JP2005325132A - 静注用免疫グロブリン製剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】夾雑ウィルスを不活性化し、夾雑蛋白が極めて少なく、安全性と有効性が高い静注用免疫グロブリン製剤の効率的な製造方法の提供。
【解決手段】 免疫グロブリンを含む画分を出発原料とし、少なくとも（ａ）、（ｃ）、（ｄ）の工程はこの順序で処理を行うことを特徴とする静注用免疫グロブリン製剤の製造方法：（ａ）ｐＨ５〜７、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍの条件下、陰イオン交換体で処理して非吸着画分を回収。（ｂ）加熱処理により夾雑するウィルスを不活性化。（ｃ）ｐＨ４〜６、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０００〜１０，０００のポリエチレングリコール４〜１２ｗ／ｖ％で処理して上清を回収。（ｄ）（ｃ）の上清をｐＨ７〜９、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０００〜１０，０００のポリエチレングリコール１０〜１５ｗ／ｖ％で処理して沈殿を回収。
【選択図】なし

Description

本発明は、静注用免疫グロブリン製剤の製造方法に関する。

血漿蛋白成分である免疫グロブリンのうち、特にＩｇＧを主成分とする免疫グロブリン製剤は、これまで広く感染症の予防および治療に用いられてきた。

この免疫グロブリン製剤中の、肝炎ウィルス等の夾雑ウィルスの混在は必ずしも否認されていない。そこで、夾雑ウィルスの不活性化法として液状加熱処理法（特許文献１）或いは乾熱処理法（特許文献２、特許文献３）が提案されている。
特開昭６１−１９１６２２号公報 特開昭６１−７８７３０号公報 特願昭６０−２７０１９５号

本発明は、上記加熱処理をさらに発展させ、静注用免疫グロブリン製剤の製造における収率改善、生産性の向上、夾雑蛋白のさらなる除去等を課題とするものである。即ち、本発明の目的は、夾雑ウィルスを不活性化し、夾雑蛋白が極めて少なく、臨床上適用できる製剤、すなわち、安全性と有効性がさらに高い静注用免疫グロブリン製剤の効率的な製造方法を提供することにある。

本発明者らは、この目的に沿って静注用免疫グロブリン製剤の工業的な製法について検討し、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧという）分画処理、加熱処理および陰イオン交換体処理を組み合わせ、各工程の処理条件を設定して本発明を完成した。

本発明の要旨は、その特許請求の範囲に記載した通りであり、特に免疫グロブリンを含む画分を出発原料とする、以下の処理を含む静注用免疫グロブリン製剤の製造方法に関する。

（ａ）ｐＨ５〜７、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍの条件下、陰イオン交換体で処理して非吸着画分を回収する。
（ｂ）夾雑するウィルスが不活性化するのに十分な条件下に加熱処理する。
（ｃ）ｐＨ４〜６、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０００〜１０，０００のＰＥＧ４〜１２ｗ／ｖ％で処理して上清を回収する。
（ｄ）（ｃ）の上清をｐＨ７〜９、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０００〜１０，０００のＰＥＧ１０〜１５ｗ／ｖ％で処理して沈殿を回収する。

（出発原料）
本発明の出発原料としては、免疫グロブリンを含む画分が使用され、これはヒト血漿由来であって、免疫グロブリン画分を含むものであれば特に限定されない。具体的には、コーンのエタノール分画により得られる画分II＋III 、画分II、および免疫グロブリンを含むこれらと同等の画分のペースト等が挙げられる。また、この出発原料は、ヒト血液型抗体、カリクレイン、プレカリクレイン、ＩｇＭ、ＩｇＧ重合体などを含んでいてもよい。

（製法）
本発明による製造方法は、以下の工程を含むものである。

Ｉ．陰イオン交換体処理工程
本工程は陰イオン交換体で接触処理して非吸着画分を回収する工程である。本工程は、ＩｇＭ、ＩｇＧ重合体を除くために行われる。

（ｉ）陰イオン交換体の調製
陰イオン交換体としては、陰イオン交換基を不溶性担体に結合したものが使用され、陰イオン交換基としてはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、四級アミノエチル（ＱＡＥ）基等を、不溶性担体としてはアガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド等を用いることが出来る。その結合は公知の方法で行われる。

