JPH01258700A - 血液凝固第４因子の精製方法 - Google Patents
血液凝固第４因子の精製方法Info
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- JPH01258700A JPH01258700A JP8445888A JP8445888A JPH01258700A JP H01258700 A JPH01258700 A JP H01258700A JP 8445888 A JP8445888 A JP 8445888A JP 8445888 A JP8445888 A JP 8445888A JP H01258700 A JPH01258700 A JP H01258700A
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- Japan
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- factor
- blood coagulation
- coagulation factor
- aqueous solution
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は純度の高い血液凝固第Ｘ因子（以下、第Ｘ因子
ともいう）の製造法に関する。
ともいう）の製造法に関する。
より詳細には、血液凝固第Ｘ因子含有水溶液を固定化抗
血液凝固第Ｘ因子抗体により処理することによる血液凝
固第Ｘ因子の精製方法における改良に関する。
血液凝固第Ｘ因子抗体により処理することによる血液凝
固第Ｘ因子の精製方法における改良に関する。
第Ｘ因子は、通常単独で使用されることはなく、たとえ
ばヒト血液凝固因子因子、第■因子、および第Ｘ因子等
を含んだ、所謂第Ｘ因子複合体として使用される。
ばヒト血液凝固因子因子、第■因子、および第Ｘ因子等
を含んだ、所謂第Ｘ因子複合体として使用される。
血液凝固は約２０種の促進因子および抑制因子の関連す
るＣａ５ｃａｄｅから成り、これらの血液凝固因子の減
少、増大は血液凝固障害を起こし、種々の疾患をもたら
す、それらの疾患のうち、第■因子の欠乏に基づ（もの
を血友病Ａ、第Ｘ因子の欠乏に基づくものを血友病Ｂと
言う。
るＣａ５ｃａｄｅから成り、これらの血液凝固因子の減
少、増大は血液凝固障害を起こし、種々の疾患をもたら
す、それらの疾患のうち、第■因子の欠乏に基づ（もの
を血友病Ａ、第Ｘ因子の欠乏に基づくものを血友病Ｂと
言う。
この第Ｘ因子は、臨床的には
ｉ）血友病Ｂ患者に対する第Ｘ因子の補充、ｉｉ）血友
病Ａ患者（第■因子抗体保有者）に対するバイパス療法
、 １ｉｉ）凝固因子生合成不全症（薬物投与による）に対
する凝固因子補充療法 などに用いられる。
病Ａ患者（第■因子抗体保有者）に対するバイパス療法
、 １ｉｉ）凝固因子生合成不全症（薬物投与による）に対
する凝固因子補充療法 などに用いられる。
本発明の目的は第Ｘ因子含有水溶液中に含まれる夾雑物
質を分離除去し、純度の高い安全な第Ｘ因子製剤を提供
することにある。
質を分離除去し、純度の高い安全な第Ｘ因子製剤を提供
することにある。
〔課題を解決するための手段］
上記目的を達成するために本発明者らは種々研究を重ね
て来た結果、第Ｘ因子含有水溶液を固定化抗血液凝固第
Ｘ因子抗体によって精製処理する際に、溶出液としてチ
オシアン酸カリウムおよびグアニジンから選ばれる少な
くとも一種を含有する水溶液を使用することによって効
率よく、かつ純度高く第Ｘ因子が得られることを見出し
、さらに研究を重ねて本発明を完成させるに至った。
て来た結果、第Ｘ因子含有水溶液を固定化抗血液凝固第
Ｘ因子抗体によって精製処理する際に、溶出液としてチ
オシアン酸カリウムおよびグアニジンから選ばれる少な
くとも一種を含有する水溶液を使用することによって効
率よく、かつ純度高く第Ｘ因子が得られることを見出し
、さらに研究を重ねて本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は第Ｘ因子含有水溶液を固定化抗血液凝固
第Ｘ因子抗体により処理することによる第Ｘ因子の精製
