JPH01301165A - 免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、免疫凝集反応に基づ（免疫測定法。

特に、測定感度の高い免疫測定法に関する。

（従来の技術） 体液中の微量成分などの測定方法のひとつとして、目的
とする被測定物質に該被測定物質と抗原抗体反応しうる
物質（抗体）を作用させ、生じる凝集の度合を測定する
免疫測定法が採用されている。このような方法としては
、免疫比濁法、ラテノクスａ集法などが知られており、
凝集による反応系の濁度の上昇を測定する方法９粒子数
または粒子径の分布の変化を血球カウンターを用いて測
定する方法などにより測定が行われる。

凝集による反応系の濁度の上昇を測定する方法において
測定感度を上げるための種々の方法が提案されており１
例えば、特公昭６２−４３１３８号公報には、被測定物
質とラテックス試薬との反応系の吸光度を反応開始後、
少なくとも２回測定する方法が開示されている。特開昭
５９−１８７２６４号公報には。

反応系に入射する光の透過光および散乱光の強度を測定
し、積分球式濁度計で測定する方法が開示されている。

これら、もしくは他の改良法を包含し、臨床検査の分野
で用いられる種々の測定システムや測定キットが市販さ
れている。そのようなシステムとしては、　ＬＰＩΔ（
（株）ダイアヤトロン）。

ＬＡシステム（（株）アルファチック）　、　ＥＬ−１
０００（協和メデックス（株））などの種々の専用測定
システムがある。測定キットとしては、汎用の生化学自
動分析装置（例えば９日立７０５型２日立７３６型など
）を測定８ｇ器として用い、ラテックス凝集反応を利用
した種々の測定キット（（株）カイノス、　（株）ヤト
ロンなど）がある。上記反応系における粒子数または粒
子径の分布の変化を測定する方法としては２例えば、特
開昭６０−１１１９６３号公報に反応液中の粒子径側の
粒子数を計数し、凝集の度合を測定する方法が開示され
ている。

これらの方法のうち、上記システムやキットを利用した
凝集反応測定法が汎用されている。例えば、上記のシス
テムを用いて、検体に含有される抗原物質と、抗体を含
有する試薬（免疫診断試薬）との抗原抗体反応（凝集反
応）を行うには、一般に次のような工程が採用される：
１−（ａ）検体を反応容器に分注する工程；１−（ｂ）
希釈液を反応容器に分注し、検体を希釈する工程；およ
び１−（ｃ）免疫診断試薬を反応容器に添加し１反応を
開始させる工程。または、　２−（ａ）免疫診断試薬を
反応容器に分注する工程；および２−　（ｂ）検体をそ
のまま。

あるいは希釈液とともに反応容器に添加し３反応を開始
させる工程。そして、この反応の速度の測定は９次の（
１）、（２）または（３）の方法により行われる：（１
）上記１−（ｂ）工程の後に１回測定して検体ブランク
値とし、その後、　１−（ｃ）工程の後に１回測定して
得られた値から該検体ブランク値または該検体ブランク
値について各工程での容量の変化を補正した値を差し引
く（この方法は、乳びや溶血のために検体ブランク値が
高い場合に有効である）；上記２−　（ａ）工程の後に
１回測定してブランク値とし、その後、　２−（ｂ）工
程の後に１回測定して得られた値から該ブランク値また
は該ブランク値について各工程での容量の変化を補正し
た値を差し引く　（この方法は、試薬ブランク値が高い
場合に有効である）；（３）上記１−（ｃ）または２−
（ｂ）工程の後に２回以上測定した値から反応速度を求
める（この方法においては、検体および試薬のブランク
値は測定値に無関係である）。

これらの測定方法においては、検体中の抗原と免疫試薬
中の抗体との反応は上記工程１−（ｃ）または２−（ｂ
）における１度だけであり、上記工程１−（ｃ）または
２−１）の試薬に用いられる抗体はこの反応に適したポ
リクローナル抗体が主である。そのため、十分な測定感
度を得るためには、上記工程１−（ｃ）または２−　（
ｂ　）で行われる反応時間を長く設定することが必要で
ある。しかし９日常検査においては迅速な検査が望まれ
ることが多く１反応時間の延長にも限度があるため、′
より短い反応時間で精度よくなされ得る高感度の免疫測
定法の開発が望まれる。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、上記従来の課題を解決するものであり、その
目的とするところは、生体成分などを抗原抗体反応によ
る凝集を利用し、迅速にかつ精度よく測定する方法を提
供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明の免疫測定法は、（Ａ）抗原を含有する検体と、
該抗原に対する抗体の１種である抗体Ｂｌ。