（ii）処理方法
出発原料を適当な水性溶媒に溶解する。水性溶媒はｐＨ５〜７（好ましくはｐＨ５．５〜６．５）、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ（好ましくは０．０００１〜０．０１Ｍ）の水溶液とする。水性溶媒の溶質として、たとえば塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム等を含ませてもよい。蛋白質濃度としては、１〜１５ｗ／ｖ％（特に、３〜１０ｗ／ｖ％）が好ましい。さらに、上記水性溶媒で平衡化した陰イオン交換体と接触処理する。その処理に際してはバッチ法、カラム法のどちらを用いてもよい。

たとえば、バッチ法では、陰イオン交換体１ｍｌに対して処理対象溶液１０〜１００ｍｌ程度と混合させ、０〜４℃で３０分〜２時間程度攪拌した後、遠心分離（６０００〜８０００ｒｐｍ、１０〜３０分間）して上清を回収する。カラム法でも、陰イオン交換体１ｍｌに対して処理対象溶液１０〜１００ｍｌ程度を接触させ、非吸着画分を回収する。

ＩＩ．加熱処理工程
本工程は、免疫グロブリンの抗体活性の減少は最小限にとどめるが、夾雑するウィルス、例えばＨＢウィルス、ＡＩＤＳウィルス等は完全に不活性化する条件下で加熱処理する工程である。

加熱処理は、含湿度３％以下の乾燥状態（即ち、乾熱処理）、または溶液状態、即ち免疫グロブリンの水溶液状態（即ち、液状加熱処理）で行い、なかでも液状加熱処理を行うことが特に好ましい。さらに、この加熱処理は安定化剤の存在下に行うことが好ましく、この安定化剤としては、上記乾熱処理および液状加熱処理のいずれの場合も、二糖類（例、サッカロース、マルトース）、糖アルコール（例、ソルビトール、マンニトール）が例示され、なかでもソルビトールが好適に例示される。安定化剤の添加量は、乾熱処理では、二糖類、糖アルコール等を０．５〜５ｗ／ｖ％（好ましくは１〜３ｗ／ｖ％）、液状加熱処理では、二糖類、糖アルコール等を１０ｗ／ｖ％以上（好ましくは２０〜４０ｗ／ｖ％）用いることが好適に例示される。

加熱の対象となる免疫グロブリンの量は、乾熱処理では、蛋白量として１〜１０ｗ／ｖ％（好ましくは３〜７ｗ／ｖ％）に調整することが好ましい。液状加熱処理では、蛋白量として０．１〜３０ｗ／ｖ％（好ましくは５〜２０ｗ／ｖ％）に調整することが好ましい。加熱処理は、乾熱処理の場合、好ましくは安定化剤を添加後、必要に応じ除菌濾過し、たとえば凍結乾燥等によって含水率３％以下、好ましくは１％以下とする。凍結乾燥の条件としては０．５ｍｍＨｇの真空下、２０〜４０℃で２４〜９６時間程度が例示される。次いで、例えば５０〜８０℃（好ましくは６０℃程度）、１〜２００時間（好ましくは１０〜１００時間程度）で処理する。また、本加熱処理工程は不活性ガス雰囲気下で行うことにより、加熱時の安定性をより高めることができる。不活性ガスとしては例えば、窒素ガス、アルゴン、ヘリウム等が例示される。液状加熱処理の場合は、水溶液のｐＨを４．５〜６．５、好ましくはｐＨ５〜６に調整し、例えば５０〜８０℃（好ましくは６０℃程度）で１０分〜２０時間（好ましくは１０時間程度）処理される。また、水溶液のイオン強度としては、０．０００１〜０．１Ｍ（特に好ましくは０．０００１〜０．０１Ｍ）が例示される。

ＩＩＩ．低濃度ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）処理工程
本工程は、低濃度ＰＥＧで処理し、上清を回収する工程である。

処理対象物を分子量１，０００〜１０，０００（好適には約２，０００〜６，０００）のＰＥＧで処理する（例えば、両者を混合する）。処理条件は、ＰＥＧ濃度４〜１２ｗ／ｖ％（特に８〜１２ｗ／ｖ％）、ｐＨ４〜６（特に４．５〜５．５）、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ（特に、０．０００１〜０．０１Ｍ）とする。この際、蛋白濃度１〜２０ｗ／ｖ％（特に、５〜１５ｗ／ｖ％）であることが好ましい。当該処理は、０〜４℃程度で通常３０分〜６時間程度攪拌することによって行われる。その後、例えば遠心分離（６０００〜８０００ｒｐｍ、１０〜３０分間）して上清を回収する。

ＩＶ．高濃度ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）処理工程
本工程はＩＩＩの工程で得られた上清を高濃度ＰＥＧで処理し、沈殿を回収する工程である。

