JPH07316071A

JPH07316071A - 筋ジストロフィー治療薬

Info

Publication number: JPH07316071A
Application number: JP6108260A
Authority: JP
Inventors: Hideho Tanaka; 秀穂田中; Ryoichi Matsuda; 良一松田
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1994-05-23
Filing date: 1994-05-23
Publication date: 1995-12-05

Abstract

(57)【要約】【目的】筋ジストロフィー症の治療薬を提供する。【構成】インスリン用成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）ま
たはその生物学的に活性なフラグメントを有効成分とす
る筋ジストロフィー治療薬。【効果】筋ジストロフィー症の発症抑制、進行遅延に
優れた効果を発揮する薬剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、筋ジストロフィー治療
薬に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】筋ジ
ストロフィー症は骨格筋に一時的な変性をきたす進行性
遺伝性疾患群の総称で、極めて重篤な筋疾患の一つであ
る。筋ジストロフィー（進行性筋ジストロフィー）は、
その遺伝形式によって次の３つの代表的な型に分類され
る。すなわち、１）伴性劣性遺伝をとるＤｕｃｈｅｎｎ
ｅＭｕｓｃｕｌａｒＤｙｓｔｒｏｐｈｙ（以下、
「ＤＭＤ」と略記する）とＢｅｃｋｅｒＭｕｓｃｕｌ
ａｒＤｙｓｔｒｏｐｈｙ（以下、「ＢＭＤ」と略記す
る）、２）常染色体劣性遺伝をとるＬｉｍｂ−Ｇｉｒｄ
ｌｅ、３）常染色体優性遺伝をとるＦａｃｉｏ−Ｓｃａ
ｐｕｌｏ−Ｈｕｍｅｒａｌである。

【０００３】このうちＤＭＤは、最も進行が早く重症で
ある。ＤＭＤの臨床的特徴としては、３歳前後の処女歩
行の遅れ、階段昇降、起立、走るなどの遅れを伴い、非
常に高いクレアチンキナーゼ（ＣＫ）値を示し、近位側
の筋収縮と脱力、下腿筋の仮性肥大を特徴とする。組織
学的には筋繊維の変性、壊死が進行する。筋電図や筋生
検の所見は特徴あるパターンを示す。進行は早く、７〜
１１歳頃には歩行不能となり、２０歳頃までに呼吸不
全、心不全などにより死亡する。

【０００４】ＤＭＤの発症率は、男子出生児およそ３０
００人に１人の割合である。変異遺伝子座位はＸｐ２１
で、１９８７年にハーバードメディカルスクールの
Ｋｕｎｋｅｌらがこの原因遺伝子を同定した（Ｃｅｌ
ｌ，５１，９１９（１９８７））。この原因遺伝子産物
は、筋蛋白の約０．００２％を占める分子量４２７ｋｄ
のタンパク質で、ジストロフィンと命名された。ジスト
ロフィンは筋細胞膜細胞質側を裏打ちする膜細胞骨格蛋
白で、ＤＭＤでは免疫組織学的手法によって検出され
ず、ＢＭＤでは検出されるものの２／３の例で分子のサ
イズや量に異常が認められる。ＤＭＤ患者のジストロフ
ィン遺伝子には、部分的な欠失が６０〜７０％に、重複
が６〜１０％に見られ、また残りには点突然変異がある
ことによりジストロフィンに構造上の欠陥を与えると考
えられる。ジストロフィンの異常がＤＭＤの原因である
ことはよもや疑いないものと考えられるが、しかし何
故、これが筋繊維崩壊を誘導するかについての明確な答
えは見出されていない。

【０００５】ところで、筋ジストロフィー症には根本的
治療法はない。例えば正常筋細胞の移植、遺伝子治療等
は理論的に可能であるが、その実現には相当の年月がか
かるものと考えられる。現在行われている対症療法は、
予防的な歩行訓練、呼吸機能訓練で、筋拘縮、関節変形
の予防、特に脊柱側湾の予防などが必要とされる。末期
で歩行不能となり全身の筋萎縮が進行すると、呼吸不全
が主たる障害となり、長期の呼吸管理、心不全に対する
薬物療法が行われる。