方法において、溶出液が、チオシアン酸カリウムおよび
グアニジンから選ばれる少なくとも一種を含有する水？
８ａであることを特徴とする精製方法である。
第Ｘ因子抗体により処理することによる第Ｘ因子の精製
方法において、溶出液が、チオシアン酸カリウムおよび
グアニジンから選ばれる少なくとも一種を含有する水？
８ａであることを特徴とする精製方法である。
（ａ）本発明による処理対象物
本発明の方法の処理対象物は、第■因子含有水ン容液で
ある。
ある。
第Ｘ因子はヒト血漿由来のものであれば特に限定されな
い。ここに第Ｘ因子含有水溶液とは、活性成分として第
Ｘ因子のみを含有するものの他、たとえば血液分画技術
等によって得られる所の第Ｘ因子および他の成分を含む
、所謂第Ｘ因子複合体含有溶液であってもよい。
い。ここに第Ｘ因子含有水溶液とは、活性成分として第
Ｘ因子のみを含有するものの他、たとえば血液分画技術
等によって得られる所の第Ｘ因子および他の成分を含む
、所謂第Ｘ因子複合体含有溶液であってもよい。
第Ｘ因子複合体は、第Ｘ因子を主成分とし、さらに他の
成分、たとえば他の血液凝固に関与する成分を含むもの
をいい、たとえばヒト血液凝固第■因子、第■因子およ
び／または第Ｘ因子をも含んでおり、生物学的製剤基準
で規定される規格に適合したものがあげられる。その組
成比は、たとえば１バイアル（２０ｍ）当たりに換算す
ると、第Ｘ因子、第■因子、第■因子、第Ｘ因子を、各
々４００〜５００単位、１００〜５００単位、５〜１５
０単位、１００〜５００単位の値で含むものである。
成分、たとえば他の血液凝固に関与する成分を含むもの
をいい、たとえばヒト血液凝固第■因子、第■因子およ
び／または第Ｘ因子をも含んでおり、生物学的製剤基準
で規定される規格に適合したものがあげられる。その組
成比は、たとえば１バイアル（２０ｍ）当たりに換算す
ると、第Ｘ因子、第■因子、第■因子、第Ｘ因子を、各
々４００〜５００単位、１００〜５００単位、５〜１５
０単位、１００〜５００単位の値で含むものである。
第Ｘ因子含有水溶液としては、血漿、血漿分画、血漿濃
縮物などが例示される。
縮物などが例示される。
（ｂ）固定化抗体による処理
第Ｘ因子は抗第■因子抗体よりなる吸着剤、具体的には
固定化抗第■因子抗体を用いたアフィニティークロマト
グラフィーにより高度精製する。
固定化抗第■因子抗体を用いたアフィニティークロマト
グラフィーにより高度精製する。
担体としては、ポリクローナル抗体カラム、モノクロー
ナル抗体カラムのどちらを用いてもよい。
ナル抗体カラムのどちらを用いてもよい。
ポリクローナル抗体に関して、抗第■因子抗体は、高度
に精製した第Ｘ因子を動物に免疫し、得られた血清から
回収・精製することによって得られる。
に精製した第Ｘ因子を動物に免疫し、得られた血清から
回収・精製することによって得られる。
当該抗血清の製造は公知の方法にて行なえばよく、例え
ば高度精製第Ｘ因子とフロイントの完全アジュバントの
混合乳液を作り、動物の皮肉に２〜３回注射し、最終免
疫の数日後採血を行ない室温で凝固せしめた後、４°Ｃ
で一夜放置し、３．００Ｏｒｐｍ 、２０分間の遠心分
離により当該抗血清が得られる。
ば高度精製第Ｘ因子とフロイントの完全アジュバントの
混合乳液を作り、動物の皮肉に２〜３回注射し、最終免
疫の数日後採血を行ない室温で凝固せしめた後、４°Ｃ
で一夜放置し、３．００Ｏｒｐｍ 、２０分間の遠心分
離により当該抗血清が得られる。
免疫に用いる動物としては、特に動物種を選ぶ必要はな
く、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等が
挙げられる。当該抗血清の精製は、例えば、Ｊ、 Ａｍ
、 Ｃｈｅｗ、 Ｓｏｃ、、 ＪＬ２．３３８６ （１
９４０）。
く、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等が
挙げられる。当該抗血清の精製は、例えば、Ｊ、 Ａｍ
、 Ｃｈｅｗ、 Ｓｏｃ、、 ＪＬ２．３３８６ （１
９４０）。
Ｆｅｄ、 Ｐｒｏｃ、、 Ｌｌ、 １１６１ （１９５
Ｂ）に記載の方法にて行なわれる。
Ｂ）に記載の方法にて行なわれる。