該抗体Ｂ１を含有する物質、該抗体Ｂｌが微小粒子担体
に結合した担体結合抗体、または該抗体Ｂ１を含有する
物質が微小粒子担体に結合した担体結合抗体とを混合し
て反応させ、免疫複合体Ｃ１を形成させる工程；（Ｂ）
該免疫複合体Ｃ５を含有する反応液に、該抗原に対する
抗体であってかつ該抗体Ｂ１とは異なる抗体８２．該抗
体Ｂ２を含有する物質、該抗体Ｂ２が微小粒子担体に結
合した担体結合抗体、または該抗体Ｂ２を含有する物質
が微小粒子担体に結合した担体結合抗体を混合して反応
させ、免疫複合体Ｃ２を形成させる工程；および、（Ｃ
）得られた反応液の凝集状態の測定を行い、測定値から
検体中の抗原濃度を算出する工程；を包含し、そのこと
により上記目的が達成される。

本発明方法により測定すべき検体は、抗原となりうる成
分を含有する試料、特に生体試料（例えば、血清または
尿）などである。上記検体の測定すべき成分としては、
抗原となりうるあらゆる物質が包含される。つまり従来
法で測定されていた物質のいずれもが包含される。例え
ば、アルファフェトプロティン（八ＦＰ）　、　　フィ
フ゛リノーゲン、　Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）　、ヒ
ト絨毛膜ゴナドトロピン（ＩＩＣＧ）　、癌胎児性抗原
（ＣＥＡ）などが挙げられる。

上記抗体Ｂ、は、特定の抗原決定基を認識して結合しう
る１種類またはそれ以上の種類のモノクローナル抗体で
ある。上記抗体Ｂ２としては、モノクローナル抗体およ
びポリクローナル抗体のいずれもが使用され得る。これ
らのモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、
−船釣な免疫および精製の工程を採用し、公知の方法に
より得られる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブ
リドーマを用いる方法；リンパ腫を引き起こすＥＢウィ
ルスを用いて特定のＢリンパ球を増やす方法；またはマ
ウス骨髄由来の培養細胞や酵母などの微生物を遺伝子操
作する方法を用いることにより得られ、各種クロマトグ
ラフィー（例えば、ゲルクロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー。

アフィニティクロマトグラフィーなど）を組合せて使用
することにより精製される。そして、ポリクローナル抗
体は２例えば、抗原となる物質で適当な動物を免疫する
ことにより得られ、モノクローナル抗体と同様の精製操
作を行うことにより精製される。

これらのモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体
は、そのままの形で用いられ得るが、さらに必要に応じ
て、該抗体を含有する物質の形で。

該抗体が微小粒子担体に結合した担体結合抗体の形で、
または該抗体を含有する物質が微小粒子担体に結合した
担体結合抗体の形で用いられる（以下これらを、免疫診
断試薬と呼ぶ）。上記微小粒子担体としては、不活性な
合成高分子製粒子（例えば、ポリスチレン粒子など）ま
たは無機質粒子（例えば、カオリン、ベントナイト）が
用いられる。特に、ポリスチレンやスチレン系共重合体
粒子を均一に懸濁させたラテックスが好適に用いられる
。ラテックス粒子に既知の抗体を担持させたラテックス
試薬が市販されており、これを利用することもできる。

本発明方法により検体中に含まれる抗原を測定するには
１例えば、まず血液、尿などの検体を反応容器に分注し
、これに特定の抗原決定基を認識するモノクローナル抗
体Ｂ、または該モノクローナル抗体Ｂ１を含有する免疫
診断試薬を分注・混合する。このごとにより免疫複合体
Ｃ１が形成される（（Ａ）工程）。この工程において検
体および試薬の分注の順序は、逆でも同時（生化学自動
分析装置を用いる場合）でもよい。検体中の抗原濃度が
高すぎる場合は、検体を適当な希釈液にて希釈して用い
てもよい。希釈液は、上記抗原および／または免疫診断
試薬を含有せず、かつ該抗原および／または免疫診断試
薬と化学的に不活性である液体（通常、水、生理食塩水
、緩衝液など）が用いられる。免疫診断試薬の分注量は
測定に支障ない範囲においてできるだけ少なくするのが
好ましく。

