JPH07203980A - 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 エシェリヒア属に属する微生物のＬ−グルタ
ミン酸の生産能を向上させ、安価かつ効率的なＬ−グル
タミン酸の製造法を提供する。 【構成】 エシェリヒア属に属し、α−ケトグルタル酸
デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下しかつホスホ
エノールピルベートカルボキシラーゼ活性とグルタメー
トデヒドロゲナーゼ活性が増幅された株を液体培地で培
養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−グル
タミン酸の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は発酵法によりＬ−グルタ
ミン酸を製造するために使用される変異株および該変異
株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関
する。Ｌ−グルタミン酸は食品、医薬品等として重要な
アミノ酸である。

【０００２】

【従来の技術】従来Ｌ−グルタミン酸は主としてブレビ
バクテリウム属、コリネバクテリウム属またはミクロバ
クテリウム属に属するいわゆるグルタミン酸生産菌また
はそれらの変異株を用いた発酵法により製造されてきた
（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５
頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法による
Ｌ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、スト
レプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方
法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュードモナ
ス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ
属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６３，８
５７号）等が知られている。従来の方法によりＬ−グル
タミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需
要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率
的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められてい
る。

【０００３】大腸菌（エシェリヒア・コリ）はその増殖
速度の大きさ並びに遺伝子解析の進み方から将来的に優
れたＬ−グルタミン酸生産菌として利用される可能性を
有しているが、従来の報告では大腸菌によるＬ−グルタ
ミン酸の蓄積量は２．３ｇ／ｌと極めて低いレベルにあ
った（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５０巻、１６４〜１６
５頁、１９６１年）。ところが最近、α−ケトグルタル
酸デヒドロゲナーゼ（以下、α−ＫＧＤＨと略す）活性
が欠損もしくは低下した変異株が高いグルタミン酸生産
能を有することが報告された（仏国特許公開２６８０１
７８号）。

【０００４】

【本発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、エ
シェリヒア属に属する微生物のＬ−グルタミン酸生産能
をさらに向上させ、より安価でかつ効率的なＬ−グルタ
ミン酸の製造法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、大腸菌の
変異株によるＬ−グルタミン酸の製造法について鋭意研
究を重ねた結果、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下
し、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ
（以下ＰＰＣと略す）活性とグルタメートデヒドロゲナ
ーゼ（以下ＧＤＨと略す）活性が増幅された変異株が高
いＬ−グルタミン酸生産能を持つことを見いだし、本発
明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、 （発明１）エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が
欠損もしくは低下しかつＰＰＣ活性とＧＤＨ活性が増幅
されたＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株、およ
び、 （発明２）エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が
欠損もしくは低下しかつＰＰＣ活性とＧＤＨ活性が増幅
されたＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株を液体培
地に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする発酵法によるＬ
−グルタミン酸の製造法である。

【０００７】以下、本発明について説明する。

【０００８】（１）エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤ
Ｈ活性が欠損もしくは低下した変異株の取得

【０００９】本発明の変異株を調製するために使用され
る出発親株としては、エシェリヒア属に属する微生物で
病原性のない菌株が用いられる。具体的な例としては、
次のような株が挙げられる。

【００１０】 エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８） エシェリヒア・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５） エシェリヒア・コリＢ（ＡＴＣＣ１１３０３） エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７）

【００１１】エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性
が欠損もしくは低下しＬ−グルタミン酸生産能を有する
変異株は以下のようにして調製される。

【００１２】まず、前記の出発親株に通常の変異処理
法、例えばＸ線や紫外線の照射あるいはＮ−メチル−
Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、ＮＧと
略す）等の変異剤に接触せしめる等の方法を適用し変異
を導入する。

【００１３】あるいは、遺伝子工学的手法、例えば遺伝
子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いることに
よっても目的の変異を効率よく導入することができる。

【００１４】遺伝子組換え法によるα−ＫＧＤＨ活性の
欠損株の取得方法は以下の通りである。既に明らかにさ
れているα−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子
（以下、ｓｕｃＡ遺伝子と略す）の塩基配列（Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４１巻、３５１〜３５９
頁、１９８４年）に基づいてプライマーを合成し、染色
体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によりｓｕｃＡ遺伝子を
増幅し、増幅したｓｕｃＡ遺伝子内に薬剤耐性遺伝子を
挿入し、機能を失ったｓｕｃＡ遺伝子を作成する。つい
で相同組換えを利用して染色体上のｓｕｃＡ遺伝子を薬
剤耐性遺伝子の挿入によりその機能を失ったｓｕｃＡ遺
伝子に置換する。

【００１５】親株に変異処理を施した後、目的変異株選
抜のためのより具体的な手段は次のようなものである。

【００１６】α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した
変異株は、好気的培養条件下ではグルコースを含む最少
培地で生育できないかもしくは生育速度が著しく低下す
る。ところが、同一条件でもグルコースを含む最小培地
にコハク酸またはリジンおよびメチオニンを添加するこ
とにより通常の生育が可能となる。あるいは、嫌気的培
養条件下で培養するとグルコースを含む最少培地でも生
育可能となる（Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、第１０５巻、１８２〜１９０頁、１９６９年）。こ
れらの現象を指標として目的変異株の選抜が可能であ
る。

【００１７】以上のようにして得られるα−ＫＧＤＨ活
性が欠損もしくは低下した変異株の具体例としては次の
ものが挙げられる。 エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍ^r

【００１８】α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した
変異株は、さらにＬ−グルタミン酸の分解活性が低下し
た性質や、マレートシンターゼ（ａｃｅＢ）・イソシト
レートリアーゼ（ａｃｅＡ）・イソシトレートデヒドロ
ゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼ（ａｃｅＫ）オペ
ロン（以下、ａｃｅオペロンと略す）の発現が構成的に
なった性質を併せ持つことが、Ｌ−グルタミン酸の生産
性向上の面から有利である。これらの性質については仏
国特許２６８０１７８号に記載されている。また、従来
よりＬ−グルタミン酸生産菌の性質として知られている
各種栄養要求性、薬剤耐性、薬剤感受性、または薬剤依
存性等の性質を持つことがＬ−グルタミン酸の生産性向
上の面から有利であることはいうまでもない。

【００１９】Ｌ−グルタミン酸の分解能が低下した変異
株は、単一炭素源としてグルコースの代わりにＬ−グル
タミン酸を含む最少培地または単一窒素源として硫酸ア
ンモニウムの代わりにＬ−グルタミン酸を含む最少培地
で生育できないかもしくは生育速度が著しく低下する変
異株として分離できる。但し、栄養要求性を有する変異
株を用いる場合は、生育に必要な栄養素の必要最少限量
を当然培地に添加しなければならない。

【００２０】ａｃｅオペロンの発現が構成的になった変
異株は、フォスフォエノールピルベートシンターゼ欠損
株を親株とし、乳酸を炭素源とする最少培地で生育し、
ピルビン酸または酢酸・ピルビン酸を炭素源とする最少
培地では生育できない株として得られる他、好気的培養
条件下でα−ＫＧＤＨ欠損もしくは低下株の生育を改善
する変異株としても得られる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．、第９６巻、２１８５〜２１８６頁、１９６８
年）。