モノクローナル抗体に関して、抗第■囚子抗体は細胞融
合法によって得られる。細胞融合法は自体既知の手段に
て行なわれ、その−例は増殖性を持った細胞と目的とす
る抗体を産生しているリンパ球とをポリエチレングリコ
ールの存在下で反応せしめることにより、増殖性と抗体
産生能とを同時に兼ねそなえた細胞を製し、この細胞に
抗体を産生せしめるものであり、当該抗体は一個の抗原
決定基に対してのみ反応する単一の抗体である。
合法によって得られる。細胞融合法は自体既知の手段に
て行なわれ、その−例は増殖性を持った細胞と目的とす
る抗体を産生しているリンパ球とをポリエチレングリコ
ールの存在下で反応せしめることにより、増殖性と抗体
産生能とを同時に兼ねそなえた細胞を製し、この細胞に
抗体を産生せしめるものであり、当該抗体は一個の抗原
決定基に対してのみ反応する単一の抗体である。
より具体的には増殖性を持つ細胞としてマウスミエロー
マ細胞を、抗体産生リンパ球として第Ｘ因子で免疫され
たマウス肺臓細胞（Ｂ細胞）を用いて融合させ、さらに
目的とする抗体を産生じている細胞をスクリーニングし
て、当該細胞から第Ｘ因子のモノクローナル抗体を得る
。
マ細胞を、抗体産生リンパ球として第Ｘ因子で免疫され
たマウス肺臓細胞（Ｂ細胞）を用いて融合させ、さらに
目的とする抗体を産生じている細胞をスクリーニングし
て、当該細胞から第Ｘ因子のモノクローナル抗体を得る
。
また、このようにして得られた抗第■因子抗体を、その
活性を失うことなく固定化する方法としては、以下の不
溶性マトリックスを応用する方法をあげることができる
。かかる方法としては、例えばアミノ酸のコポリマーを
使用する方法（Ｊ。
活性を失うことなく固定化する方法としては、以下の不
溶性マトリックスを応用する方法をあげることができる
。かかる方法としては、例えばアミノ酸のコポリマーを
使用する方法（Ｊ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、２３６ １９７０ （１９６
１）） 、セルロースを使用する方法（Ｎａｔｕｒｅ、
１８９．５７６ （１９６１）） 、アガロースあ
るいはセファデックスを使用する方法（Ｎａｔｕｒｅ、
２ｉｉＬ１４９１ （１９６７）、 Ｎａｔｕｒｅ、
２４５．３０５９（１９７０）） 、ポリアクリルアミ
ドを使用する方法（Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、、 ８．４０
７４ （１９６６））などがあげられる。
１）） 、セルロースを使用する方法（Ｎａｔｕｒｅ、
１８９．５７６ （１９６１）） 、アガロースあ
るいはセファデックスを使用する方法（Ｎａｔｕｒｅ、
２ｉｉＬ１４９１ （１９６７）、 Ｎａｔｕｒｅ、
２４５．３０５９（１９７０）） 、ポリアクリルアミ
ドを使用する方法（Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、、 ８．４０
７４ （１９６６））などがあげられる。
これらの方法により抗第■因子抗体を効率良く固定化し
うる。また、このようにして得られた吸着剤を用いるこ
とにより、収率良く、しかも高純度の第Ｘ因子を得るこ
とができる。
うる。また、このようにして得られた吸着剤を用いるこ
とにより、収率良く、しかも高純度の第Ｘ因子を得るこ
とができる。
本発明に関して、固定化抗血液凝固第■因子抗体による
処理は、例えば以下の通りにして行われる。まず、適度
に精製した第■因子含有水溶液を適当な溶媒〔例えば、
０．０１〜０．１ Ｍ ）リス緩衝１（ｐＨ６〜８）〕
で平衡化した固定化抗第■因子抗体にアプライする。同
じ溶媒で洗浄後、溶出液で溶出させた第■因子画分を回
収する。
処理は、例えば以下の通りにして行われる。まず、適度
に精製した第■因子含有水溶液を適当な溶媒〔例えば、
０．０１〜０．１ Ｍ ）リス緩衝１（ｐＨ６〜８）〕
で平衡化した固定化抗第■因子抗体にアプライする。同
じ溶媒で洗浄後、溶出液で溶出させた第■因子画分を回
収する。
本発明において溶出液としては、チオシアン酸カリウム
およびグアニジンから選ばれる少なくとも一種を含有す
る水溶液（通常、緩衝液溶液）が使用され、この点が本
発明の特徴点である。