それによって検体中に含有される抗原とモノクローナル
抗体Ｂ＋とを比較的濃い状態で接触させることができ、
免疫複合体形成反応が迅速に進行する。

上記試薬の濃度（例えば、試薬が含有する抗体の力価、
ラテックスの固形分の量など）は、使用する反応系や測
定機器などの測定条件により最適であるように設定する
ことが好ましい。そして、この反応により形成される免
疫複合体の凝集状態は。

分光光度計で測定されないような（吸光度変化がほとん
ど０であるような）程度であることが好ましい。

次いで、この反応液に上記抗原に対する抗体であってか
つ上記抗体とは異なる抗原決定基を認識する抗体Ｂ２ま
たは該抗体Ｂ２を含有する免疫診断試薬を分注・混合す
る。これにより、該抗体Ｂ２が。

抗原および／または上記免疫複合体Ｃ，に結合し。

その結果、上記免疫複合体Ｃ０よりも粒径の大きな免疫
複合体Ｃ２が形成される（（Ｂ）工程）。この免疫複合
体Ｃ２は１通常１分光光度計で吸光度測定するのに十分
な粒径を有する。しかし２粒径の大きさが十分でない場
合、またはさらに大きな粒径の免疫複合体を得て測定感
度を上げたい場合には。

必要に応じてこの（Ｂ）工程の操作をさらにｎ回（ただ
し、ｎは好ましくはＯ〜５）繰り返し、免疫複合体Ｃ２
゜１を形成させることも可能である。

このようにして形成された免疫複合体Ｃ２゜７を含有す
る反応液の凝集状態を測定することによって。

検体中の抗原濃度が算出される。反応液の凝集状態の測
定は２次の■、■または■のいずれかにより行われる： ■（Ａ）工程の後で１回測定してブランク値とし。

その後、（Ｂ）工程の後で１回測定して得られた値から
該ブランク値または該ブランク値について各工程での反
応液の容量の変化を補正した値を差し引く　； ■（Ｂ）工程の後で１回測定する；または■（Ｂ）工程
の後で２回以上測定した値から反応速度を求める。

上記測定は、既知の装置によりなされうる。例えば、吸
光度を測定する通常の分光光度計、光の散乱強度を測定
する装置２粒子数および／または粒子径を測定するため
の装置などが用いられる。

上記免疫凝集反応を測定するための専用装置としては２
分光光度計を組み込んだ生化学自動分析装置、免疫比濁
法による凝集反応を測定するための専用装置、フローイ
ンジェクションを利用して凝集反応を測定するための専
用装置、ラテックス凝集反応を測定するための専用装置
などがある。これらの装置としては、従来技術の項で示
した種々の市販の専用測定システムが用いられ得る。そ
の他１通常の用手法により測定装置セル内で凝集反応を
行わせる方法も好適に用いられる。このような種々の方
法により測定を行なう場合には、最も良い測定結果（測
定の感度、精度など）を得るために、検体の希釈倍率１
反応時間、凝集状態の測定の様式などの最適な条件を前
もって調べておくことが望ましい。

（作用） 上記のように本発明方法では、上記従来法においては１
度に加えられていた免疫診断試薬の抗体成分（主として
ポリクローナル抗体）を、異なる抗原決定基を認識する
２種以上の抗体に分け、これらが検体を含む系に順次加
えられる。つまり。

本発明方法においては、まず、最初のモノクローナル抗
体Ｂ１またはそれを含む免疫診断試薬が加えられる。こ
れらは、該抗体と抗原とが比較的濃い状態で接触するよ
うな濃度となるように添加されることが好ましく、この
ことにより免疫複合体ＣＩが迅速に形成される。この免
疫複合体Ｃ，の形成は。

分光光度計では測定され得ないような微小の粒径変化を
有する。次いで、この免疫複合体Ｃ１に上記とは別のモ
ノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体Ｂ
２またはそれを含む免疫診断試薬を反応させることによ
り、該免疫複合体Ｃ１よりも大きな粒径を有し１分光光
度計で測定し得る免疫複合体Ｃ２が形成される。この免
疫複合体Ｃ２は、上記免疫複合体Ｃ１が系内に存在する
ために速やかに形成され、その生成速度は、上記従来法
のように抗体を一度に加えた場合に比べ極めて速い。そ
のため、吸光度測定しうる程度の大きさの免疫複合体の
単位時間あたりの生成量が増加する。つまり。