上記上清を分子量１，０００〜１０，０００（好適には２，０００〜６，０００）のＰＥＧにてさらに処理する（例えば、両者を混合する）。処理条件は、ＰＥＧ濃度１０〜１５ｗ／ｖ％（特に、１１〜１３ｗ／ｖ％）、ｐＨ７〜９（特に７．５〜８．５）、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ（特に、０．０００１〜０．０１Ｍ）とする。この際、蛋白濃度１〜２０ｗ／ｖ％（特に、５〜１５ｗ／ｖ％）であることが好ましい。当該処理は、０〜４℃程度で通常３０分〜６時間程度攪拌することによって行われる。その後、例えば遠心分離（６０００〜８０００ｒｐｍ、１０〜３０分間）して沈殿を回収する。

本発明においては、上記処理に加え、さらに陰イオン交換体による再処理あるいは以下の処理を施すことが好ましい。

Ｖ．固定化ジアミノ化合物による処理
本工程は、固定化ジアミノ化合物で接触処理して、非吸着画分を回収する工程である。本工程はプレカリクレインまたはカリクレインを除くために行われる。

（ｉ）固定化ジアミノ化合物の調製
固定化ジアミノ化合物は、ジアミノ化合物を不溶性担体に固定化したものである。ジアミノ化合物としては、アミノベンズアミジン、アミノベンズグアニジン、リジン、アルギニン等を用いることができる。不溶性担体としてはアガロース、セルロース、デキストラン、シリカゲル、ガラス等が用いられる。固定化は公知の方法に準じればよい。例えば、アガロース、セルロース等は、例えばＣＮＢｒ活性化法により、またシリカゲル、ガラス等はオキシラン法により、ジアミノ化合物を固定化することができる。

（ii）処理方法
処理対象物、例えば上記ＩＶの工程で得られた沈殿画分をｐＨ５〜８（特に、ｐＨ６〜７）、イオン強度０．０１〜０．２Ｍ（特に０．０５〜０．１５Ｍ）の条件下で固定化ジアミノ化合物と接触処理する。その際、蛋白濃度１〜１５ｗ／ｖ％（特に、３〜１０ｗ／ｖ％）であることが好ましく、またバッチ法、カラム法のいずれもが好適に使用される。

例えばバッチ法では、固定化ジアミノ化合物１ｍｌに対して上記画分１０〜１００ｍｌ程度を混合させ、０〜１０℃、好ましくは０〜４℃で３０分〜４時間、好ましくは３０分〜２時間程度攪拌した後、遠心分離（６，０００〜８，０００ｒｐｍ、１０〜３０分間）して上清を回収する。カラム法でも、固定化ジアミノ化合物１ｍｌに対して上記画分１０〜１００ｍｌ程度を接触させ、非吸着画分を回収する。

ＶＩ．固定化ヒト血液型物質処理工程
本工程は、固定化ヒト血液型物質で接触処理して、非吸着画分を回収する工程である。本工程はヒト血液型抗体を除くために行われる。

（ｉ）固定化ヒト血液型物質の調製
固定化ヒト血液型物質は、ヒト血液型物質を不溶性担体に固定化したものである。ヒト血液型物質の調製は、公知の方法を用いればよい。例えば、ヒトＡ、Ｂ、ＡＢまたはＯ型の赤血球を低張溶液中で溶血、または超音波処理した後、硫安分画法またはＰＥＧ分画法により精製すること等により得られる。ヒト血液型物質としては合成抗原（糖鎖）を用いることもできる〔Human Blood Groups and Carbohydrate Chemistry(1978) Chem.Soc.Rev. p423〜452 を参照〕。

さらにこのヒト血液型物質は生理的食塩液に溶解後、夾雑するウィルスの不活性化に有効とされている、例えば、約５０〜７０℃、好ましくは約６０℃で、７〜１３時間、好ましくは約１０時間、または約８０〜１３０℃、好ましくは９５〜１２１℃で約１〜４０分、好ましくは約２〜３０分間加熱処理する。その後、遠心分離して不溶物を除去し、蒸留水に対して透析して、各ヒト血液型物質を得る。不溶性担体としてはアガロース、セルロース、デキストラン、シリカゲル、ガラス等が用いられる。固定化は公知の方法に準じればよい。例えば、アガロース、セルロース等はＣＮＢｒ活性化法により、シリカゲル、ガラス等はオキシラン法によりヒト血液型物質を固定化できる。

