JPH07270411A - 免疫反応測定用試薬キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 検査従事者への感染の危険が少なく、また凝
集判定が容易な免疫反応測定用試薬キットを提供する。 【構成】 測定対象物質（例、リウマチ因子）に対する
抗体または抗原（例、ヒトＩｇＧ）が担持された不溶性
担体（例、ポリスチレンラテックス）からなる反応試薬
が、内部が減圧され、少なくとも観察部分が透明である
容器（例、１２．６ｍｍφ×７５ｍｍのポリエチレンテ
レフタレート製試験管）に収容されていることを特徴と
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫反応測定用試薬キ
ットに関し、さらに詳しくは、測定対象物質に対する抗
体または抗原が担持された不溶性担体の凝集の程度を検
出することにより免疫反応を測定可能な免疫反応測定用
試薬キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、血液や尿などの体液中のタンパク
質や脂質等、例えば、梅毒抗体、Ｂ型肝炎ウイルス、癌
胎児性抗原、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ−反応性蛋白
質、Ｂ型肝炎ウイルス抗体、ヒト免疫不全ウイルス抗
体、リウマチ因子、抗ストレプトリジン−Ｏ等の免疫学
的に抗原または抗体に属する物質（以下、「測定対象物
質」という）の測定に、ラテックス担体のような不溶性
担体に測定対象物質に対応する抗体または抗原を担持さ
せ、免疫反応による該担体の凝集の程度を検出すること
により免疫反応を測定可能な免疫反応測定用試薬が一般
的に使用されている。

【０００３】従来、このような担体の凝集を検出して測
定対象物質を測定する試薬においては、通常、反応液中
の不溶性担体の凝集の程度を、肉眼で判定する方法と反
応液に光を照射してその散乱光または透過光を光学的に
検出する方法がある（例えば、特開平２−２３８３６０
号公報）。

【０００４】上記の不溶性担体の凝集の程度を肉眼で判
定する方法は、試料中の測定対象物質の存在の有無や、
測定対象物質の半定量のために使用されるが、その測定
操作の簡便さから病院のベッドサイド等でよく利用され
ている。

【０００５】上記の測定方法は、ラテックス担体のよう
な不溶性担体に測定対象物質に対応する抗体または抗原
を担持させた反応試薬と、患者の血清や尿等の検体溶液
とを凝集判定プレート上で混合させ、その凝集を観察す
る方法である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記の測定方法におい
ては、患者からの検体溶液をピペット等により人手によ
って凝集判定プレート上に採取するため、検査従事者へ
の感染の危険があった。また凝集判定プレートによる判
定は見にくく検査従事者により判定結果に差が出やすい
という問題点もあった。本発明は、上記問題点に鑑みて
なされたものであり、その目的は、検査従事者への感染
の危険が少なく、また凝集判定が容易な免疫反応測定用
試薬キットを提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明で使用される不溶
性担体としては、従来から、測定対象物質に対する抗体
または抗原が担持された不溶性担体の凝集により免疫反
応測定を行うために使用されてきた担体はいずれも使用
可能であり、例えば、無機物質粉末、有機高分子物質粉
末、微生物、血球、細胞膜片などが挙げられる。無機物
質としては、金、チタン、鉄、ニッケル等の金属；アル
ミナ、チタニア等の金属酸化物；シリカ等が挙げられ
る。有機高分子としては、特に限定されないが、例え
ば、スチレン重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩
共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ア
クリルニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化
ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−ア
クリル酸エステル共重合体等が挙げられる。特に、これ
らの重合体粉末を水に均一に懸濁させたラテックス粒子
が好ましい。該ラテックス粒子の平均粒径は、０．０５
〜１．０μｍが好ましく特に０．０５〜０．５μｍが好
ましい。