短時間で凝集反応が進行し２反応系の吸光度が上昇する
。これを測定することにより短時間で精度よく被測定物
質を定量することが可能となる。本発明方法においては
１通常、免疫複合体Ｃ２を含有する反応系の測定を行な
う方法が、操作が簡単であるなどの理由から最も好適に
用いられ得る。しかし、必要に応じてｎ個の抗体（また
はそれを含む免疫試薬）の添加をさらに行ない、免疫複
合体Ｃ２，１を含む反応系を測定する方法もまた。採用
され得る。このように１例えば、ラテックス試薬などの
免疫診断試薬自体の感度を改善することなく。

短時間で高精度の測定が行われる。

（実施例） 本発明を以下の実施例につき説明する。

実笥汎土 （ＡＦＰの測定） 次の靜Ｐ標準溶液、免疫診断試薬、および測定装置を用
いてＡＦＰの測定を行い、　ＡＦＰ検量線を作成した。

Ｍム撰準産ｉ　：　ＡＦＰ標準品（国立予防衛生研究所
から入手）を、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をる
ようにに希釈し、これをＡＦＰ標準溶液とした。

確認のために、この標準溶液中のＡＦＰ濃度を市販のラ
ジオイムノアッセイキントを用いて測定しておいた。

免覗（」Ｐ１゛　ラテックス法１υ−：マウス細胞を使
用して、常法の細胞融合法により、抗原認識部位の異な
る２種類の抗ヒ日ＦＰモノクローナル抗体（ＭＡＢ−１
およびＭＡＲ−２）産生ハイプリドーマを作製した。こ
れらのハイブリドーマをマウス腹腔中で増殖させ、その
腹水を得た。これらの腹水中のモノクローナル抗体を、
陰イオン交換クロマトグラフィーの非吸着画分として溶
出する通常のモノクローナル抗体精製法により、　Ｉｇ
Ｇ画分にまで精製した。別に２粒径０．１５μｍのポリ
スチレンラテックスを用意し、これを固形分が２％とな
るようにＰＢＳで希釈した。上記モノクローナル抗体Ｍ
ＡＢ−１およびＭＡＲ−２をそれぞれ２００μｇ／ｒｒ
ｄｌとなるようにＰＢＳで希釈し、上記ポリスチレンラ
テックス液と等量混合し、そして３７°Ｃにて１時間穏
やかに攪拌した。次いでこの混合液を２７．０００　Ｘ
　ｇで遠心分剤し、結合しなかったモノクローナル抗体
を除去した。抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体が結合し
たポリスチレンラテックスに１％ＢＳＡを含有するＰＢ
Ｓを添加して、ラテックス固形分０．５％および１％の
ラテックス試薬−１（ＭＡＲ−１を含有）並びにラテッ
クス固形分０．５％および１％のラテックス試薬−２（
ＭＡＲ−２を含有）を調製した。

皿冗塁１：　７０５型日立自動分析装置［ＡＦＰの測定
］ 第１試薬および第２試薬を使用する２試薬系の測定モー
ドを採用した。第１試薬としてラテックス固形分０．５
％のラテックス試薬−１と希釈液（１％Ｒ５Ａを含有す
るＰＢＳ）とを３：４０の割合で含有する混合溶液を用
い、第２試薬としてはラテックス固形分０．５％のラテ
ックス試薬−２を用いた。反応および測定は次のように
行った：反応は全工程が３７°Ｃで行われるように設定
し２反応系の凝集程度の測定は５７０ｎｍにおける吸光
度測定によって行った。

ＡＦＰ標準溶液２０μβに上記第１試薬４３０μ尼を分
注して、　ＡＦＰとＭＡＲ−１とを反応させた。上記第
１試薬を分注してから４分４０秒後と５分後の吸光度を
測定し、その平均値（Ａ、）をブランク値とし。

５〜５分２０秒の間の任意の時間において第２試薬を３
０μ１分注し、さらにＭＡＢ−２を反応させた。第２試
薬を加えてから５分後および５分２０秒後に反応系の吸
光度を測定し、その平均値（Ａｓ）を求めた。ＡＳ＋八
、より、吸光度（補正値）ΔＡ＝Ａ、−Ａ。