（ii）処理方法
処理対象物、例えばＶの工程の非吸着画分をｐＨ５〜８（特にｐＨ６〜７）、イオン強度０．０１〜０．２Ｍ（特に０．０５〜０．１５Ｍ）の条件下で、上記水性溶媒で平衡化した固定化ヒト血液型物質と接触処理する。その際、蛋白濃度１〜１５ｗ／ｖ％（特に、３〜１０ｗ／ｖ％）であることが好ましく、またバッチ法、カラム法のどちらを用いてもよい。

例えば、バッチ法では、固定化ヒト血液型物質１ｍｌに対して処理対象溶液１０〜１００ｍｌ程度と混合させ、０〜１０℃、好ましくは０〜４℃で、３０分〜４時間、好ましくは３０分〜２時間程度攪拌した後、遠心分離（６，０００〜８，０００ｒｐｍ、１０〜３０分間）して上清を回収する。カラム法でも、固定化ヒト血液型物質１ｍｌに対して処理対象溶液１０〜１００ｍｌ程度を接触させ、非吸着画分を回収する。

（液状製剤の調製）
得られた免疫グロブリン組成物を１〜１０ｗ／ｖ％（好ましくは３〜７ｗ／ｖ％）になるように適当な溶媒（例えば、注射用蒸留水）に溶解し、さらに安定化剤、例えば、二糖類（ショ糖、マルトース等）、糖アルコール（ソルビトール、マンニトール等）、特に好ましくはソルビトール１〜２０ｗ／ｖ％（好ましくは、２〜１０ｗ／ｖ％）を添加し、ｐＨ５〜６（好ましくはｐＨ５．３〜５．７、特に好ましくは約５．５）、低電導度、好ましくは電導度１ｍｍｈｏ以下（特に、０．６ｍｍｈｏ以下、共に８℃換算）になるように、自体既知の手段にて調整したのち、通常の製剤化技術に基づいて、除菌濾過、分注等を行う。かくして、静脈内投与可能な免疫グロブリン製剤が調製される。

本発明においては、上記のような方法により静注用グロブリン製剤を製造したため、得られた製剤中に、ＩｇＧ重合体が検出されなくなり、また、製造工程中におけるＩｇＧの収率が向上した。

本発明により得られた製剤は免疫グロブリンが殆ど不活化されておらず、しかも、加熱処理を施しているので夾雑ウィルスも不活化され、溶解性も良好で、抗補体活性も十分に低く、また好ましい態様においてはプレカリクレイン、カリクレイン、抗ヒト血液型物質抗体等の夾雑物が含まれない等の性質を有し、昭和６０年度発行の日本国生物学的製剤基準（以下、生基準）をパスできる安全な製剤である。

また、本発明により得られた製剤は、静脈内投与、点滴等により、感染症等の予防または治療に用いられる。即ち、本発明は静注用免疫グロブリン製剤の工業的製法として有益である。

本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、本発明は、これらによって何ら限定されるものではない。

実施例１
コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩ １ｋｇに水３リットルを加え、ｐＨ４で抽出後、この溶液にＤＥＡＥ−セファデックスを添加（５０ｍｌ溶液当たり１ｍｌ）し、ｐＨ６．０、４℃の条件下に接触処理し、処理後遠心分離（７０００ｒｐｍ 、約２０分間）して上清（ＩｇＧ溶液）を回収した。さらに１００ｍｌに対してソルビトールを５０ｇ添加し、ｐＨを５．５に調整した後、６０℃で１０時間加熱処理した。加熱終了後、ｐＨを５．５に調整した後、ＰＥＧ＃４０００を終濃度が８ｗ／ｖ％になるように添加し、２℃で遠心分離を行った。得られた上清を１Ｎ−水酸化ナトリウムを用いｐＨ８．８とした後、ＰＥＧ＃４０００を終濃度が１５ｗ／ｖ％になるように加え、２℃で遠心分離を行い、沈殿画分にＩｇＧ画分を得た。このＩｇＧ画分を蒸留水に対して透析後、５ｗ／ｖ％ＩｇＧ溶液に調整し、酢酸ナトリウムで溶液のｐＨを約５．５にし、さらにソルビトールを終濃度５ｗ／ｖ％まで添加した。この水溶液（電導度約１ｍｍｈｏ）を除菌濾過し静注用免疫グロブリン液状製剤を得た。