【０００８】本発明で使用される反応試薬の製造方法と
しては、従来から使用されてきた方法が使用でき、例え
ば、まず、不溶性担体が分散された懸濁液中で該不溶性
担体に測定対象物質に対する抗体または抗原を担持させ
る。この担持には、公知の物理的吸着法または化学的結
合法が使用される。

【０００９】抗体を担持させる場合、抗体としては、モ
ノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が好適に使
用される。これらの抗体は、通常、硫安沈殿、ゲルクロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィーなどの公知の抗体精製手
段を適宜組み合わせて精製される。抗体の種類として
は、例えば、ＩｇＧやＩｇＭ等の免疫グロブリンが挙げ
られ、必要に応じてＦ（ａｂ’）² 、Ｆａｂとなされて
もよい。抗原を担持させる場合、抗原の種類としては、
特に限定されず、例えば、タンパク質、ポリペプチド、
ステロイド、多糖類、脂質等が測定目的に応じて使用さ
れる。

【００１０】上記試薬中に存在させる、該抗体または抗
原が担持された不溶性担体の濃度は、上記懸濁液中０．
２〜１０ｍｇ／ｍｌが好ましく、より好ましくは１〜５
ｍｇ／ｍｌである。該不溶性担体の濃度が低くなると、
測定範囲が狭くなり、高くなると凝集して免疫反応を阻
害し易くなる。

【００１１】上記試薬中には、さらに、必要に応じて公
知の免疫反応促進物質を加えてもよい。免疫反応促進物
質としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチル
セルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポ
リビニルピロリドン等の水溶性高分子物質が挙げられ
る。

【００１２】本発明で使用される内部が減圧され、少な
くとも観察部分が透明である容器の本体の材質として
は、プラスチックスまたはガラスが用いられる。プラス
チックスとしては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、変性
天然樹脂のいずれもが用いられ得る。

【００１３】熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ポリ−４−メチルペンテン−
１、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩
化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレン
テレフタレート、スチレン−アクリロニトリル共重合
体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、スチレン−ア
クリル酸共重合体、スチレン−メチルメタクリレート共
重合体、エチレン−プロピレン共重合体、エチレン−ア
クリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸エステル共重
合体、ポリビニルアルコールアセタール化物、ポリビニ
ルアルコールブチラール化物等が挙げられる。

【００１４】熱硬化性樹脂としては、例えば、不飽和ポ
リエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ−アクリレー
ト樹脂等が挙げられる。

【００１５】変性天然樹脂としては、例えば、酢酸セル
ロース、プロピオン酸セルロース、、酢酸酪酸セルロー
ス、エチルセルロース、エチルキチン等が挙げられる。

【００１６】本発明で使用される容器には、その内部を
減圧に維持するために栓体を必要とする。栓体の材質と
しては、ガスバリヤー性の高いものが好ましく、例え
ば、ブチルゴム、塩素化ブチルゴム、熱可塑性エラスト
マー等が挙げられる。

【００１７】本発明の免疫反応測定用試薬キットの減圧
の程度は、常圧の検体溶液と該試薬キットが連通された
ときに、該試薬キット中に常圧の検体溶液が吸入され得
る程度の圧力であればよく、その圧力は、吸入しようと
する検体溶液の量によって決められる。すなわち、吸入
しようとする検体溶液の量が多ければ多いほど減圧の程
度を大きくする。

【００１８】本発明の免疫反応測定用試薬キットの製造
方法の一例を挙げると、内部を減圧にすることが可能で
あり、少なくとも観察部分が透明である容器に、前記の
反応試薬を加え、容器を所定の減圧状態にした後、該容
器に栓をすることによって製造する。

【００１９】上記の容器としては、例えば、一端が開口
し他端が閉塞してなる有底管体が好ましく、開口部は、
栓体によって密閉可能なものが好ましい。該有底管体と
しては、例えば、試験管形状のものが挙げられ、そのサ
イズとしては、外径が５〜３０ｍｍ、高さ２０〜１５０
ｍｍ程度が好ましい。