【００２１】以上の変異株の具体例としては次のものが
挙げられる。 エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８（ＦＥＲＭＢＰ−３
８５４） エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４（ＦＥＲＭＢＰ−３
８５３） エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８株は、α−ＫＧＤＨ
活性が低下し、さらにＬ−グルタミン酸の分解活性が低
下し、ａｃｅオペロンの発現が構成的になった性質を併
せ持つ変異株であり、エシェリヒア・コリＡＪ１２６２
４株は、α−ＫＧＤＨ活性が低下し、さらにＬ−グルタ
ミン酸の分解活性が低下した変異株である（仏国特許２
６８０１７８号参照）。

【００２２】かくして得られるα−ＫＧＤＨ活性が欠損
もしくは低下した変異株は、ＴＣＡサイクルのα−ケト
グルタル酸を経てＬ−グルタミン酸に至る生合成経路の
流れが改善されておりＬ−グルタミン酸の生産能が向上
している。またα−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下
し、かつ生成したＬ−グルタミン酸の分解活性が著しく
低い変異株や、これら性質に加えてさらにａｃｅオペロ
ンが構成的に発現するために生育が改善した変異株で
は、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上している。

【００２３】（２）エシェリヒア属に属し、ＰＰＣ活性
とＧＤＨ活性が増幅された変異株の取得

【００２４】後述の実施例では、エシェリヒア属に属
し、ＰＰＣ活性とＧＤＨ活性が増幅された変異株の取得
を、エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損も
しくは低下しＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株を
出発親株として行った。しかし、エシェリヒア属に属す
る野生型の菌株を出発親株として行い、ＰＰＣ活性とＧ
ＤＨ活性が増幅された変異株の取得を行った後にα−Ｋ
ＧＤＨ活性が欠損もしくは低下するよう育種してもかま
わない。

【００２５】従って、ＰＰＣ活性とＧＤＨ活性が増幅さ
れた変異株を調製するために使用される出発親株として
は、エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損も
しくは低下しＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株、
あるいはエシェリヒア属に属する微生物で病原性のない
野生型菌株が用いられる。具体的な例としては、次のよ
うな株が挙げられる。

【００２６】 エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍ^r エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８（ＦＥＲＭＢＰ−３
８５４） エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４（ＦＥＲＭＢＰ−３
８５３） （以上、エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠
損もしくは低下しＬ−グルタミン酸生産能を有する変異
株） エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８） エシェリヒア・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５） エシェリヒア・コリＢ（ＡＴＣＣ１１３０３） エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７） （以上、エシェリヒア属に属する微生物で病原性のない
野生型菌株）

【００２７】ＰＰＣ活性とＧＤＨ活性を増幅するにはＰ
ＰＣおよびＧＤＨをコードする遺伝子を適当なプラスミ
ド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて宿
主となる上記出発親株を形質転換すればよい。形質転換
株の細胞内のＰＰＣおよびＧＤＨをコードする遺伝子
（以下、おのおのをｐｐｃ遺伝子、ｇｄｈＡ遺伝子と略
する）のコピー数が上昇し、その結果ＰＰＣ活性および
ＧＤＨ活性が増幅される。

【００２８】クローニングされるｐｐｃ遺伝子およびｇ
ｄｈＡ遺伝子は一種類のプラスミド上にクローン化され
て宿主となる上記出発親株に導入されるか、もしくは共
存可能な二種類のプラスミド上に別々にクローン化され
て出発親株に導入される。

【００２９】ＰＰＣ活性とＧＤＨ活性を増幅するにはｐ
ｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を宿主となる上記出発
親株の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっ
ても達成できる。エシェリヒア属に属する微生物の染色
体ＤＮＡ上にｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を多コ
ピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在す
る配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体
ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティ
ブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド
・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９
９８５号公報に開示されるようにｐｐｃ遺伝子およびｇ
ｄｈＡ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移さ
せて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能であ
る。形質転換株の細胞内のｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ
遺伝子のコピー数が上昇し、その結果ＰＰＣ活性および
ＧＤＨ活性が増幅される。

【００３０】ＰＰＣ活性とＧＤＨ活性を増幅するには、
上記の遺伝子増幅による以外にも、ｐｐｃ遺伝子および
ｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターを強力なものに置換する
ことによっても達成される。たとえば、ｌａｃプロモー
ター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａ
ｃプロモーター、ラムダファージのＰ_Rプロモーター、
Ｐ_Lプロモーター等が強力なプロモーターとして知られ
ている。ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子の発現が強
化されることによってＰＰＣ活性およびＧＤＨ活性が増
幅される。

【００３１】ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子は、お
のおのＰＰＣもしくはＧＤＨ活性を欠失した変異株を用
いてその栄養要求性を相補する遺伝子を単離することに
よって取得できる。またエシェリヒア・コリのこれら遺
伝子は既に塩基配列が明かにされていることから（Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９〜９１６頁、１９
８４年、Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９
８４年）それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合
成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得す
ることが可能である。

【００３２】（３）エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤ
Ｈ活性が欠損もしくは低下しかつＰＰＣ活性とＧＤＨ活
性が増幅されたＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株
を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の生産

【００３３】エシェリヒア属に属し、α−ＫＧＤＨ活性
が欠損もしくは低下しかつＰＰＣ活性とＧＤＨ活性が増
幅されたＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株を用い
てＬ−グルタミン酸を生産せしめるには、炭素源、窒素
源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン
等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて
常法により行うことができる。合成培地または天然培地
のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源及
び窒素源は、使用菌の利用可能なものならばいずれの種
類を用いてもよい。

【００３４】炭素源としては、グルコース、グリセロー
ル、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノ
ース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が
使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独
あるいは他の炭素源と併用して用いられる。

【００３５】窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩ま
たは硝酸塩等が使用される。

【００３６】有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプ
トン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使
用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株
を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必
要である。

【００３７】無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。

【００３８】培養方法は、発酵温度２０ないし４５℃、
ｐＨを５ないし９に制御しつつ通気培養を行う。培養中
にｐＨが下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、
アンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして１０
時間ないし４日間程度培養することにより培養液中に著
量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。

【００３９】培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸
を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよ
い。例えば培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する
方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって
採取される。

【００４０】

【実施例】次に実施例によって本発明をさらに詳細に説
明する

【００４１】実施例１ （１）エシェリヒア・コリのｓｕｃＡ遺伝子、ジヒドロ
リポアミドサクシニルトランスフェラーゼ遺伝子のクロ
ーニング エシェリヒア・コリＫ１２株のｓｕｃＡ遺伝子および、
ジヒドロリポアミドサクシニルトランスフェラーゼ遺伝
子（以下、ｓｕｃＢ遺伝子と略す）の塩基配列は既に明
かにされている。明らかにされているｓｕｃＡ遺伝子お
よびｓｕｃＢ遺伝子の塩基配列は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．、第１４１巻、３５１〜３７４頁、１９８４
年に開示されているが、同配列を配列表の配列番号７に
も記載した。３２７番目から３１２８番目に至る塩基配
列がｓｕｃＡ遺伝子のＯ．Ｒ．Ｆ．に相当し、３１４３
番目から４３５７番目に至る塩基配列がｓｕｃＢ遺伝子
のＯ．Ｒ．Ｆ．に相当する。報告されている塩基配列に
基づいて配列表配列番号１から４に示すプライマーを合
成し、エシェリヒア・コリＷ３１１０株の染色体ＤＮＡ
を鋳型としてＰＣＲ法によりｓｕｃＡ遺伝子およびｓｕ
ｃＢ遺伝子をそれぞれ増幅した。

