０は、抗ＣＲＰ抗体を固定化したラテックス粒子を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。
図１１は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−１）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−４）を固定化したラテックス粒子を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。
図１２は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−２）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−４）を固定化したラテックス粒子を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。
図１３は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−３）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−４）を固定化したラテックス粒子を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。
図１４は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−１）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−５）を固定化したラテックス粒子を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。
図１５は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−２）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−５）を固定化したラテックス粒子を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。
図１６は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−３）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−５）を固定化したラテックス粒子を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
〔１〕Ｃ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質
本発明において、Ｃ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質は、ＣＲＰに特異的に結合することができる物質であり、このようにＣＲＰに特異的に結合することができる物質であれば特に限定はない。
このＣＲＰに結合する特異的結合物質としては、例えば、ＣＲＰに結合することができる抗体（抗ＣＲＰ抗体）、アプタマー（核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマー）、アフィボディー、又はレセプター等を挙げることができる。
なお、ＣＲＰに結合することができる抗体（抗ＣＲＰ抗体）としては、例えば、ＣＲＰに結合することができるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、抗体の断片〔Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２など〕、又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等を挙げることができる。
そして、ＣＲＰに結合する特異的結合物質としては、ＣＲＰに結合することができる抗体（抗ＣＲＰ抗体）が好ましく、当該抗体がモノクローナル抗体であることがより好ましい。
〔２〕カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質
本発明において、カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質（以下「Ｃａ依存性ＣＲＰ特異的結合物質」と略すこともある）は、カルシウム結合型ＣＲＰと結合するが、カルシウム非結合型ＣＲＰとはその結合活性が著しく低下する特異的結合物質のことをいう。
例えば、先に述べたように、カルシウムイオンの共存下、カルシウムイオンと結合したＣＲＰはその立体構造の一部を変化させる。そして、試料中にＥＤＴＡなどのキレート剤が存在している等の場合、ＣＲＰに結合していたカルシウムイオンはこのキレート剤と結合する等して、ＣＲＰの立体構造（抗原性）が変化してしまう。
この場合、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質は、キレート剤を存在させること等によって立体構造が変化したＣＲＰ（カルシウム非結合型ＣＲＰ）とは、その結合活性が著しく低下する。
このことから、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質は、ＣＲＰがカルシウムイオンと結合することによってその立体構造が変化する部分（特異的結合物質が抗体の場合、この変化する部分は抗原決定基である）を認識する特異的結合物質であると推測される。
なお、カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに特異的に結合することができる物質であれば特に限定はない。
このカルシウムイオン依存的にＣＲＰに特異的に結合することができる物質としては、例えば、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合することができる抗体、アプタマー（核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマー）、アフィボディー、又はレセプター等を挙げることができる。
なお、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合することができる抗体としては、例えば、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合することができるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、抗体の断片〔Ｆａｂ若しくはＦ（ａｂ’）_２など〕、又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等を挙げることができる。
また、このカルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合することができる抗体は、遺伝子組み換え技術等により免疫原（ＣＲＰ）を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等）であっても良い。
そして、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質としては、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合することができる抗体が好ましく、当該抗体がモノクローナル抗体であることがより好ましい。
なお、本発明においては、２種以上の、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を用いても良い。
そして、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質は、公知の方法等により、適宜調製することができる。
〔３〕カルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質
本発明において、カルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質（以下「Ｃａ非依存性ＣＲＰ特異的結合物質」と略すこともある）は、カルシウム結合型ＣＲＰとも、カルシウム非結合型ＣＲＰとも、ほぼ同程度に結合する特異的結合物質のことをいう。
すなわち、例えば、前述の通り、カルシウムイオンの共存下、カルシウムイオンと結合したＣＲＰはその立体構造の一部を変化させる。そして、試料中にＥＤＴＡなどのキレート剤が存在している等の場合、ＣＲＰに結合していたカルシウムイオンはこのキレート剤と結合する等して、ＣＲＰの立体構造（抗原性）が変化してしまう。
この場合、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質は、キレート剤を存在させること等によって立体構造が変化したＣＲＰ（カルシウム非結合型ＣＲＰ）とも、カルシウムイオンが結合しているＣＲＰ（カルシウム結合型ＣＲＰ）とも、ほぼ同程度に結合することができるものである。
カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質は、ＣＲＰがカルシウムイオンと結合することによってその立体構造が変化する部分以外の箇所（特異的結合物質が抗体の場合、この箇所は抗原決定基である）を認識する特異的結合物質であると推測される。
なお、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質は、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに特異的に結合することができる物質であれば特に限定はない。
このカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに特異的に結合することができる物質としては、例えば、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合することができる抗体、アプタマー（核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマー）、アフィボディー、又はレセプター等を挙げることができる。
なお、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合することができる抗体としては、例えば、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合することができるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、抗体の断片〔Ｆａｂ若しくはＦ（ａｂ’）_２など〕、又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等を挙げることができる。
また、このカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合することができる抗体は、遺伝子組み換え技術等により免疫原（ＣＲＰ）を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等）であっても良い。
そして、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質としては、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合することができる抗体が好ましく、当該抗体がモノクローナル抗体であることがより好ましい。
なお、本発明においては、２種以上の、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を用いても良い。
そして、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質は、公知の方法等により、適宜調製することができる。
〔４〕カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合するポリクローナル抗体、又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合するポリクローナル抗体の調製方法
カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合するポリクローナル抗体、又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合するポリクローナル抗体は、以下の操作により調製することができる。
抗体産生用の免疫原としては、天然のＣＲＰ、遺伝子組み換え操作により得たＣＲＰ又はＣＲＰ由来ペプチド等のＣＲＰの全部又は一部を用いることができる。
前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、若しくはラクダなど）又は鳥類（ニワトリ若しくはダチョウなど）等に免疫する。
この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により決められるものであるが、マウスの場合には約５〜１０週齢のマウス一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇ、好ましくは５０μｇ〜２ｍｇの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射する。
また、ウサギの場合はウサギ一匹当り一回につき１０μｇ〜５００ｍｇの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射する。
なお、この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、２〜３週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。この場合も、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して抗体を含む抗血清を得る。
この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。
ここで得られたポリクローナル抗体は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合するポリクローナル抗体と、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合するポリクローナル抗体の両方を含むものであるので、更に、これをカルシウム非結合型ＣＲＰをリガンドとして固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィーのカラムに、キレート剤共存下で通して接触させる。
カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合するポリクローナル抗体は、このカラムのリガンド（カルシウム非結合型ＣＲＰ）を介して固相に結合し、捕集される。
これに対して、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合するポリクローナル抗体は、このカラムのリガンド（カルシウム非結合型ＣＲＰ）に結合することなく、このカラムを素通りするので、素通りした画分を得ることにより、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合するポリクローナル抗体を取得することができる。
また、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合するポリクローナル抗体が素通りした後、このカラムのリガンド（カルシウム非結合型ＣＲＰ）に結合したカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合するポリクローナル抗体を、低いｐＨの溶液又は塩を含む溶液をカラムに流すこと等の常法により前記リガンドより遊離させ、この画分を得ることにより、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合するポリクローナル抗体を取得することができる。
なお、免疫原と担体の結合物を用いて動物等に免疫した場合には、得られたポリクローナル抗体中に、この担体に対する抗体が存在するので、このような担体に対する抗体の除去処理を行うことが好ましい。
この除去処理方法としては、担体を、得られたポリクローナル抗体の溶液中に添加して生成した凝集物を取り除くか、担体を不溶化固相に固定化してアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等を用いることができる。
〔５〕カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合するモノクローナル抗体、又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合するモノクローナル抗体の調製方法
カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合するモノクローナル抗体、又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合するモノクローナル抗体は、以下の操作により調製することができる。
モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、リンパ腫を引き起こすエプスタン−バーウイルス（ＥＢウイルス）を用いて特定のＢリンパ球を増やす方法、又はマウス骨髄由来の培養細胞や酵母などの微生物を遺伝子操作する方法等により得ることができる。
細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、以下の操作により行うことができる。
抗体産生用の免疫原としては、天然のＣＲＰ、遺伝子組み換え操作により得たＣＲＰ又はＣＲＰ由来ペプチド等のＣＲＰの全部又は一部を用いることができる。
前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、若しくはラクダなど、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリ若しくはダチョウなど）等に免疫する。
この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇ、好ましくは５０μｇ〜２ｍｇの前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては、２〜６回が一般的である。
この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラットなど）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ ００２９）等を用いることができる。
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソームもしくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、後述のようにＥＬＩＳＡ法等により、カルシウム結合型ＣＲＰ、カルシウム非結合型ＣＲＰとの結合性を測定し、そのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体がカルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合するモノクローナル抗体であるか、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合するモノクローナル抗体であるかの判定を行なうことにより、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをそれぞれ選択することができる。
このハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合するモノクローナル抗体の産生細胞株、又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合するモノクローナル抗体の産生細胞株をそれぞれ単離して得ることができる。
このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清からカルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合するモノクローナル抗体、又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合するモノクローナル抗体を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
また、モノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より前記のモノクローナル抗体を得ることもできる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製されたモノクローナル抗体として得ることができる。
〔６〕カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質の判定
（１）判定について
ＣＲＰに結合する特異的結合物質が、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質であるか、又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質であるかは、そのＣＲＰに結合する特異的結合物質のカルシウム結合型ＣＲＰとの結合性、及びカルシウム非結合型ＣＲＰとの結合性をそれぞれ測定し、判定を行う。
カルシウム結合型ＣＲＰと結合するが、カルシウム非結合型ＣＲＰとはその結合活性が著しく低下する「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質である。
また、カルシウム結合型ＣＲＰとも、カルシウム非結合型ＣＲＰとも、ほぼ同程度に結合する「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」は、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質である。
（２）判定の具体例
以下、より具体的に例を挙げて、この判定について説明する。
（イ）試薬の調製
（ａ）ＣＲＰ固定化マイクロプレートの調製
ＣＲＰを９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに接触させ、吸着させて、固定化し、ＣＲＰ固定化マイクロプレートを調製する。
（ｂ）酵素標識抗体の調製
判定を行おうとする「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」に、特異的に結合することができる抗体に酵素を標識させた「酵素標識抗体」を調製する。〔例えば、ＣＲＰに結合する特異的結合物質が抗ＣＲＰマウス抗体の場合、この酵素標識抗体として酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体等を挙げることができる。〕
（ｃ）洗浄液の調製
界面活性剤を純水に溶解し、洗浄液を調製する。
（ｄ）発色液の調製
前記の酵素標識抗体の標識酵素の触媒としての働きにより、発色が起こる反応に係わる物質を含有する発色液を調製する。
（ロ）試料
（ａ）希釈液Ａの調製
カルシウム塩を純水に溶解し、カルシウムイオン含有水溶液を調製し、これを希釈液Ａとする。
（ｂ）希釈液Ｂの調製
キレート剤を純水に溶解し、キレート剤含有水溶液を調製し、これを希釈液Ｂとする。
（ｃ）カルシウムイオン含有・ＣＲＰに結合する特異的結合物質の試料
判定を行おうとする「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」を含有する溶液を、前記（ａ）の希釈液Ａで希釈し、「カルシウムイオン含有・ＣＲＰに結合する特異的結合物質の試料」を調製する。
また、前記（ａ）の希釈液Ａを、「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」を全く含有しない試料、すなわち陰性試料とする。
（ｄ）キレート剤含有・ＣＲＰに結合する特異的結合物質の試料
判定を行おうとする「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」を含有する溶液を、前記（ｂ）の希釈液Ｂで希釈し、「キレート剤含有・ＣＲＰに結合する特異的結合物質の試料」を調製する。
また、前記（ｂ）の希釈液Ｂを、「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」を全く含有しない試料、すなわち陰性試料とする。
（ハ）測定
（ａ） 前記（イ）の（ａ）のＣＲＰ固定化マイクロプレートのウェルに、前記の（ロ）の（ｃ）の「カルシウムイオン含有・ＣＲＰに結合する特異的結合物質の試料」を添加する。
これにより、このウェルに固定化されているＣＲＰは、カルシウムイオンと結合したカルシウム結合型ＣＲＰとなる。
そして、一定時間静置して、試料に含まれるＣＲＰに結合する特異的結合物質と、ウェルに固定化されたカルシウム結合型ＣＲＰとの特異的結合反応を行わせる。
（ｂ） 前記（イ）の（ａ）のＣＲＰ固定化マイクロプレートの他のウェルに、前記の（ロ）の（ｄ）の「キレート剤含有・ＣＲＰに結合する特異的結合物質の試料」を添加する。
これにより、このウェルに固定化されているＣＲＰは、カルシウム非結合型ＣＲＰとなる。
そして、一定時間静置して、試料に含まれるＣＲＰに結合する特異的結合物質と、ウェルに固定化されたカルシウム非結合型ＣＲＰとの特異的結合反応を行わせる。
（ｃ） 前記の各ウェル内の液を吸引し除去した後、各ウェルに前記の（イ）の（ｃ）の洗浄液を添加し、そしてこれを吸引除去し、洗浄を行う。この洗浄操作を数回繰り返し行う。
（ｄ） 前記の各ウェルに、前記の（イ）の（ｂ）の酵素標識抗体を添加し、一定時間静置する。
これにより、カルシウム結合型ＣＲＰ、又はカルシウム非結合型ＣＲＰを介して前記のＣＲＰ固定化マイクロプレートのウェルに結合した「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」に、酵素標識抗体を結合させる。
（ｅ） 前記の各ウェル内の液を吸引し除去した後、各ウェルに前記の洗浄液を添加し、そしてこれを吸引除去し、洗浄を行う。この洗浄操作を数回繰り返し行う。
（ｆ） 次に、前記の各ウェルに、前記の（イ）の（ｄ）の発色液を添加し、一定時間静置する。
これにより、「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」及び「カルシウム結合型ＣＲＰ又はカルシウム非結合型ＣＲＰ」を介して前記のＣＲＰ固定化マイクロプレートのウェルに結合した「酵素標識抗体」の標識酵素と、発色液に含有させた物質との反応により、発色反応を行わせる。
（ｇ） 前記の各ウェル内の液の吸光度を、その発色の測定に適した波長において、マイクロプレートリーダー等を用いて測定する。
（ｈ） 前記の試料に替えて、前記の陰性試料を用いる以外は、前記（ａ）〜（ｇ）の通りに操作を行い、吸光度を測定する。
（ｉ） カルシウム結合型ＣＲＰを固定化したウェルにおける前記（ｇ）において測定された吸光度から前記（ｈ）において測定された吸光度を差し引き算出した吸光度差の値を得る。
本測定系において、この吸光度差の値が、「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の「カルシウム結合型ＣＲＰ」との結合性を反映した値であり、この吸光度差の値が高い程、「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の「カルシウム結合型ＣＲＰ」との結合性が高いことを示す。
そして、この吸光度差の値が低い程、「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の「カルシウム結合型ＣＲＰ」との結合性が低いことを示す。
（ｊ） また、カルシウム非結合型ＣＲＰを固定化したウェルにおける前記（ｇ）において測定された吸光度から前記（ｈ）において測定された吸光度を差し引き算出した吸光度差の値を得る。
本測定系において、この吸光度差の値が、「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の「カルシウム非結合型ＣＲＰ」との結合性を反映した値であり、この吸光度差の値が高い程、「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の「カルシウム非結合型ＣＲＰ」との結合性が高いことを示す。
そして、この吸光度差の値が低い程、「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の「カルシウム非結合型ＣＲＰ」との結合性が低いことを示す。
（ｋ） ＣＲＰに結合する特異的結合物質が、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質であるか、又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質であるかの判定は、前記の通り、カルシウム結合型ＣＲＰと結合するが、カルシウム非結合型ＣＲＰとはその結合活性が著しく低下する「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」については、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質」であると判定する。
また、カルシウム結合型ＣＲＰとも、カルシウム非結合型ＣＲＰとも、ほぼ同程度に結合する「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」については、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質」であると判定する。
（ｌ） なお、前記の（ａ）〜（ｈ）の測定操作において、測定に用いるカルシウム結合型ＣＲＰを固定化したウェルと、カルシウム非結合型ＣＲＰを固定化したウェルとは、同一のマイクロタイタープレートのウェルであることが好ましい。
また、前記の（ａ）〜（ｈ）の測定操作は、それぞれ時間を置かずに連続して行うことが好ましい。
なお、この判定は、具体的には次のようにして行なうこともできる。
（３）複数試料を測定することによる判定
（イ） 前記（２）の「判定の具体例」の記載に従い判定を行う場合、複数の試料について測定を行うこと、すなわち、ＣＲＰに結合する特異的結合物質の濃度を変えた複数の試料について測定を行うことが好ましい。
（ロ） この具体的な例は、後述の〔実施例１〕に記載された通りであるが、複数の濃度の「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の試料を前記の「判定の具体例」の記載に従い測定して得られた吸光度差の値を縦軸に、測定を行った試料の「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の濃度を横軸にとり、カルシウム結合型ＣＲＰを固定化したウェルにおける測定値（吸光度差）、及びカルシウム非結合型ＣＲＰを固定化したウェルにおける測定値（吸光度差）をそれぞれプロットしたグラフ（図）を作成する。
（ハ） このグラフにおける、「カルシウム結合型ＣＲＰ」を固定化したウェルにおける測定値（吸光度差）を結んだ曲線、すなわち試料中の「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の「カルシウム結合型ＣＲＰ」との結合性を示す曲線と、「カルシウム非結合型ＣＲＰ」を固定化したウェルにおける測定値（吸光度差）を結んだ曲線、すなわち試料中の「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の「カルシウム非結合型ＣＲＰ」との結合性を示す曲線とを比較する。
（ニ） ここで、このグラフにおいて、上記の「カルシウム結合型ＣＲＰとの結合性を示す曲線」と、上記の「カルシウム非結合型ＣＲＰとの結合性を示す曲線」とが、大きくかい離している場合は、試料中の「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」は、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質」であると判定する。
（ホ） また、このグラフにおいて、上記の「カルシウム結合型ＣＲＰとの結合性を示す曲線」と、上記の「カルシウム非結合型ＣＲＰとの結合性を示す曲線」とが、かい離していないか又は僅かしかかい離していない場合は、試料中の「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」は、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質」であると判定する。
（４）更なる判定方法
前記の通りで判定が難しいときには、次のようにして、ＣＲＰに結合する特異的結合物質が、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質」であるか、又は「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質」であるかを判定することができる。
（イ） まず、前記（３）の「複数試料を測定することによる判定」の記載に従い、試料中の「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の「カルシウム結合型ＣＲＰとの結合性を示す曲線」（カルシウム結合型ＣＲＰを固定化したウェルにおける測定値〔吸光度差〕を結んだ曲線）と、「カルシウム非結合型ＣＲＰとの結合性を示す曲線」（カルシウム非結合型ＣＲＰを固定化したウェルにおける測定値〔吸光度差〕を結んだ曲線）が示されたグラフ（図）を作成する。
（ロ） 次に、このグラフにおける「カルシウム結合型ＣＲＰとの結合性を示す曲線」が試料中の「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の濃度が増すにつれ増加し、プラトー又は極大に達するときの吸光度差の値（Ａ）を求める。
（ハ） 次に、このグラフの「カルシウム結合型ＣＲＰとの結合性を示す曲線」において、吸光度差の値が、前記のプラトー又は極大に達するときの吸光度差の値（Ａ）の１／２の値（Ａ／２）となるときの「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の濃度の値（Ｃ１）を求める。
（ニ） また、このグラフの「カルシウム非結合型ＣＲＰとの結合性を示す曲線」において、吸光度差の値が、前記（ハ）の「Ａ／２」の値となるときの「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の濃度の値（Ｃ２）を求める。
（ホ） 次に、前記の「Ｃ１」の値と「Ｃ２」の値とを対比し、「Ｃ２／Ｃ１」の値を求める。
（ヘ） そして、「Ｃ２／Ｃ１」の値が、３以上のときは、試料中の「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」は、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質」であると判定する。
また、「Ｃ２／Ｃ１」の値が、３未満のときは、試料中の「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」は、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質」であると判定する。
（ト） なお、このグラフの「カルシウム非結合型ＣＲＰとの結合性を示す曲線」で、横軸の試料中の「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」の濃度が、前記（ハ）で求めた「Ｃ１」の値を３倍した「３＊Ｃ１」の値までの範囲において、前記「カルシウム非結合型ＣＲＰとの結合性を示す曲線」が前記（ハ）の「Ａ／２」の値に達しないものであるときは、それは「Ｃ２／Ｃ１」の値が３以上であることに等しいので、試料中の「ＣＲＰに結合する特異的結合物質」は、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質」であると判定する。
〔７〕カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体
本発明における、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体は、前記のカルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を、担体に固定化したものである。
この、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体と、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体との混合物であってもよい。
この場合のカルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体と、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体との混合比率は、用いる各々の特異的結合物質や使用する担体の種類などの条件等により異なるため一概に言うことは出来ないが、例えば、両方の担体が同一濃度となるよう混合して用いること等を挙げることができる。
また、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質と、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質とが、同一の担体に固定化されたものであってもよい。
この場合のカルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質と、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質との比率は、用いる各々の特異的結合物質や使用する担体の種類などの条件等により異なるため一概に言うことは出来ないが、例えば、両方の特異的結合物質が同一比率となるよう担体に固定化すること等を挙げることができる。
そして、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体は、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体」と、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体」と、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質と、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質とが、同一の担体に固定化されたもの」との混合物であってもよい。
この担体の材質は、特に限定はなく、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ゼラチン、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等を挙げることができる。
そして、この担体は、ラテックス粒子、リポソーム、マイクロカプセル、又は赤血球等の粒子であって良い。
本発明における担体としては、粒子であることが好ましく、ラテックス粒子であることが特に好ましい。
カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を担体に固定化することは、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行なうことができる。
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質及び／又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質と、担体とを、緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、或いは緩衝液等に溶解したカルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質及び／又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を、担体に接触させること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質及び／又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質と、担体とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質及び／又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質と、担体の、それぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と前記の二価性の架橋試薬とを反応させること等により行うことができる。
なお、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体が、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体と、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体との混合物である場合は、前記の方法等により、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を担体に固定化し、また、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を担体に固定化し、これらの２種類の担体を混合する方法等を挙げることができる。
また、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体が、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質と、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質とが、同一の担体に固定化されたものである場合には、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質の両方を含む溶液を調製し、前記の方法等により、この溶液を担体に接触させ、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質と、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質とを、同一の担体に固定化する方法等を挙げることができる。
更に、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体の自然凝集や、非特異的反応等を抑制するために処理を行う必要があれば、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体の表面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
なお、本発明における試料中のＣＲＰの測定を、ラテックス比濁法等の比濁法により測定を行う場合、ラテックス粒子等の担体の大きさ（粒径）については、特に制限はない。
しかし、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体が、試料中に含まれていたＣＲＰとの複合体凝集物（凝集塊）を生成する程度、及びこの生成した複合体凝集物の測定の容易さ等の理由より、担体の大きさ（粒径）は、その平均径（平均粒径）が、０．０１μｍ〜１０μｍであることが好ましく、０．０４μｍ〜１μｍであることがより好ましい。
また、本発明の試料中のＣＲＰの測定方法及び測定試薬において、担体は、その大きさ（粒径）、材質、又は形状等が異なる２種類以上の担体を使用してもよい。
なお、本発明における試料中のＣＲＰの測定を、ラテックス比濁法等の比濁法により測定を行う場合、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体の測定反応時における濃度は、前記の特異的結合物質の担体表面上での分布密度、担体の大きさ（粒径）、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概に言うことはできない。
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、担体に固定化されたカルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質と、試料に含まれていたＣＲＰとの、特異的結合反応が行われる測定反応時に、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体の濃度が、この測定反応時の反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度のカルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体を測定試薬に含有させることが好ましい。
本発明の測定方法及び測定試薬においては、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；カルシウムイオンなどの各種金属イオン；カルシウム塩などの各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上と共存させてもよい。
なお、本発明の測定方法及び測定試薬においては、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体を、カルシウムイオン又はカルシウム塩と共存させることが好ましい。
そして、上記の各物質を共存させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
〔８〕試料
本発明において、試料とは、ＣＲＰが存在する可能性があり、かつＣＲＰの存在の有無、又は含有量（濃度）の測定を行おうとするものをいう。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、髄液若しくは腹水などの体液、又は臓器、組織若しくは細胞などの抽出液等、ＣＲＰが含まれる可能性のあるものを挙げることができる。
〔９〕容器
本発明の試料中のＣＲＰの測定方法に用いる容器は、特に限定はなく、適した物を用いることができる。
〔１０〕測定試薬
本発明における試料中のＣＲＰの測定試薬は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体を含有することを特徴とするものである。
これにより、試料中のＣＲＰの測定において低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができ、そして、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができるのである。
本発明の測定試薬は、一つの測定試薬よりなるものであってよい。
この場合、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体は、その一つの測定試薬に含有される。
また、本発明の測定試薬は、二つ以上の測定試薬より構成されるものであってよい。
この場合、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体は、二つ以上の測定試薬の内の一つの測定試薬に含有されるものであってもよく、また、二つ以上の測定試薬に含有されるものであってもよい。
例えば、本発明の測定試薬が、第１試薬及び第２試薬の二つの測定試薬より構成されるものである場合、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体は、第１試薬にのみ含有させてもよく、また、第２試薬にのみ含有させてもよく、更には、第１試薬と第２試薬の両方に含有させてもよい。
本発明の測定試薬が二つの測定試薬より構成される場合、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体は、第２試薬にのみ含有させることが好ましい。
また、本発明の測定試薬が二つ以上の測定試薬より構成されるものである場合、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体を含有さる試薬以外の試薬、すなわち、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体を含有しない試薬は、例えば緩衝液等であってよい。
なお、本発明の測定試薬の溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ５〜ｐＨ１０の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
また、本発明の試料中のＣＲＰの測定試薬には、前記のカルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；カルシウムイオンなどの各種金属イオン；カルシウム塩などの各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。
なお、本発明の測定試薬には、カルシウムイオン又はカルシウム塩を含有させることが好ましい。
そして、これらを本発明の測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
なお、本発明の試料中のＣＲＰの測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中のＣＲＰの測定に使用することができる。
また、本発明の試料中のＣＲＰの測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中のＣＲＰの測定に使用することもできる。
前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
〔１１〕測定方法
本発明における試料中のＣＲＰの測定方法は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を各々担体に固定化し、当該担体に固定化した特異的結合物質と試料中に含まれていたＣＲＰとの当該特異的結合反応により生成した当該特異的結合物質とＣＲＰとの複合体凝集物を測定することにより、試料中のＣＲＰを測定する方法である。
本発明の試料中のＣＲＰの測定方法における測定操作は、公知の測定操作に従って行うことができる。
例えば、まず、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体〔例えば、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体と、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体との混合物」、又は「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質と、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質とが、同一の担体に固定化されたもの」等〕を含有する測定試薬を調製し、準備する。
次に、試料と、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体を含有する測定試薬とを混合し、接触させる。
これにより、担体に固定化したカルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質と、試料中に含まれていたＣＲＰとの、特異的結合反応を行わせる。
なお、この特異的結合反応を行わせる際には、カルシウムイオン又はカルシウム塩を存在させることが好ましい。
次に、この特異的結合反応により生成した、担体に固定化したカルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質と、ＣＲＰとの複合体凝集物を測定する。
この生成した複合体凝集物の測定は、この複合体凝集物が存在する測定反応時の反応混合液の透過光又は散乱光などの吸光度等の測定を、エンドポイント法又はレート法等により行うことにより、実施する。
そして、試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質（ＣＲＰ濃度が既知の試料）を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていたＣＲＰの濃度（定量値）を算出する。
なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、透過光を測定しても、又は散乱光を測定してもよく、そして、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差または比）であってもよい。
なお、測定波長は、３４０ｎｍから１，０００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。
なお、本発明の試料中のＣＲＰの測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。
測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。
また、この測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。
以下、ラテックス比濁法を測定原理とする試料中のＣＲＰの測定試薬を用いて、試料中のＣＲＰの測定を行う場合を例にとって、具体的に説明を行う。
（１） まず、試料中のＣＲＰの測定試薬として、以下のものを調製し、準備する。
第１試薬： 緩衝剤を含有させｐＨを一定の値に調整した緩衝液
第２試薬： カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体と、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体とが、同一のラテックス粒子に固定化されたものを含有する緩衝液
（２） 血清等の試料の一定量と前記の第１試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
なお、試料と第１試薬の混合比率（量比）は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃〜３０℃）又は微温（３０℃〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
（３） 一定時間後、前記の試料と第１試薬との混合液に、前記の第２試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
なお、第２試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃〜３０℃）又は微温（３０℃〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
そして、前記の静置の時間は、１分以上、１０分以下の一定時間であることが好ましく、３分以上、５分以下の一定時間であることがより好ましい。
試料と第１試薬との混合液への第２試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化したカルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体と、試料中に含まれていたＣＲＰとの抗原抗体反応（測定反応）を行わせる。
そして、この抗原抗体反応（測定反応）により、「…〔カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体＝ラテックス粒子＝カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体〕−〔ＣＲＰ〕−〔カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体＝ラテックス粒子＝カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体〕…」等の架橋が形成され、ＣＲＰを介した、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体を固定化したラテックス粒子」同士の複合体凝集物が生成する。
（４） そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生じるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料中に含まれていたＣＲＰの量を求める。
（５） そして、「試料の測定を行って得た測定値（透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値）」と、「標準液又は標準血清等の標準物質（濃度既知のＣＲＰを含む試料）の測定を行って得た測定値（透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値）」とを比較することにより、測定を行った試料中に含まれるＣＲＰの量（濃度）の算出を行う。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