【００２０】本発明の免疫反応測定用試薬キットにおい
て、反応試薬は緩衝液等の分散媒に分散されて容器に加
えられた後、必要に応じて凍結乾燥されてもよい。凍結
乾燥された場合は、測定時に検体溶液によって不溶性担
体が再び分散される。

【００２１】本発明の免疫反応測定用試薬キットによっ
て検体中の測定対象物質を測定するには、検体溶液の容
器と該試薬キットを連通させ該試薬キット中に検体溶液
を吸入させる。次いで、該試薬キットを振盪して検体と
反応試薬を混合させて、検体中の測定対象物質と反応試
薬を免疫反応させる。免疫反応終了後、反応試薬の凝集
を肉眼で観察することにより免疫反応の程度を判定す
る。

【００２２】上記の検体溶液の容器と該試薬キットを連
通させる方法としては、例えば、検体溶液の容器を注射
針付きの注射筒としておき、該注射針を免疫反応測定用
試薬キットの容器の栓体に突き刺す方法が挙げられる。

【００２３】上記の免疫反応におけるｐＨは、５〜１０
が好ましく、より好ましくは６〜８である。免疫反応時
のｐＨを上記のように調整するには、反応試薬、検体溶
液または反応試薬と検体溶液の両方の溶媒もしくは分散
媒を適当なｐＨの緩衝液にしておけばよい。この緩衝液
としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリ
シン緩衝液などが挙げられる。免疫反応温度は、０〜５
０℃が好ましく、より好ましくは２０〜４０℃である。
凝集反応時間は、２０秒〜３０分が好ましく、より好ま
しくは１〜１５分である。

【００２４】本発明の免疫反応測定用試薬キットによっ
て測定することのできる検体は、抗原や抗体などの免疫
学的に活性な物質を含有する試料、特に生体試料（例え
ば、血液、胸水、腹水、リンパ液などの体液、尿、便、
汗などの排泄物、又は組織の抽出物など）である。

【００２５】本発明の免疫反応測定用試薬によって測定
することのできる測定対象物質は、通常、免疫学的に抗
原または抗体に属するあらゆる物質が包含される。例え
ば、リウマチ因子（ＲＦ）、アルファフェトプロティン
（ＡＦＰ）、抗ストレプトリジン−Ｏ（ＡＳＯ）、Ｃ−
反応性蛋白質（ＣＲＰ）、フィブリノーゲン−フィブリ
ン分解物（ＦＤＰ）、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ＨＣ
Ｇ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アンチトロンビンIII
(ＡＴ III) 、梅毒抗体、Ｂ型肝炎ウイルス抗体、Ｃ型
肝炎ウイルス抗体、ヒト免疫不全ウイルス抗体などのタ
ンパク質またはポリペプチド、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈ
Ｂ）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｃ）、ヒト免疫不全ウイル
ス（ＨＩＶ）、ステロイド、多糖類、脂質等が挙げられ
る。

【００２６】

【実施例】以下、本発明を具体的に説明するために、そ
の実施例を示す。以下の実施例および比較例において
は、次の試薬を用いた。 ＰＢＳ（リン酸−食塩緩衝液）：リン酸１ナトリウム
（２水和物）、リン酸２ナトリウム（２水和物）および
塩化ナトリウムを、リン酸および塩化ナトリウムの終濃
度がそれぞれ０．０２Ｍ、０．１５Ｍ、ｐＨが７．２と
なるように精製水を加えて調製した。 １％ＢＳＡ−ＰＢＳ：ＰＢＳに試薬特級牛血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）を１％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解した。