およびグアニジンから選ばれる少なくとも一種を含有す
る水溶液（通常、緩衝液溶液）が使用され、この点が本
発明の特徴点である。
本発明において使用されるチオシアン酸カリウムおよび
グアニジンの濃度は１〜５Ｍ、好ましくは２〜４Ｍであ
る。当該水溶液のｐｉ（は通常６〜８、好ましくは７程
度である。当該溶出液としては、具体的には１〜５Ｍチ
オシアン酸カリウム含有０．０１〜０．１ Ｍ ）リス
緩衝液（ｐＨ６〜８）、１〜５Ｍグアニジン−塩酸含有
０．０１〜０．１ Ｍ ）リス緩衝液（ｐＨ６〜８）な
どが示される。
グアニジンの濃度は１〜５Ｍ、好ましくは２〜４Ｍであ
る。当該水溶液のｐｉ（は通常６〜８、好ましくは７程
度である。当該溶出液としては、具体的には１〜５Ｍチ
オシアン酸カリウム含有０．０１〜０．１ Ｍ ）リス
緩衝液（ｐＨ６〜８）、１〜５Ｍグアニジン−塩酸含有
０．０１〜０．１ Ｍ ）リス緩衝液（ｐＨ６〜８）な
どが示される。
本発明の方法においては、さらに塩を除去するために、
所望によりたとえば透析を行う。
所望によりたとえば透析を行う。
（ｄ）製剤化
上記処理に続いて、第Ｘ因子を主成分とする医薬品製造
における常套手段に従って処理を行って、極めて安全性
の高い第■因子製剤を提供することができる。
における常套手段に従って処理を行って、極めて安全性
の高い第■因子製剤を提供することができる。
本発明の処理による第Ｘ因子ないしは第■因子複合体の
回収率は極めて高く、生物学的製剤基阜が規定する規格
にも十二分に適合できるものであ従って、本発明は純度
の高い第■因子製剤を製造する上で、橿めて有効な方法
である。
回収率は極めて高く、生物学的製剤基阜が規定する規格
にも十二分に適合できるものであ従って、本発明は純度
の高い第■因子製剤を製造する上で、橿めて有効な方法
である。
本発明をより詳細に説明するために、実施例および実験
例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定される
ものではない。
例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定される
ものではない。
なお、第Ｘ因子の力価は一段階による凝固測定法（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌ、 Ｍｅｄ、、 Ｌ１２５〜１３０ （１
９６２））によった。
ｗ Ｅｎｇｌ、 Ｍｅｄ、、 Ｌ１２５〜１３０ （１
９６２））によった。
実験例１（溶出液の種類）
各種溶出液を用いた場合の、第Ｘ因子の回収率と比活性
を検討した（第１表）。
を検討した（第１表）。
第１表
実験例２（′ａ度）
溶出液としてグアニジン−塩酸含有０．０５ Ｍ トリ
ス緩衝液（ｐＨ７，０）を用いて、各濃度における回収
率と比活性を検討した（第２表）。
ス緩衝液（ｐＨ７，０）を用いて、各濃度における回収
率と比活性を検討した（第２表）。
第２表
実施例
（１） 固定化抗体の調製
抗第■因子モノクローナル抗体をＣＮＢｒ法により活性
化したセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）に結合さ
せた。
化したセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）に結合さ
せた。
調製した抗第■因子モノクローナル抗体−セファロース
４ Ｂ （ＩｇＧ： ８．６ ｍｇ／ ｍｌ ｏｆゲル
）は、ゲルｌ ｍｌ当たり第Ｘ因子を１５０ Ｕ （１
７Ｕ／ｍｇ ｏｆＩｇＧ）を結合しているものである。
４ Ｂ （ＩｇＧ： ８．６ ｍｇ／ ｍｌ ｏｆゲル
）は、ゲルｌ ｍｌ当たり第Ｘ因子を１５０ Ｕ （１
７Ｕ／ｍｇ ｏｆＩｇＧ）を結合しているものである。
（２）処理方法
瓢 上記で得た固定化抗体１ｄを０．０５ Ｍ ）リ
ス緩衝ｎ、 （ｐＨ７，０）で平衡化した。
ス緩衝ｎ、 （ｐＨ７，０）で平衡化した。
このカラムに第■因子含有溶液（ｐｒｏｆｉｌｎｉｎｅ
”比活性２．５１Ｊ／Ａｓｓ。）をアプライし、上記の
溶媒で洗浄した。
”比活性２．５１Ｊ／Ａｓｓ。）をアプライし、上記の
溶媒で洗浄した。
その後、４Ｍグアニジン−塩酸含有０．０５ Ｍ ）リ