（抗ＣＲＰ抗体の確認）
ペルオキシダーゼ標識抗体及びＣＲＰ固定化プレートを使用し、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）のサンドイッチ法により、４種類の抗ＣＲＰ抗体のそれぞれについて、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体であるか、又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体であるかの判定を行った。
１．試薬の調製
（１）ペルオキシダーゼ標識抗体の調製
ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体溶液（Ｊａｃｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社）を、０．５％カゼイン溶液で２０００倍に希釈し調製し、ペルオキシダーゼ標識抗体とした。
（２）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水〔ｐＨ７．２（２０℃）〕を調製し、洗浄液とした。
（３）ＣＲＰ固定化プレートの調製
遺伝子組換えＣＲＰ（オリエンタル酵母工業社）を、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水〔ｐＨ７．４（２０℃）〕で５μｇ／ｍＬの濃度になるように希釈し、９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社）に１ウェル当たり５０μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、前記ＣＲＰを前記マイクロプレートの各ウェルに吸着させ、固定化した。
このＣＲＰが固定化されたマイクロタイタープレートを前記（２）の洗浄液を１ウェル当たり３００μＬずつ加えて洗浄し、この洗浄を計５回行った後、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．５％カゼイン溶液を１ウェル当たり２００μＬずつ加えて、４℃で一晩静置してブロッキング処理を行い、ＣＲＰ固定化プレートを調製した。
（４）発色液の調製
０．１Ｍクエン酸緩衝液〔ｐＨ４．０（２０℃）〕の１００ｍＬに、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス［３−エチル−２，３−ジヒドロベンゾチアゾール−６−スルホン酸］）（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０ｍｇ及び３０％過酸化水素水１０μＬを使用の直前に添加し、調製し、発色液とした。
２．抗体試料の調製
（１）希釈液Ａの調製
０．５％カゼイン水溶液に、塩化カルシウムを２ｍＭとなるように溶解して調製し、これを希釈液Ａとした。
（２）希釈液Ｂの調製
０．５％カゼイン水溶液に、キレート剤であるＥＤＴＡ・２ナトリウム塩（同仁化学研究所社）を１０ｍＭとなるように溶解して調製し、これを希釈液Ｂとした。
（３）抗ＣＲＰ抗体
抗ＣＲＰ抗体として、次の４種類の市販の抗体を用意した。
（イ） 抗体−１： マウス抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体〔クローン：ＣＲＢ−０１８〕（日本バイオテスト研究所社）
（ロ） 抗体−２： マウス抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体〔クローン：ＣＲＢ−０２３〕（日本バイオテスト研究所社）
（ハ） 抗体−３： マウス抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体〔クローン：ＣＲＢ−０３１〕（日本バイオテスト研究所社）
（ニ） 抗体−４： マウス抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体〔クローン：ＣＲＢ−０３２〕（日本バイオテスト研究所社）
（４）抗体試料の調製
（イ）カルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料
前記（３）の抗体−１から抗体−４までの４種類の抗ＣＲＰ抗体を、前記（１）で調製した希釈液Ａで各々希釈し、抗ＣＲＰ抗体の濃度がそれぞれ０．０１０μｇ／ｍＬ、０．１０μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１０．０μｇ／ｍＬ、又は１００．０μｇ／ｍＬであるカルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料をそれぞれ調製した。
また、前記（１）で調製した希釈液Ａを、抗ＣＲＰ抗体の濃度が０μｇ／ｍＬのカルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料とした。
（ロ）ＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料
前記（３）の抗体−１から抗体−４までの４種類の抗ＣＲＰ抗体を、前記（２）で調製した希釈液Ｂで各々希釈し、抗ＣＲＰ抗体の濃度がそれぞれ０．０１０μｇ／ｍＬ、０．１０μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１０．０μｇ／ｍＬ、又は１００．０μｇ／ｍＬであるＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料をそれぞれ調製した。
また、前記（２）で調製した希釈液Ｂを、抗ＣＲＰ抗体の濃度が０μｇ／ｍＬのＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料とした。
３．ＥＬＩＳＡ法による測定
（１）測定
（イ） 前記１の（３）で調製したＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに、前記１の（２）で調製した洗浄液を１ウェル当たり４００μＬずつ加えて洗浄し、この洗浄を計５回行った。
（ロ） その後、前記２の（４）の（イ）で調製した、抗体−１から抗体−４までの４種類の抗ＣＲＰ抗体各々について、抗ＣＲＰ抗体の濃度がそれぞれ０μｇ／ｍＬ、０．０１０μｇ／ｍＬ、０．１０μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１０．０μｇ／ｍＬ、又は１００．０μｇ／ｍＬであるカルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料〔抗ＣＲＰ抗体４種類×６濃度＝計２４種類）の５０μＬを、それぞれ前記（イ）で洗浄したＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに添加し、３７℃で２時間静置して、ＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに固定化したＣＲＰと、前記の各抗ＣＲＰ抗体との抗原抗体反応を行わせた。
なお、このとき、ＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに固定化されたＣＲＰは、カルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料の添加、接触により、カルシウム結合型ＣＲＰとなっている。
よって、このとき、各ウェルに固定化されたカルシウム結合型ＣＲＰに対する、前記の各抗ＣＲＰ抗体の結合性が試験される。
（ハ） その後、このＣＲＰ固定化プレートの各ウェル内のカルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料を吸引して除去し、前記１の（２）で調製した洗浄液を１ウェル当たり４００μＬずつ各ウェルに加えて洗浄し、この洗浄を計５回行った。
（ニ） 次に、前記１の（１）で調製したペルオキシダーゼ標識抗体をＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに５０μＬずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。
（ホ） 次いで、ＣＲＰ固定化プレートの各ウェルを前記１の（２）で調製した洗浄液を１ウェル当たり４００μＬずつ加えて洗浄し、この洗浄を計５回行った。
（ヘ） この後、前記１の（４）で調製した発色液１００μＬをＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに添加し、室温で３０分間反応させた。
（ト） その後、ＣＲＰ固定化プレートの各ウェル内の反応液の４１５ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製；３５５０型）を用いて測定した。
（チ） 抗体−１から抗体−４までの４種類の抗ＣＲＰ抗体毎に、抗ＣＲＰ抗体濃度がそれぞれ０．０１０μｇ／ｍＬ、０．１０μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１０．０μｇ／ｍＬ、又は１００．０μｇ／ｍＬのカルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料の測定値（吸光度）から、抗ＣＲＰ抗体濃度が０μｇ／ｍＬのカルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料の測定値（吸光度）を差し引いて、吸光度差の値を求めた。
（リ） 前記（ロ）における、カルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料〔抗ＣＲＰ抗体４種類×６濃度＝計２４種類）に替えて、ＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料〔抗ＣＲＰ抗体４種類×６濃度＝計２４種類）の５０μＬを、それぞれＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに添加すること以外は、前記（イ）〜（チ）の記載の通りに操作を行って、吸光度差の値を求めた。
なお、このＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料の測定においては、ＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料の添加、接触により、ＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに固定化されたＣＲＰに結合していたカルシウムイオンは、ＥＤＴＡ・２Ｎａと結合する等により、前記の各ウェルに固定化されたＣＲＰは、カルシウム非結合型ＣＲＰとなっている。
よって、このとき、各ウェルに固定化されたカルシウム非結合型ＣＲＰに対する、前記の各抗ＣＲＰ抗体の結合性が試験される。
（２）測定結果
前記（１）において、カルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料〔抗ＣＲＰ抗体４種類×６濃度＝計２４種類）、及びＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料〔抗ＣＲＰ抗体４種類×６濃度＝計２４種類）について測定を行い、各抗ＣＲＰ抗体のカルシウム結合型ＣＲＰ、及びカルシウム非結合型ＣＲＰとの結合性を見た試験において得られた吸光度差の値を、表１（抗体−１〜抗体−４）、並びに図１（抗体−１）、図２（抗体−２）、図３（抗体−３）及び図４（抗体−４）に示した。