【００２７】実施例１ リウマチ因子測定用試薬キットの製造とリウマチ因子の
測定 （１）ヒトＩｇＧのラテックスへの担持 ヒトＩｇＧ分画（生化学工業社製）を１ｍｇ／ｍｌの濃
度でＰＢＳに溶解した液１０ｍｌに、平均粒径が０．２
３μｍのポリスチレン系ラテックス（固形分１０％、積
水化学工業社製）５００μｌを添加し室温で１時間攪拌
した。次に、１５０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、得
られた沈澱物を１０ｍｌの１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁し
洗浄した。これを２回繰り返した後、遠心分離で得られ
た沈澱を１０ｍｌの１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁しヒトＩ
ｇＧ担持ラテックスを作製した。

【００２８】（２）リウマチ因子測定用試薬キットの製
造 上記（１）で得られたヒトＩｇＧ担持ラテックス１００
μｌをポリエチレンテレフタレート製の４ｍｌ試験管
（１２．６φ×７５ｍｍ）に注入し、管径に合うブチル
ゴム製の栓体を試験管の開口部に軽く載せた後（開口部
を密栓しないように載せた）、減圧にできる容器内に置
き１００μｌ以上吸引できるように３６０ｍｍＨｇに減
圧したところで、試験管の開口部を密栓して、リウマチ
因子測定用試薬キットを製造した。

【００２９】（３）リウマチ因子の測定 １０倍、２０倍、４０倍および８０倍に希釈したリウマ
チ因子陽性ヒト血清（希釈をしないもののリウマチ因子
濃度１５００ＩＵ／ｍｌ）、また対照として日立化成工
業社製のリウマチ因子測定キット「セラテスタムＲＦ」
にて測定した結果リウマチ因子が３０ＩＵ／ｍｌ以下で
あった正常ヒト血清を、注射針の付いた１ｍｌの注射筒
にそれぞれ取り、その注射針を、上記（２）で得られた
リウマチ因子測定用試薬キットのブチルゴム製の栓体部
分に突き刺し、血清検体を該キット中に採取した。な
お、この際、一定量の血清検体を採取するために、１０
０μｌ採取されたことを重量増加により確認した（血清
の比重を１．０２として計算）。

【００３０】次いで、該キットを転倒混和し血清検体と
ヒトＩｇＧ担持ラテックスを混合した。転倒混和３０、
６０、９０および１２０秒後にラテックスの凝集状態を
観察し、結果を表１に示した。なお、この測定は、リウ
マチ因子陽性ヒト血清３種類（それぞれをリウマチ因子
陽性ヒト血清Ａ、Ｂ、Ｃとする）および正常ヒト血清３
種類（それぞれを正常ヒト血清Ａ、Ｂ、Ｃとする）につ
いて行った。なお、表１（および後述の表２）におけ
る、記号の意味は以下の通りである。 ◎：凝集が強い。 ○：凝集が分かる。 △：弱い凝集が分かる。 ×：凝集していない。

【００３１】実施例２ 実施例１の工程（２）において、ヒトＩｇＧ担持ラテッ
クスをポリエチレンテレフタレート製の４ｍｌ試験管
（１２．６φ×７５ｍｍ）に注入したことの代わりに、
ガラス製の４ｍｌ試験管（１２φ×７５ｍｍ）に注入し
たことの他は、実施例１と同様にしてリウマチ因子測定
用試薬キットを製造し、実施例１と同様にしてリウマチ
因子の測定を行い、結果を表１に示した。

【００３２】比較例１ 実施例１の工程（１）で得られたヒトＩｇＧ担持ラテッ
クス１００μｌと、実施例１の工程（３）で調製した血
清検体の１００μｌを、凝集判定板（積水化学工業社
製）上に採り、混合、攪拌し反応させた。攪拌開始の３
０、６０、９０および１２０秒後にラテックスの凝集状
態を観察し、結果を表１に示した。