【００４２】ｓｕｃＡ遺伝子の増幅に用いた合成プライ
マーは配列表配列番号１および２に示す塩基配列であ
り、配列表配列番号１はＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、第１４１巻、３５４頁、１９８４年に記載されて
いるｓｕｃＡ遺伝子の塩基配列図上の４５番目から６５
番目の塩基に至る配列に相当する。また、配列表配列番
号７として記載する塩基配列の４５番目から６５番目の
塩基に至る配列に相当する。

【００４３】配列表配列番号２はＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．、第１４１巻、３６４頁、１９８４年に記載さ
れているｓｕｃＢ遺伝子の塩基配列図上の３１７３番目
から３１９３番目までの配列に相当する。また、配列表
配列番号７として記載する塩基配列の３１７３番目から
３１９３番目の塩基に至る配列に相当する。

【００４４】またｓｕｃＢ遺伝子の増幅に用いた合成プ
ライマーは配列表配列番号３および４に示す塩基配列で
あり、、配列表配列番号３はＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、第１４１巻、３５４頁、１９８４年に記載されて
いるｓｕｃＡ遺伝子の塩基配列図上の２１７９番目から
２１９８番目までの塩基配列に相当する。また、配列表
配列番号７として記載する塩基配列の２１７９番目から
２１９８番目の塩基に至る配列に相当する。

【００４５】配列表配列番号４はＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．第１４１巻、３６４頁、１９８４年に記載され
ているｓｕｃＢ遺伝子の塩基配列図上の４５６６番目か
ら４５９１番目の塩基配列に相当する。また、配列表配
列番号７として記載する塩基配列の４５６６番目から４
５９１番目の塩基に至る配列に相当する。 尚、ｓｕｃ
Ａ遺伝子とｓｕｃＢ遺伝子はオペロンを成す。

【００４６】エシェリヒア・コリＷ３１１０株の染色体
ＤＮＡの回収は、常法によった（生物工学実験書、日本
生物工学会編、９７ー９８頁、培風館、１９９２年）。

【００４７】ＰＣＲ反応は、ＰＣＲテクノロジー（ヘン
リーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）
８頁に記載されている標準反応条件を用いた。

【００４８】次いで生成したＰＣＲ産物の末端をＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより平滑にし、ベクターであるｐＢ
Ｒ３２２のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。ｐＢＲ
３２２にｓｕｃＡ遺伝子をクローニングしたプラスミド
をｐＢＲ−ｓｕｃＡ、同様にｓｕｃＢ遺伝子をクローニ
ングしたものをｐＢＲ−ｓｕｃＢと名づけた。以上の様
にして得られたプラスミドをエシェリヒア・コリＪＭ１
０９株に導入し、プラスミドを調製後、制限酵素地図を
作成し、報告されているｓｕｃＡ、ｓｕｃＢ遺伝子の制
限酵素地図と比較し、クローニングされた遺伝子がｓｕ
ｃＡ、ｓｕｃＢ遺伝子であることを確認した。

【００４９】図１に示すようにｐＢＲ−ｓｕｃＢをＫｐ
ｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｓｕｃＢ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を調製した。ｐＢＲ−ｓｕｃＡをＫｐｎＩお
よびＥｃｏＲＩで消化し、大断片を調製した。両者をＴ
４ＤＮＡリガーゼにより連結しｐＢＲ−ｓｕｃＡＢを作
成した。

【００５０】（２）エシェリヒア・コリＷ３１１０の染
色体ＤＮＡ上のｓｕｃＡ遺伝子の破壊図２にエシェリヒ
ア・コリＷ３１１０株の染色体ＤＮＡ上のｓｕｃＡ遺伝
子の破壊の概略を示す。

【００５１】ｐＢＲ−ｓｕｃＡＢをＫｐｎＩで消化し、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化した。一方、
ｐＵＣ４Ｋ（ファルマシアから購入）をＰｓｔＩで消化
し、カナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化した。両
者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、ｐＢＲ−ｓｕｃ
Ａ：：Ｋｍ^rを作成した。次に本プラスミドからカナマ
イシン耐性遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断
片を切り出し、この直鎖状ＤＮＡを用いてエシェリヒア
・コリジェネティックストックセンター（米国エール
大）から入手したエシェリヒア・コリＪＣ７６２３株
（ｔｈｒ−１、ａｒａー１４、ｌｅｕＢ６、△（ｇｐｔ
ーｐｒｏＡ）６２、ｌａｃＹ１、ｔｓｘ−３３、ｓｕｐ
Ｅ４４、ｇａｌＫ２、λ^ー、ｒａｃ^ー、ｓｂｃＢ１５、ｈ
ｉｓＧ４、ｒｆｂＤ１、ｒｅｃＢ２１、ｒｅｃＣ２２、
ｒｐｓＬ３１、ｋｄｇＫ５１、ｘｙｌ−５、ｍｔｌ−
１、ａｒｇＥ３、ｔｈｉ−１）を形質転換し、染色体Ｄ
ＮＡ上のｓｕｃＡ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子の挿
入されたｓｕｃＡ遺伝子（ｓｕｃＡ：：Ｋｍ^r）に組換
えられた株を２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ培
地（バクトトリプトン １０ｇ／ｌ、酵母エキス ５ｇ
／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、寒天 １５ｇ／ｌ、ｐＨ
７．２）上で選択した。エシェリヒア・コリＪＣ７６２
３株はｒｅｃＢ^ー、ｒｅｃＣ^ー、ｓｂｃＢ^ーの形質を有し
ているために直鎖状のＤＮＡを用いて形質転換を行って
も頻度良く組換えをおこす。

【００５２】カナマイシン耐性株が１２株得られたので
１２株それぞれから染色体ＤＮＡを調製し、ＫｐｎＩで
消化し、ｓｕｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片をプローブに
してサザンハイブリダイゼイションを行い、１２株全て
が染色体ＤＮＡ上のｓｕｃＡ遺伝子がカナマイシン耐性
遺伝子の挿入されたｓｕｃＡ遺伝子に組換えられた株で
あることを確認した。ｐＢＲ−ｓｕｃＡのｓｕｃＡ遺伝
子を含む２．６ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
をプローブにしてサザンハイブリダイゼイションを行う
と野生株ではｓｕｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片の中にＫ
ｐｎＩ部位が存在するために５．２Ｋｂと６．２Ｋｂの
２本のバンドが現れるが、カナマイシン耐性遺伝子が挿
入されたｓｕｃＡ遺伝子に組換えられた株ではカンマイ
シン耐性遺伝子の挿入の際にＫｐｎＩ部位が破壊されて
いるため１１．４Ｋｂの１本のバンドしか現れない。こ
の様にして得られたカナマイシン耐性のエシェリヒア・
コリＪＣ７６２３（ｓｕｃＡ：：Ｋｍ^r）株にＰ１ファ
ージを感染させ、溶菌液を調製後、エシェリヒア・コリ
Ｗ３１１０株にｓｕｃＡ：：Ｋｍ^rを形質導入した。Ｐ
１ファージによる形質導入は常法によった（生物工学実
験書、日本生物工学会編、７５−７６頁、培風館、１９
９２年）。カナマイシン耐性株として分離した株の内代
表株をＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍ^rと名付けた。