なお、この図１、図２、図３及び図４において、横軸はＣＲＰ固定化プレートのウェルに添加した抗体試料中の抗ＣＲＰ抗体の濃度（μｇ／ｍＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値（４１５ｎｍ）を表す。
また、この図１、図２、図３及び図４において、「●」は各々のカルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料を測定したときの測定結果（吸光度差）を示し、「▲」は各々のＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料を測定したときの測定結果（吸光度差）を示す。
４．考察
（イ） 上記の検討結果より、抗体−１（図１）、抗体−２（図２）、及び抗体−３（図３）においてはそれぞれ、各抗ＣＲＰ抗体のカルシウム結合型ＣＲＰとの結合性を示す測定結果（カルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料）の曲線と、各抗ＣＲＰ抗体のカルシウム非結合型ＣＲＰとの結合性を示す測定結果（ＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料）の曲線が、大きくかい離していることが分かる。
すなわち、抗体−１、抗体−２、及び抗体−３では、カルシウム結合型ＣＲＰとの結合に比べ、カルシウム非結合型ＣＲＰとの結合が著しく低いことが分かる。
このことより、抗体−１、抗体−２、及び抗体−３はそれぞれ、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」であると、判定することができる。
（ロ） また、抗体−４（図４）においては、抗ＣＲＰ抗体のカルシウム結合型ＣＲＰとの結合性を示す測定結果（カルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料）の曲線と、抗ＣＲＰ抗体のカルシウム非結合型ＣＲＰとの結合性を示す測定結果（ＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料）の曲線が、ほとんどかい離していないことが分かる。
すなわち、抗体−４は、カルシウム結合型ＣＲＰとも、カルシウム非結合型ＣＲＰとも、ほぼ同程度に結合することが分かる。
このことより、抗体−４は、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」であると、判定することができる。