実施例２
コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩ １ｋｇに水３リットルを加え、ｐＨ４で抽出後、この溶液にＤＥＡＥ−セファデックスを添加（２０ｍｌ溶液当たり１ｍｌ）し、ｐＨ６．０、４℃の条件下に接触処理し、処理後遠心分離（７０００ｒｐｍ、約２０分間）して上清（ＩｇＧ溶液）を回収した。さらに１００ｍｌに対してソルビトールを５０ｇ添加し、ｐＨを５．５に調整した後、６０℃で１０時間加熱処理した。加熱終了後、ｐＨを５．３〜５．４に調整した後、ＰＥＧ＃４０００を終濃度が１２ｗ／ｖ％になるように添加し、２℃で遠心分離を行った。得られた上清を１Ｎ−水酸化ナトリウムを用いｐＨ８．８とした後、ＰＥＧ＃４０００を終濃度が１５ｗ／ｖ％になるように加え、２℃で遠心分離を行い、沈殿画分にＩｇＧ画分を得た。このＩｇＧ画分を蒸留水に溶解し、ＤＥＡＥ−セファデックスを添加（３３ｍｌ溶液当たり１ｍｌ）し、ｐＨ６．０、４℃の条件下に接触処理し、処理後遠心分離（７０００ｒｐｍ、約２０分間）して上清（ＩｇＧ溶液）を回収した。このＩｇＧ画分を蒸留水に対して透析後、５ｗ／ｖ％ＩｇＧ溶液に調整し、酢酸ナトリウムで溶液のｐＨを約５．５にし、さらにソルビトールを終濃度５ｗ／ｖ％まで添加した。この水溶液（電導度約１ｍｍｈｏ）を除菌濾過し静注用免疫グロブリン液状製剤を得た。

上記実施例１および２で得られた製剤は実質的にＩｇＧ単量体のみを含み、抗補体価も１０〜１５ＣＨ₅₀程度であり、静注用グロブリンとしての生基準にも合格した。

実験例１
上記実施例１において、加熱処理前に陰イオン交換体による前処理を行わない方法を従来法１（特開昭６３−１８３５３９号公報に記載の方法）とし、これにより得られた製剤中のグロブリンを免疫比濁法により定量して、グロブリンの回収率を求めた。同様にして、実施例１におけるグロブリンの回収率を求めた。その結果、上記従来法１での回収率を１００％とすると、実施例１での回収率は１４６％であった。

実験例２
上記実施例２において、加熱処理前に陰イオン交換体による前処理を行わない方法を従来法２（特開昭６３−１８３５３９号公報に記載の方法）とし、これにより得られた製剤中のグロブリンを免疫比濁法により定量して、グロブリンの回収率を求めた。同様にして、実施例２におけるグロブリンの回収率を求めた。その結果、上記従来法２での回収率を１００％とすると、実施例２での回収率は１５４％であった。

実験例３
上記実施例２で得られた静注用免疫グロブリン液状製剤において、夾雑蛋白質を免疫拡散法により、ＩｇＧ重合体をＨＰＬＣによりそれぞれ定量して、該製剤の性状を分析したところ、表１に示す結果が得られた。

Claims (2)

1. 免疫グロブリンを含む画分を出発原料とする、以下の工程を含み、少なくとも（ａ）、（ｃ）、（ｄ）の工程はこの順序で処理を行うことを特徴とする静注用免疫グロブリン製剤の製造方法：
   （ａ）ｐＨ５〜７、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍの条件下、陰イオン交換体で処理して非吸着画分を回収する。
   （ｂ）夾雑するウィルスが不活性化するのに十分な条件下に加熱処理する。
   （ｃ）ｐＨ４〜６、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０００〜１０，０００のポリエチレングリコール４〜１２ｗ／ｖ％で処理して上清を回収する。
   （ｄ）（ｃ）の上清をｐＨ７〜９、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０００〜１０，０００のポリエチレングリコール１０〜１５ｗ／ｖ％で処理して沈殿を回収する。
2. 免疫グロブリンを含む画分を出発原料とする、以下の工程を含み、さらに（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の順序で処理を行うことを特徴とする静注用免疫グロブリン製剤の製造方法：
   （ａ）ｐＨ５〜７、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍの条件下、陰イオン交換体で処理して非吸着画分を回収する。
   （ｂ）夾雑するウィルスが不活性化するのに十分な条件下に加熱処理する。
   （ｃ）ｐＨ４〜６、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０００〜１０，０００のポリエチレングリコール４〜１２ｗ／ｖ％で処理して上清を回収する。
   （ｄ）（ｃ）の上清をｐＨ７〜９、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０００〜１０，０００のポリエチレングリコール１０〜１５ｗ／ｖ％で処理して沈殿を回収する。