【００５３】Ｗ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍ^r株並びにエ
シェリヒア・コリＷ３１１０株のα−ＫＧＤＨ活性をＲ
ｅｅｄ等の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、第１３巻、５５頁、１９６９年）により測定
した。その結果を表１に示す。 エシェリヒア・コリＷ
３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍ^r株にはα−ＫＧＤＨ活性は
検出されなかった。すなわち、エシェリヒア・コリＷ３
１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍ^r株はα−ＫＧＤＨを欠損して
いる株である。

【００５４】

【表１】

【００５５】（３）エシェリヒア・コリＷ３１１０株の
ｇｄｈＡ遺伝子のクローニング ｓｕｃＡおよびｓｕｃＢ遺伝子のクローニングと同様に
ＰＣＲ法によりｇｄｈＡ遺伝子をクローニングした。Ｆ
ｅｒｎａｎｄｏ等により報告されているｇｄｈＡ遺伝子
の塩基配列をもとにしてＰＣＲ用プライマーを合成し
た。ｇｄｈＡ遺伝子の塩基配列はＧｅｎｅ、第２７巻、
１９３〜１９９頁、１９８４年に開示されているが、配
列表の配列番号８としても記載した。ＰＣＲ用プライマ
ーの塩基配列を配列表配列番号５及び６に示す。

【００５６】配列表配列番号５はＧｅｎｅ、第２７巻、
１９５頁、１９８４年に記載されているｇｄｈＡ遺伝子
の塩基配列図上の−１９１番目から−１７１番目の配列
に相当し、配列表配列番号８の３番目から２３番目の配
列に相当する。

【００５７】配列表配列番号６はＧｅｎｅ、第２７巻、
１９５頁、１９８４年に記載されているｇｄｈＡ遺伝子
の塩基配列図上の１６８７番目から１７０７番目の塩基
までの配列に相当し、配列表配列番号８の１８８０番目
から１９００番目の塩基までの配列に相当する。

【００５８】調製したエシェリヒア・コリＷ３１１０の
染色体ＤＮＡを鋳型にして合成したプライマーを用いて
ＰＣＲ法によりｇｄｈＡ遺伝子を増幅し、得られたＰＣ
Ｒ産物を精製後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端に
した後、ＥｃｏＲＶで消化したｐＢＲ３２２に連結しプ
ラスミドｐＢＲＧＤＨを作成した。

【００５９】（４）ｐｐｃ遺伝子とｇｄｈＡ遺伝子を有
するプラスミドの作成 図３にｐｐｃ遺伝子とｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミ
ドの構築方法を示した。ｐＢＲ３２２のＳａｌＩサイト
にエシェリヒア・コリＫ−１２株に由来するｐｐｃ遺伝
子の全領域を含む４．４ＫｂのＳａｌＩ断片が挿入され
たプラスミドｐＳ２（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９巻、
９０９〜９１６頁、１９８４年）をＨｉｎｄＩＩＩで消
化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで両末端を平滑末端にし
た。一方ＰＣＲ法で合成したｇｄｈＡ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にした。次
いで両者をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。得られたプ
ラスミドで、エシェリヒア・コリジェネティックストッ
クセンター（米国エール大）より入手したＧＤＨ欠損株
エシェリヒア・コリＰＡ３４０（ｔｈｒ−１、ｆｈｕＡ
２、ｌｅｕＢ６、ｌａｃＹ１、ｓｕｐＥ４４、ｇａｌ−
６、λ^ー、ｇｄｈ−１、ｈｉｓＧ１、ｒｆｂＤ１、ｇａ
ｌＰ６３、Δ（ｇｌｔＢ−Ｆ）、ｒｐｓＬ１９、ｍａｌ
Ｔ１（λ^R）、ｘｙｌ−７、ｍｔｌ−２、ａｒｇＨ１、
ｔｈｉ−１）を形質転換し、アンピシリン耐性でかつグ
ルタミン酸要求性を消失した株を分離した。この株より
プラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、本プラス
ミド上にｐｐｃ遺伝子、ｇｄｈＡ遺伝子が存在すること
を確認し、本プラスミドをｐＧＫと名付けた。

【００６０】（５）α−ＫＧＤＨ欠損株エシェリヒア・
コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍ^rへのｐＳ２、ｐＢＲ
ＧＤＨ、ｐＧＫの導入と培養評価 αＫＧＤＨ欠損株エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃ
Ａ：：Ｋｍ^rをｐＳ２、ｐＢＲＧＤＨ、ｐＧＫでそれぞ
れ形質転換し、得られた形質転換株をそれぞれ表２の組
成の培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ容振とうフラス
コに接種して、３７℃にて培地中の糖が消費されるまで
振とう培養したところ、表３に示す結果が得られた。

【００６１】

【表２】

【００６２】

【表３】

【００６３】ｐＳ２を導入しＰＰＣ活性を増幅した形質
転換株では宿主であるＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍ^rに
比較して若干生育が低下したが、Ｌ−グルタミン酸の蓄
積量は宿主と変わらなかった。また、ｐＢＲＧＤＨを導
入しＧＤＨ活性を増幅した株では生育が極めて悪く、驚
くことにＬ−グルタミン酸の蓄積量はＷ３１１０ｓｕｃ
Ａ：：Ｋｍ^r株に比較して低下した。

【００６４】ところが一方、ｐＧＫを導入しＰＰＣとＧ
ＤＨ活性を同時に増幅した形質転換株では生育は宿主と
変わらず、Ｌ−グルタミン酸蓄積量には顕著な増加が認
められた。ｐｐｃ遺伝子とｇｄｈＡ遺伝子を有するプラ
スミドｐＧＫが導入されたエシェリヒア・コリＷ３１１
０ｓｕｃＡ：：Ｋｍ^r株をＡＪ１２９４９と名付けた。
エシェリヒア・コリＡＪ１２９４９株は通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター
に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４０３９
が付与されている。

【００６５】尚、宿主であるＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋ
ｍ^r株は寄託したＡＪ１２９４９株より宿主細胞を損な
うことなく宿主細胞中のプラスミドを除去することによ
り得られる。プラスミドは宿主より自然に失われること
もあるし、除去操作によって除くこともできる（Ｂａｃ
ｔ． Ｒｅｖ．、第３６巻、３６１〜４０５頁、１９７
２年）。他の除去操作の例は以下の通りである。ＡＪ１
２９４９株をＬブロス（バクトトリプトン １０ｇ／
ｌ、酵母エキス ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、ｐＨ
７．２）に接種し、４０℃で一晩培養後、培養液を適当
に希釈し、アンピシリンを含有しないＬ培地に塗布し、
３７℃で一晩培養後出現したコロニーをアンピシリン１
００μｇ／ｍｌを含むＬ培地に移植し、アンピシリン感
受性のコロニーを分離する。 かくして得られる株がＷ
３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍ^rである。

【００６６】

【発明の効果】本発明の方法により、エシェリヒア属に
属する変異株のＬ−グルタミン酸生産能を高めることが
でき、Ｌ−グルタミン酸を安価かつ効率的に製造するこ
とができる。

【００６７】

【配列表】

【００６８】配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：エシェリヒア・コリｓｕｃＡ遺伝子増幅用
プライマー 配列 ＡＣＧＣＧＣＡＡＧＣ ＧＴＣＧＣＡＴＣＡＧ Ｇ
２１

【００６９】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：エシェリヒア・コリｓｕｃＡ遺伝子増幅用
プライマー 配列 ＡＴＣＧＧＣＴＡＣＧ ＡＡＴＴＣＡＧＧＣＡ Ｇ
２１