（抗ＣＲＰ抗体固定化ラテックス粒子の確認）
カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体を固定化したラテックス粒子、又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体を固定化したラテックス粒子について、試料中のＣＲＰとの反応性を確認した。
１．測定試薬
（１）第１試薬
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２Ｍ塩化ナトリウム、０．２ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製し、第１試薬とした。
（２）第２試薬
（イ）第２試薬〔抗体−１〕
平均粒径０．１μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液０．０９４ｍＬに、実施例１の２の（３）の抗体−１〔カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）〕を０．１ｇ／ｄＬの濃度で６．７ｍＭ ＭＥＳ緩衝液〔ｐＨ５．０（２０℃）〕に混和した液０．５０９８ｍＬを加え、５℃にて一晩撹拌した。これにより、前記の抗体−１をラテックス粒子に固定化した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に１．０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１００ｍＭグリシン緩衝液〔ｐＨ９．５（２０℃）〕を加え懸濁し、室温下で３０分間撹拌し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で波長５８５ｎｍにおける吸光度が９．５ＯＤとなるように懸濁した。
そして、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液により希釈して、抗体−１を固定化したラテックス粒子の０．０６０％懸濁液を調製した。
これを第２試薬〔抗体−１〕とした。
（ロ）第２試薬〔抗体−２〕
前記（イ）における抗体−１を、実施例１の２の（３）の抗体−２〔カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）〕に変えること以外は、前記（イ）の記載の通りに操作を行い、抗体−２を固定化したラテックス粒子の０．０６０％懸濁液を調製した。
これを第２試薬〔抗体−２〕とした。
（ハ）第２試薬〔抗体−３〕
前記（イ）における抗体−１を、実施例１の２の（３）の抗体−３〔カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）〕に変えること以外は、前記（イ）の記載の通りに操作を行い、抗体−３を固定化したラテックス粒子の０．０６０％懸濁液を調製した。
これを第２試薬〔抗体−３〕とした。
（ニ）第２試薬〔抗体−４〕
前記（イ）における抗体−１を、実施例１の２の（３）の抗体−４〔カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）〕に変えること以外は、前記（イ）の記載の通りに操作を行い、抗体−４を固定化したラテックス粒子の０．０６０％懸濁液を調製した。
これを第２試薬〔抗体−４〕とした。
２．試料
（１）試料希釈液の調製
４％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．２ｍＭ塩化カルシウム・２水和物、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製して、試料希釈液とした。
（２）試料の調製
遺伝子組み換え体ＣＲＰ（オリエンタル酵母工業社製）を、前記（１）の試料希釈液で希釈することにより、次のＣＲＰ濃度の試料をそれぞれ調製した。
また、生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）を、ＣＲＰ濃度０ｍｇ／ｄＬの試料とした。
（イ）試料１： ０ｍｇ／ｄＬ
（ロ）試料２： ０．５ｍｇ／ｄＬ
（ハ）試料３： ２．０ｍｇ／ｄＬ
（ニ）試料４： ６．０ｍｇ／ｄＬ
（ホ）試料５： １８．０ｍｇ／ｄＬ
（ヘ）試料６： ３０．０ｍｇ／ｄＬ
３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
（イ） 測定は、日立−７１８０形自動分析装置（日立製作所社製）を使用して行った。
まず、測定用セル（キュベット）に、前記２の（２）の試料１、試料２、試料３、試料４、試料５、又は試料６の３μＬを添加した。
次に、これらの測定用セル（キュベット）に、前記１の（１）の第１試薬の１００μＬを添加し、混合した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置した。
（ロ） 前記の第１試薬の添加後４分３４秒目（１６ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液に、更に、前記１の（２）の（イ）の第２試薬〔抗体−１〕の１００μＬを添加し、混合した。
（ハ） 前記の第１試薬の添加後５分０９秒目（１８ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液の吸光度（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を試料盲検として測定した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置して、反応を行わせた。
これにより、前記のラテックス粒子に固定化された抗ＣＲＰ抗体と、前記の試料に含まれていたＣＲＰとの抗原抗体反応を行わせ、ラテックス粒子の凝集塊を生成させた。
（ニ） 前記の第１試薬の添加後９分５４秒目（３４ポイント目）に、この測定用セル（キュベット）内の反応混合液の吸光度（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を、前記試料の測定値として測定した。
（ホ） 前記（ニ）において測定した吸光度（測定値）から前記（ロ）において測定した吸光度（試料盲検）を差し引き、吸光度差を得た。
なお、この吸光度差は試料に含まれるＣＲＰの量（濃度）に比例したものである。
（ヘ） なお、前記（ロ）において、第２試薬〔抗体−１〕に替えて、前記１の（２）の（ロ）の第２試薬〔抗体−２〕を用いること以外は、前記（イ）〜（ホ）の通りに操作を行い、第２試薬として第２試薬〔抗体−２〕を用いた場合の各試料の吸光度差を得た。
（ト） また、前記（ロ）において、第２試薬〔抗体−１〕に替えて、前記１の（２）の（ハ）の第２試薬〔抗体−３〕を用いること以外は、前記（イ）〜（ホ）の通りに操作を行い、第２試薬として第２試薬〔抗体−３〕を用いた場合の各試料の吸光度差を得た。
（チ） そして、前記（ロ）において、第２試薬〔抗体−１〕に替えて、前記１の（２）の（ニ）の第２試薬〔抗体−４〕を用いること以外は、前記（イ）〜（ホ）の通りに操作を行い、第２試薬として第２試薬〔抗体−４〕を用いた場合の各試料の吸光度差を得た。
（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、表２及び図５に示した。
なお、この図５において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。
また、この図５において、「□」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−１〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「○」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−２〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「△」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−３〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「◇」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−４〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示す。