【０００６】すなわち、筋ジストロフィー患者の病状の
進行遅延をもたらす有効な治療方法は見出されていない
のが現状であった。ＤＭＤ患者における治療効果を推定
するためには、例えばこれと同等の遺伝子変異を有し、
筋繊維崩壊が進行するモデル動物であるｍｄｘマウスが
用いられている。ｍｄｘマウスは、マウスジストロフィ
ンｃＤＮＡの３１８５番目の塩基ＣがＴに置き換わり、
ＣＡＡ（Ｇｌｎ）であるべきコドンがＴＡＡ（停止コド
ン）となり、ジストロフィンのロッド構造の約１／３ま
でで蛋白の合成がストップしていることが明らかになっ
ている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１５７８（１９８
９））。ところがｍｄｘマウスは、ヒト患者と同等の遺
伝子変異を有するにもかかわらず、行動上の障害を呈す
るには至らないのが普通である。この理由としては、ｍ
ｄｘマウス筋には塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧ
Ｆ）が多く含まれ、ｍｄｘ筋衛星細胞が正常細胞より強
く反応して増殖すること、マウスは筋組織中の血管密度
がヒトより高く、筋繊維維持のための栄養供給がよいこ
と、さらにはマウスは４足歩行動物であり、四肢にかか
る筋繊維当たりの荷重が少ないため、筋繊維の崩壊が遅
く、筋再生が間に合う等が考えられている。

【０００７】このため、筋ジストロフィー症の病態発現
阻止、遅延を十分に評価することはできず、またさら
に、筋繊維の変性、壊死を病理面で定量的に評価するこ
とは容易ではないことから、筋繊維に対する薬物の保護
効果を明確に示す手段は未だに確立されていなかった。
一方、インスリン様成長因子−Ｉ（以下、「ＩＧＦ−
Ｉ」と略記する）は７０個のアミノ酸からなる一本鎖の
ペプチド（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５３，２７６
９（１９７８）；ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，８９，２８３
（１９７８）等）で、肝臓およびその他の末梢組織で産
生される。ＩＧＦ−Ｉは、細胞への糖、アミノ酸の取り
込み促進作用、蛋白合成促進作用、細胞増殖促進作用、
分化促進作用、同化促進作用等を有し、筋肉、骨、神経
など多くの臓器が標的となる。

【０００８】成長ホルモン欠損症マウスにＩＧＦ−Ｉを
投与することにより、腎臓およびひ臓の重量、さらには
体重と体長の増加が認められている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌｏｇｙ，１２４，２５１９（１９８９）等）。下垂
体除去ラットにおいても同様の作用が観察されており
（Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１１２，１２３（１９
８７）等）、これらの知見からＩＧＦ−Ｉの侏儒症にお
ける治療効果が臨床的に検討されている。また、顕著な
インスリン抵抗性を呈するｔｙｐｅＡ糖尿病において
も、ＩＧＦ−Ｉによる治療効果が検討されている（Ｎ．
Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１７，１３７（１９８７）
等）。しかし、重篤で致命的な筋組織崩壊をもたらす筋
ジストロフィーに対するＩＧＦ−Ｉの効果については、
これまで全く報告されていない。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、筋ジスト
ロフィー患者が陥る状況に対して、筋繊維の崩壊、壊死
を抑制し、筋組織の同化を促進させることにより、筋ジ
ストロフィーの病状の進行を遅延させる手段を提供する
ことを目的として検討を重ねてきた。その結果、ｍｄｘ
マウスを用いて筋ジストロフィーの進行を定量的に評価
する新規な方法を検討し、それによりＩＧＦ−Ｉが筋ジ
ストロフィーに対する有効な治療薬となり得ることを初
めて見出し、本発明を完成するに至った。