ス緩衝液（ｐＨ１，０＞により溶出した。
ス緩衝液（ｐＨ１，０＞により溶出した。
（ａ） 精製した第Ｘ因子は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ法に
より分析したところ、非還元条件下で分子置駒６５００
０の単一ピークを示した。
より分析したところ、非還元条件下で分子置駒６５００
０の単一ピークを示した。
（ｂ） 精製した第Ｘ因子を用いてフィブリノゲン凝
固時間を測定したところ、３．８時間（第Ｘ因子２５Ｕ
／ｄ）であった。
固時間を測定したところ、３．８時間（第Ｘ因子２５Ｕ
／ｄ）であった。
（Ｃ） 結合した第Ｘ因子は４Ｍ−塩酸グアニジンに
よりその約８０％が回収された。。
よりその約８０％が回収された。。
（ｄ） 溶出された第Ｘ因子の比活性は約９０ 丁Ｉ
ｔ Ａ！１１６で、その純度は９５％以上（ＳＯ５−Ｐ
ＡＧＥ）でありｔまた、このものは生物学的製剤基準活
性凝固否η試験にも適合した。
ｔ Ａ！１１６で、その純度は９５％以上（ＳＯ５−Ｐ
ＡＧＥ）でありｔまた、このものは生物学的製剤基準活
性凝固否η試験にも適合した。
特許出願人 株式会社 ミドリ＋１
Claims (1)
- 血液凝固第IX因子含有水溶液を固定化抗血液凝固第IX因
子抗体により処理することによる血液凝固第IX因子の精
製方法において、溶出液がチオシアン酸カリウムおよび
グアニジンから選ばれる少なくとも一種を含有する水溶
液であることを特徴とする精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8445888A JPH01258700A (ja) | 1988-04-05 | 1988-04-05 | 血液凝固第４因子の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8445888A JPH01258700A (ja) | 1988-04-05 | 1988-04-05 | 血液凝固第４因子の精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01258700A true JPH01258700A (ja) | 1989-10-16 |
Family
ID=13831184
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8445888A Pending JPH01258700A (ja) | 1988-04-05 | 1988-04-05 | 血液凝固第４因子の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01258700A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100245542B1 (ko) * | 1991-08-22 | 2000-02-15 | 모저 하., 라우페 하. 페. | 응고 인자 xiii 또는 xiiia의 정제방법 및 인자 xiiia에 대한 모노클로날 항체 |
| US6280729B1 (en) | 1991-03-01 | 2001-08-28 | Aventis Behring Llc | Preparation of factor IX |
-
1988
- 1988-04-05 JP JP8445888A patent/JPH01258700A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6280729B1 (en) | 1991-03-01 | 2001-08-28 | Aventis Behring Llc | Preparation of factor IX |
| KR100245542B1 (ko) * | 1991-08-22 | 2000-02-15 | 모저 하., 라우페 하. 페. | 응고 인자 xiii 또는 xiiia의 정제방법 및 인자 xiiia에 대한 모노클로날 항체 |
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