４．考察
（イ） この表２及び図５より、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−１」、「抗体−２」、そして「抗体−３」を用いた場合にはそれぞれ、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときはＣＲＰとの反応性は低く測定の感度は高くないものの、中濃度域から高濃度域までＣＲＰとの反応性は高く、試料中のＣＲＰ濃度の増加に応じて吸光度差の値が増加してゆき、すなわち試料中のＣＲＰ濃度の増加に応じて複合体凝集物の生成量が増加してゆくことが分かる。
よって、前記の「抗体−１」、「抗体−２」、そして「抗体−３」を用いた場合、すなわち「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」を用いた場合には、低濃度域では低感度であるものの、中濃度域から高濃度域に渡っては感度高く測定の定量性を有するものであることが確かめられた。
（ロ） また、この表２及び図５より、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−４」を用いた場合には、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときはＣＲＰとの反応性は高く測定の感度は高いものの、中濃度域から高濃度域に掛けては、試料中のＣＲＰ濃度が増加しても吸光度差の値は増加しないか又は低下し、すなわち試料中のＣＲＰ濃度が増加しても複合体凝集物の生成量は増加しないか又は低下することが分かる。
よって、前記の「抗体−４」を用いた場合、すなわち「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」を用いた場合には、低濃度域では高感度であるものの、中濃度域から高濃度域に掛けては測定の定量性を有しないものであることが確かめられた。

（本願発明の試料中のＣＲＰの測定方法及び測定試薬の効果の確認−１）
カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−１）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−４）を固定化したラテックス粒子を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確かめた。
１．測定試薬
（１）第１試薬
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２Ｍ塩化ナトリウム、０．２ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製し、第１試薬とした。
（２）第２試薬
（イ）抗体−１固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
平均粒径０．１μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液０．０９４ｍＬに、実施例１の２の（３）の抗体−１〔カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）〕を０．１ｇ／ｄＬの濃度で６．７ｍＭ ＭＥＳ緩衝液〔ｐＨ５．０（２０℃）〕に混和した液０．５０９８ｍＬを加え、５℃にて一晩撹拌した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に１．０％ＢＳＡを含む１００ｍＭグリシン緩衝液〔ｐＨ９．５（２０℃）〕を加え懸濁し、室温下で３０分間撹拌し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で波長５８５ｎｍにおける吸光度が９．５ＯＤとなるように懸濁した。
そして、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液により希釈して、抗体−１（カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子の０．１２０％懸濁液を調製した。
これを抗体−１固定化ラテックス粒子懸濁液とした。
（ロ）抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
平均粒径０．１μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液０．０９４ｍＬに、実施例１の２の（３）の抗体−４〔カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）〕を０．１ｇ／ｄＬの濃度で６．７ｍＭ ＭＥＳ緩衝液〔ｐＨ５．０（２０℃）〕に混和した液０．５０９８ｍＬを加え、５℃にて一晩撹拌した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に１．０％ＢＳＡを含む１００ｍＭグリシン緩衝液〔ｐＨ９．５（２０℃）〕を加え懸濁し、室温下で３０分間撹拌し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で波長５８５ｎｍにおける吸光度が９．５ＯＤとなるように懸濁した。
そして、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液により希釈して、抗体−４（カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子の０．０３６％懸濁液を調製した。
これを抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液とした。
（ハ）第２試薬〔抗体−１〕の調製
前記（イ）で調製した抗体−１固定化ラテックス粒子懸濁液の５ｍＬと、０．０５％アジ化ナトリウム水溶液の５ｍＬとを混合し、０．０６０％の「抗体−１（カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子」を含有する縣濁液を調製した。
これを第２試薬〔抗体−１〕とした。
（ニ）第２試薬〔抗体−４〕の調製
前記（ロ）で調製した抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液の５ｍＬと、０．０５％アジ化ナトリウム水溶液の５ｍＬとを混合し、０．０１８％の「抗体−４（カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子」を含有する縣濁液を調製した。
これを第２試薬〔抗体−４〕とした。
（ホ）第２試薬〔抗体−１・抗体−４〕の調製
前記（イ）で調製した抗体−１固定化ラテックス粒子懸濁液の５ｍＬと、前記（ロ）で調製した抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液の５ｍＬとを混合し、０．０６０％の「抗体−１（カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子」、及び０．０１８％の「抗体−４（カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子」を含有する縣濁液を調製した。
これを第２試薬〔抗体−１・抗体−４〕とした。
２．試料
（１）試料希釈液の調製
４％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．２ｍＭ塩化カルシウム・２水和物、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製して、試料希釈液とした。
（２）試料の調製
遺伝子組み換え体ＣＲＰ（オリエンタル酵母工業社製）を、前記（１）の試料希釈液で希釈することにより、次のＣＲＰ濃度の試料をそれぞれ調製した。
また、生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）を、ＣＲＰ濃度０ｍｇ／ｄＬの試料とした。
（イ）試料１： ０ｍｇ／ｄＬ
（ロ）試料２： ０．５ｍｇ／ｄＬ
（ハ）試料３： ２．０ｍｇ／ｄＬ
（ニ）試料４： ６．０ｍｇ／ｄＬ
（ホ）試料５： １８．０ｍｇ／ｄＬ
（ヘ）試料６： ３０．０ｍｇ／ｄＬ
３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
（イ） 測定は、日立−７１８０形自動分析装置（日立製作所社製）を使用して行った。
まず、測定用セル（キュベット）に、前記２の（２）の試料１、試料２、試料３、試料４、試料５、又は試料６の３μＬを添加した。
次に、これらの測定用セル（キュベット）に、前記１の（１）の第１試薬の１００μＬを添加し、混合した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置した。
（ロ） 前記の第１試薬の添加後４分３４秒目（１６ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液に、更に、前記１の（２）の（ハ）の第２試薬〔抗体−１〕の１００μＬを添加し、混合した。
（ハ） 前記の第１試薬の添加後５分０９秒目（１８ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液の吸光度（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を試料盲検として測定した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置して、反応を行わせた。
これにより、前記のラテックス粒子に固定化された抗ＣＲＰ抗体と、前記の試料に含まれていたＣＲＰとの抗原抗体反応を行わせ、ラテックス粒子の凝集塊を生成させた。
（ニ） 前記の第１試薬の添加後９分５４秒目（３４ポイント目）に、この測定用セル（キュベット）内の反応混合液の吸光度（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を、前記試料の測定値として測定した。
（ホ） 前記（ニ）において測定した吸光度（測定値）から前記（ハ）において測定した吸光度（試料盲検）を差し引き、吸光度差を得た。
なお、この吸光度差は試料に含まれるＣＲＰの量（濃度）に比例したものである。
（ヘ） なお、前記（ロ）において、前記の第２試薬〔抗体−１〕に替えて、前記１の（２）の（ニ）の第２試薬〔抗体−４〕を用いること以外は、前記（イ）〜（ホ）の通りに操作を行い、第２試薬として第２試薬〔抗体−４〕を用いた場合の各試料の吸光度差を得た。
（ト） また、前記（ロ）において、前記の第２試薬〔抗体−１〕に替えて、前記１の（２）の（ホ）の第２試薬〔抗体−１・抗体−４〕を用いること以外は、前記（イ）〜（ホ）の通りに操作を行い、第２試薬として第２試薬〔抗体−１・抗体−４〕を用いた場合の各試料の吸光度差を得た。
（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、表３及び図６に示した。
なお、この図６において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。
また、この図６において、「△」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−１〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「○」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−４〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「■」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−１・抗体−４〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示す。

４．考察
（イ） この表３及び図６より、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−１」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−１〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには低感度であるものの、中濃度域から高濃度域に渡っては感度高く測定の定量性を有するものであることが分かる。
（ロ） また、この表３及び図６より、前記の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−４」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−４〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには高感度であるものの、中濃度域から高濃度域に掛けては測定の定量性を有しないものであることが分かる。
（ハ） これに対して、この表３及び図６より、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−１」と、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−４」とを組み合わせて使用した場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−１・抗体−４〕」である場合には）、試料中のＣＲＰの測定において低濃度から高濃度まで測定範囲が拡がっていることが分かる。
すなわち、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定方法及び測定試薬であることが確かめられた。

（本願発明の試料中のＣＲＰの測定方法及び測定試薬の効果の確認−２）
カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−２）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−４）を固定化したラテックス粒子を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確かめた。
１．測定試薬
（１）第１試薬
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２Ｍ塩化ナトリウム、０．２ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製し、第１試薬とした。
（２）第２試薬
（イ）抗体−２固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
平均粒径０．１μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液０．０９４ｍＬに、実施例１の２の（３）の抗体−２〔カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）〕を０．１ｇ／ｄＬの濃度で６．７ｍＭ ＭＥＳ緩衝液〔ｐＨ５．０（２０℃）〕に混和した液０．５０９８ｍＬを加え、５℃にて一晩撹拌した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に１．０％ＢＳＡを含む１００ｍＭグリシン緩衝液〔ｐＨ９．５（２０℃）〕を加え懸濁し、室温下で３０分間撹拌し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で波長５８５ｎｍにおける吸光度が９．５ＯＤとなるように懸濁した。
そして、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液により希釈して、抗体−２（カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子の０．１２０％懸濁液を調製した。
これを抗体−２固定化ラテックス粒子懸濁液とした。
（ロ）抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
前記の実施例３の１の（２）の（ロ）の記載の通りに行い、抗体−４（カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子の０．０３６％懸濁液を調製し、これを抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液とした。
（ハ）第２試薬〔抗体−２〕の調製
前記（イ）で調製した抗体−２固定化ラテックス粒子懸濁液の５ｍＬと、０．０５％アジ化ナトリウム水溶液の５ｍＬとを混合し、０．０６０％の「抗体−２（カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子」を含有する縣濁液を調製した。
これを第２試薬〔抗体−２〕とした。
（ニ）第２試薬〔抗体−４〕の調製
前記（ロ）で調製した抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液の５ｍＬと、０．０５％アジ化ナトリウム水溶液の５ｍＬとを混合し、０．０１８％の「抗体−４（カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子」を含有する縣濁液を調製した。
これを第２試薬〔抗体−４〕とした。
（ホ）第２試薬〔抗体−２・抗体−４〕の調製
前記（イ）で調製した抗体−２固定化ラテックス粒子懸濁液の５ｍＬと、前記（ロ）で調製した抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液の５ｍＬとを混合し、０．０６０％の「抗体−２（カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子」、及び０．０１８％の「抗体−４（カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子」を含有する縣濁液を調製した。
これを第２試薬〔抗体−２・抗体−４〕とした。
２．試料
前記の実施例３の２の（１）及び（２）の記載の通りに行い、次のＣＲＰ濃度の試料をそれぞれ調製した。
（イ）試料１： ０ｍｇ／ｄＬ
（ロ）試料２： ０．５ｍｇ／ｄＬ
（ハ）試料３： ２．０ｍｇ／ｄＬ
（ニ）試料４： ６．０ｍｇ／ｄＬ
（ホ）試料５： １８．０ｍｇ／ｄＬ
（ヘ）試料６： ３０．０ｍｇ／ｄＬ
３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第２試薬として、前記１の（２）の（ハ）の第２試薬〔抗体−２〕、（ニ）の第２試薬〔抗体−４〕、及び（ホ）の第２試薬〔抗体−２・抗体−４〕をそれぞれ用いる他は、前記の実施例３の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。
（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、表４及び図７に示した。
なお、この図７において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。
また、この図７において、「△」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−２〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「○」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−４〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「■」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−２・抗体−４〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示す。