【００１０】即ち本発明の要旨は、ＩＧＦ−Ｉまたはそ
の生物学的に活性なフラグメントを有効成分とする筋ジ
ストロフィー治療薬に存する。以下、本発明につき詳細
に説明する。ＩＧＦ−Ｉは、前述したように既知物質で
ある。ヒトＩＧＦ−ＩはＲｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔらに
よってヒト血清中より単離され（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，７３，４３７９（１９７
６））、その後そのアミノ酸配列が決定された（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５３，２７６９（１９７８）；
ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，８９，２８３（１９７８）
等）。従って、ＩＧＦ−Ｉは上記文献記載の方法に従っ
て血清から天然物タンパク質として調製することができ
る。また、ＩＧＦ−Ｉは組換えＤＮＡ技術を用いて製造
することもできる。例えば欧州特許公開１２３２２８
号、欧州特許公開１２８７３３号、欧州特許公開２１９
８１４号各公報等に記載の方法に従って、あるいはそれ
に準じて組換えＩＧＦ−Ｉを得ることができる。具体的
には、ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子もしくはその前駆
体遺伝子を適当な発現ベクターに導入し、かかる発現ベ
クターを用いて大腸菌、枯草菌等の細菌（原核細胞）、
パン酵母等の酵母類、ハスモンヨトウガの卵巣由来細胞
（Ｓｆ９細胞株）等の昆虫細胞、チャイニーズハムスタ
ーの卵巣由来細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル
の腎由来細胞（ＣＯＳ細胞）等の（哺乳）動物細胞等を
形質転換し、当該形質転換体を培養することにより目的
とする組換えタンパク質を得ることができる。さらに、
ＩＧＦ−Ｉは既知のペプチド合成法に従って化学合成し
たものを使用することもできる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８０，２２１６（１９８
３）等）本発明で使用されるＩＧＦ−Ｉは、生物学的に
ＩＧＦ−Ｉと同等の活性を有するものであれば、いかな
るものも使用することができる。ヒト患者の治療を考慮
した場合、ＩＧＦ−Ｉもヒト由来のものであることが望
ましいが、そのアミノ酸配列中に他の哺乳類、鳥類、両
生類、は虫類、魚類由来のＩＧＦ−Ｉの配列を含むもの
であってもよい。また活性の上昇、安定性の上昇を目的
として、Ｎ末端から数個のアミノ酸を欠失させたもの
や、逆にＮ末端にいくつかのアミノ酸を付加することも
可能である。本発明においては、このようにその生物学
的活性を損なわない範囲において、そのアミノ酸配列の
一部を除去、挿入、修飾、置換あるいは追加する等の改
変を行ったものもＩＧＦ−Ｉとして定義される。ＩＧＦ
−Ｉの改変体、類縁体としては、欧州特許公開１５８８
９２号、特開昭６２−１６９７３３号、特開平１−５０
８９９号、特開平１−６３５９７号、特開平１−６６１
９８号、特開平１−６６１９９号、欧州特許公開３４６
４２９号各公報等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ，ＵＳＡ，８３，４９０４（１９８６）、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１
４９，３９８（１９８７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，６７２（１
９８７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２３，３７
３（１９８８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，
６２３３（１９８８）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５，７６６（１９８
９）等に記載されている。

【００１１】筋繊維の変性、壊死の定量的評価方法とし
ては、例えばエバンスブルー等の筋染色性色素を１０〜
２５０ｍｇ／ｋｇの用量でＰｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆ
ｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ液（以下、「ＰＢＳ」と略記
する）に溶解し、ｍｄｘマウスの尾静脈内に投与する。
１〜数日後、マウスをエーテル等により屠殺し、皮膚を
剥離して筋組織を露出させる。筋染色性色素は崩壊した
筋繊維に特異的に取り込まれて、筋繊維が染色されるの
が観察される（エバンスブルーを用いた場合、青色に染
色される）。これにより、半定量的に筋繊維の崩壊数を
推定することが可能となる。さらに、この筋繊維の病理
切片を作成し、蛍光顕微鏡を用いて観察すると、色素が
取り込まれた繊維が蛍光を発するため（エバンスブルー
を用いた場合、赤色に蛍光を発する）、筋崩壊繊維数を
定量的に測定することが可能となる。

【００１２】本発明の筋ジストロフィー治療薬は、上記
ＩＧＦ−Ｉを有効成分とし、好ましくはこれを適当な希
釈剤や他の添加剤と共に適当な製剤形態（剤型）に調合
され、使用に供される。剤型としては、一般に非経口的
投与に適する剤型が用いられる。好ましくは、注射用ア
ンプル剤や注射用凍結乾燥粉末剤（バイアル）等を挙げ
ることができる。

【００１３】上記各種剤型への調製は、この技術分野で
慣用されている通常の手法をもちいて行うことができ
る。製剤化する際に用いられる製剤担体としては、各種
剤型への調製に慣用されている希釈剤や添加剤等が用い
られる。例えば注射用凍結乾燥粉末剤は、精製されたＩ
ＧＦ−Ｉの有効量を例えば蒸留水、生理食塩水、ブドウ
糖水溶液等の希釈剤に溶解し、必要に応じてカルボキシ
メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等の賦形剤、
ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノー
ル等の保存剤、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸
プロカイン等の無痛化剤、塩酸、酢酸、クエン酸、水酸
化ナトリウム等のｐＨ調節剤等を加え、常法に従い凍結
乾燥することにより調製される。

【００１４】また注射用アンプル剤は、ＩＧＦ−Ｉの有
効量を例えば蒸留水、生理食塩水、リンゲル液等の希釈
剤に溶解し、必要に応じてサリチル酸ナトリウム、マン
ニトール等の溶解補助剤、クエン酸ナトリウム、グリセ
リン等の緩衝剤、ブドウ糖、転化糖等の等張化剤、ポリ
エチレングリコール等の安定化剤、上記保存剤、上記無
痛化剤、上記ｐＨ調節剤等の添加剤を加え、これを通常
の加熱滅菌、無菌ろ過等により無菌化して調製される。