の値を求めた（第２試薬の添加前後の反応系の容積は、
それぞれ４５０μ！と４８０μ！であり、添加前後の容
積変化量は３０μ！である。この変化量は。

添加前の反応系容積の１０％以下程度なので、Δへの計
算に際し、　ＡｓＯ値については容積補正をしなかった
。）。各濃度のＡＦＰ標準溶液について。

３回ずつΔＡを測定し、その平均値（７ｉ）を求めた。

各濃度の訂から、　　ＡＦＰ濃度がＯの時の吸光度の値
（狂）を差し引き、その値（Ａ　Ａ　　Ａ　Ａ　ｏ　）
をＡＦＰ；ｉ４度に対してプロットした結果を第１図（
ｉ）に示す。

北較尉上 （従来法によるＡＰＩ’の測定） 第１試薬としては、実施例１で使用した第１試薬用の希
釈液４３０μｌのみを、第２試薬としては。

実施例１で調製したラテックス固形分１％のラテックス
試薬−１およびラテックス固形分１％のラテックス試薬
−２を１５μ！ずつ混合したもの３０μｌを用い、　Ａ
ＦＰとＭＡＲ−１およびＭＡＲ−２とが１工程で反応す
るようにしたこと以外は、実施例１と同様に操作し、訂
−兄をＡＦＰ濃度に対してプロットした結果を、実施例
１の結果と共に第１図（ｉｉ）に示す。

第１図から、従来法を用いるとＡＦＰが５ｎｇ／ｍｆｆ
１という低濃度ではほとんど吸光度変化が認められない
ことがわかる。これに対して本発明方法においては、５
ｎｇ／ｍｌの場合でさえも検出可能な吸光度変化が観察
され、かつその値が大きく、測定感度が改善されている
ことが明らかである。

尖施桝叉 （フィブリノーゲンの測定） 次のフィブリノーゲン標準溶液、免疫診断試薬。

および測定装置を用いてフィブリノーゲンの測定を行い
、その検量線を作成した。

フィブリノーゲンＷ’凍結乾燥したフィブ／瀬となるよ
うにに希釈し、これをフィブリノーゲン標準溶液とした
。

免孜Ｅ１ｕむＬ王立ｌＪじ畳り連ＬＬ：抗ヒトフィブリ
ノーゲンモノクローナル抗体は、常法によって作製した
モノクローナル抗ヒトフィブリノーゲン抗体産生ハイブ
リドーマを増殖させたマウス腹水から得、実施例１と同
様の精製方法により精製した。抗ヒトフィブリノーゲン
ポリクローナル抗体は、ヒトフィブリノーゲンでヤギを
免疫し、得られた抗血清を硫安分画してＴ−グロブリン
画分を採取することにより精製した。これらのモノクロ
ーナル抗体およびポリクローナル抗体を、それぞれ２０
０　ｕ　ｇ　／　ｍｌおよび５００　Ｂ　ｇ　／　ｎｄ
ｌとなるようにＰＢＳで希釈し、実施例１と同様の試薬
を用いた同様の操作により、ラテックス固形分０゜５％
および０．８３％のラテックス試薬−１（抗ヒトフィブ
リノーゲンモノクローナル抗体を含有）並びにラテック
ス固形分０．５％および０．７８％のラテックス試薬−
２（抗ヒトフィブリノーゲンポリクローナル抗体を含有
）を調製した。

■基又ｚニア０５型日立自動分析装置 ［フィブリノーゲンの測定］ 第１試薬および第２試薬を使用する２試薬系の測定モー
ドを採用した。第１試薬としてラテックス固形分０．５
％のラテックス試薬−１と希釈液（１％ＢＳＡを含有す
るＰＢＳ）とを３：４０の割合で含有する混合溶液を用
い、第２試薬としてはラテックス固形分０．５％のラテ
ックス試薬−２を用いた。反応および測定は次のように
行った：反応は全工程が３７°Ｃで行われるように設定
し９反応系の凝集程度の測定は５７０ｎｍにおける吸光
度測定によって行った。

フィブリノーゲン標準溶液１０μ２に上記第１試薬１試
薬を分注してから５〜５分２０秒の間の任意の時間にお
いて第２試薬を５０μ℃分注し、上記で形成された免疫
複合体に、さらに抗ヒトフィブリノーゲンポリクローナ
ル抗体を反応させた。第２試薬を加えてから５分後およ
び５分２０秒後に反応系の吸光度を測定し、その平均値
（Ａ３）を求めた。各濃度の標準溶液について、３回ず
つへ３を測定し。