４．考察
（イ） この表４及び図７より、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−２」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−２〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには低感度であるものの、中濃度域から高濃度域に渡っては感度高く測定の定量性を有するものであることが分かる。
（ロ） また、この表４及び図７より、前記の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−４」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−４〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには高感度であるものの、中濃度域から高濃度域に掛けては測定の定量性を有しないものであることが分かる。
（ハ） これに対して、この表４及び図７より、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−２」と、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−４」とを組み合わせて使用した場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−２・抗体−４〕」である場合には）、試料中のＣＲＰの測定において低濃度から高濃度まで測定範囲が拡がっていることが分かる。
すなわち、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定方法及び測定試薬であることが確かめられた。

（本願発明の試料中のＣＲＰの測定方法及び測定試薬の効果の確認−３）
カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−３）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−４）を固定化したラテックス粒子を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確かめた。
１．測定試薬
（１）第１試薬
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２Ｍ塩化ナトリウム、０．２ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製し、第１試薬とした。
（２）第２試薬
（イ）抗体−３固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
平均粒径０．１μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液０．０９４ｍＬに、実施例１の２の（３）の抗体−３〔カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）〕を０．１ｇ／ｄＬの濃度で６．７ｍＭ ＭＥＳ緩衝液〔ｐＨ５．０（２０℃）〕に混和した液０．５０９８ｍＬを加え、５℃にて一晩撹拌した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に１．０％ＢＳＡを含む１００ｍＭグリシン緩衝液〔ｐＨ９．５（２０℃）〕を加え懸濁し、室温下で３０分間撹拌し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で波長５８５ｎｍにおける吸光度が９．５ＯＤとなるように懸濁した。
そして、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液により希釈して、抗体−３（カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子の０．１２０％懸濁液を調製した。
これを抗体−３固定化ラテックス粒子懸濁液とした。
（ロ）抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
前記の実施例３の１の（２）の（ロ）の記載の通りに行い、抗体−４（カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子の０．０３６％懸濁液を調製し、これを抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液とした。
（ハ）第２試薬〔抗体−３〕の調製
前記（イ）で調製した抗体−３固定化ラテックス粒子懸濁液の５ｍＬと、０．０５％アジ化ナトリウム水溶液の５ｍＬとを混合し、０．０６０％の「抗体−３（カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子」を含有する縣濁液を調製した。
これを第２試薬〔抗体−３〕とした。
（ニ）第２試薬〔抗体−４〕の調製
前記（ロ）で調製した抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液の５ｍＬと、０．０５％アジ化ナトリウム水溶液の５ｍＬとを混合し、０．０１８％の「抗体−４（カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子」を含有する縣濁液を調製した。
これを第２試薬〔抗体−４〕とした。
（ホ）第２試薬〔抗体−３・抗体−４〕の調製
前記（イ）で調製した抗体−３固定化ラテックス粒子懸濁液の５ｍＬと、前記（ロ）で調製した抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液の５ｍＬとを混合し、０．０６０％の「抗体−３（カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子」、及び０．０１８％の「抗体−４（カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体）を固定化したラテックス粒子」を含有する縣濁液を調製した。
これを第２試薬〔抗体−３・抗体−４〕とした。
２．試料
前記の実施例３の２の（１）及び（２）の記載の通りに行い、次のＣＲＰ濃度の試料をそれぞれ調製した。
（イ）試料１： ０ｍｇ／ｄＬ
（ロ）試料２： ０．５ｍｇ／ｄＬ
（ハ）試料３： ２．０ｍｇ／ｄＬ
（ニ）試料４： ６．０ｍｇ／ｄＬ
（ホ）試料５： １８．０ｍｇ／ｄＬ
（ヘ）試料６： ３０．０ｍｇ／ｄＬ
３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第２試薬として、前記１の（２）の（ハ）の第２試薬〔抗体−３〕、（ニ）の第２試薬〔抗体−４〕、及び（ホ）の第２試薬〔抗体−３・抗体−４〕をそれぞれ用いる他は、前記の実施例３の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。
（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、表５及び図８に示した。
なお、この図８において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。
また、この図８において、「△」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−３〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「○」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−４〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「■」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−３・抗体−４〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示す。

４．考察
（イ） この表５及び図８より、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−３」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−３〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには低感度であるものの、中濃度域から高濃度域にわたっては感度高く測定の定量性を有するものであることが分かる。
（ロ） また、この表５及び図８より、前記の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−４」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−４〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには高感度であるものの、中濃度域から高濃度域にかけては測定の定量性を有しないものであることが分かる。
（ハ） これに対して、この表５及び図８より、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−３」と、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−４」とを組み合わせて使用した場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−３・抗体−４〕」である場合には）、試料中のＣＲＰの測定において低濃度から高濃度まで測定範囲が拡がっていることが分かる。
すなわち、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定方法及び測定試薬であることが確かめられた。

（抗ＣＲＰ抗体の確認−２）
ペルオキシダーゼ標識抗体及びＣＲＰ固定化プレートを使用し、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）のサンドイッチ法により、抗ＣＲＰ抗体について、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体であるか、又はカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体であるかの判定を行った。
１．試薬の調製
（１）ペルオキシダーゼ標識抗体の調製
前記実施例１の１の（１）の記載の通りに、ペルオキシダーゼ標識抗体を調製した。
（２）洗浄液の調製
前記実施例１の１の（２）の記載の通りに、洗浄液を調製した。
（３）ＣＲＰ固定化プレートの調製
前記実施例１の１の（３）の記載の通りに、ＣＲＰ固定化プレートを調製した。
（４）発色液の調製
前記実施例１の１の（４）の記載の通りに、発色液を調製した。
２．抗体試料の調製
（１）希釈液Ａの調製
前記実施例１の２の（１）の記載の通りに、希釈液Ａを調製した。
（２）希釈液Ｂの調製
前記実施例１の２の（２）の記載の通りに、希釈液Ｂを調製した。
（３）抗ＣＲＰ抗体
抗ＣＲＰ抗体として、次の市販の抗体を用意した。
抗体−５： マウス抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体〔クローン：ＣＲＢ−０２８〕（日本バイオテスト研究所社）
（４）抗体試料の調製
（イ）カルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料
前記（３）の抗体−５（抗ＣＲＰ抗体）を、前記（１）で調製した希釈液Ａで希釈し、抗ＣＲＰ抗体の濃度が０．０１０μｇ／ｍＬ、０．１０μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１０．０μｇ／ｍＬ、又は１００．０μｇ／ｍＬであるカルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料を調製した。
また、前記（１）で調製した希釈液Ａを、抗ＣＲＰ抗体の濃度が０μｇ／ｍＬのカルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料とした。
（ロ）ＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料
前記（３）の抗体−５（抗ＣＲＰ抗体）を、前記（２）で調製した希釈液Ｂで希釈し、抗ＣＲＰ抗体の濃度が０．０１０μｇ／ｍＬ、０．１０μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１０．０μｇ／ｍＬ、又は１００．０μｇ／ｍＬであるＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料を調製した。
また、前記（２）で調製した希釈液Ｂを、抗ＣＲＰ抗体の濃度が０μｇ／ｍＬのＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料とした。
３．ＥＬＩＳＡ法による測定
（１）測定
（イ） 前記１の（３）で調製したＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに、前記１の（２）で調製した洗浄液を１ウェル当たり４００μＬずつ加えて洗浄し、この洗浄を計５回行った。
（ロ） その後、前記２の（４）の（イ）で調製した、抗体−５（抗ＣＲＰ抗体）について、抗ＣＲＰ抗体の濃度が０μｇ／ｍＬ、０．０１０μｇ／ｍＬ、０．１０μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１０．０μｇ／ｍＬ、又は１００．０μｇ／ｍＬであるカルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料〔抗ＣＲＰ抗体１種類×６濃度＝計６種類）の５０μＬを、それぞれ前記（イ）で洗浄したＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに添加し、３７℃で２時間静置して、ＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに固定化したＣＲＰと、前記の抗ＣＲＰ抗体との抗原抗体反応を行わせた。
なお、このとき、ＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに固定化されたＣＲＰは、カルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料の添加、接触により、カルシウム結合型ＣＲＰとなっている。
よって、このとき、各ウェルに固定化されたカルシウム結合型ＣＲＰに対する、前記の抗ＣＲＰ抗体の結合性が試験される。
（ハ） その後、このＣＲＰ固定化プレートの各ウェル内のカルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料を吸引して除去し、前記１の（２）で調製した洗浄液を１ウェル当たり４００μＬずつ各ウェルに加えて洗浄し、この洗浄を計５回行った。
（ニ） 次に、前記１の（１）で調製したペルオキシダーゼ標識抗体をＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに５０μＬずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。
（ホ） 次いで、ＣＲＰ固定化プレートの各ウェルを前記１の（２）で調製した洗浄液を１ウェル当たり４００μＬずつ加えて洗浄し、この洗浄を計５回行った。
（ヘ） この後、前記１の（４）で調製した発色液１００μＬをＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに添加し、室温で３０分間反応させた。
（ト） その後、ＣＲＰ固定化プレートの各ウェル内の反応液の４１５ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製；３５５０型）を用いて測定した。
（チ） 抗体−５の抗ＣＲＰ抗体濃度が０．０１０μｇ／ｍＬ、０．１０μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１０．０μｇ／ｍＬ、又は１００．０μｇ／ｍＬのカルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料の測定値（吸光度）から、抗ＣＲＰ抗体濃度が０μｇ／ｍＬのカルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料の測定値（吸光度）を差し引いて、吸光度差の値を求めた。
（リ） 前記（ロ）における、カルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料〔抗ＣＲＰ抗体１種類×６濃度＝計６種類）に替えて、ＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料〔抗ＣＲＰ抗体１種類×６濃度＝計６種類）の５０μＬを、それぞれＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに添加すること以外は、前記（イ）〜（チ）の記載の通りに操作を行って、吸光度差の値を求めた。
なお、このＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料の測定においては、ＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料の添加、接触により、ＣＲＰ固定化プレートの各ウェルに固定化されたＣＲＰに結合していたカルシウムイオンは、ＥＤＴＡ・２Ｎａと結合する等により、前記の各ウェルに固定化されたＣＲＰは、カルシウム非結合型ＣＲＰとなっている。
よって、このとき、各ウェルに固定化されたカルシウム非結合型ＣＲＰに対する、前記の抗ＣＲＰ抗体の結合性が試験される。
（２）測定結果
前記（１）において、カルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料〔抗ＣＲＰ抗体１種類×６濃度＝計６種類）、及びＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料〔抗ＣＲＰ抗体１種類×６濃度＝計６種類）について測定を行い、抗ＣＲＰ抗体（抗体−５）のカルシウム結合型ＣＲＰ、及びカルシウム非結合型ＣＲＰとの結合性を見た試験において得られた吸光度差の値を、表６、及び図９に示した。

なお、この図９において、横軸はＣＲＰ固定化プレートのウェルに添加した抗体試料中の抗ＣＲＰ抗体の濃度（μｇ／ｍＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値（４１５ｎｍ）を表す。
また、この図９において、「●」は各々のカルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料を測定したときの測定結果（吸光度差）を示し、「▲」は各々のＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料を測定したときの測定結果（吸光度差）を示す。
４．考察
上記の検討結果より、抗体−５においては、抗ＣＲＰ抗体のカルシウム結合型ＣＲＰとの結合性を示す測定結果（カルシウムイオン含有・抗ＣＲＰ抗体試料）の曲線と、抗ＣＲＰ抗体のカルシウム非結合型ＣＲＰとの結合性を示す測定結果（ＥＤＴＡ含有・抗ＣＲＰ抗体試料）の曲線が、ほとんどかい離していないことが分かる。
すなわち、抗体−５は、カルシウム結合型ＣＲＰとも、カルシウム非結合型ＣＲＰとも、ほぼ同程度に結合することが分かる。
このことより、抗体−５は、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」であると、判定することができる。

