JPH0662435B2 - 免疫グロブリンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫グロブリンの製造方法に関する。詳細には
アミノベンズアミジン、アミノフェニルグアニジンおよ
び塩基性アミノ酸から選ばれる化合物を水不溶性担体に
共有結合した固定化担体で粗製γ−グロブリン画分を処
理することにより、グロブリン画分からプレカリクレイ
ンまたはカリクレインを除去し、あるいはグリブリン画
分中の抗補体価を低下させることによる免疫グロブリン
の製造方法に関する。

〔従来技術・発明が解決しようとする問題点〕

血漿由来の粗製γ−グロブリン画分中には、プレカリク
レイン、カリクレインが含まれ、また抗補体価も高いこ
とが問題とされている。

すなわち、従来からの分画法、例えば、メタノール分画
法、ポリエチレングリコール法あるいは硫安分画法等に
よっても上記の問題点を克服するまでには至っていな
い。

そこで、各種の解決手段が考えられてくる。たとえば、
プレカリクレインを除く方法としてＤＥＡＥ−あるいは
ＱＡＥ−セファデックスによる処理（特開昭５６−１６
４１６号）、カリクレインを除く方法としてポリエチレ
ングリコールによる処理（特開昭５９−１８４１３３
号）そして抗補体価を下げる方法として固定化プラスミ
ンによる処理（特開昭５６−７７２１号）、酸処理（特
開昭５７−３２２２８号）、ＣＭ−セルロースによる処
理（特開昭５９−２２５１２４号）、アルミナ、珪酸等
による処理（特開昭６０−６６２２号）などが挙げられ
る。

しかし、これらの方法によっても上記問題点を十分に解
決することができず、新たな処理方法が期待されてい
る。

従って、本発明は粗製γ−グロプリン画分を原料とし
て、プレカリクレイン、カリクレインの除去、または抗
補体価の低下された免疫グロブリンを製造する方法を提
供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、上記目的を達成するために種々研究を重
ねて来たところ、粗製γ−グロブリン画分を、ｐＨ６〜
８および塩濃度０．０１〜０．２Ｍの処理条件下で、ア
ミノベンズアミジン、アミノフェニルグアニジンおよび
塩基性アミノ酸から選ばれる化合物を水不溶性担体に共
有結合した固定化担体で処理することにより、上記の目
的に対して、従来法以上に良好な効果が得られることを
見出した。即ち、上記処理によって免疫グロブリンのみ
が効率よく非吸着画分中に含まれ、プレカリクレインお
よびカレクレインは当該担体に吸着され、しかも抗補体
価が低下されることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は粗製γ−グロブリン画分を、ｐＨ６〜８
および塩濃度０．０１〜０．２Ｍの処理条件下で、アミ
ノベンズアミジン、アミノフェニルグアニジンおよび塩
基性アミノ酸から選ばれる化合物を水不溶性担体に共有
結合した固定化担体で処理することにより、プレカリク
レインまたはカリクレインを除去し、あるいは抗補体価
を低下させることを特徴とする免疫グロブリンの製造方
法に関する。

本発明で用いられる粗製γ−グロブリン画分としては、
プレカリクレインまたはカリクレインを夾雑するもの、
あるいは抗補体価が高いもの（特に、抗補体価が２０Ｃ
Ｈ₅₀単位／ml以下のもの）であれば特に限定されない。

例えば、エタノール分画法〔ジヤーナル・オブ・アメリ
カン・ケミカル・ソサイアティ（Ｊ．Am.Chem.Soc.）6
8, 459(1946)〕、ポリエチレングリコール分画（特開昭
４８−１０１５１６号）、硫安分画法〔ジヤーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ(J.Am.Chem.S
oc.)62,3386(1940)〕等、あるいはこれらの任意の２種
以上の方法を組み合わせて、γ−グロブリン含有物（た
とえば、血漿）を処理して得られたもの、筋注用に調製
された従来既知のγ−グロブリン、静注用に調製された
γ−グロブリンも精製γ−グロブリン画分に含まれる。