【００７０】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：エシェリヒア・コリｓｕｃＢ遺伝子増幅用
プライマー 配列 CCGGTCGCGG TACCTTCTTC 20

【００７１】配列番号：４ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：エシェリヒア・コリｓｕｃＢ遺伝子増幅用
プライマー 配列 CGTAGACCGA ATTCTTCGTA TCGCTT 26

【００７２】配列番号：５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：エシェリヒア・コリｇｄｈＡ遺伝子増幅用
プライマー 配列 GGGTGGCAAA GCTTTAGCGT C 21

【００７３】配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：エシェリヒア・コリｇｄｈＡ遺伝子増幅用
プライマー 配列 TCGAGAAGCA TGCATTATAT A 21

【００７４】配列番号：７ 配列の長さ：４６２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 起源 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） 配列の特徴 特徴を表す記号： CDS 存在位置： 327..3128 特徴を決定をした方法： E 特徴を表す記号： CDS 存在位置： 3143..4357 特徴を決定をした方法： E 配列 TCGATGTTGT TGCAACGTAA TGCGTAAACC GTAGGCCTGA TAAGACGCGC AAGCGTCGCA 60 TCAGGCAACC AGTGCCGGAT GCGCGTGAAC GCCTTATCCG GCCTACAAGT CATTACCCGT 120 AGGCCTGATA AGCGCAGCGC ATCAGGCGTA ACAAAGAAAT GCAGGAAATC TTTAAAAACT 180 GCCCCTGACA CTAAGACAGT TTTTAAAGGT TCCTTCGCGA GCCACTACGT AGACAAGAGC 240 TCGCAAGTGA ACCCCGGCAC GCACATCACT GTGCGTGGTA GTATCCACGG CGAAGTAAGC 300 ATAAAAAAGA TGCTTAAGGG ATCACG ATG CAG AAC AGC GCT TTG AAA GCC TGG 353 Met Gln Asn Ser Ala Leu Lys Ala Trp 1 5 TTG GAC TCT TCT TAC CTC TCT GGC GCA AAC CAG AGC TGG ATA GAA CAG 401 Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Gln Ser Trp Ile Glu Gln 10 15 20 25 CTC TAT GAA GAC TTC TTA ACC GAT CCT GAC TCG GTT GAC GCT AAC TGG 449 Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Asn Trp 30 35 40 CGT TCG ACG TTC CAG CAG TTA CCT GGT ACG GGA GTC AAA CCG GAT CAA 497 Arg Ser Thr Phe Gln Gln Leu Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Asp Gln 45 50 55 TTC CAC TCT CAA ACG CGT GAA TAT TTC CGC CGC CTG GCG AAA GAC GCT 545 Phe His Ser Gln Thr Arg Glu Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala 60 65 70 TCA CGT TAC TCT TCA ACG ATC TCC GAC CCT GAC ACC AAT GTG AAG CAG 593 Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ile Ser Asp Pro Asp Thr Asn Val Lys Gln 75 80 85 GTT AAA GTC CTG CAG CTC ATT AAC GCA TAC CGC TTC CGT GGT CAC CAG 641 Val Lys Val Leu Gln Leu Ile Asn Ala Tyr Arg Phe Arg Gly His Gln 90 95 100 105 CAT GCG AAT CTC GAT CCG CTG GGA CTG TGG CAG CAA GAT AAA GTG GCC 689 His Ala Asn Leu Asp Pro Leu Gly Leu Trp Gln Gln Asp Lys Val Ala 110 115 120 GAT CTG GAT CCG TCT TTC CAC GAT CTG ACC GAA GCA GAC TTC CAG GAG 737 Asp Leu Asp Pro Ser Phe His Asp Leu Thr Glu Ala Asp Phe Gln Glu 125 130 135 ACC TTC AAC GTC GGT TCA TTT GCC AGC GGC AAA GAA ACC ATG AAA CTC 785 Thr Phe Asn Val Gly Ser Phe Ala Ser Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu 140 145 150 GGC GAG CTG CTG GAA GCC CTC AAG CAA ACC TAC TGC GGC CCG ATT GGT 833 Gly Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Pro Ile Gly 155 160 165 GCC GAG TAT ATG CAC ATT ACC AGC ACC GAA GAA AAA CGC TGG ATC CAA 881 Ala Glu Tyr Met His Ile Thr Ser Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln 170 175 180 185 CAG CGT ATC GAG TCT GGT CGC GCG ACT TTC AAT AGC GAA GAG AAA AAA 929 Gln Arg Ile Glu Ser Gly Arg Ala Thr Phe Asn Ser Glu Glu Lys Lys 190 195 200 CGC TTC TTA AGC GAA CTG ACC GCC GCT GAA GGT CTT GAA CGT TAC CTC 977 Arg Phe Leu Ser Glu Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Arg Tyr Leu 205 210 215 GGC GCA AAA TTC CCT GGC GCA AAA CGC TTC TCG CTG GAA GGC GGT GAC 1025 Gly Ala Lys Phe Pro Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp 220 225 230 GCG TTA ATC CCG ATG CTT AAA GAG ATG ATC CGC CAC GCT GGC AAC AGC 1073 Ala Leu Ile Pro Met Leu Lys Glu Met Ile Arg His Ala Gly Asn Ser 235 240 245 GGC ACC CGC GAA GTG GTT CTC GGG ATG GCG CAC CGT GGT CGT CTG AAC 1121 Gly Thr Arg Glu Val Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn 250 255 260 265 GTG CTG GTG AAC GTG CTG GGT AAA AAA CCG CAA GAC TTG TTC GAC GAG 1169 Val Leu Val Asn Val Leu Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu 270 275 280 TTC GCC GGT AAA CAT AAA GAA CAC CTC GGC ACG GGT GAC GTG AAA TAC 1217 Phe Ala Gly Lys His Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr 285 290 295 CAC ATG GGC TTC TCG TCT GAC TTC CAG ACC GAT GGC GGC CTG GTG CAC 1265 His Met Gly Phe Ser Ser Asp Phe Gln Thr Asp Gly Gly Leu Val His 300 305 310 CTG GCG CTG GCG TTT AAC CCG TCT CAC CTT GAG ATT GTA AGC CCG GTA 1313 Leu Ala Leu Ala Phe Asn Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val 315 320 325 GTT ATC GGT TCT GTT CGT GCC CGT CTG GAC AGA CTT GAT GAG CCG AGC 1361 Val Ile Gly Ser Val Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Asp Glu Pro Ser 330 335 340 345 AGC AAC AAA GTG CTG CCA ATC ACC ATC CAC GGT GAC GCC GCA GTG ACC 1409 Ser Asn Lys Val Leu Pro Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Thr 350 355 360 GGG CAG GGC GTG GTT CAG GAA ACC CTG AAC ATG TCG AAA GCG CGT GGT 1457 Gly Gln Gly Val Val Gln Glu Thr Leu Asn Met Ser Lys Ala Arg Gly 365 370 375 TAT GAA GTT GGC GGT ACG GTA CGT ATC GTT ATC AAC