（抗ＣＲＰ抗体固定化ラテックス粒子の確認−２）
カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体である、前記の抗体−５を固定化したラテックス粒子について、試料中のＣＲＰとの反応性を確認した。
１．測定試薬
（１）第１試薬
前記実施例２の１の（１）の記載の通りに、第１試薬を調製した。
（２）第２試薬
・第２試薬〔抗体−５〕
前記実施例２の１の（２）の（イ）における抗体−１を、実施例６の２の（３）の抗体−５〔カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）〕に変えること以外は、前記実施例２の１の（２）の（イ）の記載の通りに操作を行い、抗体−５を固定化したラテックス粒子の０．０６０％懸濁液を調製した。
これを第２試薬〔抗体−５〕とした。
２．試料
（１）試料希釈液の調製
前記実施例２の２の（１）の記載の通りに、試料希釈液を調製した。
（２）試料の調製
前記実施例２の２の（２）の記載の通りに、次の各試料を調製した。
（イ）試料１： ０ｍｇ／ｄＬ
（ロ）試料２： ０．５ｍｇ／ｄＬ
（ハ）試料３： ２．０ｍｇ／ｄＬ
（ニ）試料４： ６．０ｍｇ／ｄＬ
（ホ）試料５： １８．０ｍｇ／ｄＬ
（ヘ）試料６： ３０．０ｍｇ／ｄＬ
３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
（イ） 測定は、日立−７１８０形自動分析装置（日立製作所社製）を使用して行った。
まず、測定用セル（キュベット）に、前記２の（２）の試料１、試料２、試料３、試料４、試料５、又は試料６の３μＬを添加した。
次に、これらの測定用セル（キュベット）に、前記１の（１）の第１試薬の１００μＬを添加し、混合した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置した。
（ロ） 前記の第１試薬の添加後４分３４秒目（１６ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液に、更に、前記１の（２）の第２試薬〔抗体−５〕の１００μＬを添加し、混合した。
（ハ） 前記の第１試薬の添加後５分０９秒目（１８ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液の吸光度（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を試料盲検として測定した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置して、反応を行わせた。
これにより、前記のラテックス粒子に固定化された抗ＣＲＰ抗体と、前記の試料に含まれていたＣＲＰとの抗原抗体反応を行わせ、ラテックス粒子の凝集塊を生成させた。
（ニ） 前記の第１試薬の添加後９分５４秒目（３４ポイント目）に、この測定用セル（キュベット）内の反応混合液の吸光度（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を、前記試料の測定値として測定した。
（ホ） 前記（ニ）において測定した吸光度（測定値）から前記（ロ）において測定した吸光度（試料盲検）を差し引き、吸光度差を得た。
なお、この吸光度差は試料に含まれるＣＲＰの量（濃度）に比例したものである。
（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、表７及び図１０に示した。
なお、この図１０において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。
また、この図１０において、「▲」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−５〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示す。

４．考察
この表７及び図１０より、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−５」を用いた場合には、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときはＣＲＰとの反応性は高く測定の感度は高いものの、中濃度域から高濃度域に掛けては、試料中のＣＲＰ濃度が増加しても吸光度差の値は増加しないか又は低下し、すなわち試料中のＣＲＰ濃度が増加しても複合体凝集物の生成量は増加しないか又は低下することが分かる。
よって、前記の「抗体−５」を用いた場合、すなわち「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」を用いた場合には、低濃度域では高感度であるものの、中濃度域から高濃度域に掛けては測定の定量性を有しないものであることが確かめられた。

（本願発明の試料中のＣＲＰの測定方法及び測定試薬の効果の確認−４）
カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−１）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−４）を固定化したラテックス粒子を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確かめた。
１．測定試薬
（１）第１試薬
前記実施例３の１の（１）の記載の通りに、第１試薬を調製した。
（２）第２試薬
（イ）抗体−１固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
前記実施例３の１の（２）の（イ）の記載の通りに、抗体−１固定化ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（ロ）抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
前記実施例３の１の（２）の（ロ）の記載の通りに、抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（ハ）第２試薬〔抗体−１〕の調製
前記実施例３の１の（２）の（ハ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−１〕を調製した。
（ニ）第２試薬〔抗体−４〕の調製
前記実施例３の１の（２）の（ニ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−４〕を調製した。
（ホ）第２試薬〔抗体−１・抗体−４〕の調製
前記実施例３の１の（２）の（ホ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−１・抗体−４〕を調製した。
２．試料
前記実施例３の２の（１）及び（２）の記載の通りに行い、次のＣＲＰ濃度の試料をそれぞれ調製した。
（イ）試料１： ０ｍｇ／ｄＬ
（ロ）試料２： ０．５ｍｇ／ｄＬ
（ハ）試料３： ２．０ｍｇ／ｄＬ
（ニ）試料４： ６．０ｍｇ／ｄＬ
（ホ）試料５： １８．０ｍｇ／ｄＬ
（ヘ）試料６： ３０．０ｍｇ／ｄＬ
３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第２試薬として、前記１の（２）の（ハ）の第２試薬〔抗体−１〕、（ニ）の第２試薬〔抗体−４〕、及び（ホ）の第２試薬〔抗体−１・抗体−４〕をそれぞれ用い、前記実施例３の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。
（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、表８及び図１１に示した。
なお、この図１１において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。
また、この図１１において、「△」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−１〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「○」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−４〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「■」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−１・抗体−４〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示す。

４．考察
（イ） 前記実施例２の実験結果からも分かるように、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−１」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−１〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには低感度であるものの、中濃度域から高濃度域にわたっては感度高く測定の定量性を有するものである。
（ロ） また、前記実施例２の実験結果からも分かるように、前記の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−４」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−４〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには高感度であるものの、中濃度域から高濃度域にかけては測定の定量性を有しないものである。
（ハ） これに対して、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−１」と、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−４」とを組み合わせて使用した場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−１・抗体−４〕」である場合には）、試料中のＣＲＰの測定において低濃度から高濃度まで測定範囲が拡がっていることが分かる。
すなわち、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定方法及び測定試薬であることが確かめられた。

（本願発明の試料中のＣＲＰの測定方法及び測定試薬の効果の確認−５）
カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−２）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−４）を固定化したラテックス粒子を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確かめた。
１．測定試薬
（１）第１試薬
前記実施例４の１の（１）の記載の通りに、第１試薬を調製した。
（２）第２試薬
（イ）抗体−２固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
前記実施例４の１の（２）の（イ）の記載の通りに、抗体−２固定化ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（ロ）抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
前記実施例４の１の（２）の（ロ）の記載の通りに、抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（ハ）第２試薬〔抗体−２〕の調製
前記実施例４の１の（２）の（ハ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−２〕を調製した。
（ニ）第２試薬〔抗体−４〕の調製
前記実施例４の１の（２）の（ニ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−４〕を調製した。
（ホ）第２試薬〔抗体−２・抗体−４〕の調製
前記実施例４の１の（２）の（ホ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−２・抗体−４〕を調製した。
２．試料
前記実施例３の２の（１）及び（２）の記載の通りに行い、次のＣＲＰ濃度の試料をそれぞれ調製した。
（イ）試料１： ０ｍｇ／ｄＬ
（ロ）試料２： ０．５ｍｇ／ｄＬ
（ハ）試料３： ２．０ｍｇ／ｄＬ
（ニ）試料４： ６．０ｍｇ／ｄＬ
（ホ）試料５： １８．０ｍｇ／ｄＬ
（ヘ）試料６： ３０．０ｍｇ／ｄＬ
３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第２試薬として、前記１の（２）の（ハ）の第２試薬〔抗体−２〕、（ニ）の第２試薬〔抗体−４〕、及び（ホ）の第２試薬〔抗体−２・抗体−４〕をそれぞれ用い、前記実施例３の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。
（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、表９及び図１２に示した。
なお、この図１２において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。
また、この図１２において、「△」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−２〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「○」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−４〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「■」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−２・抗体−４〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示す。

４．考察
（イ） 前記実施例２の実験結果からも分かるように、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−２」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−２〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには低感度であるものの、中濃度域から高濃度域にわたっては感度高く測定の定量性を有するものである。
（ロ） また、前記実施例２の実験結果からも分かるように、前記の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−４」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−４〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには高感度であるものの、中濃度域から高濃度域にかけては測定の定量性を有しないものである。
（ハ） これに対して、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−２」と、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−４」とを組み合わせて使用した場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−２・抗体−４〕」である場合には）、試料中のＣＲＰの測定において低濃度から高濃度まで測定範囲が拡がっていることが分かる。
すなわち、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定方法及び測定試薬であることが確かめられた。

（本願発明の試料中のＣＲＰの測定方法及び測定試薬の効果の確認−６）
カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−３）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−４）を固定化したラテックス粒子を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確かめた。
１．測定試薬
（１）第１試薬
前記実施例５の１の（１）の記載の通りに、第１試薬を調製した。
（２）第２試薬
（イ）抗体−３固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
前記実施例５の１の（２）の（イ）の記載の通りに、抗体−３固定化ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（ロ）抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
前記実施例５の１の（２）の（ロ）の記載の通りに、抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（ハ）第２試薬〔抗体−３〕の調製
前記実施例５の１の（２）の（ハ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−３〕を調製した。
（ニ）第２試薬〔抗体−４〕の調製
前記実施例５の１の（２）の（ニ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−４〕を調製した。
（ホ）第２試薬〔抗体−３・抗体−４〕の調製
前記実施例５の１の（２）の（ホ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−３・抗体−４〕を調製した。
２．試料
前記実施例３の２の（１）及び（２）の記載の通りに行い、次のＣＲＰ濃度の試料をそれぞれ調製した。
（イ）試料１： ０ｍｇ／ｄＬ
（ロ）試料２： ０．５ｍｇ／ｄＬ
（ハ）試料３： ２．０ｍｇ／ｄＬ
（ニ）試料４： ６．０ｍｇ／ｄＬ
（ホ）試料５： １８．０ｍｇ／ｄＬ
（ヘ）試料６： ３０．０ｍｇ／ｄＬ
３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第２試薬として、前記１の（２）の（ハ）の第２試薬〔抗体−３〕、（ニ）の第２試薬〔抗体−４〕、及び（ホ）の第２試薬〔抗体−３・抗体−４〕をそれぞれ用い、前記実施例３の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。
（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、表１０及び図１３に示した。
なお、この図１３において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。
また、この図１３において、「△」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−３〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「○」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−４〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「■」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−３・抗体−４〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示す。

４．考察
（イ） 前記実施例２の実験結果からも分かるように、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−３」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−３〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには低感度であるものの、中濃度域から高濃度域にわたっては感度高く測定の定量性を有するものである。
（ロ） また、前記実施例２の実験結果からも分かるように、前記の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−４」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−４〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには高感度であるものの、中濃度域から高濃度域にかけては測定の定量性を有しないものである。
（ハ） これに対して、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−３」と、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−４」とを組み合わせて使用した場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−３・抗体−４〕」である場合には）、試料中のＣＲＰの測定において低濃度から高濃度まで測定範囲が拡がっていることが分かる。
すなわち、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定方法及び測定試薬であることが確かめられた。