【００３３】実施例３ ヒトのＣ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）測定用試薬キットの
製造とＣＲＰの測定 （１）抗ＣＲＰ抗体のラテックスへの担持 抗ＣＲＰ抗体（コスモバイオ社製）を１ｍｇ／ｍｌの濃
度でＰＢＳに溶解した液１０ｍｌに、平均粒径が０．３
０μｍのポリスチレン系ラテックス（固形分１０％、積
水化学工業社製）５００μｌを添加し室温で１時間攪拌
した。次に、１５０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、得
られた沈澱物を１０ｍｌの１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁し
洗浄した。これを２回繰り返した後、遠心分離で得られ
た沈澱を１０ｍｌの１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁し抗ＣＲ
Ｐ抗体担持ラテックスを作製した。

【００３４】（２）ＣＲＰ測定用試薬キットの製造 上記（１）で得られた抗ＣＲＰ抗体担持ラテックス１０
０μｌをポリエチレンテレフタレート製の７ｍｌ試験管
（１４φ×１００ｍｍ）に注入し、管径に合うブチルゴ
ム製の栓体を試験管の開口部に軽く載せた後（開口部を
密栓しないように載せた）、減圧にできる容器内に置き
１００μｌ以上吸引できるように３６０ｍｍＨｇに減圧
したところで、試験管の開口部を密栓して、ＣＲＰ測定
用試薬キットを製造した。

【００３５】（３）ＣＲＰの測定 １０倍、２０倍、４０倍および８０倍に希釈したＣＲＰ
陽性ヒト血清（希釈しないもののＣＲＰ濃度５０ｍｇ／
ｄｌ）、また対照として日立化成工業社製のＣＲＰ測定
キット「セラテスタムＣＲＰ」にて測定した結果ＣＲＰ
が０．５ｍｇ／ｄｌ以下であった正常ヒト血清を、注射
針の付いた１ｍｌの注射筒にそれぞれ取り、上記（２）
で得られたＣＲＰ測定用試薬キットのブチルゴム製の栓
体部分に突き刺し、血清検体を該キット中に採取した。
なお、この際、一定量の血清検体を採取するために、１
００μｌ採取されたことを重量増加により確認した（血
清の比重を１．０２として計算）。

【００３６】次いで、該キットを転倒混和し血清検体と
抗ＣＲＰ抗体担持ラテックスを混合した。転倒混和３
０、６０および９０秒後にラテックスの凝集状態を観察
し、結果を表２に示した。なお、この測定は、ＣＲＰ陽
性ヒト血清３種類（それぞれをＣＲＰ陽性ヒト血清Ｄ、
Ｅ、Ｆとする）および正常ヒト血清３種類（それぞれを
正常ヒト血清Ｄ、Ｅ、Ｆとする）について行った。

【００３７】実施例４ 実施例３の工程（２）において、抗ＣＲＰ抗体担持ラテ
ックスをポリエチレンテレフタレート製の７ｍｌ試験管
（１４φ×１００ｍｍ）に注入したことの代わりに、ガ
ラス製の試験管（１３φ×９０ｍｍ）に注入したことの
他は、実施例３と同様にしてＣＲＰ測定用試薬キットを
製造し、実施例３と同様にしてＣＲＰの測定を行い、結
果を表２に示した。

【００３８】比較例２ 実施例３の工程（１）で得られた抗ＣＲＰ抗体担持ラテ
ックス１００μｌと、実施例３の工程（３）で調製した
血清検体の１００μｌを、凝集判定板（積水化学工業社
製）上に採り、混合、攪拌し反応させた。攪拌開始の３
０、６０および９０秒後にラテックスの凝集状態を観察
し、結果を表２に示した。

【００３９】

【表１】

【００４０】

【表２】

【００４１】

【発明の効果】本発明の免疫反応測定用試薬キットの構
成は前記した通りであり、本発明のキットによると、検
査従事者への感染の危険が少なく、また凝集判定が容易
である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 測定対象物質に対する抗体または抗原が
   担持された不溶性担体からなる反応試薬が、内部が減圧
   され、少なくとも観察部分が透明である容器に収容され
   ていることを特徴とする免疫反応測定用試薬キット。