AAC CAG GTT GGT 1505 Tyr Glu Val Gly Gly Thr Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly 380 385 390 TTC ACC ACC TCT AAT CCG CTG GAT GCC CGT TCT ACG CCG TAC TGT ACT 1553 Phe Thr Thr Ser Asn Pro Leu Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr 395 400 405 GAT ATC GGT AAG ATG GTT CAG GCC CCG ATT TTC CAC GTT AAC GCG GAC 1601 Asp Ile Gly Lys Met Val Gln Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp 410 415 420 425 GAT CCG GAA GCC GTT GCC TTT GTG ACC CGT CTG GCG CTC GAT TTC CGT 1649 Asp Pro Glu Ala Val Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Phe Arg 430 435 440 AAC ACC TTT AAA CGT GAT GTC TTC ATC GAC CTG GTG TCG TAC CGC CGT 1697 Asn Thr Phe Lys Arg Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Ser Tyr Arg Arg 445 450 455 CAC GGC CAC AAC GAA GCC GAC GAG CCG AGC GCA ACC CAG CCG CTG ATG 1745 His Gly His Asn Glu Ala Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met 460 465 470 TAT CAG AAA ATC AAA AAA CAT CCG ACA CCG CGC AAA ATC TAC GCT GAC 1793 Tyr Gln Lys Ile Lys Lys His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp 475 480 485 AAG CTG GAG CAG GAA AAA GTG GCG ACG CTG GAA GAT GCC ACC GAG ATG 1841 Lys Leu Glu Gln Glu Lys Val Ala Thr Leu Glu Asp Ala Thr Glu Met 490 495 500 505 GTT AAC CTG TAC CGC GAT GCG CTG GAT GCT GGC GAT TGC GTA GTG GCA 1889 Val Asn Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Asp Ala Gly Asp Cys Val Val Ala 510 515 520 GAG TGG CGT CCG ATG AAC ATG CAC TCT TTC ACC TGG TCG CCG TAC CTC 1937 Glu Trp Arg Pro Met Asn Met His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu 525 530 535 AAC CAC GAA TGG GAC GAA GAG TAC CCG AAC AAA GTT GAG ATG AAG CGC 1985 Asn His Glu Trp Asp Glu Glu Tyr Pro Asn Lys Val Glu Met Lys Arg 540 545 550 CTG CAG GAG CTG GCG AAA CGC ATC AGC ACG GTG CCG GAA GCA GTT GAA 2033 Leu Gln Glu Leu Ala Lys Arg Ile Ser Thr Val Pro Glu Ala Val Glu 555 560 565 ATG CAG TCT CGC GTT GCC AAG ATT TAT GGC GAT CGC CAG GCG ATG GCT 2081 Met Gln Ser Arg Val Ala Lys Ile Tyr Gly Asp Arg Gln Ala Met Ala 570 575 580 585 GCC GGT GAG AAA CTG TTC GAC TGG GGC GGT GCG GAA AAC CTC GCT TAC 2129 Ala Gly Glu Lys Leu Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr 590 595 600 GCC ACG CTG GTT GAT GAA GGC ATT CCG GTT CGC CTG TCG GGT GAA GAC 2177 Ala Thr Leu Val Asp Glu Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp 605 610 615 TCC GGT CGC GGT ACC TTC TTC CAC CGC CAC GCG GTG ATC CAC AAC CAG 2225 Ser Gly Arg Gly Thr Phe Phe His Arg His Ala Val Ile His Asn Gln 620 625 630 TCT AAC GGT TCC ACT TAC ACG CCG CTG CAA CAT ATC CAT AAC GGG CAG 2273 Ser Asn Gly Ser Thr Tyr Thr Pro Leu Gln His Ile His Asn Gly Gln 635 640 645 GGC GCG TTC CGT GTC TGG GAC TCC GTA CTG TCT GAA GAA GCA GTG CTG 2321 Gly Ala Phe Arg Val Trp Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu 650 655 660 665 GCG TTT GAA TAT GGT TAT GCC ACC GCA GAA CCA CGC ACT CTG ACC ATC 2369 Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Pro Arg Thr Leu Thr Ile 670 675 680 TGG GAA GCG CAG TTC GGT GAC TTC GCC AAC GGT GCG CAG GTG GTT ATC 2417 Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile 685 690 695 GAC CAG TTC ATC TCC TCT GGC GAA CAG AAA TGG GGC CGG ATG TGT GGT 2465 Asp Gln Phe Ile Ser Ser Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly 700 705 710 CTG GTG ATG TTG CTG CCG CAC GGT TAC GAA GGG CAG GGG CCG GAG CAC 2513 Leu Val Met Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His 715 720 725 TCC TCC GCG CGT CTG GAA CGT TAT CTG CAA CTT TGT GCT GAG CAA AAC 2561 Ser Ser Ala Arg Leu Glu Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn 730 735 740 745 ATG CAG GTT TGC GTA CCG TCT ACC CCG GCA CAG GTT TAC CAC ATG CTG 2609 Met Gln Val Cys Val Pro Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu 750 755 760 CGT CGT CAG GCG CTG CGC GGG ATG CGT CGT CCG CTG GTC GTG ATG TCG 2657 Arg Arg Gln Ala Leu Arg Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser 765 770 775 CCG AAA TCC CTG CTG CGT CAT CCG CTG GCG GTT TCC AGC CTC GAA GAA 2705 Pro Lys Ser Leu Leu Arg His Pro Leu Ala Val Ser Ser Leu Glu Glu 780 785 790 CTG GCG AAC GGC ACC TTC CTG CCA GCC ATC GGT GAA ATC GAC GAG CTT 2753 Leu Ala Asn Gly Thr Phe Leu Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Glu Leu 795 800 805 GAT CCG AAG GGC GTG AAG CGC GTA GTG ATG TGT TCT GGT AAG GTT TAT 2801 Asp Pro Lys Gly Val Lys Arg Val Val Met Cys Ser Gly Lys Val Tyr 810 815 820 825 TAC GAC CTG CTG GAA CAG CGT CGT AAG AAC AAT CAA CAC GAT GTC GCC 2849 Tyr Asp Leu Leu Glu Gln Arg Arg Lys Asn Asn Gln His Asp Val Ala 830 835 840 ATT GTG CGT ATC GAG CAA CTC TAC CCG TTC CCG CAT AAA GCG ATG CAG 2897 Ile Val Arg Ile Glu Gln Leu Tyr Pro Phe Pro His Lys Ala Met Gln 845 850 855 GAA GTG TTG CAG CAG TTT GCT CAC GTC AAG GAT TTT GTC TGG TGC CAG 2945 Glu Val Leu Gln Gln Phe Ala His Val Lys Asp Phe Val Trp Cys Gln 860 865 870 GAA GAG CCG CTC AAC CAG