その平均値（Ａ５）を求めた。各濃度の罷から、フィブ
リノーゲン濃度が０の時の吸光度の値（■π）を差し引
き、その値（＾、−＾、。）をフィブリノーゲン濃度に
対してプロットした結果を第２図（ｉ）に示す。

第２図から明らかであるように、フィブリノーゲンが０
．５μｇ／ｒｒｄｌという非常に低い濃度においても、
検出可能である吸光度変化が得られた。

ル較貫主 （従来法によるフィブリノーゲンの測定）第１試薬とし
ては、実施例２で使用した第１試薬用の希釈液４３０μ
！のみを、第２試薬止しては。

実施例２で調製したラテックス固形分０．８３％のラテ
ックス試薬−１の１８μ２およびラテックス固形分０．
７８％のラテックス試薬−２の３２μｌを混合したちの
５０μ２を用い、フィブリノーゲンと、抗ヒトフィブリ
ノーゲンモノクローナル抗体および抗ヒトフィブリノー
ゲンポリクローナル抗体とが１工程で反応するようにし
たこと以外は、実施例２と同様に操作し、　　Ａｓ　　
Ａｓｏをフィブリノーゲン濃度に対してプロットした結
果を、実施例２の結果と共に第２図（ｉｉ）に示す。

第２図から、従来法を用いると、フィブリノーゲンが１
．０μｇ／ｍｌという低濃度ではほとんど吸光度変化が
認められないことがわかる。これに対して本発明方法に
おいては、その半分の濃度の０．５μｇ／ｍｌの場合で
さえも検出可能な吸光度変化が観察され、かつその値が
大きく、測定感度が改善されていることが明らかである
。

（発明の効果） 本発明方法によれば、このように、免疫反応を利用した
種々の物質の定量が、より迅速に高感度で行われる。こ
の方法を利用して２例えば、アルファフェトプロティン
（八ＦＰ）、　　フィブリノーゲン。

Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、ヒト絨毛膜ゴナドトロピ
ン（ＨＣＧ）　、癌胎児性抗原（ＣＥＡ　）などの定量
が効果的になされる。そのため本方法は、疾病の診断お
よび治療のための臨床検査などの分野に広く利用され得
る。

４、　″　　の　　　なＬ 第１図は９本発明方法および従来法を用いてＡＦＰを含
む検体中のＡＦＰ　４度を測定したときの、　ＡＩ’ｌ
”濃度と吸光度（０，０，）との関係を示すグラフ；そ
して第２図は９本発明方法および従来法を用いてフィブ
リノーゲンを含む検体中のフィブリノーゲン濃度を測定
したときの、フィブリノーゲン濃度と吸光度（０，０，
）との関係を示すグラフである。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（Ａ）抗原を含有する検体と、該抗原に対する抗体
   の１種である抗体Ｂ＿１、該抗体Ｂ＿１を含有する物質
   、該抗体Ｂ＿１が微小粒子担体に結合した担体結合抗体
   、または該抗体Ｂ＿１を含有する物質が微小粒子担体に
   結合した担体結合抗体とを混合して反応させ、免疫複合
   体Ｃ＿１を形成させる工程；（Ｂ）該免疫複合体Ｃ＿１
   を含有する反応液に、該抗原に対する抗体であってかつ
   該抗体Ｂ＿１とは異なる抗体Ｂ＿２、該抗体Ｂ＿２を含
   有する物質、該抗体Ｂ＿２が微小粒子担体に結合した担
   体結合抗体、または該抗体Ｂ＿２を含有する物質が微小
   粒子担体に結合した担体結合抗体を混合して反応させ、
   免疫複合体Ｃ＿２を形成させる工程；および （Ｃ）得られた反応液の凝集状態の測定を行い、測定値
   から検体中の抗原濃度を算出する工程；を包含する免疫
   測定法。 ２、さらに前工程に用いる抗体とは異なる抗体を用いて
   、前記（Ｂ）工程の操作を、ｎ回（ただし、ｎは０〜５
   ）繰り返す工程を包含する、特許請求の範囲第１項に記
   載の測定法。 ３、前記抗体Ｂ＿１が少なくとも１種のモノクローナル
   抗体である、特許請求の範囲第１項または第２項に記載
   の方法。 ４、前記抗体Ｂ＿２が少なくとも１種のモノクローナル
   抗体またはポリクローナル抗体である、特許請求の範囲
   第１項または第２項に記載の方法。