本発明で用いられる固定化担体は、アミノベンズアミジ
ン、アミノフェニルグアニジンあるいは塩基性アミノ酸
（たとえば、リジン、アルギニンなど）から選ばれる化
合物を水不溶性担体に含有結合させたものである。水不
溶性担体としてはセルロース、アガロース、デキストラ
ン、ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体等が挙げら
れる。固定化は、公知の方法に準じて行えばよい。例え
ば、特公昭５７−１３２６６号に開示の方法等が例示さ
れる。

また、共有結合を形成させるために、架橋剤および縮合
剤を用いることも可能である。一例を挙げると、シアン
化ブロムで活性化したアガロースをε−アミノカプロン
酸（架橋剤）と結合させた後、１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（縮合剤）の
存在下、アミノベンズアミジンと結合させて、固定化担
体を得る。当該担体の市販品として、ベンズアミジン−
セファロース６Ｂ（登録商標、ファルマシア社製）など
がある。

処理方法としては、カラム法、バッチ法のどちらを用い
てもよい。その際の条件としては、好ましくは次のとお
りである。即ち、いずれの方法においても、処理条件は
pH６〜８、塩濃度０．０１〜０．２Ｍであることが好ま
しい。

具体的にはバッチ法の場合、pH６〜８、塩濃度０．０１
〜０．２Ｍの溶液（たとえば、生理食塩液、０．０５Ｍ
リン酸緩衝液など）に溶解した粗製γ−グロブリン画分
（蛋白濃度としては、１〜１０ｗ／ｖ％であることが好
ましい）を同じ溶液で平衡化した固定化担体と接触させ
る。その条件としては、固定化担体１mlに対して粗製γ
−グロブリン画分溶液１〜１００ml程度と混合させ、４
±２℃で３０分〜２時間程度であることが好ましい。そ
の後、遠心分離して上清のみを回収する。

カラム法の場合、pH６〜８、塩濃度0.01〜０．２Ｍの溶
液（たとえば、生理食塩液、０．０５Ｍリン酸緩衝液な
ど）に溶解した粗製γ−グロブリン画分（蛋白濃度とし
ては、１〜１０ｗ／ｖ％であることが好ましい）を同じ
溶液で平衡化した固定化担体（カラム）において接触、
展開させる。その条件としては、固定化担体１mlに対し
て粗製γ−グロブリン画分溶液１〜１００ml程度と接触
させ、流速１〜１０ml／分程度で展開することが好まし
い。その後、非吸着の透過画分のみを回収する。

こうして得られたγ−グロブリン画分は、公知の手段に
より精製、例えば透析、イオン交換クロマトグラフィー
を施した後、免疫グロブリンとして調製される。

〔効果〕

本発明の手段により、プレカリクレインまたはカリクレ
インを含み、あるいは抗補体価の高い粗製γ−グロブリ
ン画分に対し、プレカリクレインまたはカリクレインの
除去、あるいは抗補体価の低下を施すことができる。

こうして得られる免疫グロブリンは不純物を含まないた
め、従来品に比べてさらに安全性が保証されており、静
脈投与用として充分に適用できるものである。

〔実施例・実験例・参考例〕

本発明を詳細に説明するために、実施例、参考例、実験
例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。

なお、以下の実施例および実験例において、γ−グロブ
リン量は２８０nmの吸光度として、カリクレイン量はPr
o-Phe-Arg-パラニトロソアニリドを用いた発色法により
４０５nmの吸光度として測定したものであり、また抗補
体価はカバットとマイヤーの方法〔エクスペリメンタル
・イムノケミストリー，２２５（１９６１）〕および西
岡・岡田の方法〔免疫の生化学，１０３，昭和４６年
（共市出版）〕により測定したものである。さらに、凝
集度は高速ゲル濾過法（カラムは東洋曹達社製ＳＷ300
0、検出器はウォーターズ社製モデル440 を用いた）に
より測定したものである。