GGC GCA TGG TAC TGC AGC CAG CAT CAT TTC 2993 Glu Glu Pro Leu Asn Gln Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe 875 880 885 CGT GAA GTG ATT CCG TTT GGG GCT TCT CTG CGT TAT GCA GGC CGC CCG 3041 Arg Glu Val Ile Pro Phe Gly Ala Ser Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro 890 895 900 905 GCC TCC GCC TCT CCG GCG GTA GGG TAT ATG TCC GTT CAC CAG AAA CAG 3089 Ala Ser Ala Ser Pro Ala Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Lys Gln 910 915 920 CAA CAA GAT CTG GTT AAT GAC GCG CTG AAC GTC GAA TAAATAAAGG 3135 Gln Gln Asp Leu Val Asn Asp Ala Leu Asn Val Glu 925 930 ATACACA ATG AGT AGC GTA GAT ATT CTG GTC CCT GAC CTG CCT GAA TCC 3184 Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser 1 5 10 GTA GCC GAT GCC ACC GTC GCA ACC TGG CAT AAA AAA CCC GGC GAC GCA 3232 Val Ala Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala 15 20 25 30 GTC GTA CGT GAT GAA GTG CTG GTA GAA ATC GAA ACT GAC AAA GTG GTA 3280 Val Val Arg Asp Glu Val Leu Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val 35 40 45 CTG GAA GTA CCG GCA TCA GCA GAC GGC ATT CTG GAT GCG GTT CTG GAA 3328 Leu Glu Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Ile Leu Asp Ala Val Leu Glu 50 55 60 GAT GAA GGT ACA ACG GTA ACG TCT CGT CAG ATC CTT GGT CGC CTG CGT 3376 Asp Glu Gly Thr Thr Val Thr Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Arg 65 70 75 GAA GGC AAC AGC GCC GGT AAA GAA ACC AGC GCC AAA TCT GAA GAG AAA 3424 Glu Gly Asn Ser Ala Gly Lys Glu Thr Ser Ala Lys Ser Glu Glu Lys 80 85 90 GCG TCC ACT CCG GCG CAA CGC CAG CAG GCG TCT CTG GAA GAG CAA AAC 3472 Ala Ser Thr Pro Ala Gln Arg Gln Gln Ala Ser Leu Glu Glu Gln Asn 95 100 105 110 AAC GAT GCG TTA AGC CCG GCG ATC CGT CGC CTG CTG GCT GAA CAC AAT 3520 Asn Asp Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Leu Ala Glu His Asn 115 120 125 CTC GAC GCC AGC GCC ATT AAA GGC ACC GGT GTG GGT GGT CGT CTG ACT 3568 Leu Asp Ala Ser Ala Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr 130 135 140 CGT GAA GAT GTG GAA AAA CAT CTG GCG AAA GCC CCG GCG AAA GAG TCT 3616 Arg Glu Asp Val Glu Lys His Leu Ala Lys Ala Pro Ala Lys Glu Ser 145 150 155 GCT CCG GCA GCG GCT GCT CCG GCG GCG CAA CCG GCT CTG GCT GCA CGT 3664 Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gln Pro Ala Leu Ala Ala Arg 160 165 170 AGT GAA AAA CGT GTC CCG ATG ACT CGC CTG CGT AAG CGT GTG GCA GAG 3712 Ser Glu Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu 175 180 185 190 CGT CTG CTG GAA GCG AAA AAC TCC ACC GCC ATG CTG ACC ACG TTC AAC 3760 Arg Leu Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn 195 200 205 GAA GTC AAC ATG AAG CCG ATT ATG GAT CTG CGT AAG CAG TAC GGT GAA 3808 Glu Val Asn Met Lys Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Glu 210 215 220 GCG TTT GAA AAA CGC CAC GGC ATC CGT CTG GGC TTT ATG TCC TTC TAC 3856 Ala Phe Glu Lys Arg His Gly Ile Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr 225 230 235 GTG AAA GCG GTG GTT GAA GCC CTG AAA CGT TAC CCG GAA GTG AAC GCT 3904 Val Lys Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala 240 245 250 TCT ATC GAC GGC GAT GAC GTG GTT TAC CAC AAC TAT TTC GAC GTC AGC 3952 Ser Ile Asp Gly Asp Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser 255 260 265 270 ATG GCG GTT TCT ACG CCG CGC GGC CTG GTG ACG CCG GTT CTG CGT GAT 4000 Met Ala Val Ser Thr Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp 275 280 285 GTC GAT ACC CTC GGC ATG GCA GAC ATC GAG AAG AAA ATC AAA GAG CTG 4048 Val Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu 290 295 300 GCA GTC AAA GGC CGT GAC GGC AAG CTG ACC GTT GAA GAT CTG ACC GGT 4096 Ala Val Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Glu Asp Leu Thr Gly 305 310 315 GGT AAC TTC ACC ATC ACC AAC GGT GGT GTG TTC GGT TCC CTG ATG TCT 4144 Gly Asn Phe Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser 320 325 330 ACG CCG ATC ATC AAC CCG CCG CAG AGC GCA ATT CTG GGT ATG CAC GCT 4192 Thr Pro Ile Ile Asn Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala 335 340 345 350 ATC AAA GAT CGT CCG ATG GCG GTG AAT GGT CAG GTT GAG ATC CTG CCG 4240 Ile Lys Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gln Val Glu Ile Leu Pro 355 360 365 ATG ATG TAC CTG GCG CTG TCC TAC GAT CAC CGT CTG ATC GAT GGT CGC 4288 Met Met Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg 370 375 380 GAA TCC GTG GGC TTC CTG GTA ACG ATC AAA GAG TTG CTG GAA GAT CCG 4336 Glu Ser Val Gly Phe Leu Val Thr Ile Lys Glu Leu Leu Glu Asp Pro 385 390 395 ACG CGT CTG CTG CTG GAC GTG TAGTAGTTTA AGTTTCACCT GCACTGTAGA 4387 Thr Arg Leu Leu Leu Asp Val 400 405 CCGGATAAGG CATTATCGCC TTCTCCGGCA ATTGAAGCCT GATGCGACGC TGACGCGTCT 4447 TATCAGGCCT ACGGGACCAC CAATGTAGGT CGGATAAGGC GCAACGCCGC ATCCGACAAG 4507 CGATGCCTGA TGTGACGTTT AACGTGTCTT ATCAGGCCTA CGGGTGACCG ACAATGCCCG 4567 GAAGCGATAC GAAATATTCG GTCTACGGTT TAAAAGATAA CGATTACTGA AGGATG 4623