【００１５】本発明の筋ジストロフィー治療薬は、筋ジ
ストロフィー症治療の際に、これを必要とする患者に対
して非経口的に、一般には皮下、筋肉内または静脈内注
射により、その所定量を単回、もしくは複数回に分けて
投与するか、または連続的に投与する。本発明の筋ジス
トロフィー治療薬の投与量は、単回もしくは複数回投与
の場合には、通常有効成分（ＩＧＦ−Ｉ）として成人１
日当たり約１０μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲で、これを
投与すべき患者の静脈内、皮下、筋肉内に投与するのが
好ましく、患者の病理状態、栄養状態、年齢、体重、併
用薬剤等に応じて適宜増減させることができる。また連
続投与の場合には、成人１時間当たり約０．１〜５０μ
ｇ／ｋｇ、好ましくは１〜３０μｇ／ｋｇの範囲で、上
記１日量に相当する量を投与することができる。

【００１６】投与方法としては、注射用アンプル剤の場
合はそのまま皮下、筋肉内または静脈内に投与すること
ができるが、静脈内投与の場合には、必要に応じて輸液
用ミニポンプをもちいて投与することもできる。また注
射用凍結乾燥粉末剤の場合には、当該粉末剤を使用時に
蒸留水、生理食塩水、リンゲル液等の希釈剤に溶解した
上、アンプル剤の場合と同様にして投与する。

【００１７】更に本発明の筋ジストロフィー治療薬は、
筋ジストロフィー症の治療の際にブドウ糖等の糖輸液に
予め所定量を混合して投与するか、または該糖輸液の投
与と同時にその有効量を単独で末梢静脈等から投与する
ことも可能である。

【００１８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明す
るが、その要旨を越えない限り以下に限定されるもので
なない。実施例１欧州特許公開１２８７３３号公報に記載の方法に従っ
て、大腸菌を宿主細胞とする遺伝子組換え法により組換
えヒトＩＧＦ−Ｉ（配列表の配列番号１）を製造し、精
製した。

【００１９】実験には、筋繊維崩壊が始まりつつある３
週齢のｍｄｘマウス３匹（オスおよびメス。いずれも実
験動物中央研究所から納入）および遺伝子変異のないＢ
１０マウス３匹を用いた。当該マウスは、通常の飼育ケ
ージで飼育された。ＩＧＦ−Ｉは朝１０時および夜８時
の１日２回に分けて、４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で７
日間、皮下投与された。コントロール群（ｍｄｘマウス
５匹、Ｂ１０マウス４匹）には、同様の投与形態でＰＢ
Ｓが投与された。

【００２０】投与開始後６日目の夜８時におけるＩＧＦ
−Ｉ投与後に、エーテル麻酔下にてＰＢＳに溶解したエ
バンスブルーを１００ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与し
た。翌日、エーテルにて屠殺後、皮膚を剥離し、５％ホ
ルマリン中でマウスを固定した。２日後、大腿直筋およ
び横隔膜を単離し、パラフィン包埋、薄切してヘマトキ
シリンエオジン染色を施し、光学顕微鏡および蛍光顕微
鏡観察を行い、写真撮影を行った。大腿直筋標本は、写
真上で、筋繊維が崩壊することによりエバンスブルーが
取り込まれ、赤色の蛍光を発している領域の面積をデジ
タイザーにて計測した。大腿直筋断面積当たりの、崩壊
した筋繊維が占める領域の断面積の比率を、図１及び表
１に示す。

【００２１】

【表１】

【００２２】図１及び表１から明らかなように、ＩＧＦ
−Ｉ非投与群で２６．２％であるのに対し、ＩＧＦ−Ｉ
投与群では１５．７％と、明らかなＩＧＦ−Ｉ投与によ
る筋繊維崩壊抑制作用が観察された。また横隔膜では、
非ＩＧＦ−Ｉ投与群でより重篤な筋繊維崩壊が観察され
た。

【００２３】

【発明の効果】本発明の筋ジストロフィー治療薬は、筋
ジストロフィー症の発症抑制、進行遅延に優れた効果を
発揮する薬剤として期待される。

【００２４】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：７０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60 Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70

【図面の簡単な説明】

【図１】ｍｄｘマウスおよびＢ１０マウスにおける薬剤
（ＰＢＳおよびＩＧＦ−Ｉ）処理後の筋繊維崩壊領域の
割合を表した図面である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】インスリン様成長因子−Ｉまたはその生
物学的に活性なフラグメントを有効成分とする筋ジスト
ロフィー治療薬。
【請求項２】薬学的に許容され得る担体を含有してな
ることを特徴とする請求項１記載の筋ジストロフィー治
療薬。