（本願発明の試料中のＣＲＰの測定方法及び測定試薬の効果の確認−７）
カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−１）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−５）を固定化したラテックス粒子を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確かめた。
１．測定試薬
（１）第１試薬
前記実施例３の１の（１）の記載の通りに、第１試薬を調製した。
（２）第２試薬
（イ）抗体−１固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
前記実施例３の１の（２）の（イ）の記載の通りに、抗体−１固定化ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（ロ）抗体−５固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗体−４に替え、前記実施例６の２の（３）の抗体−５（カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体）を用いる他は、前記実施例３の１の（２）の（ロ）の記載の通りに、抗体−５固定化ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（ハ）第２試薬〔抗体−１〕の調製
前記実施例３の１の（２）の（ハ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−１〕を調製した。
（ニ）第２試薬〔抗体−５〕の調製
抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液に替え、前記（ロ）の抗体−５固定化ラテックス粒子懸濁液を用いる他は、前記実施例３の１の（２）の（ニ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−５〕を調製した。
（ホ）第２試薬〔抗体−１・抗体−５〕の調製
抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液に替え、前記（ロ）の抗体−５固定化ラテックス粒子懸濁液を用いる他は、前記実施例３の１の（２）の（ホ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−１・抗体−５〕を調製した。
２．試料
前記実施例３の２の（１）及び（２）の記載の通りに行い、次のＣＲＰ濃度の試料をそれぞれ調製した。
（イ）試料１： ０ｍｇ／ｄＬ
（ロ）試料２： ０．５ｍｇ／ｄＬ
（ハ）試料３： ２．０ｍｇ／ｄＬ
（ニ）試料４： ６．０ｍｇ／ｄＬ
（ホ）試料５： １８．０ｍｇ／ｄＬ
（ヘ）試料６： ３０．０ｍｇ／ｄＬ
３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第２試薬として、前記１の（２）の（ハ）の第２試薬〔抗体−１〕、（ニ）の第２試薬〔抗体−５〕、及び（ホ）の第２試薬〔抗体−１・抗体−５〕をそれぞれ用い、前記実施例３の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。
（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、表１１及び図１４に示した。
なお、この図１４において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。
また、この図１４において、「△」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−１〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「○」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−５〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「■」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−１・抗体−５〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示す。

４．考察
（イ） 前記実施例２の実験結果からも分かるように、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−１」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−１〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには低感度であるものの、中濃度域から高濃度域にわたっては感度高く測定の定量性を有するものである。
（ロ） また、前記実施例７の実験結果からも分かるように、前記の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−５」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−５〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには高感度であるものの、中濃度域から高濃度域にかけては測定の定量性を有しないものである。
（ハ） これに対して、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−１」と、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−５」とを組み合わせて使用した場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−１・抗体−５〕」である場合には）、試料中のＣＲＰの測定において低濃度から高濃度まで測定範囲が拡がっていることが分かる。
すなわち、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定方法及び測定試薬であることが確かめられた。

（本願発明の試料中のＣＲＰの測定方法及び測定試薬の効果の確認−８）
カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−２）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−５）を固定化したラテックス粒子を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確かめた。
１．測定試薬
（１）第１試薬
前記実施例３の１の（１）の記載の通りに、第１試薬を調製した。
（２）第２試薬
（イ）抗体−２固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗体−１に替え、前記実施例１の２の（３）の（ロ）の抗体−２（カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体）を用いる他は、前記実施例３の１の（２）の（イ）の記載の通りに、抗体−２固定化ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（ロ）抗体−５固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗体−４に替え、前記実施例６の２の（３）の抗体−５（カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体）を用いる他は、前記実施例３の１の（２）の（ロ）の記載の通りに、抗体−５固定化ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（ハ）第２試薬〔抗体−２〕の調製
抗体−１固定化ラテックス粒子懸濁液に替え、前記（イ）の抗体−２固定化ラテックス粒子懸濁液を用いる他は、前記実施例３の１の（２）の（ハ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−２〕を調製した。
（ニ）第２試薬〔抗体−５〕の調製
抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液に替え、前記（ロ）の抗体−５固定化ラテックス粒子懸濁液を用いる他は、前記実施例３の１の（２）の（ニ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−５〕を調製した。
（ホ）第２試薬〔抗体−２・抗体−５〕の調製
抗体−１固定化ラテックス粒子懸濁液に替え、前記（イ）の抗体−２固定化ラテックス粒子懸濁液を用い、及び、抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液に替え、前記（ロ）の抗体−５固定化ラテックス粒子懸濁液を用いる他は、前記実施例３の１の（２）の（ホ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−２・抗体−５〕を調製した。
２．試料
前記実施例３の２の（１）及び（２）の記載の通りに行い、次のＣＲＰ濃度の試料をそれぞれ調製した。
（イ）試料１： ０ｍｇ／ｄＬ
（ロ）試料２： ０．５ｍｇ／ｄＬ
（ハ）試料３： ２．０ｍｇ／ｄＬ
（ニ）試料４： ６．０ｍｇ／ｄＬ
（ホ）試料５： １８．０ｍｇ／ｄＬ
（ヘ）試料６： ３０．０ｍｇ／ｄＬ
３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第２試薬として、前記１の（２）の（ハ）の第２試薬〔抗体−２〕、（ニ）の第２試薬〔抗体−５〕、及び（ホ）の第２試薬〔抗体−２・抗体−５〕をそれぞれ用い、前記実施例３の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。
（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、表１２及び図１５に示した。
なお、この図１５において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。
また、この図１５において、「△」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−２〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「○」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−５〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「■」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−２・抗体−５〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示す。

４．考察
（イ） 前記実施例２の実験結果からも分かるように、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−２」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−２〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには低感度であるものの、中濃度域から高濃度域にわたっては感度高く測定の定量性を有するものである。
（ロ） また、前記実施例７の実験結果からも分かるように、前記の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−５」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−５〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには高感度であるものの、中濃度域から高濃度域にかけては測定の定量性を有しないものである。
（ハ） これに対して、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−２」と、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−５」とを組み合わせて使用した場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−２・抗体−５〕」である場合には）、試料中のＣＲＰの測定において低濃度から高濃度まで測定範囲が拡がっていることが分かる。
すなわち、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定方法及び測定試薬であることが確かめられた。

（本願発明の試料中のＣＲＰの測定方法及び測定試薬の効果の確認−９）
カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−３）を固定化したラテックス粒子、及びカルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体（抗体−５）を固定化したラテックス粒子を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確かめた。
１．測定試薬
（１）第１試薬
前記実施例３の１の（１）の記載の通りに、第１試薬を調製した。
（２）第２試薬
（イ）抗体−３固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗体−１に替え、前記実施例１の２の（３）の（ハ）の抗体−３（カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体）を用いる他は、前記実施例３の１の（２）の（イ）の記載の通りに、抗体−３固定化ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（ロ）抗体−５固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗体−４に替え、前記実施例６の２の（３）の抗体−５（カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体）を用いる他は、前記実施例３の１の（２）の（ロ）の記載の通りに、抗体−５固定化ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（ハ）第２試薬〔抗体−３〕の調製
抗体−１固定化ラテックス粒子懸濁液に替え、前記（イ）の抗体−３固定化ラテックス粒子懸濁液を用いる他は、前記実施例３の１の（２）の（ハ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−３〕を調製した。
（ニ）第２試薬〔抗体−５〕の調製
抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液に替え、前記（ロ）の抗体−５固定化ラテックス粒子懸濁液を用いる他は、前記実施例３の１の（２）の（ニ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−５〕を調製した。
（ホ）第２試薬〔抗体−３・抗体−５〕の調製
抗体−１固定化ラテックス粒子懸濁液に替え、前記（イ）の抗体−３固定化ラテックス粒子懸濁液を用い、及び、抗体−４固定化ラテックス粒子懸濁液に替え、前記（ロ）の抗体−５固定化ラテックス粒子懸濁液を用いる他は、前記実施例３の１の（２）の（ホ）の記載の通りに、第２試薬〔抗体−３・抗体−５〕を調製した。
２．試料
前記実施例３の２の（１）及び（２）の記載の通りに行い、次のＣＲＰ濃度の試料をそれぞれ調製した。
（イ）試料１： ０ｍｇ／ｄＬ
（ロ）試料２： ０．５ｍｇ／ｄＬ
（ハ）試料３： ２．０ｍｇ／ｄＬ
（ニ）試料４： ６．０ｍｇ／ｄＬ
（ホ）試料５： １８．０ｍｇ／ｄＬ
（ヘ）試料６： ３０．０ｍｇ／ｄＬ
３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第２試薬として、前記１の（２）の（ハ）の第２試薬〔抗体−３〕、（ニ）の第２試薬〔抗体−５〕、及び（ホ）の第２試薬〔抗体−３・抗体−５〕をそれぞれ用い、前記実施例３の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。
（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、表１３及び図１６に示した。
なお、この図１６において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。
また、この図１６において、「△」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−３〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「○」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−５〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示し、「■」は第２試薬として「第２試薬〔抗体−３・抗体−５〕」を用いたときの測定結果（吸光度差の値）を示す。

４．考察
（イ） 前記実施例２の実験結果からも分かるように、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−３」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−３〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには低感度であるものの、中濃度域から高濃度域にわたっては感度高く測定の定量性を有するものである。
（ロ） また、前記実施例７の実験結果からも分かるように、前記の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−５」を用いた場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−５〕」である場合には）、試料中のＣＲＰが低濃度域にあるときには高感度であるものの、中濃度域から高濃度域にかけては測定の定量性を有しないものである。
（ハ） これに対して、試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる「抗ＣＲＰ抗体を固定化した担体（ラテックス粒子）」の抗ＣＲＰ抗体として、「カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−３」と、「カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質（抗体）」である前記の「抗体−５」とを組み合わせて使用した場合には（第２試薬が「第２試薬〔抗体−３・抗体−５〕」である場合には）、試料中のＣＲＰの測定において低濃度から高濃度まで測定範囲が拡がっていることが分かる。
すなわち、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定方法及び測定試薬であることが確かめられた。

Claims (12)

1. カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質を各々担体に固定化し、当該担体固定化特異的結合物質と試料中に含まれていたＣ反応性蛋白質との当該特異的結合反応により生成した当該特異的結合物質とＣ反応性蛋白質との複合体凝集物を測定することにより、試料中のＣ反応性蛋白質を測定する方法。
2. カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質が、カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体である、請求の範囲第１項記載の試料中のＣ反応性蛋白質を測定する方法。
3. カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体がモノクローナル抗体である、請求の範囲第１項又は第２項記載の試料中のＣ反応性蛋白質を測定する方法。
4. カルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質が、カルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体である、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載の試料中のＣ反応性蛋白質を測定する方法。
5. カルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体がモノクローナル抗体である、請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項記載の試料中のＣ反応性蛋白質を測定する方法。
6. 担体がラテックス粒子である、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項記載の試料中のＣ反応性蛋白質を測定する方法。
7. カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質、及びカルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質を固定化した担体を含有することを特徴とする、試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬。
8. カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質が、カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体である、請求の範囲第７項記載の試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬。
9. カルシウムイオン依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体がモノクローナル抗体である、請求の範囲第７項又は第８項記載の試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬。
10. カルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する特異的結合物質が、カルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体である、請求の範囲第７項〜第９項のいずれか１項記載の試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬。
11. カルシウムイオン非依存的にＣ反応性蛋白質に結合する抗体がモノクローナル抗体である、請求の範囲第７項〜第１０項のいずれか１項記載の試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬。
12. 担体がラテックス粒子である、請求の範囲第７項〜第１１項のいずれか１項記載の試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬。

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