【００７５】配列番号：８ 配列の長さ：１９３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 起源 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） 配列の特徴 特徴を表す記号： CDS 存在位置： 194..1537 特徴を決定をした方法： E 配列 CCGGGTGGCA AAACTTTAGC GTCTGAGGTT ATCGCAATTT GGTTATGAGA TTACTCTCGT 60 TATTAATTTG CTTTCCTGGG TCATTTTTTT CTTGCTTACC GTCACATTCT TGATGGTATA 120 GTCGAAAACT GCAAAAGCAC ATGACATAAA CAACATAAGC ACAATCGTAT TAATATATAA 180 GGGTTTTATA TCT ATG GAT CAG ACA TAT TCT CTG GAG TCA TTC CTC AAC 229 Met Asp Gln Thr Tyr Ser Leu Glu Ser Phe Leu Asn 1 5 10 CAT GTC CAA AAG CGC GAC CCG AAT CAA ACC GAG TTC GCG CAA GCC GTT 277 His Val Gln Lys Arg Asp Pro Asn Gln Thr Glu Phe Ala Gln Ala Val 15 20 25 CGT GAA GTA ATG ACC ACA CTC TGG CCT TTT CTT GAA CAA AAT CCA AAA 325 Arg Glu Val Met Thr Thr Leu Trp Pro Phe Leu Glu Gln Asn Pro Lys 30 35 40 TAT CGC CAG ATG TCA TTA CTG GAG CGT CTG GTT GAA CCG GAG CGC GTG 373 Tyr Arg Gln Met Ser Leu Leu Glu Arg Leu Val Glu Pro Glu Arg Val 45 50 55 60 ATC CAG TTT CGC GTG GTA TGG GTT GAT GAT CGC AAC CAG ATA CAG GTC 421 Ile Gln Phe Arg Val Val Trp Val Asp Asp Arg Asn Gln Ile Gln Val 65 70 75 AAC CGT GCA TGG CGT GTG CAG TTC AGC TCT GCC ATC GGC CCG TAC AAA 469 Asn Arg Ala Trp Arg Val Gln Phe Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys 80 85 90 GGC GGT ATG CGC TTC CAT CCG TCA GTT AAC CTT TCC ATT CTC AAA TTC 517 Gly Gly Met Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Leu Lys Phe 95 100 105 CTC GGC TTT GAA CAA ACC TTC AAA AAT GCC CTG ACT ACT CTG CCG ATG 565 Leu Gly Phe Glu Gln Thr Phe Lys Asn Ala Leu Thr Thr Leu Pro Met 110 115 120 GGC GGT GGT AAA GGC GGC AGC GAT TTC GAT CCG AAA GGA AAA AGC GAA 613 Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Glu 125 130 135 140 GGT GAA GTG ATG CGT TTT TGC CAG GCG CTG ATG ACT GAA CTG TAT CGC 661 Gly Glu Val Met Arg Phe Cys Gln Ala Leu Met Thr Glu Leu Tyr Arg 145 150 155 CAC CTG GGC GCG GAT ACC GAC GTT CCG GCA GGT GAT ATC GGG GTT GGT 709 His Leu Gly Ala Asp Thr Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly 160 165 170 GGT CGT GAA GTC GGC TTT ATG GCG GGG ATG ATG AAA AAG CTC TCC AAC 757 Gly Arg Glu Val Gly Phe Met Ala Gly Met Met Lys Lys Leu Ser Asn 175 180 185 AAT ACC GCC TGC GTC TTC ACC GGT AAG GGC CTT TCA TTT GGC GGC AGT 805 Asn Thr Ala Cys Val Phe Thr Gly Lys Gly Leu Ser Phe Gly Gly Ser 190 195 200 CTT ATT CGC CCG GAA GCT ACC GGC TAC GGT CTG GTT TAT TTC ACA GAA 853 Leu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Phe Thr Glu 205 210 215 220 GCA ATG CTA AAA CGC CAC GGT ATG GGT TTT GAA GGG ATG CGC GTT TCC 901 Ala Met Leu Lys Arg His Gly Met Gly Phe Glu Gly Met Arg Val Ser 225 230 235 GTT TCT GGC TCC GGC AAC GTC GCC CAG TAC GCT ATC GAA AAA GCG ATG 949 Val Ser Gly Ser Gly Asn Val Ala Gln Tyr Ala Ile Glu Lys Ala Met 240 245 250 GAA TTT GGT GCT CGT GTG ATC ACT GCG TCA GAC TCC AGC GGC ACT GTA 997 Glu Phe Gly Ala Arg Val Ile Thr Ala Ser Asp Ser Ser Gly Thr Val 255 260 265 GTT GAT GAA AGC GGA TTC ACG AAA GAG AAA CTG GCA CGT CTT ATC GAA 1045 Val Asp Glu Ser Gly Phe Thr Lys Glu Lys Leu Ala Arg Leu Ile Glu 270 275 280 ATC AAA GCC AGC CGC GAT GGT CGA GTG GCA GAT TAC GCC AAA GAA TTT 1093 Ile Lys Ala Ser Arg Asp Gly Arg Val Ala Asp Tyr Ala Lys Glu Phe 285 290 295 300 GGT CTG GTC TAT CTC GAA GGC CAA CAG CCG TGG TCT CTA CCG GTT GAT 1141 Gly Leu Val Tyr Leu Glu Gly Gln Gln Pro Trp Ser Leu Pro Val Asp 305 310 315 ATC GCC CTG CCT TGC GCC ACC CAG AAT GAA CTG GAT GTT GAC GCC GCG 1189 Ile Ala Leu Pro Cys Ala Thr Gln Asn Glu Leu Asp Val Asp Ala Ala 320 325 330 CAT CAG CTT ATC GCT AAT GGC GTT AAA GCC GTC GCC GAA GGG GCA AAT 1237 His Gln Leu Ile Ala Asn Gly Val Lys Ala Val Ala Glu Gly Ala Asn 335 340 345 ATG CCG ACC ACC ATC GAA GCG ACT GAA CTG TTC CAG CAG GCA GGC GTA 1285 Met Pro Thr Thr Ile Glu Ala Thr Glu Leu Phe Gln Gln Ala Gly Val 350 355 360 CTA TTT GCA CCG GGT AAA GCG GCT AAT GCT GGT GGC GTC GCT ACA TCG 1333 Leu Phe Ala Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Thr Ser 365 370 375 380 GGC CTG GAA ATG CCA CAA AAC GCT GCG CGC CTG GGC TGG AAA GCC GAG 1381 Gly Leu Glu Met Pro Gln Asn Ala Ala Arg Leu Gly Trp Lys Ala Glu 385 390 395 AAA GTT GAC GCA CGT TTG CAT CAC ATC ATG CTG GAT ATC CAC CAT GCC 1429 Lys Val Asp Ala Arg Leu His His Ile Met Leu Asp Ile His His Ala 400 405 410 TGT GTT GAG CAT GGT GGT GAA GGT GAG CAA ACC AAC TAC GTG CAG GGC 1477 Cys Val Glu His Gly Gly Glu Gly Glu Gln Thr Asn Tyr Val Gln Gly 415 420 425 GCG AAC ATT GCC GGT TTT GTG AAG GTT GCC GAT GCG ATG CTG GCG CAG 1525 Ala Asn Ile Ala Gly Phe Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln 430 435 440 GGT GTG ATT TAAGTTGTAA ATGCCTGATG GCGCTACGCT TATCAGGCCT 1574 Gly Val Ile 445 ACAAATGGGC ACAATTCATT GCAGTTACGC TCTAATGTAG GCCGGGCAAG CGCAGCGCCC 1634 CCGGCAAAAT TTCAGGCGTT TATGAGTATT TAACGGATGA TGCTCCCCAC GGAACATTTC 1694 TTATGGGCCA ACGGCATTTC TTACTGTAGT GCTCCCAAAA CTGCTTGTCG TAACGATAAC 1754 ACGCTTCAAG TTCAGCATCC GTTAACTTTC TGCGGACTCA CGCGCGCAGC ACTATGCCAG 1814 TAAAGAAATC CCATTTGACT ATTTTTTTGA TAATCTTCTT CGCTTTCGAA CAACTCGTGC 1874 GCCTTTCGAG AAGCAAGCAT TATATAATGC CAGGCCAGTT CTTCTTCAAT TGTCCCGTTT 1934 TGA 1937

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＢＲ−ｓｕｃＡＢの構築図を示す。

【図２】エシェリヒア・コリＷ３１１０の染色体ＤＮＡ
上のｓｕｃＡ遺伝子を破壊する過程を示す。

【図３】ｐＧＫの構築図を示す。

フロントページの続き (72)発明者 倉橋 修 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エシェリヒア属に属し、α−ケトグルタ
   ル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下しかつフ
   ォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ活性とグ
   ルタメートデヒドロゲナーゼ活性が増幅されたＬ−グル
   タミン酸生産能を有する変異株。
2. 【請求項２】 エシェリヒア属に属し、α−ケトグルタ
   ル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下しかつフ
   ォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ活性とグ
   ルタメートデヒドロゲナーゼ活性が増幅されたＬ−グル
   タミン酸生産能を有する変異株を液体培地に培養し、培
   養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを採
   取することを特徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸
   の製造法。