実施例１ エタノール分画法により得られた粗製γ−グロブリン画
分を生理食塩液で５ｗ／ｖ％に調整した（カリクレイン
値 0.816、抗補体価53）。一方、ベンズアミジン−セフ
ァロース６Ｂ（ファルマシア社製）を生理食塩液で平衡
化した。このカラム５mlにγ−グロブリン溶液２０mlを
チャージし、透過画分を採取した。

こうして得られたγ−グロブリンはカリクレイン値0.0
2、抗補体価１５であり、良好なものであった。

実施例２ ポリエチレングリコール分画法により得られた粗製γ−
グロブリン画分を生理食塩液で５ｗ／ｖ％に調整した
（カリクレイン値 0.027）。このグロブリン溶液５０ml
を用いる以外は実施例１に準じて行い、同様にカリクレ
イン含量の少ないγ−グロブリン（カリクレイン値0.00
7）を得た。

実施例３ 参考例１（後述）で調製したｐ−アミノベンズアミジン
結合アガロースを用いて、実施例１に準じて操作し、同
様にカリクレイン値（０．０１８）、抗補体価（１４）
が共に低いγ−グロブリンを得た。

実施例４ 参考例２（後述）で調製したｐ−アミノベンズアミジン
結合アガロースを用いて、実施例２に準じて操作し、同
様にカリクレイン値（０．００８）が低いγ−グロブリ
ンを得た。

参考例１ アガロースを室温下、pH１１においてシアン化ブロムで
活性化させた後、ε−アミノカプロン酸を添加し、pH
９．５で２４時間反応させ、結合させた。十分洗浄後、
pH５に調整し、ｐ−アミノベンズアミジン及び１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ドを添加して２４時間反応させ、ｐ−アミノベンズアミ
ジン結合アガロースを得た。

参考例２ ｐ−アミノベンズアミジンの代わりに、ｐ−アミノベン
ズグアニジンを用いて、参考例１と同様に操作し、ｐ−
アミノベンズグアニジン結合アガロースを得た。

実験例１ ｐ−アミノベンズアミジン結合セファロース６Ｂカラム
（５ml）を生理食塩液で平衡化した後、各出発原料を生
理食塩液で５ｗ／ｖ％に調整したものをチャージし、透
過画分を５mlずつ分取した。

かくして各分についてのγ−グロブリン量およびカリク
レイン量を前述の方法によって測定し、その結果を第１
表に示した。

出発原料としては、血漿をエタノール分画法に付して得
られた粗製γ−グロブリン画分（筋注製剤用）、これを
さらにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分画法により
処理して得られた粗製γ−グロブリン画分（静注製剤
用）を用いた。（物性を下記第１表に示す） 実験例２ 本発明処理後の抗補体価、凝集度の変化を調べた。

カラムとしてはｐ−アミノベンズアミジン結合セファロ
ース６Ｂ（１０ml）を、出発原料としては血漿をエタノ
ール分画法により処理して得た粗製γ−グロブリン画分
の生理食塩溶液５（ｗ／ｖ％）２０mlを用いて本発明方
法を実施した。かくして得られた免疫グロブリンについ
て、その抗補体価、凝集度を前述の方法にて測定し、原
料物質のそれと比較した。その結果は第２表に示した通
りである。

実験例３ 使用する担体の違いによる効果を比較した。

カラムは１０mlとし、出発原料としては血漿をエタノー
ル分画法に付して得られた粗製γ−グロブリン画分を、
さらにポリエチレングリコール分画法で処理して得られ
た粗製γ−グロブリン画分の生理食塩溶液（５ｗ／ｖ
％）２０mlを用い、担体としては第３表の処理方法の欄
に記載のものを用いた。

その結果を第３表に示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−16416（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−184133（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−17364（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−89184（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】粗製γ−グロブリン画分を、ｐＨ６〜８お
   よび塩濃度０．０１〜０．２Ｍの処理条件下で、アミノ
   ベンズアミジン、アミノフェニルグアニジンおよび塩基
   性アミノ酸から選ばれる化合物を水不溶性担体に共有結
   合した固定化担体で処理することにより、プレカリクレ
   インまたはカリクレインを除去し、あるいは抗補体価を
   低下させることを特徴とする免疫グロブリンの製造方
   法。